CN1038838A

CN1038838A - 聚醚抗菌素

Info

Publication number: CN1038838A
Application number: CN89104280A
Authority: CN
Inventors: 罗伯特·L·哈米尔; 姚慈晃
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 1988-05-02
Filing date: 1989-05-02
Publication date: 1990-01-17
Also published as: KR890017362A; ATE84535T1; HUT54418A; DE68904348T2; HK54893A; IE891420L; PT90434B; PT90434A; GR3007507T3; FI892077A0; IL90130A; NZ228935A; JPH0215085A; EP0341019A3; AU3391689A; HU204893B; DK211289D0; EP0341019B1; AU625818B2; EP0341019A2

Abstract

本发明提供了新的聚醚抗菌素A82810，它的酰基和烷基酯、烷基醚和脲烷衍生物及其盐类，它们可作为抗菌和抗球虫剂使用，并能提高动物的饲料利用率。本发明还提供了通过培养纤维马杠拉放线菌(Actinomadura Fibrosa)新种NRRL18348制备A82810的方法，及制备A82810化合物与硝卡巴嗪、4，4′-二硝基对称二苯脲、某种萘胺和苯胺化合物及二氯二甲吡啶酚的增效组合物的方法。

Description

本发明涉及一种新的聚醚抗菌素。具体的说，本发明涉及抗菌素A82810，以及通过培养一种新的微生物制备它的方法。

动物医药产品的需要量很大。抗菌素一直是一类重要的动物医药产品，它不仅用来治疗疾病，还用来促进动物的生长。抗菌素能够通过减少疾病或增加饲料利用率而促进生长。

球虫病是一种严重影响家禽业的疾病。球虫病是通过一种或多种艾美球虫属（Eimeria）或等孢球虫属（Isospora）中的病菌感染产生的。由于球虫病不断造成的经济损失需要有性能得到改进的抗球虫病药品。

在兽医学领域中，从经济的观点看来期望达到的另一目的是通过提高饲料利用率促进生长。这种生长促进作用对于反刍动物（如牛）及单胃动物（如家禽和猪）来说尤其重要。

在动物医药领域中，聚醚抗菌素是一组非常重要的抗菌素。例如，聚醚莫能菌素是一种很有价值的市售产品，它被用来治疗家禽球虫病和提高动物的饲料利用率。

本发明提供了一种称为A82810的聚醚抗菌素。Westley按照类和型对现有聚醚进行了分离（John W.Westley《聚醚抗菌素：天然存在的酸性离子载体，第2卷、化学》，MarceL Dekker，New York1983）。根据Westley的***，A82810是1b类（1）型聚醚组中的一个新成员，因为它具有一个螺缩酮***。此组中的其他成员还有A80190（US4，582，822）;;A28695A和B（US3，839，558）;A204Ⅰ和Ⅱ（US3，705，238）;A-32887（US4，133，876）;卡氏霉素（Carriomycin）;醚霉素;CP-47，434，RP37454和X-14868等抗菌素。

因此，本发明在一个方面提供了一种式1的A82810化合物，它的基或烷基酯，它的烷基醚衍生物，或它的盐

其中，R是氢或-CONHR₁，而R₁是烷基、芳基、烷芳基、芳烷基卤代芳基、硝基芳基、卤代芳烷基、烷氧芳基、芳氧芳基、芳基环烷基、酰基芳基和环烷基。

A82810的性质

已确定抗菌素A82810的结构为式1所示的结构（根据质谱分析和NMR研究）。A82810（游离酸形式）具有下述特性：

状态：白色晶体

熔点：69～71℃

PKa：＝6.6（80%＝甲亚砜水溶液）

〔α〕²⁵ ₅₈₉D：-7.35℃（C1，MeoH）

分子量：842（场解吸质谱）

经验式：C₄₅H₇₈O₁₄

紫外光谱：只有末端吸收

红外光谱（CH₃Cl）：图1：在下列频率具有吸收（cm^-1）：3020 2977，2935，2880，1726，1458 1379 1206，1164，1146，1115，1104，1094，1073，1050，1025，1006，991，980及946

溶解性：不溶于水;溶于低级醇如甲醇，酮例如丙酮，酯例如乙酸甲酯，卤代烃例如氯仿，以及烃类如***、苯、甲苯和热己烷。

从A82810的结构明显可见，它具有一个能够形成盐和酯衍生物的羧酸功能团，并至少具有一个羟基，它能够被酯化或形成醚衍生物。

在式1的化合物中，如果R不是氢则称为尿烷衍生物。式1的化合物可作为抗菌素使用，或作为提高饲料利用率的药剂。

术语“酰基”是指C₁-C₇，优选C₁-C₄的链烷酸部分，即具有下式的基团

其中，R₁a是C₁-C₆烷基或氢，例如甲酰基，乙酰基、丙酰基、丁酰基等。

术语“环烷基”是指含有3-7个碳原子的环状烃基，例如环丙基、环丁基、环己基等，优选环己基。环烷基可由芳基（如本文所定义的）取代以形成芳基环烷基，例如2-（苯基）环丙基。

术语“烷氧基”是指C₁-C₇的具有一个氧取代基团的低级烷基，例如甲氧基、乙氧基、丙氧基等。

术语“芳基”是指从芳香烃上除去一个氢原子产生的芳香残基，例如苯基、吡啶基或呋喃基，尤其是苯基。“芳基”可由各种基团取代。苯核上的取代基最好位于4位。例子有4-烷基芳基如4-甲基苯基（4-甲苯基）;4-卤代苯基如4-氯苯基;4-硝基苯基;4-芳氧基芳基如4-苯氧基苯基;4-烷氧基苯基如4-甲氧基苯基;4-（烷基-羧基）苯基如4-（甲基羧基）苯基或4-（苯基羧基）苯基。

术语“烷基”是指C₁-C₇直链或支链烃基，优选C₁-C₄烃基例如甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基等。烷基可由芳香残基取代（定义如上）以形成芳烷基残基，例如苯乙基或2-苯乙基，或由卤代芳香残基取代以形成卤代芳基烷基如4-溴苯乙基。

A82810及其衍生物的盐类可用来分离和纯化抗菌素。药物上可接受的盐类尤其有用。盐类的例子有A82810及其衍生物的碱金属、碱土金属和胺的盐类。

A82810具代表性的合适的碱金属和碱土金属盐包括钠、钾、锂、铯、铷、钡、钙和镁盐。A82810的合适的胺盐包括铵和一级、二级及三级C₁-C₄烷基铵和羟基-C₂-C₄-烷基胺盐。典型的胺盐包括由A82810与下述物质反应所形成的胺盐：氢氧化铵、甲胺、仲丁胺异丙基胺、二乙胺、二异丙基胺、乙醇胺、三乙胺、3-氨基-1-丙醇等。

