TWI688406B - 與白蛋白具有較佳結合親和力之藥物分子 - Google Patents

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Abstract

本揭示內容提出多種分子構建體，其具有複數個脂肪酸以及一功能性元件。亦揭示使用此種分子構建體來治療各種疾病之用途。

Description

與白蛋白具有較佳結合親和力之藥物分子
本揭示內容是關於新穎的藥學構建體；更明確地說，是關於經二或更多個脂肪酸或二元脂肪酸分子修飾的藥學構建體，因而能夠提高其對白蛋白的結合親和力以及改善其血清中壽命。
具備多重功效的藥物開發已成為相關領域的主流研發方向。舉例來說，國際專利申請公開案WO 2016/112870 (A1)所述的多臂接合單元以及相關申請案提出了重要的化學實體，其能夠用以建構具有二或更多功能性部位之分子。然而，WO 2016/112870公開案使用具有特殊官能基(如四嗪基、環辛烯基與環辛炔基)的胺基酸來進行鏈接化學反應(click chemistry reaction)；然而，無法在固態胜肽合成反應中加入此類胺基酸。更有甚者，根據WO 2016/112870公開案，需使用一端帶有順丁烯二醯亞胺基、另一端帶有四嗪基、環辛烯基或環辛炔基的異雙官能基(heterobifunctional)連接物，以透過半胱胺酸殘基(cysteine，C)的硫醇基和上述異雙官能基連接物的順丁烯二醯亞胺基之間的反應，而加入帶有四嗪基、環辛烯基或環辛炔基的耦合臂(coupling arm)。已知硫醇與順丁烯二醯亞胺基反應的產物較不穩定，可能會發生逆向反應(reverse reaction)或和鄰近帶有硫醇基的分子發生交換反應，進而可能影響耦接之接合單元的儲存穩定性。此外，如WO 2016/112870公開案所述，當多肽中心核帶有半胱胺酸殘基時，若連接臂帶有可和多肽核上之硫醇反應的功能基，就無法進行此種連接臂(linking arm)的連續固態合成(多肽分支)。再者，多肽中心核N-端的α-胺基需要額外的阻斷步驟，此一步驟會降低多肽中心核或接合單元的產率與純度。
此外，在某些臨床應用中，需要延長藥品的半衰期，而使得所需的給藥頻率可以降低並減少藥物在血液中的濃度波動，這些功效能夠降低治療成本且可提升患者對療程醫囑的遵從性。
目前已利用多種方法來延長藥物的半衰期。譬如可改變胜肽或蛋白藥物分子的結構(如透過胺基酸殘基突變)，而不需使用特殊的製劑或與其他化學實體接合。舉例來說，利用胺基酸取代來降低其對蛋白酶的敏感性、改變其等電點以及增加脂溶性等，可以延長某些藥物的半衰期。透過遺傳工程製備的組織血漿蛋白原活化因子—替奈普酶(tenecteplase)有數個定點突變，且可抵抗血漿蛋白原活化因子抑制劑，且因此相較於野生型活化酶有較長的半衰期。甘精胰島素(insulin glargine)是一種商業銷售的人類胰島素，其將一個天冬醯胺殘基取代為甘胺酸，因此可降低其在中性pH下的溶解度，且當透過皮下注射注入患者體內時會聚集在一起。這種聚集的胰島素會慢慢地溶解並進入血液循環中，因此其半衰期比起一般的野生型胰島素來得長。
有效藥物則是和會形成基質的物質(如聚乳酸甘醇酸)混合，或是包載於微脂體或其他類型的微球/奈米粒子中。當將此類藥物製劑施用於患者後，可展現較緩慢的釋放動力。已將數種化療藥物(如，紫杉醇與阿黴素)以及荷爾蒙藥物(如，體抑素類似物(如奧曲肽乙酯(octreotide acetate))與促性腺素釋放激素類似物(如柳菩林(leuprorelin))製成微球注射液以供長時間緩釋。
還有許多蛋白藥物經聚乙二醇(polyethylene glycol ，PEG)修飾，以改善其藥動學活性與穩定性，並減低免疫源性，上述藥物如干擾素-α、干擾素-β、紅血球生成素、人類生長激素、顆粒性白血球群落刺激因子、腺苷去胺酶與天冬醯胺酸酶。使用PEG修飾的缺點之一在於複合產物的異質性。長鏈PEG也可能包繞蛋白分子，因而抑制蛋白藥物的活性。長鏈PEG亦可抵抗降解，故會積累於患者體內。
另一種改善蛋白藥物藥動學特性的方法是將蛋白和IgG之Fc部分的CH2-CH3結構域融合。可將蛋白藥物與CH2-CH3片段以連續重組胜肽的形式表現，而兩個此類多肽就可以形成二聚物構型。目前已開發出數種細胞介素受體以及細胞表面蛋白的Fc融合蛋白並於臨床上廣泛使用，譬如針對細胞毒性T細胞蛋白4(cytotoxic T-cell protein 4，CTLA-4)的貝拉西普(belatacept)、針對腫瘤壞死因子-α (tumor necrosis factor-α，TNF-α)的依那西普(etanercept)、針對血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的阿柏西普(aflibercept)以及針對介白素-1 (interleukin-1，IL-1)的列洛西普(rilonacept)。許多細胞介素與細胞介素受體的血清半衰期短於1天。將其與IgG的Fc部分接合能夠將其半衰期延長到1週以上。
與白蛋白融合也是另一種延長胜肽或蛋白藥物半衰期的方法。白蛋白在血液循環中的半衰期為19天。因為白蛋白是單一多肽蛋白，可利用重組多肽來製備白蛋白與一多肽或蛋白的融合蛋白。舉例來說，阿必魯肽(albiglutide)是將白蛋白與對二肽基肽酶-4 (dipeptideyl peptidese-4)具抗性的似升糖素胜肽1 (glucagon-like peptide 1，GLP-1)二聚物融合所得的蛋白，其已經許可用以治療第二型糖尿病。阿必魯肽的血清半衰期為4-7天，相較之下，一般的GLP-1只有1-2小時。愛必凝是由白蛋白與第九凝血因子融合之蛋白。此藥物每14天施用一次，可用以防止患有B型血友病的兒童或成人出血。
即便如此，既有用以提升藥物血清半衰期的方法仍欠缺彈性。亦即，無法經調整而適用於有不同藥動學特性需求的各種藥物。因此，在藥物研究與開發領域中，具有較佳或可調整之藥動學特性之藥物仍是即為重要的課題。
本揭示內容的第一態樣是關於一種接合單元的平台技術，此種接合單元可提升藥物的血清半衰期。具體來說，所述接合單元至少包含二或更多個脂肪酸衍生物或二元脂肪酸衍生物，其可透過點擊反應與藥物(藥物本身或以載藥束的形式)耦接。如此一來，接合單元中的多個脂肪酸鏈可***一單一人類血清白蛋白(human serum albumin，HSA)的不同疏水性凹口或不同HAS的疏水性凹口，因而增加接合單元(且因而增加，接合單元-藥物耦合物整體)與一或多HAS間的結合強度。再者，利用本技術平台能夠輕易地調整脂肪酸鏈的常務、數目以及二脂肪酸鏈間的距離。如此一來，就能夠視需要而透過改變脂肪酸鏈的長度與數目以及二脂肪酸鏈間的距離來調整藥物的藥動學特性。
根據本揭示內容某些實施方式，所述接合單元至少包含一中心核以及二至五個第一元件。根據本揭示內容多個實施方式，所述中心核至少包含： (1)二至五個離胺酸(K)殘基； (2)視需要地，一或多填充物，其中任兩個所述K殘基彼此相鄰或由該填充物隔開； (3)視需要地，一末端間隔物，其中該末端間隔物為連接至該第一K殘基之N-端的一N-端間隔物或連接至該最後K殘基之C-端的一C-端間隔物；以及 (4)一複合部分，藉由與該末端K殘基形成醯胺鍵，或當存有該末端間隔物時，藉由與末端間隔物的末端胺基酸殘基形成醯胺鍵，而與其連接，其中該複合部分具有選自以下群組的一複合基：疊氮基、炔基、四嗪基、環辛烯基與環辛炔基。
一般來說，中心核可有2、3、4或5個K殘基。於不同的實施方式中，任兩個所述K殘基可彼此相鄰(即，兩者間並無填充物)或以一填充物隔開。當有多個填充物時，每一填充物的組合可以彼此不同。
在結構方面，該些填充物的每一者與末端間隔物至少獨立地包含：(i) 1到12個胺基酸殘基，每一個獨立選自於K殘基以外的胺基酸殘基，或(ii)具有2至12個乙二醇(ethylene glycol，EG)重複單元的一聚乙二醇化胺基酸(PEGylated amino acid)。根據某些例示性的實施方式，所述填充物或末端間隔物可至少包含一或多甘胺酸(G)及/或絲胺酸(serine，S)殘基。於某些實施例中，所述填充物或末端間隔物由2至10個胺基酸殘基所組成；較佳為，2至5個胺基酸殘基。於某些實施方式中，填充物或末端間隔物至少包含2至5個EG重複單元。
根據本揭示內容某些實施方式，中心核至少包含一N-端間隔物，其連接到N-端起第一個連接胺基酸殘基的N-端。額外地或替代性地，中心核至少包含一C-端間隔物，其連接到N-端起最後一個連接胺基酸殘基的C-端。
根據本揭示內容某些視需要而採用的實施方式，接合單元至少包含兩個複合部分(如，一第一複合部分與一第二複合部分)。
在某些視需要而採用的實施方式中，複合部分可具有一官能基，其能夠與末端胺基酸殘基(即，第一個連接胺基酸殘基或N-端間隔物的N-末端胺基酸殘基)的α-胺基(-NH2)或末端胺基酸殘基(即，最後一個連接胺基酸殘基或C-端間隔物的C-末端胺基酸殘基)的羧基(-COOH)形成共價鍵，以便將複合部分與其連接。在一些實施方式中，中心核可僅具有N-與C-端間隔物其中一個，並具有第一與第二複合部分，兩者分別連接到末端胺基酸殘基(可以是末端連接胺基酸殘基或末端間隔物的末端胺基酸殘基)。在其他實施方式中，中心核至少包含N-與C-端間隔物兩者，且兩個複合部分分別連接到二末端間隔物的末端胺基酸殘基。在較佳實施方式中，形成於複合部分與末端胺基酸殘基間的共價鍵為醯胺鍵。當可想見，為了確保所得接合單元的均質性，應使一複合部分僅含有一個能和α-胺基或羧基其中一者反應的官能基。
於選擇上述兩個複合基時，較佳應使這兩個複合基無法進行點擊化學反應。根據某些實施方式，當第一複合基為疊氮基、炔基或環辛炔基時，第二複合基不能是疊氮基、炔基或環辛炔基，以避免二複合基進行反應；此時，所述第二複合基可以是四嗪基或環辛烯基。在另一些實施方式中，當第一複合基為四嗪基或環辛烯基時，第二複合基不能是四嗪基或環辛烯基；反之，第二複合基可以是疊氮基、炔基或環辛炔基。當可想見，若欲使兩個二複合部分和同一種功能元件耦合時，二複合部分的複合基可以相同或可用以進行相同的點擊化學反應。
每一該第一元件可獨立地為C8-28 脂肪酸衍生物或C8-28 二元脂肪酸衍生物，且透過K殘基的ε-胺基而連接到一個K殘基。根據本揭示內容多種實施方式，第一元件為脂肪酸衍生物，其係衍生自：辛酸、壬酸、癸酸、十一酸、月桂酸、十三酸、肉豆蔻酸、十五酸、棕櫚酸、十七酸、硬脂酸、十九酸、花生酸、二十一酸、二十二酸、二十三酸、二十四酸、棕櫚油酸、油酸、亞麻油酸、蓖麻油酸、異檸檬酸、二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid，EPA)或二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid，DHA)。根據本揭示內容某些實施方式，第一元件為二元脂肪酸衍生物，其係衍生自：1,8-辛二酸、1,7-庚二甲酸、1,10-癸二酸、十一烷二酸、十二烷二酸、十三烷二酸、十四烷二酸、十五烷二酸、十六烷二酸、十七烷二酸或十八烷二酸。於某些實施方式中，第一元件係衍生自肉豆蔻酸或棕櫚酸。於其他實施方式中，第一元件係衍生自十四烷二酸或十六烷二酸。
在一些實施方式中，脂肪酸(或二元脂肪酸)衍生物為經化學修飾的脂肪酸(或二元脂肪酸)分子。舉例來說，所述脂肪酸分子的羧基(或二元脂肪酸分子的其中一個羧基)可和具有兩個官能基的化學部分反應，上述官能基其中一個為羧基-反應性官能基(因此能夠和該(二元)脂肪酸分子形成共價鍵)，而另一個官能基可以和離胺酸殘基的側鏈胺基反應。根據本揭示內容視需要而採用的實施方式，用以修飾(二元)脂肪酸分子的化學實體為麩胺酸殘基、天冬胺酸殘基、胺基-EG2-酸、γ丁胺酸或與其相似者；然而，本揭示內容不限於此。
根據本揭示內容多個實施方式，連接至中心核的二或更多個第一元件可以相同或不同。當可想見，在多肽中心核的固態合成過程中，除了在合成中心核之後才將第一元件連接至中心核之外，也可以將經修飾帶有特定第一元件的K胺基酸殘基引入多肽鏈中。因此，根據多種實施方式，可在固態合成過程中，依序加入經不同第一元件修飾的K殘基，以便得到均質的接合單元，其中每一接合單元可接有二或更多個不同的第一元件。
根據本揭示內容的某些實施方式，本接合單元至少更包含一第二元件，其透過以下反映連接至複合基：銅催化的疊氮化物-炔羥環加成(copper catalyzed azide-alkyne cycloaddition，CuAAC)反應、應力促進的疊氮化物-炔羥鏈接化學(strain-promoted azide-alkyne click chemistry，SPAAC)反應或逆電子需求狄爾斯-阿德(inverse electron demand Diels–Alder，iEDDA)反應。第二元件可已是任何能夠治療一疾病或症狀的疾病分子。在較佳的情形中，第二元件為胜肽類藥物，譬如：胰島素、似胰島素生長因子、似升糖素胜肽-1促效劑、體抑素與體抑素類似物、降鈣素、生長激素、紅血球生成素、促性腺素釋放激因子、顆粒性白血球群落刺激因子、腺苷去胺酶、天冬醯胺酸酶、干擾素-α、干擾素-β、TNF-α受體、IL-1受體、EGF受體、半乳糖苷酶β、半乳糖苷酶α、拉羅尼酶(laronidase)、移黏寶酶(idursulphase)、阿葡糖苷酶α (alglucosidase α)以及加硫酶，或其衍生物或變異物。
當可想見，第二分子可經修飾帶有與複合基相對應的反應基，而使得第二元件與中心核的複合基連接。於某些實施方式中，胜肽類藥物可僅帶有一個離胺酸或一個不成對的半胱胺酸殘基，且此一離胺酸或半胱胺酸殘基不會顯著影響該胜肽類藥物的生物活性或治療功效；在此類情形中，離胺酸或不成對的半胱胺酸殘基經修飾帶有所述反應基。舉例來說，可將帶有所述反應基的化學部分和離胺酸殘基的ε-胺基或半胱胺酸殘基的SH基反應。於某些實施方式中，帶有反應基的化學部分可以是雙功交聯物，其一端的官能基可和ε-胺基或SH基反應，而另一端則帶有反應基。再者，對於不帶有離胺酸或半胱胺酸殘基的胜肽類藥物，可將蛋白分子表面上溶劑可達且非該蛋白生物活性必要的胺基酸殘基突變為離胺酸或半胱胺酸殘基。在一些實施方式中，胜肽類藥物可能帶有對藥物生物活性具關鍵地位的離胺酸或半胱胺酸殘基，又或者是該胜肽類藥物可帶有一個以上的離胺酸殘基或多個不成對的半胱胺酸殘基。在這些情形中，也可將蛋白分子表面上溶劑可達且非該蛋白生物活性必要的胺基酸殘基突變為半胱胺酸殘基。在另一個例子中，可利用反應基修飾胜肽類藥物N-端胺基酸殘基的α-胺基；此種情形特別適用於利用固態合成技術來製備胜肽的情形。當可想見，上述策略僅為修飾胜肽類藥物的例示性方法，經修飾後的藥物帶有可和中心核複合基進行點擊反應的反應基，然本發明不限於此。
在某些視需要而採用的實施方式中，可將第二元件製備為載藥束的形式，其至少包含兩個以上的第二元件。舉例來說，載藥束的結構可如下列國際專利申請公開案中所述：WO 2016/112870、WO 2016/184426、WO 2017/036255以及WO 2017/036407；此處將這些公開案的內容整體納入作為參照。或者是，載藥束的結構與本揭示內容所述的接合單元相似，不同之處在於以上述第二元件取代第一元件(即，脂肪酸或二元脂肪酸衍生物)。簡言之，所述載藥束至少包含一第二中心核、一第二複合部分、複數個視需要而採用的第二連接臂、一或多個視需要而採用的填充物以及一或二個視需要而採用的末端間隔物，且第二元件係透過第二中心核的離胺酸殘基之側鏈胺基或第二連接臂而連接於中心核。
在較佳的情形中，當接合單元至少包含二複合基(即，第一與第二複合基)時，其中一個複合基為疊氮基、吡啶甲基疊氮基、炔基或環辛炔基，而另一個複合基為四嗪基或環辛烯基。
視需要地，所述接合單元可至少更包含一第二與第三元件分別連接到上述複合基(即，第一與第二複合基)，其中第二元件透過CuAAC反應、SPAAC反應或iEDDA反應連接至第一複合基；且第三元件係透過CuAAC反應、SPAAC反應或iEDDA反應連接到第二複合基，且此處所用的反應和第二元件與第一複合基間的反應不同。
一般來說，環辛烯基為降莰烯基或反式-環辛烯(TCO)基；且環辛炔基為二苯并環辛炔(DBCO或DIBO)基、二氟化環辛炔(difluorinated cyclooctyne，DIFO)基、二環壬炔(bicyclononyne，BCN)基或二苯并雜氮環辛炔(dibenzoazacyclooctyne，DIBAC)基。四嗪基為1,2,3,4-四嗪基、1,2,3,5-四嗪基或1,2,4,5-四嗪基，或其衍生物。疊氮基可以是吡啶甲基疊氮或–N3 基。
為了使本揭示內容的敘述更加詳盡與完備，下文針對了本發明的實施態樣與具體實施例提出了說明性的描述；但這並非實施或運用本發明具體實施例的唯一形式。實施方式中涵蓋了多個具體實施例的特徵以及用以建構與操作這些具體實施例的方法步驟與其順序。然而，亦可利用其他具體實施例來達成相同或均等的功能與步驟順序。
為了便於說明，此處整理了說明書、實施例與附隨申請專利範圍中所用的某些詞彙。除非本說明書另有定義，此處所用的科學與技術詞彙的含義與本發明所屬技術領域中具有通常知識者所理解與慣用的意義相同。
在不和上下文衝突的情形下，本說明書所用的單數名詞涵蓋該名詞的複數型；而所用的複數名詞時亦涵蓋該名詞的單數型。具體來說，此處與申請專利範圍中，所用的單數形，如一(“a”或”an”)包含其複數形，除非與上下文衝突。此外，在本說明書與申請專利範圍中，「至少一」與「一或更多」等表述方式的意義相同，兩者都代表包含了一、二、三或更多。更有甚者，在本說明書與申請專利範圍中，「A、B及C其中至少一者」、「A、B或C其中至少一者」以及「A、B和/或C其中至少一者」係指涵蓋了僅有A、僅有B、僅有C、A與B兩者、B與C兩者、與C兩者、以及A、B與C三者。
雖然用以界定本發明較廣範圍的數值範圍與參數皆是約略的數值，此處已盡可能精確地呈現具體實施例中的相關數值。然而，任何數值本質上不可避免地含有因個別測試方法所致的標準偏差。在此處，「約」通常係指實際數值在一特定數值或範圍的正負10%、5%、1%或0.5%之內。或者是，「約」一詞代表實際數值落在平均值的可接受標準誤差之內，視本發明所屬技術領域中具有通常知識者的考量而定。除了實驗例之外，或除非另有明確的說明，當可理解此處所用的所有範圍、數量、數值與百分比（例如用以描述材料用量、時間長短、溫度、操作條件、數量比例及其他相似者）均經過「約」的修飾。因此，除非另有相反的說明，本說明書與附隨申請專利範圍所揭示的數值參數皆為約略的數值，且可視需求而更動。至少應將這些數值參數理解為所指出的有效位數與套用一般進位法所得到的數值。在此處，將數值範圍表示成由一端點至另一段點或介於二端點之間；除非另有說明，此處所述的數值範圍皆包含端點。
本揭示內容一般係關於多種接合單元，每一接合單元至少包含二至五個疏水性鏈(一脂肪酸束)，其可增加或改變藥物的血清半衰期。接合單元至少更包含一效應元件或至少包含多個效應元件的載藥束。所述效應元件或載藥束可透過點擊反應而連接到脂肪酸束。所述接合單元可更包含一標的元件，其能夠將接合單元導引至患者體內的疾病部位或附近。
在此處，「標的元件(targeting element)」一詞係指接合單元能夠直接或間接結合到一目標標的(如，一細胞表面上的受體或一組織中的蛋白質)的部分，因而能夠協助將本發明接合單元遞送到目標標的。在某些例子中，標的元件可將所述接合單元導引至鄰近目標細胞處。在其他情形中，標的元件可專一地結合到目標細胞表面上的分子；或標的元件可和第二分子專一地結合，而此一第二分子能夠專一地結合到目標細胞表面上的分子。在某些例子中，一旦標的元件與目標對象接合之後，標的元件可將本發明接合單元內化，而使其移動到目標細胞的細胞質內。標的元件可以是細胞表面受體的抗體或配體；或者是可和上述抗體或配體結合的分子，因而能夠間接地將本發明接合單元標的到目標部位(譬如所選定的細胞表面)。相較於沒有標的功能的治療藥物，利用本發明接合單元能夠加強或有利於效應元件(治療藥劑)在疾病部位的局部化(localization)。上述局部化是一種程度或相對的比例，而不是讓效應元件在疾病部位絕對或完全的局部化。
根據本發明，「效應元件(effector element)」一詞係指一旦接合單元到達目標部位後，所述接合單元中能夠發揮生物活性(譬如，誘發或壓抑免疫活性、發揮細胞毒性、抑制酵素活性及與其相似者)或其他功能活性(譬如招募免疫細胞或其他經半抗原標記的治療用分子)的部分。「效應」可指治療性或診斷性的效果。效應元件包含能夠和細胞和/或細胞外免疫調節因子結合的元件。上述效應元件包含如蛋白質、核酸、脂質、碳水化合物、醣蛋白、藥物部分(包含小分子藥與生物製劑)、化合物元素及同位素等物質，也包含上述物質的片段。
雖然在此處利用「第一」、「第二、「第三」等詞彙來描述多種元件、部件、區域和/或區段，這些元件(以及部件、區域和/或區段)不受上述修飾詞的限制。此外，除非上下文有明示的說明，使用這些序數並未隱含序列或順序。反之，這些詞彙僅是用來區分各元件。因此，亦可將下文所述的第一元件命名為第二元件，而不會悖離例示性實施方式所揭示的內容。
在此處，「連接(link)」、「耦接(couple)」以及「複合(conjugate)」等詞可互換使用，且都是用來指稱透過直接或間接的連接關係，將兩個元件連接在一起。
「多肽(polypeptide)」一詞在此係指具有至少兩個胺基酸殘基的聚合物。一般來說，多肽包含2到200個胺基酸殘基；在較佳的情形中，是2到50個殘基。在本說明書中所提及的胺基酸序列涵蓋了此種序列的L-、D-或β-胺基酸等形式。多肽亦包括胺基酸聚合物，其中有一或多個胺基酸殘基是與一天然胺基酸相應的人工化學類似物，當然也包括天然產生的胺基酸聚合物。此外，此一詞彙亦涵蓋以多肽鏈或其他方式連接的胺基酸，上述其他方式如經修飾的連接(modified linkage)，譬如以α-酯(α-ester)、β-酯(β-ester)、硫醯胺(thioamide)、磷醯胺(phosphoramide)、氨基甲酸酯(carbomate)、羥基酯(hydroxylate)鍵、以及與其相似者來取代多肽鍵。於本揭示內容中，「多肽藥物」或「胜肽類藥物」等詞應做廣義解釋，其涵蓋任何主要包含胺基酸殘基的治療性分子，譬如免疫球蛋白、抗體、抗體片段、酵素、生長因子、受體、細胞介素等等。
於一些實施方式中，本發明範圍亦涵蓋了其他相較於所述序列具有保守性置換的蛋白。於多種實施方式中，有一、二、三、四或五個不同的殘基經過置換。在此處，「保守性置換(conservative substitution)」一詞是指所述胺基酸置換不會明顯地改變分子活性(譬如生物或功能活性和/或專一性)。一般來說，保守性胺基酸置換是利用另一種具有相似化學性質(如電荷或疏水性)的胺基酸來取代某一胺基酸。某些保守性置換包括「類似物置換」，亦即以非標準(如罕見或合成等)胺基酸來取代標準胺基酸，而上述非標準胺基酸和被取代的原有胺基酸之間的差異極小。可由標準胺基酸經人工修飾而在不會大幅改變原有胺基酸結構的前提下，得到所述的胺基酸類似物，譬如異構物或代謝前驅物等皆屬之。於本揭示內容中，認為以下胺基酸殘基分屬四種獨特的胺基酸類別：(1)離胺酸，其側鏈帶有胺基；(2)半胱胺酸，其側鏈帶有硫醇基；(3)絲胺酸與蘇胺酸(threonine)，其側鏈帶有羥基；以及(4)天冬胺酸與麩胺酸，其側鏈帶有羧基。這四大類胺基酸的側鏈各自帶有獨特的官能基，可以用來和不同的化學成分複合。也可使用帶有此類官能基的非天然胺基酸，以達到類似目的。應注意到，天冬胺酸或麩胺酸的羧基可和一元件的胺基反應而形成醯胺鍵。此反應化學類似離胺酸殘基的胺基和帶有羧基之元件間的醯胺鍵形成反應。因此，可利用天冬胺酸或麩胺酸殘基來取代中心核中的離胺酸殘基，而第一元件則同樣可透過形成醯胺鍵的相同反應化學而與中心核連接。
於一些實施方式中，本案的範圍亦涵蓋和任何所述序列具有至少80%序列相似度的任何序列，上述序列相似度較佳為至少85%或90%、更佳為至少95%或98%。
此處針對多肽序列所述的「胺基酸序列相似度百分比(Percentage (%)amino acid sequence identity)」係指候選序列的胺基酸殘基與參考多肽序列的胺基酸殘基完全相同的百分比；於進行上述比對時，可將所述的候選多肽片段與所述的特定多肽片段並排，並於必要時引入間隙，以使二序列形成最高的序列相似度；在計算相似度時，保守性置換的胺基酸殘基視為不同的殘基。相關領域已有多種方法可用以進行上述並排，譬如可公開取得的軟體如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign (DNASTAR)等。本發明所屬技術領域中具有通常知識者在進行並排時，可選擇適當的參數與計算方式，以得到最佳的排列方式。在本說明書中，二多肽序列間的序列比較是採用美國國家生物科技資訊中心(Nation Center for Biotechnology Information，NCBI)所提供的蛋白質-蛋白質BLAST分析資料庫Blastp來進行。候選多肽序列A相較於參考多肽序列B的胺基酸序列相似度(在本說明書中亦稱之為多肽序列A與多肽序列B具有特定百分比(%)的胺基酸序列相似度)的計算方式如下：
Figure 02_image001
% 其中X是利用BLAST序列並排程式對序列A、B進行排列後所得到的相同胺基酸殘基數目(identical matches)，而Y是A、B二序列中較短者的胺基酸殘基總數。
「聚乙二醇化胺基酸(PEGylated amino acid)」一詞在此係指帶有一個胺基(amino group)與一個羧基(carboxyl group)的聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)鏈。一般來說，聚乙二醇化胺基酸的結構式為NH2 -(CH2 CH2 O)n -COOH。在本揭示內容中，n值介於1到20之間；較佳是介於2至12。
在此處一多肽的「端」係指位於該多肽N-端或C-端點的胺基酸殘基。在描述一聚合物(譬如此處所述的聚乙二醇)的組成單元時，「端」則是指在聚合物骨架末端的部分。在本說明書與申請專利範圍中，「自由端」一詞是用來指稱並未與另一個分子形成化學鍵結的末端胺基酸殘基或構成單元。