在治疗动物体时，究竟是用化合物的游离碱或盐一般说来不是很重要的。但由于经济、方便或毒性的原因而选择盐的形式。

本发明的另一方面涉及一种制备A82810的方法，包括在在深层通气发酵条件下，培养纤维马杜拉放线菌新种（Actinomadura fibrosa sp.nov.）NRRL 18348，或其产生A82810的突变体，以生产抗菌素A82810;以及随意地盐化。用极性有机溶剂从发酵液和从菌丝体中萃取A82810。A82810通过各种技术（例如柱层析）进行分离和进一步纯化。

本发明进一步提供了纤维马杜拉放线菌新种NRRL 18348的生物学纯培养物，或者产生A82810的突变体。为方便起见，此微生物被称为培养物A82810.1.培养物A 82810.1是由亲本菌株（培养物A82810）衍生的天然变种，培养物A82810则是从土壤样品（来自Togo West Africa）中分离出来的。

一种产生A82810生物的培养物已保藏于NRRL（Northern Regional Research Center Agricultural Research North Central Region 1815 North University Street Peoria Illinois 61604）并成为该机构所收集培养物的一部分，公众可以NRRL 18348的保藏号从该机构得到此培养物。

Frederick P Mertz（Lilly Research Laboratories）对此变种进行了分类学研究。根据这些研究，此新的生物被分为马杜拉放线菌属（Actinomadura）的一个新种，所建议的名称是纤维马杜拉放线菌新种。此分类是根据将它与相似种作实验室比较，以及将A82810.1的特性与发表的相似种的特性作比较而作出的。

所用方法：

进行这些研究所采用的方法来自为确定链霉菌属的种的特性而订立的国际链霉菌属工程（ISP）（E.B.Shirling和D.Gottlieb，

“确定链霉菌属种的特性的方法”，Int.J.Syst Bactriol 16：313-340，1966），以及由Gordon给出的方法（R.E.Gordon，D.A.Barnett，J.E.Handerhan，C.Pang”空腔诺卡氏菌、自养诺卡氏菌和诺卡氏菌素菌株”Int.J.Syst.Bacteriol.24：54-63，1974）。

淀粉水解作用是通过在ISP4号（无机盐淀粉琼脂）平板上用碘测试淀粉的存在而确定的。

NaCl耐性是通过在ISP2号琼脂中加入相当于所需浓度的NaCl而测定的。

使用ICSS-NBS Centroid Color Charts 2106号标准样品（National Bureau of Standards，1958，U.S Department of Commerce，Washington，D.C.）和《Color Harmony Manual》（第4版，Container Corporation of America Chicago Illinois，1958）分别确定反面和气生菌丝的颜色名称。

利用光学显微镜和扫描电镜（SEM）进行形态学研究。

通过Becker等人（B.Becker，M.P.Lechevalier，R.E.Gordon，H.E.Lechevalier，“通过完整细胞水解物的纸层析快速分辨诺卡氏菌和链霉菌”，Appl.Microbiol.12：431-423，1964）和Lechevalier（M.P.Lechevalier“具有临床重要性的需氧放线菌类的鉴别”J.Lab.Clin.Med.，71：934-944，1968）的层析法，确定了完整细胞水解物中的二氨基庚二酸（DAP）的异构体。

通过将抗菌素敏感性圆片铺在已接种的ISP 2号琼脂平皿表面来测定抗菌素抗性。如果观察到没有抑制带则将抗性记为（+），如果有抑制带则记为（-）。

通过以Minnikin（D.E.Minnikin，L.Alshamaony及M.Goodfellow，“通过完整生物甲醇解物的薄层层析分辨分枝杆菌属，诺卡氏菌属和相关分类单位，”J.Gen.Microbiol，88：200-204，1975））所述技术为基础的方法测定霉菌酸。

由下述方法测定磷脂：

1）M.P.Lechevalier，H.Lechevalier，《《A.University Laboratory Approach》，Dietz和Thayer编，第6号特种出版物，工业微生物学协会，Arlington VA，1980;PP.277-284;

2）D.E.Minnikin，I.G.Hutchinson和A.B.Caldicott，“含有霉菌酸细菌的甲醇解物的薄层层析”，J.Chrematography 188：221-233，1980;及

3）J.C.Dittmer和R.L.Lester，“测定薄层析上磷脂的简单专一的喷雾法”，J.Lipid Research 5（1）：126-128，1964。

通过下述方法测定甲基萘醌类成分：

1）R.M.Kroppenstedt，《细菌分类学中的化学方法》，M、Goodfellow和D.E.Minnikin编，1985，173-196页;

2）M.D.Collins;同上267-285页。

利用HP5898A微生物鉴别***（参见L.Miller和T.Berger，“通过完整细胞脂肪酸的气相层析鉴别细菌”，Hewlett-Packard Application Note 228-41，1985;第8页）进行脂肪酸分析。由在同样条件下培养的冷冻干燥的完整细胞制备脂肪酸甲基酯。

图7所示的***树图是以Euclidian距离为基础由计算机作出的。

图8所示的主要成分，分析是二维的，它也是由计算机完成的。

培养特性

培养物A82810.1在复合和确定培养基中都能良好生长。但除了在ISP 2号培养基、Bennetts氏琼脂和番茄酱/燕麦粉（TPO）琼脂上外，很少有气生菌丝体的生成。生成的气生孢子团是粉色至白色的。反面是红棕色至鲜明的红橙色。末观察到可溶色素。表Ⅰ总结了培养物A82810.1的培养特性。

表Ⅰ.A82810.1在各种琼脂培养基

上的培养特性^a

琼脂培养基 A82810.1的特性^b

ISP 2号 G：大量

R：55.s.Br

Am：大量：b白色

Sp：淡棕色

ISP 3号 G：良好

R：39.gy.rO

Am：微量：粉红色

Sp：无

ISP 4号 G：大量

R：43.m.rBr

Am：微量：粉红色

Sp：无

ISP 5号 G：大量

R：37.m.rO

Am：无

Sp：无

ISP 7号 G：大量

R：43.m.rBr

Am：无

Sp：无

ATCC 172 号G：良好

R：39.gy.ro

Am：微量：5cal.Y.粉红色

Sp：无

Bennett氏 G：大量

R：42.1.rBr

Am：良好：白色

Sp：无

Emerson 氏 G：大量

R：54.bro

Am：微量：白色

Sp：无

葡萄糖 G：大量

天冬酰胺 R：39.gy.ro

Am：微量：5ca 1、y、粉红色

Sp：无

Jensens 氏 G：一般

R：39.gy.ro

Am：微量：白色

Sp：无

养分 G：良好

R：53.m.O

Am：无

Sp：无

土豆 G：良好

胡萝卜 R：39.gy.rO

Am：微量白色

Sp：无

TPO G：大量

R：58.m.Br

Am：良好：5cb gy.y粉红色

Sp：无

C zapek 氏 G：良好

R：43.m.rBr

Am：一般：白色

Sp：无

a于30℃培养14天

b G＝生长;R＝反面;Am＝气生菌丝体;Sp＝可溶色素

形态特征

培养物A82810.1产生大量的基质菌丝体。气生菌丝很为少见。在光学显微镜和扫描电镜下观察时，没有观察到分段成孢子的现象。菌丝体似乎根本不产生孢子。可以明显见到许多菌丝束形成粗纤维。这些气生菌丝中有些形成节状或突出，它们有点象孢子。但用扫描电镜观察发现这些结构并不是真正的孢子。有时可观察其他的纤维状结构。这些结构及一般气生菌丝的纤维状外观，就是种名为“纤维”的基础。