「治療(treatment)」一詞係指預防性(如，預防用藥)、療癒性或緩和性的處置，藉以達到所欲的藥學和/或生理學效果；而治療的行為在此包括上述預防性、療癒性或緩和性的處置。具體來說，治療在此係指對於可能患有一醫療疾患、症狀、疾病或與疾患相關的異常、或易於罹患一疾患的個體施用或投予本發明接合單元或包含此接合單元的藥學組合物，以期能部分地或完全地緩和、改善、減輕特定異常和/或病症的一或多種症狀或特徵，或是延緩其發生、阻礙其進展、減輕其嚴重性和/或減低發生率。亦可對尚未表出現疾病、異常和/或病症徵兆的個體和/或出現早期徵兆的個體進行治療，以期降低發展出與該疾病、異常和/或病症相關的病理變化的風險。
在此處，「有效量(effective amount)」一詞係指本發明接合單元的用量足以招致所欲的治療反應。藥劑的有效量不必然能夠治癒疾病或病症，但能夠延緩、阻礙或防止該疾病或病症的發生，或是可緩減與疾病或病症相關的病徵。可將治療有效量可分成一、二或更多劑，而以適當的劑型在指定期間內施用一次、二次或更多次。具體的治療有效量取決於多種因素，例如欲治療的特定狀況、個體的生理條件(如，個體體重、年齡或性別)、接受治療的個體類型、治療持續時間、併行治療(如果有的話)的本質以及所用的具體配方和化合物或其衍生物的結構。舉例來說，可將治療有效量表示成活性成分的總重量，譬如以克、毫克或微克來表示；或表示成活性成分重量相對於體重的比例，譬如表示為每公斤體重若干毫克(mg/kg)。
所述「施用(application)」與「投予(administration)」等詞在此可交替使用，其係指將本發明之接合單元或藥學組合物提供給需要治療的個體。
在此處，對於本揭示內容的K殘基而言，「連續」一詞係指兩個K殘基彼此相鄰，即，兩者間沒有其他胺基酸殘基。在本揭示內容某些實施例中，中心核中二相鄰的K殘基間以至少一個本揭示內容所述的填充物隔開，譬如，中心核中二相鄰的K殘基間可由GS、GGS或GSG隔開。
「個體(subject)」或「患者(patient)」等詞在此可交互使用，且是指可接受本揭示內容之接合單元、藥學組合物和/或方法處置的動物(包含人類)。除非另有指明，「個體」或「患者」一般包含雄性與雌性。「個體」或「患者」包含任何可因本揭示內容的處置而獲益的哺乳類動物。所述「個體」或「患者」的例示包含，但不限於：人類、大鼠、小鼠、天竺鼠、猴子、豬、山羊、牛、馬、狗、貓、鳥和禽類。在一實例中，所述患者為人類。所述哺乳類動物涵蓋哺乳動物綱的所有成員，包括人類、靈長類動物、家畜和農畜(如兔子、豬、綿羊和牛)、動物園動物或競賽用動物、寵物，以及齧齒類動物(如，小鼠和大鼠)。「非人類哺乳動物」一詞則涵蓋除了人類以外的所有哺乳動物綱成員。
白蛋白是血清中的主要單白，含量約為35-50 g/L。白蛋白可作為許多物質的運輸蛋白與積存區(depot)，包括某些脂肪酸、代謝物、藥物分子等。每一個白蛋白分子有至少七個囊袋(或疏水性空腔)，而脂肪酸鏈可緊緊***囊袋中。因此，透過與白蛋白結合能夠改變藥物的藥動學特性。已有數種經過長鏈脂肪酸修飾的藥物，使得這些藥物能和白蛋白以非共價的方式結合，進而延長其半衰期。
地特胰島素(insulin detemir)是一種商業銷售的胰島素，其帶有結合到離胺酸殘基(B鏈上的第29個胺基酸殘基)的胺基上的脂肪酸(即，肉豆蔻酸)鏈。利拉魯肽是一種GLP-1促效劑，其帶有與麩胺酸殘基結合的脂肪酸(棕櫚醯基)鏈，而上述麩胺酸殘基又結合到離胺酸殘基(第25個胺基酸殘基)的胺基；且原本位在第33個位點的離胺酸殘基則經突變為精胺酸。經修飾的胰島素與GLP-1受體促效劑可和白蛋白結合，因而可達到較長的作用藥動學。
使用白蛋白作為藥物的積存區可廣泛運用於多種藥物。對於許多既有的藥物與發展中的新藥物，若能拓展用於修飾藥物使其具有對白蛋白的結合親和力的方法，應或能夠開發出用於多種臨床適應症的新用途。
目前已將酶替代療法(enzyme replacement therapy)用於多種罕見遺傳疾病的治療。通常是用重組蛋白的方式來製造治療用酶。譬如，治療法布瑞氏症(Fabry's disease)用的半乳糖苷酶β與半乳糖苷酶α、治療賀勒氏症候群(Hurler–Scheie syndrome，亦稱為第一型黏多醣症(mucopolysaccharidosis type 1，MPS-I))用的拉羅尼酶(laronidase)；治療杭特氏症(Hunter's disease，亦稱為MPS-II)用的移黏寶酶(idursulphase)；治療龐貝氏症(Pompe's disease)用的阿葡糖苷酶α (alglucosidase α)；治療馬洛托-拉米氏症候群(Maroteaux–Lamy syndrome)用的加硫酶。目前都沒有此類治療用酶的長效版本，故需經常施用此類藥物。因為這些疾病的臨床症狀通常都較為嚴重，因此若能減低藥物施用次數，除了能夠幫助患者之外，也能減少使用此類藥物的支出。因此，此類藥物的半衰期亟待提升。
本揭示內容係基於一種創新的平台，其提供了一種彈性且便利的方式能夠建構脂肪酸束，所述脂肪酸束可與藥物(即，效應元件)複合，以改變(或在較佳的情形中，提升)效應元件的藥動學特性(如，血清半衰期)。本平台的優點在於可藉由調整中心核K殘基的數目而改變脂肪酸(與脂肪二酸；除非另有說明，在此處脂肪酸一詞涵蓋一元脂肪酸與二元脂肪酸)鏈的數目。再者，可經由改變中心核二K殘基間的填充物長度來改變二K殘基間的距離。當可想見，本接合單元所攜帶的脂肪酸鏈數目越多，接合單元就有較高的機率可和單一個HAS的多個囊袋或不同HAS的囊袋形成非共價結合。再者，二脂肪酸鏈間的距離可能會影響脂肪酸鏈與相同或不同HAS間的結合動能。
第I部分 用以治療特定疾病的多臂接合物
I-(i) 用於多臂接合物的多肽中心核
人類血液中含量最豐富的成分就是蛋白質，以下為一些常見的蛋白質及其在成年人血液中的含量：白蛋白(35-50 g/L)、免疫球蛋白G (IgG) (7-18 g/L)，IgA (0.8-6 g/L)、IgM (0.4-4 g/L)與纖維蛋白原(2-4.5 g/L)。已知這些蛋白質比起其他蛋白質有較長的半衰期。舉例來說，白蛋白的循環半衰期為19天，而IgG (IgG1、IgG2與IgG4)的半衰期超過20天。基於此種藥動學特性，這些蛋白質可作為藥物分子的過渡性港口或暫時接口，因而能夠延長其半衰期。
因此，本揭示內容的第一種態樣是關於一接合單元，其至少包含：(1)一中心核，其至少包含2-5個離胺酸(K)殘基；以及(2) 2-5個第一元件，分別連接到中心核的K殘基。此處提出的中心核特徵在於具有連接到其N-及/或C-端的一或二個複合基。根據本揭示內容的實施方式，複合基係用以有效地將功能性元件(如，效應元件)耦接到中心核，而每一該第一元件為脂肪酸(或二酸)，其對於白蛋白或對白蛋白、IgG、IgA或IgM專一的單鏈可變片段(single-chain variable fragment，scFv)具有結合親和力。本接合單元提出了延長功能性元件半衰期的方法，因此能夠改善其療效。
根據本揭示內容某些實施方式，該2至5個第一元件中的每一者為脂肪酸或二酸或其衍生物。於製備本接合單元時，第一元件係透過在脂肪酸(或二酸)的羧基與K殘基的胺基間形成醯胺鍵而連接到K殘基的ˊ側鏈。於某些實施方式中，所述脂肪酸或二酸經一化學實體修飾，故此種脂肪酸或二酸衍生物可透過該化學實體的官能基而連接到K殘基的側鏈胺基。舉例來說，根據本揭示內容某些實施方式，所述脂肪酸或二酸經麩胺酸修飾。
根據本揭示內容多種實施方式，第一元件為脂肪酸衍生物，其係衍生自：辛酸、壬酸、癸酸、十一酸、月桂酸、十三酸、肉豆蔻酸、十五酸、棕櫚酸、十七酸、硬脂酸、十九酸、花生酸、二十一酸、二十二酸、二十三酸、二十四酸、棕櫚油酸、油酸、亞麻油酸、蓖麻油酸或異檸檬酸、二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA)。根據本揭示內容某些實施方式，第一元件為二元脂肪酸衍生物，其係衍生自：1,8-辛二酸、1,7-庚二甲酸、1,10-癸二酸、十一烷二酸、十二烷二酸、十三烷二酸、十四烷二酸、十五烷二酸、十六烷二酸、十七烷二酸或十八烷二酸。於某些實施方式中，本第一元件係衍生自肉豆蔻酸或棕櫚酸。於其他實施方式中，本第一元件係衍生自十四烷二酸或十六烷二酸。
根據本揭示內容多個實施方式，中心核是長度為5-120個胺基酸殘基的多肽，且至少包含2至5個K殘基，其中每一個K殘基和其下一個K殘基(即，兩個連續K殘基)間彼此相鄰或以一填充物間隔開來。
當可想見，連接到中心核的第一元件數目主要取決於中心核中所含K殘基的數目。由於此處提出的中心核中有至少兩個K殘基，本接合單元可至少包含複數個第一元件。
由中心核所含的K殘基可知，填充物的胺基酸殘基可分別且獨立地選自以下組成的群組：甘胺酸(G)、絲胺酸(S)、精胺酸(R)、組胺酸(H)、蘇胺酸(T)、天冬醯胺酸(N)、麩醯胺酸(Q)、脯胺酸(P)、丙胺酸(A)、纈胺酸(V)、異白胺酸(I)、白胺酸(L)、甲硫胺酸(M)、苯基丙胺酸(F)、酪胺酸(Y)與色胺酸(W)殘基。
根據本揭示內容某些實施方式，填充物的胺基酸殘基可分別且獨立地選自以下組成的群組：G、S、R與H殘基。於替代性的實施方式中，填充物的胺基酸殘基分別為R或H殘基。
置於K殘基間的填充物可以是所述胺基酸殘基的變形，譬如可隨機排列其序列及/或改變程度。對於帶有K殘基較少的多肽鏈，可使用較長的填充物，而對於有較多K殘基者則可以使用較短的填充物。可在填充物中連同G、S而加入親水性的胺基酸殘基，譬如N、Q、R與H。除了由G與S殘基組成的填充物之外，可選用常見人類血清蛋白質如白蛋白與免疫球蛋白中有彈性、可溶性環片段作為替代性的填充物。
或者是，填充物可以是帶有2到12個EG重複單元的聚乙二醇化胺基酸。
一般來說，中心核中的多個填充物可以相同或不同。具體而言，每一該填充物可至少包含相同或不同的胺基酸殘基/EG重複單元。或者是，中心核的某些填充物可以是帶有3個EG重複單元的聚乙二醇化胺基酸，而中心核的其他填充物則可以是帶有5-7個EG重複單元的聚乙二醇化胺基酸。
除了填充物以外，本中心核至少更包含一或二個視需要而採用的末端間隔物，其具有一複合基之連接。所述末端間隔物至少包含(i)二或更多個胺基酸殘基，其係分別且獨立地選自K殘基以外的其他胺基酸殘基；或(ii)具有2至12個EG重複單元的聚乙二醇化胺基酸。根據本揭示內容多個實施方式，所述複合基結合到末端間隔物的α-胺基(即，位於末端間隔物N-端的胺基酸殘基/聚乙二醇化胺基酸的α-胺基)，或結合到末端間隔物的羧基(即，位於末端間隔物C-端的胺基酸殘基/聚乙二醇化胺基酸的羧基)。
根據本揭示內容一實施方式，所述中心核至少包含一個末端間隔物，其位於N-端K殘基的上游；於本實施方式中，所述複合基結合於末端間隔物的α-胺基。根據本揭示內容另一實施方式，所述中心核至少包含一個末端間隔物，其位於C-末端K殘基的下游；於本實施方式中，所述複合基結合於末端間隔物的羧基。根據本揭示內容又一實施方式，所述中心核至少包含兩個末端間隔物，其中一個末端間隔物設於N-端K殘基的上游且有連接於其α-胺基的第一複合基；而另一個末端間隔物設於C-末端K殘基的下游且有連接於其羧基的第二複合基。
所述複合基係選自由以下所組成的群組：疊氮基、吡啶甲基疊氮基、炔基、四嗪基、環辛烯基、環辛炔基、順丁烯二醯亞胺基、乙烯碸基、單碸基、甲磺醯苯并噻唑基、碘基與碘乙醯胺基。根據本揭示內容較佳實施例，所述複合基為疊氮基、吡啶甲基疊氮基、炔基、四嗪、環辛烯基或環辛炔基。當可理解，當中心核有兩個與之連接的複合基時，兩個複合基可以相同或不同。在較佳的情形中，兩個複合基不同；舉例來說，一個複合基可以是疊氮基、炔基或環辛炔基，而另一個複合基可以是四嗪基或環辛烯基。
一般來說，環辛烯基可以是降莰烯或TCO基；且環辛炔基可以是DBCO/DIBO、DIFO、BCN或DIBAC基。置於四嗪基，可以是1,2,3,4-四嗪、1,2,3,5-四嗪或1,2,4,5-四嗪或其衍生物。根據本揭示內容一實施方式，四嗪基為6-甲基-四嗪。
參照圖1A-1E，其中每一個中心核10a、10b、10c、10d與10e上連接有一複合基。在圖1A至1D中，一四嗪基、TCO基、疊氮基與炔基分別連接到中心核10a、10b、10c與10d之N-端間隔物的α-胺基。圖1E是另一種替代性的實施例，其中作為保護基團的乙醯(acetyl)基和多肽中心核10e的N-端間隔物的α-胺基鍵結，而作為複合基的DBCO基則和中心核10e之C-端間隔物的羧基鍵結。
於本揭示內容中某些實施方式，中心核至少包含兩個複合基。圖1F繪示了其中一例，其中四嗪基與DBCO基分別結合到多肽中心核10f的N-端間隔物的α-胺基以及C-端間隔物的羧基。圖1G為另外一例，其中TCO基與DBCO基分別結合到多肽中心核10g的N-端間隔物的α-胺基與C-端間隔物的羧基。在替代性的具體實施例中，多肽中心核10h的N-端間隔物的α-胺基與C-端間隔物的羧基分別與炔基以及DBCO基結合(圖1H)。
反應式1-3例示了接有一或兩個所述複合基的中心核的合成方式。
相較於使用常規胺基酸(譬如G與S殘基)做間隔物，使用聚乙二醇化胺基酸來合成多肽所涉及的步驟較少。此外，聚乙二醇化胺基酸可具有不同的長度(即，不同數目的EG重複單元)，對於中心核中相鄰的K殘基提供了較為理想的彈性與可溶性。除了聚乙二醇化胺基酸之外，亦可建構中心核使其帶有人工胺基酸，譬如D-型胺基酸、高胺基酸(homo-amino acid)、N-甲基胺基酸等。在較佳的情形中，使用帶有不同PEG長度的聚乙二醇化胺基酸來建構中心核，因為胺基酸分子中的PEG部分提供了構型上的彈性且可使複合基之間有適當的間隔、提升水溶性，此外，PEG分子的免疫源性通常較弱。含聚乙二醇化胺基酸之中心核的合成方式與常規多肽合成相似。