生理特性

培养物A82810.1由下列碳水化合物产生酸：侧金盏花糖醇、L-***糖、纤维二糖、果糖、半乳糖、葡萄糖、甘油、糖原、乳糖、麦芽糖、甘露糖，鼠李糖、核糖、蔗糖、茧蜜糖和木糖。A82810.1不从下列物质产生酸：D-***糖、纤维素、糊精、卫矛醇、乙醇、赤癣糖醇、肌醇、旋覆花素、甘露醇、松三糖、蜜二糖、α-甲基-D-葡糖苷、蜜三糖、水杨苷、山梨醇、山梨糖和木糖醇。

培养物A82810.1利用下述有机酸（以钠盐的形式）：乙酸、丁酸、丙酸和丙酮酸。它不利用苯甲酸、柠檬酸、甲酸、乳酸、苹果酸、粘酸、草酸、琥珀酸和酒石酸。

A82810.1能够分解酷蛋白、弹性蛋白、七叶苷、次黄嘌呤、淀粉、睾酮、酷氨酸和脲，但不分解腺嘌呤、尿囊素、苹果酸钙、鸟嘌呤、马尿酸和黄嘌呤。

A82810.1能产生过氧化氢酶、磷酯酶和脲酶，液化明胶;水解脱脂牛奶以及能在50℃下存活8小时。它不产生类黑素或H₂S，还原硝酸或胨化脱脂牛奶。

A82810.1对先锋霉素I（30μg），林肯霉素（2ug）、青霉素G（10单位）、利福平（5μg）和溶菌酶（50μg/ml）具有抗性。它对杆菌肽（10单位）、庆大霉素（10μg）、新霉素（30μg）、夹竹桃霉素（15μg）、链霉素（10μg）、四环素（30μg）、妥布霉素（10μg）和万古霉素（30μg）敏感。

培养物A82810.1在20-45℃的温度范围内生长。最适生长温度似乎是37℃。培养物忍耐的NaCl浓度可高达（并包括）5%。

细胞壁分析：

水解的完整细胞中含有内消旋二氨基庚二酸。在完整细胞的提取液中检测到有下列糖类：半乳糖、葡萄糖、甘露糖、马杜糖（madurose）和核糖。因此，A82810.1具有Ⅲ型细胞壁和B型糖构成（参见M.P.Lechevalier和H.Lechevalier，“化学组成作为需氧型放线菌分类的标准”，Int.J.Syst.Bacteriol.20：435-443，1970）。

没有检测到霉菌酸。

测定完整细胞的磷酯表明存在有磷酯酰肌醇、二磷酯酰甘油和GluNu（一种含有葡糖胺的未知结构）。磷酯酰乙醇胺和磷酯酰胆碱都未检测到。因此，A82810.1具有Ⅳ型的磷酯构成（参见M.P.Lechevalier，A.E.Stern，H.A.Lechevalier，“放线菌类分类学中的磷酯”，《放线菌类》，K.P.Schaal和G.Pulverer编;Zbl.Bakt.Suppl.ll，Gustav Fischer Verlag，Stuttgart，New York，1981）。

在A82810.1中检测到的甲基萘醌类是具有九个异戊二烯单位的六氢甲基萘醌MK-9（H₆），以及少量的八氢甲基萘醌MK-9（H₈）。

菌株A82810.1的鉴别：

A82810.1的化学分类学性质以及培养和形态特征都支持将此分离物分入马杜拉放线菌属（参见V.B.D.Skerman，V.McGowan，P.H.A.Sneath，《细菌名称的批准名单》，美国微生物学学会，Washington D.C.1980）。

使23型的马杜拉放线菌种的菌株与培养物A82810.1在21种不同的琼脂培养基上一起培养。比较其培养和形态特征。培养物A82810.1表现出与下述的相似性：天盛马杜拉放线菌（A.coerulea）、马氏马杜拉放线菌（A.madura）、粉状马杜拉放线菌（A.Pulveraceus）、红马杜拉放线菌（A.roseorufa）、红色马杜拉放线菌（A.rubra）、沙氏马杜拉放线菌（A.salmonea）和疣孢马杜拉放线菌（A.verrucsospora）。

由文献中收集这七个种的生化特性，通过建立相似系数的表与A82810.1作比较。使用Jaccard S_j系数和简单对比系数S_sm（W.Kurylowicz，A.Paszkiewicz，W.Woznicka，W.Kurzatkowski和T.Szulga，《链霉菌的数据分类学》，Polish Medical Publishers，Warsaw 1975，37页）。

表Ⅱ中概括了这些数据。

表Ⅱ 利用相似系数进行的A82810.1与

几种马杜拉放线菌的比较^a

培养物 S_jS_sm

A82810.1 100 100

疣孢马杜拉放线菌 72 81

马氏马杜拉放线菌 73 79

沙氏马杜拉放线菌 70 78

红色马杜拉放线菌 70 76

玫红马杜拉放线菌 60 75

粉状马杜拉放线菌 59 74

^a没有天蓝马杜拉放线菌的数据

对这些培养物的完整细胞进行脂肪酸分析。图7和图8分别显示了由这些数据得到的***树图和进行的主要成分分析。

相似系数和脂肪酸分析表明，在作比较的七个已知种中，粉状马杜拉放线菌和疣孢马杜拉放线菌与A82810.1其有最多的共同性征。然而，此相似性还不足以作出结论说A82810.1是任一种的菌株。表Ⅲ给出了A82810.1和这两个种之间的差别。

表Ⅲ 粉状马杜拉放线菌、疣孢马杜拉放线

菌与A82810.1之间的区别

特性 A82810.1 粉状疣孢

脲酶生成 + - -

鸟嘌呤水解 - ND^a+

淀粉水解 + + -

由下列物质生成酸：

L-***糖 + - +

糊精 - ND +

果糖 + - +

肌酵 - + -

乳糖 + - +

甘露醇 - - +

甘露糖 + - -

茧蜜糖 + - +

特性 A82810.1 粉状疣孢

利用乙酸钠 + - ND

在45℃的生长 + - -

孢子的存在 - + +

蓝灰色孢子 - + -

对于下述物质的抗性：

夹竹桃霉素（16μg） - ND +

青霉素G（10单位） + ND -

5%N_aCl耐性 + ND -

^aND＝未做

因此，此研究支持这一结论，即培养物A82810.1是马杜拉放线菌属的一个新种。由此原因，培养物A82810.1被命名为纤维马杜拉放线菌新种，拉丁文的形容词“纤维”是指气生菌丝的纤维状外观。