基於穩定性的目的，當中心核的N-端並未與複合部分結合時，該N-端較佳與一乙醯基鍵結。
於本揭示內容中，在各圖式中以x表示中心核的α-胺基和複合基間的反應或中心核的羧基和複合基間的反應。
Figure 107132980-A0304-0001
 ＜＜反應式1 N-端帶有四嗪基或TCO基之中心核的製備＞＞ ＜＜反應式2 C-端帶有DBCO基之中心核的製備＞＞
Figure 107132980-A0304-0002
Figure 107132980-A0304-0003
 ＜＜反應式3 N-端與C-端分別帶有複合基之中心核的製備＞＞
參照圖2A。如圖所示，接合單元20A至少包含一中心核20a，其帶有三個K殘基，彼此間以一填充物(圖中以點線標示)隔開。在第一個K殘基的上游有一個末端間隔物(圖中以～標示)，且有一四嗪基25連接於其α-胺基。於本實施例中，有三個第一元件21a-21c分別連接到K殘基。
根據本揭示內容另一實施方式，圖2B所示的接合單元至少包含兩個複合基。中心核20b至少包含四個K殘基。第一與第二末端間隔物分別位於中心核的N-端與C-端，其中DBCO基28連接於第一末端間隔物的α-胺基，而TCO基26則連接於第二末端間隔物的羧基。於本實施例中，K殘基分別連接有第一元件21a-21d。
或者是，第一元件可以是對白蛋白、IgG、IgA或IgM專一的scFv。於此種情形中，第一元件可透過連接臂而連接於中心核。具體而言，對於一端帶有NH2 -反應基(如，N-羥基琥珀醯亞胺(N-hydroxysuccinimidyl，NHS)基)而另一端帶有一官能基的PEG鏈，可透過PEG鏈的NH2 -反應基和K殘基的胺基間形成的醯胺鍵而連接到中心核的任一個K殘基。於本揭示內容中，將連接於K殘基的PEG鏈稱為連接臂，其自由端有一官能基。一般來說，上述官能基選自由以下所組成的群組：羥基、三級丁基二甲矽基(tert-Butyldimethylsilyl，TBDMS)、NHS、順丁烯二醯亞胺基、乙烯碸基(vinyl sulfone)、單碸基(mono-sulfone)、甲磺醯苯并噻唑基(methylsulfonyl benzothiazole)、碘基(iodo)、碘乙醯胺基(iodoacetamide)、疊氮基、吡啶甲基疊氮基、炔基、環辛炔基、四嗪基與環辛烯基。隨著所欲的目的不同，所述順丁烯二醯亞胺基可以是經取代的順丁烯二醯亞胺基，譬如，芳基順丁烯二醯亞胺基、3-溴順丁烯二醯亞胺基與3,4-二溴順丁烯二醯亞胺基。在較佳的情形中，當複合基為疊氮基、吡啶甲基疊氮基、炔基或環辛炔基時，功能基不是疊氮基、吡啶甲基疊氮基、炔基或環辛炔基的任一種。或者是，當中心核的複合基為四嗪基或環辛烯基時，官能基不是四嗪基也不是環辛烯基。
因此，帶有相應官能基的第一元件可以透過以下任一種化學反應而連接到連接臂的自由端： (1) 於其間形成醯胺鍵：在此種情形中，連接臂的自由端帶有NHS基，而第一元件則帶有胺基； (2) 於其間形成酯鍵：在此種情形中，連接臂的自由端帶有羥基或TBDMS基，而第一元件則帶有羥基-反應基(如，甲苯磺醯-O基); (3) 硫醇–順丁烯二醯亞胺基(或乙烯碸)反應：在此種情形中，連接臂的自由端帶有順丁烯二醯亞胺基、乙烯碸基、單碸基或甲磺醯苯并噻唑基，而第一元件則帶有硫醇基； (4) SN2反應：在此種情形中，連接臂的自由端帶有碘基或碘乙醯胺基，而第一元件則帶有硫醇基； (5) 銅催化的疊氮化物-炔羥環加成(CuAAC)反應：連接臂自由端與第一元件其中之一帶有疊氮基或吡啶甲基疊氮(picolyl azide)基，而另一個則帶有炔基；例示性的CuAAC反應如反應式4、5； (6) 逆電子需求狄爾斯-阿德(iEDDA)反應：連接臂自由端與第一元件其中之一帶有四嗪基，而另一個則帶有TCO或降莰烯基；例示性的iEDDA反應如反應式6、7；或 (7) 應力促進的疊氮化物-炔羥鏈接化學(SPAAC)：連接臂自由端與第一元件其中之一帶有疊氮基，而另一個則帶有環辛炔基；例示性的SPAAC反應如反應式8。 ＜＜反應式4 疊氮基與炔基間的CuAAC反應＞＞
Figure 02_image009
Figure 107132980-A0304-0004
 ＜＜反應式5 吡啶甲基疊氮基與炔基間的CuAAC反應＞＞ ＜＜反應式6 TCO與四嗪基間的iEDDA反應＞＞
Figure 02_image013
Figure 107132980-A0304-0005
 ＜＜反應式7 降莰烯與四嗪基間的iEDDA反應＞＞ ＜＜反應式8 疊氮基與DBCO基之間的SPAAC反應＞＞
Figure 02_image017
接著參照圖2C，所示的接合單元20C與接合單元20A的結構類似，不同之處在於有三個第一元件(23a、23b與23c)分別透過三個連接臂(22a、22b與22c)而連接於K殘基。
根據本揭示內容某些實施方式，所述中心核至少包含兩個複合基分別連接於中心核的N-端間隔物的α-胺基以及C-端間隔物的羧基。在這些實施方式中，其中一個複合基為疊氮基、吡啶甲基疊氮基、炔基或環辛炔基，而另一個複合基則為四嗪基或環辛烯基；在較佳的情形中，所述連接臂的官能基為羥基、TBDMS、NHS、順丁烯二醯亞胺基、乙烯碸基、單碸基、甲磺醯苯并噻唑基、碘基或碘乙醯胺基。
在較佳的情形中，所述連接臂為帶有2-20個EG重複單元的PEG鏈。或者是，連接臂為具有2-20個EG重複單元的PEG鏈，且其未與中心核連接的一端有一雙硫鍵。當可理解，可適用的連接臂不限於PEG鏈。亦可使用多肽鏈(譬如至少包含甘胺酸、絲胺酸與其他親水性胺基酸殘基者)以及多醣類，還有其他生物相容的線性高分子，這些材料都可以經過修飾而帶有適當的官能基(如，NHS、順丁烯二醯亞胺基、疊氮基、炔基、四嗪基或高應力炔基)。
當可想見，上文針對接合單元20A-20C或其他下述接合單元所討論的某些特徵亦適用於其他所述的接合單元，因此除非另有相反的說明，某些或全部的特徵亦適用於下列的實施例。為求簡潔，下文可能省略某些重複的特徵。
本接合單元可至少更包含一或兩個連接於複合基(如，疊氮基、吡啶甲基疊氮基、炔基、四嗪基、環辛烯基或環辛炔基)的功能性元件。具體而言，功能性元件可視需要地先與短的PEG鏈(較佳為帶有2-12個EG重複單元)複合，其後再連接到複合基。
根據本揭示內容某些實施方式，中心核至少包含一個複合基(即，疊氮基、吡啶甲基疊氮基、炔基、四嗪基、環辛烯基或環辛炔基)；且相對應地，帶有疊氮基-反應基(如，炔基或DBCO基)、炔基-反應基(如，疊氮基或吡啶甲基疊氮基)、四嗪-反應基(如，TCO基或降莰烯基)、環辛烯基-反應基(如，疊氮基)或環辛炔基-反應基(如，四嗪基)的功能性元件(即，第二元件)就可以透過CuAAC反應、iEDDA反應或SPAAC反應連接於中心核的複合基。
參照圖3A，其中接合單元30A的結構與接合單元20A類似，不同之處在於第二元件33連接於末端間隔物上的四嗪基。圖3A中的實心圓點27代表四嗪基與第二元件間因iEDDA反應而形成的化學鍵結。
根據本揭示內容其他實施方式，中心核至少包含兩個複合基。如上所述，當第一複合基為疊氮基、吡啶甲基疊氮基、炔基或環辛炔基時，第二複合基較佳為四嗪基或環辛烯基。因此，兩個功能性元件(即，第二與第三元件)可分別透過SPAAC與iEDDA反應、或透過CuAAC與iEDDA反應而連接至中心核。舉例來說，帶有環辛炔基-反應基(如，疊氮基)的第二元件可透過SPAAC反應而連接到第一複合基；而帶有炔基-反應基(如，疊氮基或吡啶甲基疊氮基)、四嗪基-反應基(如，TCO基或降莰烯基)或環辛烯基-反應基(如，四嗪基)的第三元件則可以透過CuAAC或iEDDA反應而連接到第二複合基。或者是，帶有四嗪基-反應基(如，TCO基或降莰烯基)或環辛烯基-反應基(如，四嗪基)的第二元件可透過iEDDA反應連接至第一複合基；而帶有疊氮基-反應基(如，炔基或DBCO基)、炔基-反應基(如，疊氮基或吡啶甲基疊氮基)或環辛炔基-反應基(如，疊氮基)的第三元則可透過CuAAC或SPAAC反應而連接至第二複合基。
圖3B為根據本揭示內容實施例的接合單元30B，其至少包含分別與第二、第三元件連接的兩個複合基。接合單元30B的結構和接合單元20B相似，不同之處在於第一元件第二元件33連接於DBCO基，而第三元件35則連接於TCO基。圖3B中的實心三角29代表DCO基與第二元件間因SPAAC反應而形成的化學鍵結；而圖3B中的實心圓點27則代表TCO基與第三元件間因iEDDA反應而形成的化學鍵結。
圖3C是此處提出的接合單元的另一種替代性實實施例。接合單元30C至少包含兩種功能性元件(即，第二與第三元件)，其中第二元件33與連接於中心核20a之N-端間隔物上的四嗪基接合，而第三元件35則與連接於中心核20a之C-端間隔物的疊氮基接合。圖3C中的實心圓點27代表四嗪基與第二元件間因iEDDA反應而形成的化學鍵結；而圖3C中的菱形代表疊氮與間因CuAAC反應而形成的化學鍵結。
隨著所欲的目的不同，與中心核的複合基連接的功能性元件可以是能夠在疾病或症狀治療中產生治療效益的任何分子。例示性的功能性元件包括但不限於：胰島素、似胰島素生長因子、似升糖素胜肽-1促效劑、體抑素與體抑素類似物、降鈣素、生長激素、紅血球生成素、促性腺素釋放激因子、顆粒性白血球群落刺激因子、腺苷去胺酶、天冬醯胺酸酶、干擾素-α、干擾素-β、TNF-α受體、IL-1受體、EGF受體、半乳糖苷酶β、半乳糖苷酶α、拉羅尼酶、移黏寶酶、阿葡糖苷酶α以及加硫酶，或其衍生物或變異物。
I-(ii) 多臂接合物的用途
本揭示內容亦揭示了利用適當的接合單元來治療各種疾病的方法。一般而言，所述方法至少包含對需要治療的個體投予有效量的本發明接合單元。
相較於既有的治療性構建體，第I部分所述的接合單元至少有以下三種優點： (1)可以視需求和/或用途來調整第一元件(即，脂肪酸或對白蛋白、IgG、IgA或IgM專一的scFv)的數目。根據不同用途的需求，本發明接合單元可包含一種功能性元件(即，第二元件)或兩種功能性元件(即，第二與第三元件)，上述需求包括欲治療的疾病、接合單元的給藥方法、接合單元所攜抗體的結合力與親和力等等。舉例來說，當要將接合單元直接投遞到特定組織/器官時，可以只使用作為效應元件的第二元件，而不需加入作為標的元件的第三元件。然而，當透過周邊給藥途徑來投遞接合單元時，譬如經口服、腸胃道、鼻腔、局部或黏膜給藥、或以肌肉內、靜脈內或腹膜內注射，所述接合單元就需要同時包含能夠將接合單元專一地標的到病灶部位標的元件、以及可在病灶部位發揮治療效果的效應元件。為了要提高接合單元的標的或治療效果或提升其穩定度，本發明接合單元還可進一步包含第三元件；所述的第三元件可以是第二種標的元件、第二種效應元件或PEG鏈。 (2)第一元件是以成束(bundle)的形式存在。如上文所述，第一元件(即，脂肪酸)的數目取決於中心核所包含的K殘基數目。由於中心核中的K殘基數目是2到5，故每一接合單元可帶有至少兩個第一元件，進而可有效地提升功能性元件(即，第二及/或第三元件)的半衰期與治療效果。 (3)可透過所述接合單元上的複合基將其和一功能性元件或另一分子構建體(如下文第II部分所述)連接。可利用商業方法合成此處提出的中心核。或者是，可利用反應式4-8提出的反應式而輕易地由合成多肽製得此處提出的中心核，其中以複合基(即，疊氮基、吡啶甲基疊氮基、炔基、四嗪基、環辛烯基或環辛炔基)取代了作為保護性基團來保護α-胺基的N-端9-芴甲氧羰基(9-fluorenylmethoxycarbonyl，Fmoc)。額外地或替代性地，上述複合基也可和多肽的羧基反應而與多肽連接。所製得的中心核至少包含一或兩個複合基，此複合基可用於將功能性元件(如，此處提出的第二及/或第三元件)連接到中心核，而不需額外的處理步驟。
第II部分 聯合接合物構型分子構建體及其治療特定疾病的用途
本揭示內容的另一態樣是關於包含至少兩個接合單元的分子構建體，其中一個接合單元帶有多個脂肪酸(即，脂肪酸束)，而另一個接合單元帶有多個效應元件(即，載藥束)。於本揭示內容中，此種至少包含二或更多個接合單元的分子構建體亦稱為聯合接合物分子構建體。根據本揭示內容多種實施方式，所述聯合接合物分子構建體至少包含兩個第I部分所述的接合單元。
II-(i) 聯合接合物構型之分子構建體的結構
根據本揭示內容某些實施方式，所述分子構建體至少包含兩個接合單元，且所述接合單元透過CuAAC、SPAAC或iEDDA反應而彼此連接。於某些實施方式中，第一接合單元至少包含(1)中心核、(2)分別連接於中心核K殘基的複數個第一元件，以及(3)結合於中心核N-或C-端的複合基，所述複合基選自由以下所組成的群組：疊氮基、吡啶甲基疊氮基、炔基、四嗪基、環辛烯基與環辛炔基。相似地，第二接合單元至少包含(1)中心核、(2)分別連接於中心核K殘基的複數個第二元件，以及(3)結合於中心核N-或C-端的複合基，所述複合基選自由以下所組成的群組：疊氮基、吡啶甲基疊氮基、炔基、四嗪基、環辛烯基與環辛炔基。第一與第二接合單元可透過複合基間的CuAAC反應、SPAAC反應或iEDDA反應而彼此連接。