与其他生物的情况一样，本发明生产A82810.1纤维马杜拉放线菌新种NRRL 18348的特性是可以变异的。通过本领域的公知方法可得到此菌株的突变体，例如，利用各种物理和化学诱变剂进行处理，如紫外光、X射线、γ射线，化学试剂如n-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍。保留有A82810生产特性的纤维马杜拉放线菌新种NRRL 18348的天然或诱导突变体都被认为是本发明的构成部分。

用以培养纤维马杜拉放线菌的培养基可以是许多培养基中的任意一种。但为了生产的经济性、最佳产率和产品的容易分离，优选某些培养基。因此，大型发酵中的优选碳水化合物源例如有葡萄糖和土豆糊精，虽也可以使用核糖、木糖、半乳糖、甘露糖、甘露醇等。

优选的氮源是酶解的酷蛋白和酵母、尽管也可使用肝粉、肉胨、鱼粉等。培养基中可掺入的无机盐养分是那些常规的水溶性盐类，它们能够产生锌、钠、镁、钙、铵、氯、碳酸根、硫酸根、硝酸根等离子。

培养基中还应包括生物的生长发育所必需的基本微量元素。这些微量元素一般作为杂质存在于培养基的其他成分中，其数量足以满足生物生长的需求。泡沫的形成通常并不要紧，但如果需要，可在大规模发酵培养基中加入少量（即0.2ml/L）消泡剂，例如聚丙二醇。

为了大量生产抗菌素A82810，优选在罐中进行深层通气发酵。通过摇瓶培养可以得到少量A82810。由于在一般的抗菌素生产中，用孢子形式的生物给大型罐接种存在时间上的迟滞作用，因此优选使用无性接种物。无性接种物是如下制备的：用该生物的孢子或菌丝片段给少量培养基接种，以得到该生物新鲜的活性生长的培养物。然后，将无性接种物转移至大型罐中。无性接种物的培养基可以与大型发酵所用的相同，但其他培养基也是适用的。

在大约25℃至大约40℃之间的温度下培养产生A82810的生物即可生产A82810。A82810生产的最适温度似乎是大约34-36℃。

正象常规的深层通气培养法一样，由容器底部向其中吹入无菌空气，并用常规的涡轮搅拌培养基。就迄今为止所采用的发酵条件而论，

氧的最大摄取量还没有超过大约0.35mM/L/min。在含有大约115升培养基的165升全隔式发酵罐中，以300rpm的搅拌速度加上0.125V/V/min的通气率，便可在0.34个大气压下足以使溶氧水平维持在或高于45%的空气饱和度。

在发酵过程中可对抗菌素A82810的生产进行监测，即测试培养基样品对已知对此抗菌素敏感的生物的抗菌活性。枯草芽孢杆菌ATCC6633是一种可用来测试A82810的检测生物。生物检测通过常规的琼脂孔扩散测试法进行。

在深层通气发酵条件下完成1 A82810的生产以后，可利用发酵领域所用方法从发酵培养基中回收A82810。在产生A82810的生物的发酵过程中，过滤培养基及菌丝团二者都表现有抗菌活性。对A82810进行最大量回收的方法是，首先使培养基过滤使菌丝团和培养液分离，然后，分别纯化过滤培养液及菌丝团，以得到它们各自的A82810部分。有许多技术可用于此纯化过程。对于过滤培养液来说，优选的纯化技术是将其PH调至大约9，然后用合适的溶剂（例如乙酸乙酯）进行萃取。再使萃取溶剂在真空下蒸发，由此得到培养液中的A82810部分。

对于菌丝团来说，优选的纯化方法是用合适的溶剂（例如丙酮）萃取分离的菌丝滤饼。然后使萃取溶剂在真空下蒸发，以产生浓缩的水溶液。然后将此水溶液的PH调至大约9，并用合适的溶剂（例如乙酸乙酯）进行萃取。然后使萃取溶剂在真空下浓缩，以产生菌丝体中的A82810部分。

培养液和菌丝体中的A82810部分通过相似方法进一步纯化。优选方法为硅胶层析法。

另一选择是，可以用包括培养基成分和菌丝体在内的培养物固体作为A82810的来源，而不必进行萃取或分离，但最好先去除水分。例如，在生产A82810以后，通过冷冻干燥、转鼓式干燥、或通过共沸蒸溜和干燥使所有发酵培养液干燥。然后将干燥后的培养基直接混入饲料预混合物中。

根据制备阳离子盐类的常用方法，制备式1化合物的碱金属和碱土金属盐类。例如，将A82810的游离酸溶入合适的溶剂如丙酮中，加入三分之一体积的水，用所需阳离子盐的碱（如N_aOH、KOH）将此溶液的PH调至大约9-10。这样形成的盐可用常规方法分离，例如过滤或溶剂的蒸发。

形成盐类的优选方法是将A82810（酸形式）溶于与水不混溶的溶剂中，例如乙酸乙酯，加入等体积的水，用相应的阳离子碱（如N_aOH、KOH等）将混合物的PH调至10。用水洗涤分离的有机相并浓缩至干燥。使残渣在二噁烷中冷冻干燥。可用合适的溶剂（如己烷）使盐结晶。

通过类似方法能够制备与有机胺形成的盐。例如，可在A82810溶液（在合适的溶剂如丙酮中）中加入气态或液态胺;溶剂和过量的胺可通过蒸发除去。

式1的酰基酯衍生物可通过（例如）下述方法制备：用相应的酸酐或酰氯处理A82810。酯化作用发生在A82810的一个羟基上。这种酯类通常是在室温下用，例如相应的酸酐与A82810反应而制备的。

式1的烷基酯衍生物利用标准方法通过羧基的酯化制备。式1的烷基酯衍生物在体外测定中活性通常较低。但使动物服用后，这种酯类可作为前药而在体内转化为它的活性形式。

式1的烷基酯衍生物是这样一些化合物，其中它们的一个或多个羟基已被YR₂基团取代，其中：

Y代表O或S;以及R₂代表C₁-C₆-烷基，

C₁-C₄-烷氧基-C₂-C₅-烷基，

C₁-C₄-烷氧基羰基-C₂-C₅-烷基，

氨基-C₂-C₅-烷基，

巯基-C₂-C₅-烷基，

羟烷基，

卤代烷基，或

（R′）_m-苯基（CH₂）_n-，

其中R′代表C₁-C₄-烷基，C₁-C₄-烷氧基，或羟基;

m代表O-2;以及

n代表O-3。

术语烷基和烷氧基具有前面所讨论的意义，但其碳原子数目限于所指出的。

术语“羟烷基”是指单羟基-C₂-C₅-烷基部分，或当Y是0时，指2，3-二羟基丙基-1部分。

术语“卤代烷基”是指具有1-3个卤素取代基的C₂-C₅-烷基部分，卤素选自由下述构成的一组：溴、氯和氟。如果烷基部分是二卤代或三卤代的，则卤素取代基必须是相同的卤素原子。

优选的式1醚衍生物是这样的化合物，其中的Y代表O和R代表C₁-C₆烷基。醚衍生物通过使相应的A82810化合物或其盐与所需的一级醇或硫醇反应而制备。

对于某些起始醇或硫醇来说，可能必须在反应液中加入酸性催化剂。合适的催化剂包括盐酸、硫酸、甲磺酸、苯磺酸、甲苯磺酸、二氧化硒和三氟化硼。

为了促进反应可加入一种溶剂，例如水、丙酮、苯、***、四氢呋喃或二噁烷。反应通常于室温下发生，尽管也可使用较高的温度。

虽然常规的反应程序在某些时候已经足够了，但为了得到本发明的化合物有时还必需要进行进一步的纯化。这种纯化作用可通过众所周知的方法来完成，例如柱层析、薄层层析、分级结晶等等。

本发明还提供了一种制备式1的脲烷衍生物的方法，包括使A82810或其盐与式2的异氰酸酯反应，

R₁-NCO

2

其中，R₁如上述所定义，以形成A82810的合适的脲烷衍生物。

优选使用A82810的盐，尤其是钠盐。加入的异氰酸酯应当稍微过量，例如过量大约10%，以形成最佳数量的单衍生物。反应优选在惰性溶剂例如氯代烃如四氯化碳、二氯甲烷或氯仿，***、乙酸乙酯，或芳烃溶剂例如苯或甲苯中进行。反应温度并不重要，可以在0℃以上和反应混合物的沸点之间的温度下进行，但优选大约室温。

式1的化合物（A82810化合物）具有抗细菌和抗球虫菌活性。A82810化合物尤其有对抗厌氧细菌的活性。通过标准的琼酯稀释检测法测定了A82810抑制各种细菌的最低抑菌浓度（MIC），所得结果概括于表Ⅳ和表Ⅴ中。在培养24小时后读取终点。

表Ⅳ 抗菌素A82810的体外抗菌活性

测试生物 MIC（μg/ml）

金黄色葡萄球菌X1.1 1.0

金黄色葡萄球菌V41 1.0

金黄色葡萄球菌X400 1.0

金黄色葡萄球菌S13E 1.0

表皮葡萄球菌270 1.0

表皮葡萄球菌222 0.5

酿脓链球菌C203 1.0

肺炎链球菌P_ark11.0

屎链球菌X66 1.0

粪链球菌2041 1.0

流感嗜血杆菌C.L 128

流感嗜血杆菌76 64

大肠杆菌N10 1.0

大肠杆菌EC14 8.0

大肠杆菌TEM ＞128

产气肠杆菌C32 8.0

产气肠杆菌EB17 8.0

克雷伯氏菌＞128

沙门氏菌＞128

铜绿假单胞菌X528 2.0

铜绿假单胞菌X239 0.25

铜绿假单胞菌PS18 ＞128

铜绿假单胞菌PS72 0.25

粘质沙雷氏菌＞128

变形菌＞128

索氏志贺氏菌 2.0

表Ⅴ 厌氧细菌分离物对抗菌素A82810的敏感性

厌氧细菌 MIC（μg/ml）

艰难梭菌2994 0.5

产气荚膜梭菌81 0.5

败毒梭菌1128 0.5

产气真杆菌1235 ≤0.25

不解糖消化球菌1302 ≤0.25

普氏消化球菌1281 ≤0.25

厌氧消化链球菌1451 ≤0.25

中间型消化链球菌1624 ≤0.25

疮疱丙酸杆菌79 2

脆弱拟杆菌111 8

脆弱拟杆菌1877 8

脆弱拟杆菌1936B 8

多形拟杆菌1438 8

产黑素拟杆菌1856/28 8

产黑素拟杆菌2736 8

普通拟杆菌1211 4

啮蚀拟杆菌1874 8

共生梭杆菌1470 0.5

坏死梭杆菌6054A ≤0.25

抗球虫菌活性是A82810化合物的一个重要特性。例如，在针对纤细艾美球虫（Eimeria tenlla）的体外培养筛选中，A82810在＜0.0025μg/ml时有活性，丙酰基-A82810在0.05μg/ml时有活性，乙酰基-A82810在0.01μg/ml时有活性。

为了治疗家禽的球虫病，给感染或易受感染的家禽服用非毒性的抗球虫菌有效量的A82810化合物，最好每天通过口服的方式给药。可以许多方式提供A82810化合物，但最方便的是与药物上可接受的载体一起提供，优选载体是由家禽摄入的饲料。虽然，在确定A82810化合物的合适浓度时必须考滤许多因素，但一般来说，在饲料中的给药率在大约0.5至大约100ppm的范围内，最好在大约1至大约25ppm的范围内。

在另一方面，本发明涉及治疗球虫病的组合物。在一组组合物中，包含有治疗球虫病有效量的A82810化合物及一种合适的载体。以前曾经发现，许多化合物都对一种或多种聚醚抗菌素的抗球虫病活性具有增效作用。例如，Maurice E.Callender和Thomas K.Jeffers（US4，218，438）公开了含有硝卡巴嗪或4，4′-二硝基对称二苯脲（4，4′-dinitrocarbanilide）和聚醚抗菌素的抗球虫菌组合物。

Albert J.Clinton和George O.P.O′Doherty发现，某些萘胺和苯胺对于某些聚醚抗菌素的抗球虫菌活性具有增效作用（分别参见US 4，764，534和US4，366，168）。Larry R.McDougald在US 4，061，755中公开了一种莫能菌素和二氯二甲吡啶酚的抗球虫菌组合物。

US 2，731，382中记载了硝卡巴嗪和4，4′-二硝基对称二苯脲。硝卡巴嗪是4，4′-二硝基对称二苯脲和2-羟基-4，6-二甲基嘧啶的复合物，但单独的4，4′-二硝基对称二苯脲就表现有抗球虫菌活性（参见Science 122：244，1955）。

本发明的A82810化合物也与这些类型的化合物表现出增效作用。因此，本发明的另一组组合物是增效组合物，它们包含有1）式1的A82810化合物或其药物上可接受的盐，并结合有2）一种由下述构成的一组中选择出的化合物：

a）硝卡巴嗪

b）4，4′-二硝基对称二苯脲

c）式3的萘胺化合物

其中：

R²是C₁-C₄烷基;