根據某些實施方式，每一上述第一元件為脂肪酸或對白蛋白、IgG、IgA或IgM專一的scFv；且每一上述第二元件為能夠在疾病或症狀治療中產生治療效益的任何分子，譬如胰島素、似胰島素生長因子、似升糖素胜肽-1促效劑、體抑素與體抑素類似物、降鈣素、生長激素、紅血球生成素、促性腺素釋放激因子、顆粒性白血球群落刺激因子、腺苷去胺酶、天冬醯胺酸酶、干擾素-α、干擾素-β、TNF-α受體、IL-1受體、EGF受體、半乳糖苷酶β、半乳糖苷酶α、拉羅尼酶、移黏寶酶、阿葡糖苷酶α以及加硫酶，或其衍生物或變異物。對於僅帶有一個離胺酸殘基的多肽或較小的蛋白質，且所述離胺酸殘基對其生物活性並非關鍵時，此一離胺酸殘基的ε-胺基可用於和帶有胺基-反應基的異型雙功交聯物反應，譬如上述交聯物的一端為NHS而另一端為可供進行化學反應的官能基。由於許多蛋白有多個離胺酸殘基，且其半胱胺酸殘基經常成對地形成雙硫鍵，這類離胺酸與半胱胺酸殘基不適合接上可進行點擊化學反應的官能基。對於此類蛋白質，可將其表面上溶劑可達且非該蛋白生物活性必要的胺基酸殘基突變為半胱胺酸殘基。此一半胱胺酸殘基帶有的SH基可和帶有SH基-反應基的官能基之異型雙功交聯物反應，譬如上述交聯物的一端為順丁烯二醯亞胺而另一端為可供進行化學反應的官能基。
或者是，所述第一接合單元至少包含分別連接到其N-端與C-端的兩個複合基，其中一個複合基連接有功能性元件，而另一個複合基則為疊氮基、吡啶甲基疊氮基、炔基、四嗪基、環辛烯基或環辛炔基。
又或者是，第一與第二接合單元皆至少包含分別連接到其N-端與C-端的兩個複合基，其中一個複合基連接有功能性元件，而另一個複合基為疊氮基、吡啶甲基疊氮基、炔基、四嗪基、環辛烯基或環辛炔基。在此種情形中，第一與第二接合單元的功能性元件可以相同或不同。
II-(iii) 聯合接合物分子構建體的用途
本揭示內容亦揭示了利用適當的聯合接合物分子構建體來治療各種疾病的方法。一般而言，所述方法至少包含對需要治療的個體投予有效量的所述聯合接合物分子構建體。
實驗例
實驗例1：含疊氮基GLP-1促效劑的合成
人類活化升糖素胜肽-1 (GLP-1)是一種由胰高血糖素(proglucagon)肽(1-37)經處理後得到的胜肽荷爾蒙。人類GLP-1 (7-36)醯胺以及GLP-1 (7-37)兩者為截斷的等效生物活性形式。
於本實驗例中，製備含疊氮基GLP-1促效劑，其中疊氮基透過與麩胺酸殘基連接而接合於GLP-1促效劑分子(序列編號：1)。具體而言，將麩胺酸殘基的γ-羧基和GLP-1促效劑分子(序列編號：1)的離胺酸殘基的ε-胺基連接，並修飾麩胺酸殘基的α-胺基使其帶有疊氮乙醯基(如下所示)。
Figure 02_image019
含疊氮基GLP-1促效劑是由本案發明人設計並委由藥明康德新藥開發有限公司(上海，中國)製造。合成使用逐步芴甲氧羰(Fmoc)固態胜肽合成(solid phase peptide synthesis，SPSS)法，進行O-苯并***-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸鹽/N,N-二異丙基乙基胺/N,N-二甲基甲醯胺(O-Benzotriazole-N,N,N’,N’-tetramethyl-uronium-hexafluoro-phosphate/N,N-diiso-propylethylamine/ N,N-dimethylformamide，HBTU/DIEA/DMF)耦合化學，其中HBTU作為受Fmoc保護的胺基酸之原位活化試劑，而DIEA則作為耦合過程中的有機鹼。合成中使用經過Nα -Fmoc側鏈保護的胺基酸以及2-氯化氯三苯甲基(2-chlorotrityl chloride，CTC)樹脂。採用以下的側鏈保護策略：Arg (Pbf)、Trp (Boc)、Thr (OtBu)、Lys (N-Dde)、Tyr (OtBu)、Glu (OtBu)、Gln (Trt)、Ser (OtBu)、His (Trt)。在每一個耦合循環中，除了第一個循環之外，使用3 mmole的Nα -Fmoc-胺基酸、6 mmole的DIEA以及2.85 mmole當量的HBTU。以含20%哌啶的DMF溶液(三倍胜肽樹脂體積)來移除α-胺基上的Fmoc保護基。
在步驟(i)，胜肽合成一開始是將第一個胺基酸共價連接到樹脂上，使胺基酸Fmoc-Gly-OH (1.0 mmol，297.5 mg)與CTC樹脂(1.0 mmole，取代=1.0 mmole/g，1.0 g)溶解於二氯甲烷(dichloromethane，DCM)中，之後加入DIEA (4.0 mmole)並使所得的混合物在氮氣氣泡下反應膨脹。接著，將作為封端試劑(capping reagent)的甲醇(MeOH，1.0 mL)加入Fmoc-保護的胜肽樹脂並混合0.5小時，以使其與CTC樹脂上未反應的碳陽離子共價結合。
在步驟(ii)，排乾含甲醇的封端溶液，之後以DMF沖洗3次。在步驟(iii)，於沖洗樹脂後，加入含20%哌啶的DMF溶液反應30分鐘，以移除CTC樹脂上的Fmoc保護基。在步驟(iv)，排乾所得溶液並以DMF清洗5次。在步驟(v)，在氮氣氣泡下將Fmoc-Arg(Pbf)-OH (3當量)與活化劑(HBTU)加入樹脂上反應3小時，以進行第二個胺基酸的人工耦接。接著，重複步驟(ii)至(v)，每次根據胜肽序列而加入另一個胺基酸。對於每一個耦接循環步驟，以茚三酮(ninhydrin)試驗來監控耦接反應。
欲於CTC樹脂上切下側鏈受保護的胜肽時，製備40.0 mL的裂解緩衝液(5% TIS/5% H2 O/90% TFA)，並在攪拌下將其加入至含有樹脂的燒瓶中反應2小時。以冷的甲基三級丁酯(tert-butyl methyl ether)使粗胜肽析出並以6000 rpm離心3分鐘。以甲基三級丁酯再將粗胜肽沖洗兩次(共400.0 mL)並真空乾燥2小時。
利用Agilent SB-苯基製備型HT管柱(250 mm x 30 mm；7 μm)進行反相高效能液態層析(HPLC)來純化含疊氮基GLP-1促效劑，流動相使用乙腈與0.075%三氟乙酸，乙腈線性梯度為0%至60%乙腈、60分鐘，流速為20 mL/min、管柱溫度25°C。
利用反相分析級HPLC來分析純化的含疊氮基GLP-1促效劑樣本，使用Supelco C18管柱(250 mm X 4.6 mm；5 μm)，流動相使用乙腈與0.1%三氟乙酸，乙腈線性梯度為0%至100%、30分鐘，流速為1.0 ml/min、管柱溫度25°C。圖4A含疊氮基GLP-1促效劑的反相分析級HPLC圖譜，於OD254 下在滯留時間約23.153分鐘出現含疊氮基GLP-1促效劑的波峰。
利用MALDI-TOF質譜分析樣本。此處的質譜分析都是由中央研究院分子生物學研究中心(IMB)質譜核心設施(台北)進行分析，所用的設備為Bruker Autoflex III MALDI-TOF/TOF質譜(購自Bruker Daltonics，Bremen，德國)。
圖4B為所合成的含疊氮基GLP-1促效劑的質譜分析結果，由圖中可以看出此分子構建體的分子量約為3,595.037道耳頓。縮寫：Pbf，五甲基二氫苯并呋喃-5-磺醯氯(2,2,4,6,7-Pentamethyldihydrobenzofuran-5-sulfonyl chloride)；Boc，三級丁氧羰基(tert -butyloxycarbonyl)；tBu，三級丁基醚(tert -butyl ether)；Dde，1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代環己亞基)乙基(1-(4,4-dimethyl-2,6-dioxocyclohex-1-ylidene)ethyl)；Trt，三苯甲基(triphenylmethyl)；TIS，三異丙基矽烷(triisopropylsilane)；TFA，四氟乙酸(trifluoroacetic acid)。
實驗例2：經Aib取代之含疊氮基GLP-1促效劑的合成
於本實驗例中，製備含疊氮基且帶有一個ɛ-異丁胺酸(ɛ-aminoisobutyric acid，Aib)取代基的GLP-1促效劑(序列編號：2，如下所示)，其中以Aib殘基(一碼簡寫為U)取代了序列編號：1中第8個位置的丙胺酸殘基，使其較能抵抗二肽基肽酶IV (dipeptidyl peptidase IV，DPP 4)引發的降解。於本實驗例中，將麩胺酸殘基的γ-羧基和GLP-1促效劑分子(序列編號：2)之離胺酸殘基的ε-胺基連接，並修飾麩胺酸殘基的α-胺基使其帶有疊氮乙醯基(如下所示)。
Figure 02_image021
與實驗例1類似，所述的經Aib取代之含疊氮基GLP-1促效劑是由本案發明人設計並委由藥明康德新藥開發有限公司(上海，中國)製造。採用上文實驗所述的合成步驟。
利用反相分析級HPLC來分析純化的經Aib取代之含疊氮基GLP-1促效劑樣本，使用Supelco C18管柱(250 mm X 4.6 mm；5 μm)，流動相使用乙腈與0.1%三氟乙酸，乙腈線性梯度為0%至100%、30分鐘，流速為1.0 ml/min、管柱溫度25°C。利用MALDI-TOF質譜分析樣本(資料未示出)。
實驗例3：帶有可用於耦接反應的半胱胺酸殘基之體抑素類似物的合成
如下所示，設計帶有未成對半胱胺酸殘基的體抑素類似物(序列編號：3)，以供與多臂接合物之連接臂上的順丁烯二醯亞胺基耦接。所述體抑素類似物採用標準固態合成法合成，並委由浙江鴻拓生物技術有限公司(杭州，中國)生產。所製得的體抑素類似物純度高於95%。
利用質譜MALDI-TOF來鑑定所合成的胜肽。圖5顯示的質譜MALDI-TOF分析結果指出本分子構建體的分子量約為1,493.587道耳頓。
Figure 02_image023
實驗例4：耦接三個體抑素類似物的含DBCO多臂接合單元的合成
合成含DBCO多臂接合物的方法如下：在步驟(i)，將合成的胜肽2 (序列編號：4；上海強曜生物科技，上海，中國)溶解於100%無水DMSO中，最終濃度為10 mM。將胜肽與順丁烯二醯亞胺-PEG3 -DBCO以1/1的比例混合並於室溫下培育16小時，以使半胱胺酸殘基SH基和順丁烯二醯亞胺-PEG3 -DBCO (購自Conju-probe Inc.，聖地牙哥，美國)耦接，而使其帶有功能性的連接基團DBCO。
利用質譜MALDI-TOF來鑑定所合成含DBCO胜肽2 (如下所示)。
Figure 02_image025
在步驟(ii)，將所合成的含DBCO胜肽2溶解於100% DMSO中，最終濃度為10 mM。將含DBCO胜肽2與有機鹼DABCO以1/5的莫耳比混合於100% DMSO中。接著，將NHS-PEG12 -Mal交聯物加入含DBCO胜肽2溶液中，最終莫耳比為1/6 (含DBCO胜肽2：NHS-PEG12 -Mal)，於100%無水DMSO中。使反應混合物在室溫下反應一晚。
利用反相HPLC來分析耦接有三個PEG12 -Mal連接臂的含DBCO胜肽2 (如下所示)，使用Supelco C18管柱(250 mm X 10 mm；5 μm)，流動相使用乙腈與0.1%三氟乙酸，乙腈線性梯度為0%至100%、30分鐘，流速為3.0 ml/min、管柱溫度25°C。
Figure 02_image027
對所合成的耦接有三個PEG12 -Mal連接臂的含DBCO胜肽2進行質譜分析，結果顯示所述分子構建體的分子量約為4,480.89道耳頓。
在步驟(iii)，使實驗例3製得的體抑素類似物的硫醇基和耦接有三個PEG12 -Mal連接臂的含DBCO胜肽2反應。將體抑素類似物溶解於100% DMSO中，最終濃度為25 mM，並將耦接有三個連接臂的含DBCO胜肽2溶解於100% DMSO中，最終濃度為1 mM。將耦接有三個PEG12 -Mal連接臂的含DBCO胜肽2加入體抑素溶液中使其最終濃度為3.6 mM (對於1 Mm的含DBCO胜肽2多臂接合物溶液為3.6-倍莫耳過剩)。使反應混合物在室溫下反應一晚。
利用反相高效能HPLC (RP-HPLC)來純化耦接三個體抑素類似物的含DBCO多臂接合單元(下稱3-體抑素DBCO載藥束)，使用Supelco C18管柱(250 mm X 10 mm；5 μm)，流動相使用乙腈與0.1%三氟乙酸，乙腈線性梯度為0%至100%、30分鐘，流速為3.0 mL/min、管柱溫度25°C。3-體抑素DBCO載藥束的反相HPLC 洗提圖譜顯示在偵測OD254 紫外光吸收度時，洗脫峰的滯留時間約22.38分鐘，如圖6A所示。
Figure 107132980-A0304-0006
 圖6B為所合成的3-體抑素DBCO載藥束(如下所示)的質譜分析結果，由圖可知此分子構建體的分子量約為9,005道耳頓。
實驗例5：含疊氮基多臂接合單元的合成，其係以胜肽3為多肽中心核(序列編號：5)且連接臂與奧曲肽(序列編號：6)共價接合
於本實驗例中，利用標準Fmoc化學以人工合成來製備3-奧曲肽疊氮基-載藥束。載藥束是一個含疊氮基接合單元，其以胜肽3為多肽中心核(序列編號：5)並有三個連接臂，分別與一個奧曲肽(序列編號：6)共價連接。此一接合單元(3-奧曲肽疊氮基-載藥束)由本案發明人設計，並委由藥明康德新藥開發有限公司(上海，中國)。
所合成的分子，如下所示，係由與三個奧曲肽共價接合且帶有一個自由疊氮基的多臂接合單元所組成。利用質譜MALDI-TOF來鑑定樣本。
Figure 02_image031
實驗例6：脂肪酸束的合成，其係帶有兩個棕櫚醯鏈的含炔基接合單元