R²是卤素，C₁-C₄氟代烷基，C₁-C₄氟代烷氧基或C₁-C₄氟代烷硫基;

R⁴是卤素;

R⁵是氢或卤素;

m是0、1或2;以及

n是0或1;

前提是，如果存在有R⁴取代基，则它不位于2位;

d）下述的一种苯胺：2，4-二硝基-N-〔4-（三氟甲氧基）苯基〕-6-（三氟甲基）苯胺;2，4-二硝基-N-〔4-（1，1，2，2-四氟乙氧基）苯基〕-6-（三氟甲基）苯胺或2，4-二硝基-N-〔4-（五氟乙氧基）苯基〕-6-（三氟甲基）苯胺;

e）二氯二甲吡啶酚;或

f）（a）-（e）化合物的药物上可接受的盐。

在式3中，C₁-C₄烷基包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基等。

术语“卤素”代表氟、氯、溴和碘。

C₁-C₄氟代烷基是具有一或多个氟原子的C₁-C₄烷基。这种氟代烷基包括三氟甲基、1，1，2，2-四氟乙基、五氟乙基、1，2，3，3-四氟丙基、九氟丁基等。

C₁-C₄氟代烷基基是具有一或多个氟原子的C₁-C₄烷氧基。这种氟代烷氧基包括二氟甲氧基、三氟甲氧基、1-氟乙氧基、1，1，2，2-四氟乙氧基、五氟乙氧基、1，2，2，3，3-五氟丙氧基、七氟丙氧基、4，4，4-三氟丁氧基等。

C₁-C₄氟代烷硫基是具有一或多个氟原子的C₁-C₄烷硫基团。这种氟代烷硫基团包括三氟甲硫基、1，1，2，2-四氟乙硫基、五氟乙硫基、4，4，4-三氟丁硫基等。

优选的式3化合物是m和n为O且R⁵为氢的那些化合物。

典型的式3化合物有：

4-氟-N-〔2，4-二硝基-6-（三氟甲基）苯基〕-1-萘胺。

4-碘-N-〔2，4-二硝基-6-（三氟甲基）苯基〕-1-萘胺。

4-三氟甲基-N-〔2，4-二硝基-6-（三氟甲基）苯基〕-1-萘胺。

4-五氟乙基-N-〔2，4-二硝基-6-（三氟甲基）苯基〕-1-萘胺。

6，7-二甲基-4-（1，1，2，2-四氟乙氧基）-N-〔2，4-二硝基-6-（三氟甲基）苯基〕-1-萘胺。

2-异丙基-4-氯-N-〔3-氯-2，4-二硝基-6-（三氟甲基）苯基〕-1-萘胺。

8-正丁基-4-（4，4，4-三氟丁氧基）-N-〔3-溴-2，4-二硝基-6-（三氟甲基）苯基〕-1-萘胺。

3-甲基-6-丙基-4-七氟丙基-N-〔2，4-二硝基-6-（三氟甲基）苯基〕-1-萘胺。

3，4-二氯-N-〔2，4-二硝基-6-（三氟甲基）苯基〕-1-萘胺。

4-（1，1-二氟乙氧基）-N-〔2，4-二硝基-6-（三氟甲基）苯基〕-1-萘胺。

4-（1，1，2，2-四氟乙氧基）-N-〔2，4-二硝基-6-（三氟甲基）苯基〕-1-萘胺和

4-（1，1，2，2-四氟乙硫基）-N-〔2，4-二硝基-6-（三氟甲基）苯基〕-1-萘胺。

在A82810化合物和化合物2（a）-（e）的组合物中，各组分的用量要足以在结合起来时能对对抗至少一种导致球虫病的生物有增效作用。一般说来，在组合物中的最大用量与用单个组分作抗球虫菌治疗的最大用量相同。低限一般小于用单个组分治疗时所需的量。因此，实施本发明的组合物一般含有1）从大约0.5至大约100ppm的一种A82810化合物，以及2）a）从大约5-125ppm的硝卡巴嗪，b）从大约25至大约150ppm的4，4′-硝基对称二苯脲，c）从大约1至大约1000ppm的指定的萘胺，d）从大约1至125ppm的所指定的苯胺，或e）从大约20至大约70ppm的二氯二甲吡啶酚。A82810化合物与苯胺、萘胺或硝卡巴嗪一起给药时特别有效。优选的组合物含有从大约2至大约20ppm的A82810化合物及从大约5至大约80ppm的苯胺、萘胺或硝卡巴嗪。

A82810化合物的另一重要性质是能够提高动物的饲料利用率。例如，A82810化合物能提高具有发育好的瘤胃功能的反刍动物的饲料利用率。利用Arthur P.Raun在US 3，794，732（尤其参见实例5）中所述方法，能够通过观察瘤胃中丙酸酯化合物的生成和浓度而监测饲料利用率。如果反刍动物以从大约0.02mg/kg/天至大约1.5mg/kg/天的量率口服A82810化合物，则此化合物对增加丙酸酯特别有效，并因此提高饲料利用率。优选的给药量率为从大约0.05mg/Kg/天至大约0.5mg/Kg/天。

优选的给药方法是将化合物与动物饲料混合;但也可以以其他方式给药，例如作为片剂、浸液、大九剂或胶囊给药。这些不同剂量形式的配制可通过兽医药学领域的公知方法完成。每种单独的剂量单位所含本发明化合物的量应当直接相关待治疗动物的合适的每日剂量。

本发明进一步涉及用以提高饲料利用率的饲料组合物，它含有定量饲料和2-40克/吨的A82810化合物。

在另一方面，A82810可用于治疗猪痢疾。A82810在低至1.56μg/ml的水平时，仍可抑制猪痢疾密螺旋体（Treponema hyodysenteriae）的生长，它是导致猪痢疾的病原体。对于猪的优选给药方法是将适量的A82810化合物掺入定量饲料或饮用水中。合适的用量与是用来治疗还是用来预防感染有关。一般说来，预防感染所需活性化合物的浓度低于消除已感染动物的疾患所需的浓度。通常每吨饲料中A82810化合物的含量在从大约20至大约100克的范围内就能有效地预防感染。对于治疗已患有痢疾的猪来说，推荐的用量为每吨饲料中含有从大约100至大约500克A82810化合物。这些用量提供了大约1至大约5mg/公斤体重/天（预防处理）或大约5至大约25mg/公斤体重/天（治疗已感染的动物）。如果是加至饮水中，推荐的用量是每加仑水含大约0.04至大约0.2克（预防）或大约0.2至大约1克（治疗）A82810化合物。

本发明进一步涉及用于治疗猪痢疾的饲料组合物，它包括猪的定量饲料和用于此目的有效量的A82810化合物。正如前面所讨论的，典型的有效量是每吨饲料含有大约20至大约500克A82810化合物。