Figure 107132980-A0304-0007
 於本實驗例中，製備含炔基且帶有兩個棕櫚醯鏈的脂肪酸束(如下所示)。
多肽中心核(炔基-乙基-Xaa4 -K-Xaa4 -K-OMe，序列編號：7)帶有兩個K殘基，且在其N-端有炔丙醯基。在兩個K殘基間設有一間隔物，而炔基與第一個K殘基間有一N-端間隔物，這些間隔物都是帶有4個EG重複單元的聚乙二醇化胺基酸。兩條棕櫚醯鏈分別透過在棕櫚酸的羧基以及K殘基的胺基間形成醯胺鍵，而連接到多肽中心核的K殘基(如下所示)。此一新分子為炔基-EG4 -2FA-C16 (簡稱為炔基-2FA)係委由合成藥明康德新藥開發有限公司合成。
Figure 02_image035
在步驟(i)，胜肽合成一開始是將第一個胺基酸共價連接到樹脂上，使胺基酸Fmoc-Lys(Dde)-OH (6.0 mmol)與CTC樹脂(3.0 mmole)溶解於二氯甲烷(DCM)中，之後加入DIEA (12.0 mmole)並使所得的混合物在氮氣氣泡下反應膨脹2小時。
在步驟(ii)，排乾胜肽-樹脂混合物溶液，之後以DMF沖洗3次。在步驟(iii)，於沖洗樹脂後，加入含20%哌啶的DMF溶液反應30分鐘，以移除CTC樹脂上的Fmoc保護基。在步驟(iv)，排乾經處理的溶液並以DMF清洗5次。在步驟(v)，在氮氣氣泡下將Fmoc-PEG4 -OH (2當量)與活化劑(HBTU)加入樹脂上反應1小時，以進行第二個胺基酸的人工耦接。接著，重複步驟(ii)至(v)，每次根據胜肽序列而加入另一個胺基酸。將3%的N2 H4 /DMF溶液加入到胜肽樹脂溶液並反應20分鐘，以移除兩個離胺酸殘基上的Dde保護基。在最後的合成循環中，在氮氣氣泡下將棕櫚酸(1.0當量)與活化劑(HBTU)加到樹脂上反應約1小時。
欲於CTC樹脂上切下側鏈受保護的胜肽時，製備裂解緩衝液(95% TFA/2.5% TIPS/2.5% H2 O)，並在攪拌下將其加入至含有胜肽-樹脂溶液的燒瓶中在室溫下反應1小時。以冷的甲基三級丁酯使粗胜肽析出並以5000 rpm離心2分鐘。以甲基三級丁酯再將粗胜肽沖洗兩次並真空乾燥2小時。於製備C-端甲基酯時，將粗胜肽溶解於4N之HCl的MeOH溶液。使溶液反應約2小時並以液態層析質譜(LCMS)監控。在反應完成後，加入DIEA並將pH值調整為7.0以淬滅反應。將所得溶液真空乾燥。
以反相HPLC純化含炔基且帶有兩個棕櫚醯鏈的接合單元，使用Luna製備型C4管柱(250 mm x 25 mm；10 μm)，流動相使用乙腈與0.075%三氟乙酸，乙腈線性梯度為55%至90%、60分鐘，流速為20 mL/min、管柱溫度25°C。含炔基且帶有兩個脂肪酸鏈的接合單元的質譜分析結果如圖7所示，此分子構建體的分子量約為1,340.104道耳頓。縮寫：TIPS，三異丙基矽烷(triisopropylsilane)。
實驗例7：四種含炔基脂肪酸束的合成，其在多肽中心核的Lys殘基與脂肪酸鏈間有一額外的麩胺酸間隔基
於本實驗例中，製備另外四種含炔基脂肪酸束。
製備帶有兩個棕櫚醯鏈的脂肪酸束「炔基-EG4 -2E-2FA-C16」(如下所示)。多肽中心核(炔基-乙基-Xaa4 -K-Xaa4 -K-OMe，序列編號：7)有兩個K殘基，且在其N-端有炔基。在兩個K殘基之間以及在炔基與相鄰的K殘基之間的間隔物都是帶有4個EG重複單元的聚乙二醇化胺基酸。兩條棕櫚醯鏈分別與外加的麩胺酸間隔基形成兩個醯胺鍵而連接到多肽中心核的K殘基，其中一個醯胺鍵形成於麩胺酸的γ-羧基和K殘基的胺基間，另一個形成於麩胺酸殘基的α-胺基和棕櫚酸的羧基間。
Figure 02_image037
製備「炔基-EG4 -2E-2FA-C16-酸」脂肪酸束(如下所示)。多肽中心核(炔基-乙基-Xaa4 -K-Xaa4 -K-OMe，序列編號：7)帶有兩個K殘基，且在其N-端有炔基。在兩個K殘基之間以及在炔基與相鄰的K殘基之間的間隔物都是帶有4個EG重複單元的聚乙二醇化胺基酸。兩個帶有二酸基的棕櫚醯鏈(即，十六烷二酸或普塔酸)分別透過和外加的麩胺酸間隔基形成兩個醯胺鍵而連接到多肽中心核的K殘基，其中一個醯胺鍵形成於麩胺酸的γ-羧基和K殘基的胺基間，另一個形成於麩胺酸殘基的α-胺基和十六烷二酸的其中一個羧基間。
Figure 02_image039
製備「炔基-EG2 -2E-2FA-C16-酸」脂肪酸束(如下所示)。多肽中心核(炔基-乙基-Xaa2 -K-Xaa2 -K-OMe，序列編號：8)帶有兩個K殘基，且在其N-端有炔基。在兩個K殘基之間以及在炔基與相鄰的K殘基之間的間隔物都是帶有2個EG重複單元的聚乙二醇化胺基酸。兩個帶有二酸基的棕櫚醯鏈分別透過和外加的麩胺酸間隔基形成兩個醯胺鍵而連接到多肽中心核的K殘基，其中一個醯胺鍵形成於麩胺酸的γ-羧基和K殘基的胺基間，另一個形成於麩胺酸殘基的α-胺基和十六烷二酸的其中一個羧基間。
Figure 02_image041
製備「炔基-EG2 -2E-2FA-C18-酸」脂肪酸束(如下所示)。多肽中心核(炔基-乙基-Xaa2 -K-Xaa2 -K-OMe，序列編號：8)帶有兩個K殘基，且在其N-端有炔基。在兩個K殘基之間以及在炔基與相鄰的K殘基之間的間隔物都是帶有2個EG重複單元的聚乙二醇化胺基酸。兩個帶有二酸基的硬脂醯鏈鏈(即，十八烷二酸)分別透過和外加的麩胺酸間隔基形成兩個醯胺鍵而連接到多肽中心核的K殘基，其中一個醯胺鍵形成於麩胺酸的γ-羧基和K殘基的胺基間，另一個形成於麩胺酸殘基的α-胺基和十八烷二酸的其中一個羧基間。
Figure 02_image043
與實驗例6類似，此處四種脂肪酸束分子，即，炔基-EG4 -2E-2FA-C16、炔基-EG4 -2E-2FA-C16-酸、炔基-EG2 -2E-2FA-C16-酸與炔基-EG2 -2E-2FA-C18-酸皆委由藥明康德新藥開發有限公司製備。
實驗例8：由一個GLP-1促效劑與兩條脂肪酸鏈組成的分子構建體(GLP-1-Ala8 -EG4 -2FA-C16促效劑)的合成
於本實驗例中，使來自實驗例1的含疊氮基GLP-1促效劑和來自實驗例6的帶有兩條棕櫚醯鏈的含炔基接合單元透過疊氮基與炔基間的CuAAC反應耦接而得到如下所示的「GLP-1-Ala8 -EG4 -2FA-C16促效劑」(簡稱GLP-1-2FA促效劑)。
上述合成委由藥明康德新藥開發有限公司進行。簡言之，將來自實驗例1的含疊氮基GLP-1促效劑(850.0 mg，236.4 umol，1.0當量)與來自實驗例6的帶有兩條棕櫚醯鏈的含炔基接合單元(158.4 mg，118.2 μmol，0.5當量)混合於於DMSO (30.0 Ml)中，以氮氣去除氣體3次，加入CuI (22.5 mg，118.2 μmol，0.5當量)以及DIEA (61.1 mg，472.8 μmol，82.4 μL，2.0當量)，並於氮氣環境中將混合物在25°C下攪拌1小時。以液態層析質譜分析(LC-MS)確認反應完全。
Figure 02_image045
以反相HPLC純化GLP-1-2FA促效劑，使用串聯的Luna C18管柱(200 mm x 25 mm；10 μm)與Gemini C18管柱(150 mm x 30 mm；5 μm)，流動相使用乙腈與0.075%三氟乙酸，乙腈線性梯度為40%至70%、60分鐘，流速為20 mL/min、管柱溫度25°C。將產物凍乾以得到白色固態最終產物(33.2 mg，產率2.85%)。
圖8A為純化GLP-1-2FA促效劑的反相HPLC洗提圖譜，觀察OD 215 nm時，GLP-1-2FA促效劑波峰出現的滯留時間約為11.037分鐘。對所合成的GLP-1-Ala8 -EG4 -2FA-C16促效劑進行質譜分析，圖8B的分析結果顯示GLP-1-Ala8 -EG4 -2FA-C16促效劑分子構建體的分子量約為4,937道耳頓。
實驗例9：由一個GLP-1促效劑與兩條棕櫚醯鏈以及額外麩胺酸間隔基組成的分子構建體(GLP-1-Ala8 -EG4 -2E-2FA-C16促效劑)的合成
於本實驗例中，使來自實驗例1的含疊氮基GLP-1促效劑和來自實驗例7的一個含炔基脂肪酸束(炔基-EG4 -2E-2FA-C16)透過疊氮基與炔基間的CuAAC反應耦接而得到如下所示的「GLP-1-Ala8 -EG4 -2E-2FA-C16促效劑」。
Figure 02_image047
與實驗例8類似，所述合成委由藥明康德新藥開發有限公司進行。
圖9A為純化GLP-1-Ala8 -EG4 -2E-2FA-C16促效劑的反相HPLC洗提圖譜，觀察OD 215 nm時，GLP-1-Ala8 -EG4 -2E-2FA-C16促效劑波峰出現的滯留時間約為34.53分鐘，波峰如圖中箭頭所示。
對所合成的GLP-1-EG4 -2E-2FA-C16促效劑進行質譜分析，圖9B的分析結果顯示GLP-1-EG4 -2E-2FA-C16促效劑分子構建體的分子量約為5,194道耳頓。
實驗例10：由一個經Aib取代之GLP-1促效劑與兩條棕櫚醯鏈以及額外麩胺酸間隔基組成的分子構建體(GLP-1-Aib8 -EG4 -2E-2FA-C16促效劑)的合成
於本實驗例中，使來自實驗例2的經Aib取代之含疊氮基GLP-1促效劑和來自實驗例7的一個含炔基脂肪酸束(炔基-EG4 -2E-2FA-C16)透過疊氮基與炔基間的CuAAC反應耦接而得到如下所示的「GLP-1-Aib8 -EG4 -2E-2FA-C16促效劑」。
Figure 02_image049
與實驗例8類似，所述合成委由藥明康德新藥開發有限公司進行。
圖10A為純化GLP-1-Aib8 -EG4 -2E-2FA-C16促效劑的反相HPLC洗提圖譜，觀察OD 215 nm時，GLP-1-Aib8 -EG4 -2E-2FA-C16促效劑波峰出現的滯留時間約為34.635分鐘，波峰如圖中箭頭所示。
對所合成的GLP-1-Aib8 -EG4 -2E-2FA-C16促效劑進行質譜分析，圖10B的分析結果顯示GLP-1-Aib8 -EG4 -2E-2FA-C16促效劑分子構建體的分子量約為5,208道耳頓。
實驗例11：由一個經Aib取代之GLP-1促效劑與兩條棕櫚醯二酸鏈以及額外麩胺酸間隔基組成的分子構建體(GLP-1-Aib8 -EG4 -2E-2FA-C16酸促效劑)的合成
於本實驗例中，使來自實驗例2的經Aib取代之含疊氮基GLP-1促效劑和來自實驗例7的一個含炔基脂肪酸束(炔基-EG4 -2E-2FA-C16酸)透過疊氮基與炔基間的CuAAC反應耦接而得到如下所示的「GLP-1-Aib8 -EG4 -2E-2FA-C16酸促效劑」。
Figure 02_image051
與實驗例8類似，所述合成委由藥明康德新藥開發有限公司進行。
圖11A為純化GLP-1-Aib8 -EG4 -2E-2FA-C16酸促效劑的反相HPLC洗提圖譜，觀察OD 215 nm時，GLP-1-Aib8 -EG4 -2E-2FA-C16酸促效劑波峰出現的滯留時間約為25.988分鐘，波峰如圖中箭頭所示。
對所合成的GLP-1-Aib8 -EG4 -2E-2FA-C16酸促效劑進行質譜分析，圖11B的分析結果顯示GLP-1-Aib8 -EG4 -2E-2FA-C16酸促效劑分子構建體的分子量約為5,267道耳頓。
實驗例12：由一個經Aib取代之GLP-1促效劑與兩條棕櫚醯二酸鏈以及額外麩胺酸間隔基組成的分子構建體(GLP-1-Aib8 -EG2 -2E-2FA-C16酸促效劑)的合成
於本實驗例中，使來自實驗例2的經Aib取代之含疊氮基GLP-1促效劑和來自實驗例7的一個含炔基脂肪酸束(炔基-EG2 -2E-2FA-C16酸)透過疊氮基與炔基間的CuAAC反應耦接而得到如下所示的「GLP-1-Aib8 -EG2 -2E-2FA-C16酸促效劑」。
與實驗例8類似，所述合成委由藥明康德新藥開發有限公司進行。
圖12A為純化GLP-1-Aib8 -EG2 -2E-2FA-C16酸促效劑的反相HPLC洗提圖譜，觀察OD 215 nm時，GLP-1-Aib8 -EG2 -2E-2FA-C16酸促效劑波峰出現的滯留時間約為26.0分鐘，波峰如圖中箭頭所示。
對所合成的GLP-1-Aib8 -EG2 -2E-2FA-C16酸促效劑進行質譜分析，圖12B的分析結果顯示GLP-1-Aib8 -EG2 -2E-2FA-C16酸促效劑分子構建體的分子量約為5,091道耳頓。
Figure 02_image053
實驗例13：由一個經Aib取代之GLP-1促效劑與兩條硬脂醯二酸鏈以及額外麩胺酸間隔基組成的分子構建體(GLP-1-Aib8 -EG2 -2E-2FA-C18酸促效劑)的合成
於本實驗例中，使來自實驗例2的經Aib取代之含疊氮基GLP-1促效劑和來自實驗例7的一個含炔基脂肪酸束(炔基-EG2 -2E-2FA-C18酸)透過疊氮基與炔基間的CuAAC反應耦接而得到如下所示的「GLP-1-Aib8 -EG2 -2E-2FA-C18酸促效劑」。
與實驗例8類似，所述合成委由藥明康德新藥開發有限公司進行。
圖13A為純化GLP-1-Aib8 -EG2 -2E-2FA-C18酸促效劑的反相HPLC洗提圖譜，觀察OD 215 nm時，GLP-1-Aib8 -EG2 -2E-2FA-C18酸促效劑波峰出現的滯留時間約為27.815分鐘，波峰如圖中箭頭所示。