如前面所述，A82810具有抗厌氧细菌的活性，包括产气荚膜梭菌。因此，A82810化合物应当能够用来治疗或预防鸡、猪、牛和羊的肠炎。A82810化合物还可用于治疗反刍动物的肠原性毒血症。

A82810化合物还具有抗病毒活性。例如，组织培养测定表明，A82810在低至1.56μg/ml的水平具有抑制单型疱疹病毒（HSV Ⅰ和Ⅱ）的活性，在低至0.04μg/ml的水平具有抑制Friend白血病病毒的活性。在其他的组织培养测定中，A82810在低至250μg/ml的水平具有抑制大湖（Great Lakes）和巴西（Brazil）流感病毒的活性。

此外，A82810化合物还具有某些抗蠕虫活性。例如，在体外研究中，以50ppm的浓度给A82810的钠盐时，72小时后测量发现它能抑制Caenorhabditis elegans（抑制率85%）。

A82810化合物可通过口服或非肠道途径给动物服用。它们还可通过吹入法给药，即将药粉形式的抗菌素吹入饲养动物或家禽所在的封闭空间或房间中。动物或家禽吸入空气中的药粉;通过眼睛，药粉也可被摄入体内（此方法称为眼内注射法）。

最实用的A82810化合物的给药途径是将其配制于饲料中。许多种饲料都可使用，包括常见的干饲料、液态饲料和颗粒饲料。虽然优选的给药方法是将其混入动物饲料中，但也可通过其他途径给药，例如作为片剂、兽用顿服药、大九剂或胶囊给药。每种单独的剂量单位所含A82810化合物的量应当直接相关于待治疗动物的合适的每日剂量。

将药物配制于动物饲料中的方法是众所周知的。优选的方法是制备浓缩的药物预混合物，然后用它制备药物饲料。因此，本发明的一个方面是一种动物饲料预混合物，它含有1）作为活性组分的A82810化合物或2）结合有一或多种农学上可接受的载体的A82810增效组合物（见上）。典型的预混合物为每磅预混合物可含有大约1至大约200克的药物。预混合物可以是液态或固体制剂。

动物或家禽饲料的最终配制是根据给药量进行的。可使用常规的配制、混合和颗粒饲料制备法来制备含有A82810化合物的饲料。

根据兽医学领域公知的方法，可将A82810化合物配制成非肠道给药制剂。含有A82810化合物的有效的可注射组合物可以是悬浮液或溶液形式。呈溶液形式时，A82810化合物被溶于生理上可接受的载体中。这种载体包括合适的溶剂、防腐剂如苯甲醇（如果需要）以及缓冲剂。可用的溶剂包括，例如，醇类、二醇类、或惰性油类如植物油或高度精炼的矿物油类。

可注射的悬浮液组合物是利用化合物的非溶剂和作为载体的佐剂制备的。非溶剂可以是（例如）水或二元醇如聚乙二醇。

生理上可接受的合适佐剂是必需的，以维持化合物悬浮在悬浮液组合物中。佐剂可以从增稠剂中选择，例如羧甲基纤维素、聚乙烯基吡咯烷酮、明胶和藻酸盐。许多表面活性剂也可用于悬浮化合物。卵磷脂、烷基苯酚聚环氧乙烷加成物、萘磺酸酯、烷基苯磺酸酯和聚氧乙烯山梨糖醇酯都可用于将药剂悬浮在液态非溶剂中。

许多影响液体非溶剂的亲水性、密度和表面张力的物质都能在不同情况下协助制备可注射的悬浮液。例如硅酮消泡剂、二醇类、山梨醇和糖类都可用作助悬剂。

在制备吹入法使用的粉尘剂时，通常使化合物与作为佐剂的滑石、硅藻土或其他惰性物质混合。

A82810化合物还可作为杀虫剂使用。例如，A82810在低至100ppm的浓度时具有抗南方粘虫、叶螨、丽蝇幼虫的活性，在低至50ppm的浓度时具有抗成年厩蝇的活性。

下面提出一些实例以进一步说明本发明。

实例1A82810的制备

A.A82810的摇瓶发酵

用冷冻干燥颗粒状的或保存在液氮中的悬浮液形式的纤维马杜拉放线菌新种NRRL 18348为种子培养基接种，该培养基具有如下组成：

种子培养基Ⅰ

成分含量（%）

葡萄糖 1.0

可溶性淀粉 2.0

酵母膏 0.5

酷蛋白的酶促水解物^＊0.5

C_aCO₃0.1

去离子水加至1升

未调节的pH＝6.6;灭菌前加入N_aOH将pH提高至7.2;

灭菌后pH＝6.8。

^＊NZ Amine A，Sheffield Chemical Co.，Norwich N.Y.

在种子培养基中加入2%琼脂制成斜面或平板。使接过种的斜面在30℃下保温大约10至大约14天。用无菌工具刮下成熟的斜面培养物，疏松孢子，取出菌丝层并使之绉片。利用大约四分之一的疏松孢子和培养物对50ml第一级种子培养基接种。

将装在250ml三角瓶中的接过种的第一培养基于30℃下保温大约120小时，三角瓶置于在两英吋（5.08cm）圆圈中以250rpm旋转的摇床中。

用此培养好的第一级培养基（0.4ml）对50ml生产培养基接种，它具有下列组成：

生产培养基Ⅰ

成分含量（/L）

葡萄糖 5.0g

酷蛋白的酶促水解物^＊3.0g

酵母膏 5.0g

废糖蜜 15.0g

MgSO₄（无水） 1.0g

CaCO₃2.0g

土豆糊精 25.0g

油酸甲酯 20.0ml

冷自来水加至1升

（灭菌前用5N NaOH调至pH至7.0）

^＊NZ Amine A

将装在250ml宽口三角瓶中的接过种的生产培养基于30-32℃在摇床上培养8-10天，摇床在两英吋圆圈中以250rpm旋转。

B.A82810的罐式发酵

为了提供大量接种物，利用10ml部分A制备的培养过的第一级培养基对400ml第二级生长培养基接种，其组成和第一级培养基一样。使此装在2升宽口三角瓶中的第二级生长培养基于30℃在摇床上培养大约72小时，摇床在两英吋圆圈中以250rpm旋转。

用此培养好的第二级生长培养基（800ml）对115升无菌的生产培养基（如部分A所述制备，不同处在于加入了消泡剂）接种。使此接过种的生产培养基在165升搅拌式发酵罐中于34℃温度下发酵8-10天。用低速气流（0.12-0.25V/V/m）和低转速搅拌（150-200rpm）使溶氧水平维持在空气饱和度的40%以上。