對所合成的GLP-1-Aib8 -EG2 -2E-2FA-C18酸促效劑進行質譜分析，圖13B的分析結果顯示GLP-1-Aib8 -EG2 -2E-2FA-C18酸促效劑分子構建體的分子量約為5,148道耳頓。
Figure 02_image055
實驗例14：由耦接有三個奧曲肽的多臂接合單元和二條脂肪酸鏈組成的分子構建體的合成
於本實驗例中，使來自實驗例5的耦接有三個奧曲肽的含疊氮基多臂接合單元和來自實驗例7的一個含炔基脂肪酸束(炔基-EG4 -2E-2FA-C16)透過疊氮基與炔基間的CuAAC反應耦接而得到如下所示的耦接有三個奧曲肽的多臂接合單元和二條脂肪酸鏈組成的分子構建體。
Figure 107132980-A0304-0008
本分子構建體的合成步驟與上文參照實驗例8所述的步驟類似。簡言之，將來自實驗例5的耦接有三個奧曲肽的含疊氮基多臂接合單元(1.0當量)與來自實驗例7的帶有兩條棕櫚醯鏈的含炔基接合單元(炔基-EG4 -2E-2FA-C16；0.5當量)混合於於DMSO (30.0 Ml)中，以氮氣去除氣體3次，加入CuI (0.5當量)以及DIEA (2.0當量)，並於氮氣環境中將混合物在25°C下攪拌1小時。以液態層析質譜分析(LC-MS)確認反應完全。
如下所示，所合成的分子是由耦接有三個奧曲肽的多臂接合單元和二條脂肪酸鏈所組成。
Figure 02_image059
實驗例15：GLP-1-EG4 -2FA-C16促效劑對GLP-1受體的結合分析
於本實驗例中，利用ELISA分析來探究GLP-1-Ala8 -EG4 -2FA-C16促效劑(簡稱為GLP-1-2FA)對GLP-1受體的結合能力。
簡言之，在96孔微量多孔盤上塗覆重組人類GLP-1R-IgG.Fc融合蛋白(GLP-1R) (購自圖爾斯生物科技股份有限公司，台北)，濃度為10 μg/ml、每孔50 μl。在沖洗掉多餘的重組GLP-1受體蛋白之後，以1% BSA的PBS溶液(pH7.4，含0.1% NaN3 )將各孔阻斷1小時，之後在每孔加入50 μl不同濃度(1 μg/ml或10 μg/ml)的以下成分：GLP-1-EG4 -2FA-C16促效劑、帶有兩條棕櫚醯鏈的含炔基接合單元(炔基-EG4 -2FA-C16，以下簡稱炔基-2FA)、含疊氮基GLP-1促效劑(GLP-1-疊氮基)以及利拉魯肽(VICTOZA®，台灣大學基因體暨蛋白體醫學研究所張以承博士贈送)。以PBS沖洗後，加入最終濃度2 μg/ml的小鼠單株抗體IgG抗-hGLP-1 (購自Abcam，Bristol，UK)，並於37o C下培育1小時。以PBS (pH7.4)清洗後，採用以下步驟偵測與hGLP-1結合的抗體：加入1:10,000的HRP-複合山羊抗小鼠IgG(H+L) (購自Jackson ImmunoResearch)，於37o C下培育30分鐘，接著和TMB基質(購自Clinical Science Products，Mansfield，USA)一起培育。加入50 μl的1 M HCl使反應停止。以盤式分析儀測定450 nm的吸光度。每一長條代表二重複樣本的平均OD450 值。實現結果顯示，GLP-1-2FA促效劑能夠專一地結合到重組GLP-1受體(參見圖14)。P1-P2胜肽為人類膜結合IgE的CεmX結構域片段，在此處作為陰性對照組。
實驗例16：GLP-1-Ala8 -EG4 -2FA-C16促效劑對人類血清白蛋白(HSA)的結合分析
於本實驗例中，利用ELISA分析來探究GLP-1-Ala8 -EG4 -2FA-C16促效劑(簡稱為GLP-1-2FA)對HSA的結合能力。
簡言之，在96孔微量多孔盤上塗覆HSA蛋白，濃度為10 μg/ml、每孔50 μl、於1 x PBS中、pH7.4，並置於37o C下1小時。接著以1%酪蛋白的PBS溶液(pH7.4，含0.1% NaN3 )將各孔阻斷1小時，之後最終濃度為1 μg/ml或10 μg/ml的以下成分並於37o C下培育1小時：含疊氮基GLP-1促效劑(GLP-1-疊氮基)、炔基-EG4 -2FA-C16 (炔基-2FA)、利拉魯肽或GLP-1-2FA促效劑。以PBS (pH7.4)沖洗後，加入最終濃度10 μg/ml的小鼠單株抗體IgG抗-hGLP-1 (購自Abcam)，並於37o C下培育1小時。以PBS (pH7.4)清洗後，採用以下步驟偵測與hGLP-1結合的抗體：加入1:10,000的HRP-複合山羊抗小鼠IgG(H+L) (購自Jackson ImmunoResearch)，於37o C下培育30分鐘，接著和TMB基質(購自Clinical Science Products，Mansfield，USA)一起培育。加入50 μl的1 M HCl使反應停止。以盤式分析儀測定450 nm的吸光度。每一長條代表二重複樣本的平均OD450 值。實現結果顯示，比起利拉魯肽，GLP-1-2FA對HAS有更高的結合活性(參見圖15)。GLP-1-疊氮基、炔基-2FA以及二級抗體在此處作為陰性對照組。
實驗例17：利用透析平衡分析探討GLP-1-Ala8 -EG4 -2FA-C16促效劑對HSA的白蛋白結合力
為了進一步探究GLP-1-Ala8 -EG4 -2FA-C16促效劑(GLP-1-2FA)在水溶液中對HAS的結合能力，進行透析平衡分析，使用Float-A-Lyzer G2 Dialysis Device CE (購自Spectrum Europe B.V.，Breda，Netherlands)，其含有150 μM的0.2 ml HAS培育溶液並添加30 μM的利拉魯肽或GLP-1-2FA促效劑。透析袋直徑5 mm、內部體積1 ml，且分子量截斷值約20 kDa，因此，利拉魯肽(分子量約3,751.2道耳頓)或GLP-1-2FA促效劑(分子量約4,937道耳頓)可自由進出透析袋。將透析裝置放置於裝填了4 ml緩衝培育溶液的腔室中，並在震盪器上於室溫下放置一夜。將十分之一的培育溶液和透析前對照(pre-dialysis control)載入經修飾的三(羥甲基)甲基甘胺酸(tricine) SDS-PAGE上。以考瑪式藍(Coomassie-blue)染色來觀察平衡時與HAS結合的GLP-1-2FA促效劑或利拉魯肽，以比較GLP-1-2FA促效劑對HAS以及利拉魯肽對HAS的相對結合能力。
試驗結果顯示，在水溶液中，GLP-1-2FA促效劑比起利拉魯肽對HAS有更好的結合能力(圖16A)。箭頭#1為與HAS結合的利拉魯肽；箭頭#2為與HAS結合的GLP-1-2FA促效劑；箭頭#3為HSA。圖16B的SDS-PAGE圖顯示在平衡時，與HAS結合的GLP-1-2FA促效劑或利拉魯肽的百分比。資料表示為三重複樣本的平均值±SEM。
實驗例18：類似物於大鼠INS-1細胞中對GLP-1R介導的cAMP產生的功能性分析
已知當攝入食物時，小腸會釋放腸促胰液素，而β細胞會隨之產生環狀AMP (cyclic AMP，cAMP)。荷爾蒙胜肽GLP-1會透過活化特定G蛋白耦合蛋白受體(即，GLP-1受體)而增加cAMP含量，進而刺激會回應G蛋白的穿膜腺苷酸環化酶(transmembrane adenylyl cyclases)家族中的蛋白。
於本實驗例中，為了評估所製備的GLP-1類似物對β細胞上GLP-1受體的功能活性，於INS-1細胞中進行cAMP分析。
使用商用套組cAMP ELISA Kit (購自Cayman Chemicals，Ann Arbor，USA)並根據製造商的說明來測量五種GLP-1類似物誘導的細胞內cAMP改變，所用的GLP-1類似物包括：GLP-1-Ala8 -EG4 -2E-2FA-C16、GLP-1-Aib8 -EG4 -2E-2FA-C16、GLP-1-Aib8 -EG4 -2E-2FA-C16酸、GLP-1-Aib8 -EG2 -2E-2FA-C16酸以及GLP-1-Aib8 -EG2 -2E-2FA-C18酸促效劑。簡言之，在第一天，將2x105 個INS-1細胞連同500 μL/孔的培養基播於24孔盤的每一孔中(ThermoFisher Scientific，Waltham，USA)。在第三天，加入100 nM的GLP-1類似物與2.5 mM葡萄糖，並於37o C下培育20分鐘。以100 nM的利拉魯肽作為cAMP產生的陽性對照組，將其加入對照孔中並同樣於37o C下培育20分鐘。低濃度葡萄糖(2.5 mM)為陰性對照組，而高濃度葡萄糖(16mM)則用作葡萄糖誘導之cAMP產生的對照組。在經過20分鐘培育之後，抽出培養基，並將200 μL的0.1N HCl加入每一孔中。利用細胞刮板刮除表面的細胞，並1,000x g在4o C下離心10分鐘。將上清液轉移到新的試管中並在96孔盤中進行後續試驗。利用SpectraMax M2微量分析儀(購自Molecular devices，San Jose，USA)在420 nm下測量細胞中cAMP含量。
圖17為INS-1細胞與五種GLP-1類似物(即，GLP-1-Ala8 -EG4 -2E-2FA-C16 (簡稱為Ala8 -EG4 -C16)、GLP-1-Aib8 -EG4 -2E-2FA-C16 (簡稱為Aib8 -EG4 -C16)、GLP-1-Aib8 -EG4 -2E-2FA-C16酸(簡稱為Aib8 -EG4 -C16酸)、GLP-1-Aib8 -EG2 -2E-2FA-C16酸(簡稱為Aib8 -EG2 -C16酸)以及GLP-1-Aib8 -EG2 -2E-2FA-C18酸(簡稱為Aib8 -EG2 -C18酸)促效劑)共同培養後的cAMP測量結果。實驗結果顯示，在所觀測的時間點(20分鐘)，於INS-1細胞中加入這些合成的GLP-1類似物與利拉魯肽，都能引發預期的細胞cAMP含量升高。
實驗例19：利用西方墨點分析偵測INS-1細胞中經活化半胱天冬酶-3的表現
經裂解的半胱天冬酶-3是細胞凋亡過程中的關鍵成分。於本實驗例中，利用西方墨點分析來偵測半胱天冬酶-3的表現。
在多孔盤中培養將經GLP-1類似物處理的INS-1細胞以及葡萄糖、500 μL培養基。進行免疫墨點分析時，利用SDS-PAGE將蛋白質分離，之後將其轉移到聚二氟亞乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜上。以抗半胱天冬酶-3抗體(購自Cell Signaling Technology，Danvers，USA)處理膜，接著再以山葵過氧化酶(HRP)-複合二級抗體(購自Epitomics，Burlingame，USA)處理。利用強化的化學冷光系統(購自GE Healthcare Life Sciences，Buckinghamshire，USA)使膜呈色。以β-肌動蛋白的表現量將蛋白表現量標準化。
經GLP-1類似物處理後的半胱天冬酶-3表現量摘要整理於圖18A。圖18B為在經過GLP-1類似物處理後，INS-1細胞上半胱天冬酶-3表現量降低的程度。圖18A與18B的結果顯示，某些GLP-1類似物(包括GLP-1-Aib8 -EG4 -2E-2FA-C16 (Aib8 -EG4 -C16)與GLP-1-Ala8 -EG4 -2E-2FA-C16 (Ala8 -EG4 -C16))，能夠有效降低上半胱天冬酶-3在INS-1細胞上的表現量。
實驗例20：利用阿爾瑪藍分析探討INS-1 細胞的存活率
將培養的INS-1細胞以2x104 個細胞/孔的密度播於96孔盤中，使用含10％胎牛血清的培養基。48小時後，再將細胞培養24小時以進行血清飢餓。當細胞處於同步狀態(synchronization state)時，將細胞培養於含30 mM葡萄糖的培養基中，並以100 nM的GLP-1類似物或利拉魯肽處理。以培養於正常培養基中的細胞作為對照組。在培養24、48與72小時後，利用商用套組Alamar Blue cell viability reagent kit (購自Invitrogen)依製造商的建議測定細胞活率。
細胞增殖率(參見圖19)係指相較於0小時，在多個時點的細胞存活率。結果顯示，相較於利拉魯肽，某些GLP-1類似物(包括GLP-1-Aib8 -EG4 -2E-2FA-C16酸(Aib8 -EG4 -C16酸)、GLP-1-Aib8 -EG4 -2E-2FA-C16 (Aib8 -EG4 -C16)與GLP-1-Ala8 -EG4 -2E-2FA-C16 (Ala8 -EG4 -C16))可顯著提升細胞存活率。
實驗例21：對第二型糖尿病db/db小鼠進行活體內分析以探討GLP-1類似物對降低血糖的效果
8週大BKS.Cg-+Leprdb /+Leprdb / (db/db)小鼠係購自財團法人國家實驗研究院國家實驗動物中心(台灣)。在實驗過程中，於受控制的大氣環境下每籠飼養四隻，動物可自由取用引用水與食物。
於初步測試經GLP-1類似物處理的db/db小鼠之血糖值時，先進行前測試。將小鼠分為三隻一組，分別給予每公斤體重100 nmole的樣本。對小鼠進行單次的皮下注射，以投予GLP-1類似物、利拉魯肽或媒劑(PBS)。
隅測定血糖值時，由尾部靜脈採集血液，並立刻以商用酵素電極ACCU-CHEK Active (購自Roche，Germany)測量血糖。初步分析的結果顯示，相較於投予利拉魯肽的組別，某些GLP-1類似物可在96小時的時間中顯著降低經GLP-1類似物處理之db/db小鼠體內的血糖值。
當可理解，上文的具體實驗例僅為例示，且本發明所屬技術領域中具有通常知識者可對其進行各種修飾。以上的說明書、實驗例與數揭示成了本發明之例示性實驗例的結構與應用。雖然上文以特定的方式或參照一或多個別實驗例描述了本案的多種實施方式，本發明所屬技術領域中具有通常知識者可在不悖離本發明之原理與精神的情形下，對其進行各種更動與修飾。
主要元件符號如下： 20a‧‧‧中心核 21‧‧‧第一元件 27‧‧‧iEDDA反應 30A‧‧‧接合單元 33‧‧‧第二元件
為讓本發明的上述與其他目的、特徵、優點與實施例能更明顯易懂，所附圖式之說明如下：
圖1A至1H為根據本揭示內容某些實施方式的中心核示意圖。
圖2A至2C為根據本揭示內容某些實施方式的接合單元示意圖。
圖3A至3C為根據本揭示內容某些實施方式的T-E接合單元示意圖。
圖4A與4B分別為根據本揭示內容一實驗例，含疊氮基GLP-1促效劑的反相分析HPLC圖譜與MALDI-TOF分析結果。
圖5為根據本揭示內容一實驗例，帶有兩個棕櫚醯鏈(palmitoyl)鏈的含炔基接合單元的MALDI-TOF分析結果。
圖6A與6B分別為根據本揭示內容一實驗例，與三個體抑素類似物複合的含DBCO多臂接合單元的反相分析HPLC圖譜與MALDI-TOF分析結果。
圖7為根據本揭示內容一實驗例，帶有兩個十八醯(palmityl)鏈的含炔基接合單元的MALDI-TOF分析結果。
圖8A與圖8B分別為根據本揭示內容一實驗例，GLP-1-Ala8-EG4-2FA-C16促效劑的反相分析HPLC圖譜與MALDI-TOF分析結果。
圖9A與圖9B分別為根據本揭示內容一實驗例，GLP-1-Ala8-EG4-2E-2FA-C16的反相分析HPLC圖譜與MALDI-TOF分析結果。
圖10A與圖10B分別為根據本揭示內容一實驗例，GLP-1-Aib8-EG4-2E-2FA-C16促效劑的反相分析HPLC圖譜與MALDI-TOF分析結果。
圖11A與圖11B分別為根據本揭示內容一實驗例，GLP-1-Aib8-EG4-2E-2FA-C16-酸促效劑的反相分析HPLC圖譜與MALDI-TOF分析結果。
圖12A與圖12B分別為根據本揭示內容一實驗例，GLP-1-Aib8-EG2-2E-2FA-C16-酸促效劑的反相分析HPLC圖譜與MALDI-TOF分析結果。
圖13A與圖13B分別為根據本揭示內容一實驗例，GLP-1-Aib8-EG2-2E-2FA-C18-酸促效劑的反相分析HPLC圖譜與MALDI-TOF分析結果。
圖14為根據本揭示內容一實驗例的ELISA分析結果，圖中顯示2FA-GLP-1促效劑對GLP-1受體的結合親和力，其中GLP-1R-IgG.Fc融合蛋白係塗布於微量多孔盤上，接著添加最終濃度為1或10 μg/ml的含疊氮基GLP-1促效劑(GLP-1-疊氮基)、2FA-GLP-1促效劑(2FA-GLP-1)、利拉魯肽(liraglutide)以及對照多肽(P1-P2多肽，GLAGGSAQSQRAPDRVLCHSGQQQGLPRAAGGSVPHPR，序列編號：3)。
圖15為根據本揭示內容一實驗例的ELISA分析結果，圖中顯示2FA-GLP-1促效劑對人類血清白蛋白(HSA)的結合親和力，中係將HAS塗布於微量多孔盤上，接著添加含疊氮基GLP-1促效劑(GLP-1-疊氮基)、利拉魯肽，2FA-GLP-1促效劑(2FA-GLP-1)與含炔基2FA (炔基-2FA)。
圖16A與16B分別為根據本揭示內容一實驗例的ELISA分析結果以及2FA-GLP-1促效劑與利拉魯肽和HAS結合的百分比，在ELISA圖中顯示利用透析平衡分析之2FA-GLP-1促效劑對HAS的結合親和力。
圖17為根據本揭示內容一實驗例，與所合成的GLP-1類似物一起培養之INS-1細胞的cAMP測量結果。
圖18A與18B分別為根據本揭示內容一實驗例，所合成的GLP-1類似物對INS-1細胞中活化的半胱天冬酶-3 (activated caspase-3)的抑制分析結果。
圖19為根據本揭示內容一實驗例，與所合成的GLP-1類似物一起培養之INS-1細胞的細胞增生分析結果。
根據慣常的作業方式，圖中各種特徵與元件並未依比例繪製，其繪製方式是為了以最佳的方式呈現與本發明相關的具體特徵與元件。此外，在不同圖式間，以相同或相似的元件符號來指稱相似的元件/部件。
<110> 免疫功坊股份有限公司
<120> 與白蛋白具有較佳結合親和力之藥物分子
<130> P3063-TW
<150> 107132980
<151> 2018-09-19
<160> 8
<170> BiSSAP 1.3.6
<210> 1
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 1
Figure 107132980-A0305-02-0066-1
<210> 2
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MOD_RES
<222> 2
<223> Aib
<400> 2
Figure 107132980-A0305-02-0066-2
<210> 3
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 3
Figure 107132980-A0305-02-0067-4
<210> 4
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 4
Figure 107132980-A0305-02-0067-5
<210> 5
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 5
Figure 107132980-A0305-02-0067-6
<210> 6
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 6
Figure 107132980-A0305-02-0067-7
<210> 7
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> Xaa is a PEGylated amino acid with four EG units Xaa is coupled with an alkynylpropionyl group
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MOD_RES
<222> 3
<223> Xaa is a PEGylated amino acid with four EG units
<220>
<221> MOD_RES
<222> 4
<223> esterification
<400> 7
Figure 107132980-A0305-02-0068-10
<210> 8
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> Xaa is a PEGylated amino acid with two EG units Xaa is coupled with an alkynylpropionyl group
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MOD_RES
<222> 3
<223> Xaa is a PEGylated amino acid with two EG units
<220>
<221> MOD_RES
<222> 4
<223> esterification
<400> 8
Figure 107132980-A0305-02-0069-9
20a‧‧‧中心核
21‧‧‧第一元件
27‧‧‧iEDDA反應
30A‧‧‧接合單元
33‧‧‧第二元件

Claims (15)

  1. 一種接合單元，至少包含一中心核以及2至5個第一元件，其中每一該第一元件獨立地為一經麩胺酸殘基、天冬胺酸殘基、胺基-EG2-酸或γ丁胺酸修飾的C8-28脂肪酸或C8-28二元脂肪酸，且該中心核至少包含：2至5個離胺酸(lysine，K)殘基，其中該K殘基的ε-胺基經所述第一元件醯化；視需要地，一或多填充物，其中任兩個所述K殘基彼此相鄰或由一所述填充物隔開；視需要地，一末端間隔物，其中當該末端間隔物存在時，該末端間隔物為連接至該第一K殘基之N-端的一N-端間隔物或連接至該最後K殘基之C-端的一C-端間隔物，且該填充物與該末端間隔物彼此獨立地至少包含：(1)1至12個非K胺基酸殘基，或(2)具有2至12個乙二醇(ethylene glycol，EG)重複單元的一聚乙二醇化胺基酸(PEGylated amino acid)；以及一複合部分，其中當不存有該末端間隔物時，藉由與該末端K殘基形成醯胺鍵，或當存有該末端間隔物時，藉由與末端間隔物的末端胺基酸殘基形成醯胺鍵，而與其連接，其中該複合部分具有選自以下群組的一複合基：疊氮基、炔基、四嗪基、環辛烯基與環辛炔基。
  2. 如請求項1所述的接合單元，其中該脂肪酸為辛酸、壬酸、癸酸、十一酸、月桂酸、十三酸、肉豆蔻酸、十五酸、棕櫚酸、十七酸、硬脂酸、十九酸、花生酸、二十一酸、二十二酸、二十三酸、二十四酸、棕櫚油酸、油酸、亞麻油酸、蓖麻油酸、異檸檬酸、二十碳五 烯酸(eicosapentaenoic acid，EPA)或二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid，DHA)。
  3. 如請求項2所述的接合單元，其中該脂肪酸為自肉豆蔻酸或棕櫚酸。
  4. 如請求項1所述的接合單元，其中該二元脂肪酸為自1,8-辛二酸、1,7-庚二甲酸、1,10-癸二酸、十一烷二酸、十二烷二酸、十三烷二酸、十四烷二酸、十五烷二酸、十六烷二酸、十七烷二酸或十八烷二酸。
  5. 如請求項4所述的接合單元，其中該二元脂肪酸為十四烷二酸或十六烷二酸。
  6. 如請求項1所述的接合單元，其中該脂肪酸或該二元脂肪酸係經麩胺酸殘基修飾。
  7. 如請求項1所述的接合單元，至少更包含一第二元件，其係透過以下反應而連接至該複合基：銅催化的疊氮化物-炔羥環加成(copper catalyzed azide-alkyne cycloaddition，CuAAC)反應、應力促進的疊氮化物-炔羥鏈接化學(strain-promoted azide-alkyne click chemistry，SPAAC)反應或逆電子需求狄爾斯-阿德(inverse electron demand Diels-Alder，iEDDA)反應。
  8. 如請求項7所述的接合單元，其中該第二元件係選自由以下組成的群組：胰島素、似胰島素生長因子、似升糖素胜肽-1促效劑、體抑素與體抑素類似物、降鈣素、生長激素、紅血球生成素、促性腺素釋放激因子、顆粒性白血球群落刺激因子、腺苷去胺酶、精胺酸去胺酶、天冬醯胺酸酶、干擾素-α、干擾素-β、可溶性TNF-α受體、可溶性IL-1受體、可溶性EGF受體、半乳糖苷酶β、半乳糖苷酶α、拉 羅尼酶(laronidase)、移黏寶酶(idursulphase)、阿葡糖苷酶α(alglucosidase α)以及加硫酶。
  9. 如請求項8所述的接合單元，其中該體抑素類似物為奧曲肽(octreotide)。
  10. 如請求項7所述的接合單元，其中該第二元件為一載藥束，其至少包含複數個藥物分子。
  11. 如請求項1所述的接合單元，其中該環辛烯基為降莰烯(norbornene)基或反式-環辛烯(trans-cyclooctene，TCO)基；該環辛炔基為二苯并環辛炔(dibenzocyclooctyne，DBCO或DIBO)基、二氟化環辛炔(difluorinated cyclooctyne，DIFO)基、二環壬炔(bicyclononyne，BCN)基或二苯并雜氮環辛炔(dibenzoazacyclooctyne，DIBAC)基。
  12. 如請求項1所述的接合單元，其中該四嗪基為1,2,3,4-四嗪基、1,2,3,5-四嗪基或1,2,4,5-四嗪基。
  13. 如請求項1所述的接合單元，其中該疊氮基為吡啶甲基疊氮(picolyl azide)基。
  14. 如請求項1所述的接合單元，其中該中心核至少包含該N-端間隔物與該C-端間隔物兩者，且當該N-端間隔物的複合基為疊氮基、炔基或環辛炔基時；該C-端間隔物的複合基為四嗪基或環辛烯基；或當該N-端間隔物的複合基為四嗪基或環辛烯基時，該C-端間隔物的複合基為疊氮基、炔基或環辛炔基。
  15. 如請求項14所述的接合單元，至少更包含一第二元件與一第三元件，其中： 該第二元件是透過CuAAC反應或SPAAC反應而連接至該N-端間隔物的複合基，且該第三元件是透過iEDDA反應而連接至該C-端間隔物的複合基；或該第二元件是透過iEDDA反應而連接至該N-端間隔物的複合基，且該第三元件是透過CuAAC反應或SPAAC反應而連接至該C-端間隔物的複合基。
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