实例2

用实例1的方法生产A82810，不同处只是在部分B中：1）第二级生长培养基的组成如下：

第二级培养基Ⅱ

成分含量（g/L）

酵母膏 5.0

葡萄糖 5.0

土豆糊精 10.0

MgSO₄·7H₂O 2.0

甘油 1.0

去离子水加至1升

未调节的pH＝6.5;不进行PH调节，灭菌后

pH＝6.4。

以及2）生产培养基具有如下组成：

生产培养基Ⅱ

成分含量（g/L）

葡萄糖 10.0

猪肝粉 15.0

废糖蜜 5.0

MgSO₄·7H₂O 0.5

土豆糊精 25.0

自来水加至1升

未调节的pH＝6.1;用大约170ml5N NaOH

调至7.0;灭菌后pH＝6.4。

加入消泡剂：S_ag471（0.2g/L）和p-2000（0.1ml/L）。

实例3

利用实例1的方法生产A82810，不同在于：1）种子培养基如下：

种子培养基Ⅱ

成分含量（g/L）

胰蛋白酶（Trypticase）大豆汤 30

酵母膏 3

葡萄糖 5

麦芽糖 4

MgSO₄·7H₂O 2

去离子水加至1升

未调节的pH＝7.0

2）接过种的第一级培养基于36℃下培养48小时;2）接过种的第二级培养基于36℃下培养24小时;以及4）生产培养基体积是10升，培养温度是36℃，组成如下：

生产培养基Ⅲ

成分含量（g/L）

土豆糊精 30

葡萄糖 10

酷蛋白的酶促水解物^＊3

酵母 5

废糖蜜 15

MgSO₄（无水） 1

C_aCO₃2

自来水加足1升

未调节的pH＝6.3;用5N N_aOH调PH至7.0;

灭菌后pH＝6.4。

加入消泡剂：S_ag471（0.2g/L）和p-2000（0.5ml/L）。

^＊NZ Amine A

实例4 A82810的分离

将按与实例1和2所述方法类似的方法制备的2个100升罐的所有发酵液合并（215升），利用一种助滤料（3%，Hyflo Super-Cel，Manville Products Corp.，Lompoc CA 93436）使其通过压滤机过滤，以产生180升滤液。

用丙酮萃取菌丝体滤饼两次（每次60升）。合并丙酮萃取液，在真空下将体积浓缩至大约18升。浓缩物与培养基滤液合并。用5N N_aOH将此混合物的pH调至9，产生的溶液用2/3体积的乙酸乙酯萃取，搅拌1小时并冰冻过夜。分离乙酸乙酯萃取液（115升），与少量助滤料混合并过滤。澄清的萃取液在真空下浓缩成残渣。

此残渣溶于甲苯（200ml）中，将此溶液加到用甲苯装填的含有2升硅胶（Grace Grade，20-300目）的柱中。用甲苯（10升）洗涤柱子，用甲苯∶乙醇展开〔（98∶2），（96∶4）和（90∶10）依次各用10升〕，按每份1升收集。

通过利用枯草芽孢杆菌的生物检测法和红细胞琼脂平板的溶解来监测A82810的洗脱过程。合并含有大部分A82810的组分（13-20号），并浓缩至油状。将此油状物溶于二噁烷（200ml）中并冷冻干燥，得到了A82810粗制品，也为油状物。

A82810粗品溶于氯仿（200ml）中，加到氯仿装填的含有2升硅胶（Grace Grade 62，20-300目）的柱中。用氯仿（10ml）洗涤柱子，用氯仿∶丙酮展开〔（9∶1）、（4∶1）（7∶3）和（1∶1）依次各用10升〕，再用丙酮展开（10升），按每份1升收集。

通过生物检测来检测组分的洗脱，根据生物检测结果如下述合并组分：6-9号（合并液A），10-18号（合并液B）和19-28号（合并液C）。每种合并液都浓缩至残渣，然后溶于二噁烷中冰冷干燥。合并液A和C产生油状物质需要进一步纯化，而合并液B则产生9.9克作为白色粉末的A82810。

合并液A溶于丙酮中（900ml）并加至水中（1升）。用5N NaOH将溶液pH调至9.0，将溶液体积在真空下浓缩至大约1升。浓缩物用甲苯萃取两次，浓缩合并的萃取液，在二噁烷中冰冷干燥，又产生2.8克作为白色粉末的A82810。

以同样方式处理合并液C，但在冰冻干燥后仍然呈油状。将油状物质溶于乙晴（50ml）中立即便有晶体形成。使晶体过滤，在真空下干燥，又产生1224mg作为钠盐的纯A82810（熔点173-175℃）。

实例5 A82810钠盐的结晶：

通过在试管中的声处理，使无定形A82810钠盐（400mg）悬浮于己烷（50ml）中，然后将其在室温下放置。取出在试管壁上形成的结晶，真空干燥后产生50mg纯A82810的钠盐（熔点225-257℃）。

图2给出了在CHCl₃中的红外分析结果，图中显示了在下列频率（cm^-1）处有最大吸收：3020、2970、2952、2936、2679、1570、1458、1393、1380、1363、1359、1163、1115、1093、1075、1067、1054、1027、1010、1001、990、979和940。

场解吸（FD）质谱：图6。

实例6 A82810（游离酸）的制备：

将按实例4所述方法得到的A82810钠盐（200mg）溶于二噁烷（75ml）中。在此溶液中加入25ml水;通过加入1N HCl将所得溶液的pH调至3。此酸化溶液搅拌1小时，然后用氯仿萃取两次（每次100ml）合并氯仿萃取液，在真空下浓缩产生A82810的游离酸。

实例7 乙酰基-A82810的制备：

将200mg A82810的钠盐溶于4ml吡啶中;加入4ml乙酸酐;使混合物于室温下放置40小时。加入10ml水，用50ml氯仿萃取水溶液。用0.1N HCl、含有1%NaHCO₃的水和水各50ml依次洗涤氯仿萃取液。然后使氯仿萃取液在真空下浓缩成残渣，将残渣溶于丙酮中。在真空下浓缩丙酮溶液以除去残留的吡啶和乙酸。这一步骤重复三次，得到的残渣溶于苯中，冷冻干燥后得到204ml乙酰基-A82810的钠盐。

通过快原子轰击质谱（FABMS）分析，分子量＝906。

图3给出了在CHCl₃中的红外光谱，图中在下述频率（cm^-1）显示了最大吸收：3021、2976、2935、2880、2831、1728、1458、1379、1357、1321、1314、1247、1226、1223、1201、1185、1101、1094、1076、1056、1024、990、981、947、929、896和875。

实例8 丙酰基-A82810的制备：

200mgA82810的钠盐溶于4ml吡啶中;加入4ml丙酸酐;使混合物于室温下放置44小时。加入10ml水，用50ml氯仿萃取溶液。依次用0.1N HCl、含有1%N_aHCO₃的水和水各50ml洗涤氯仿萃取液。氯仿萃取液在真空下浓缩成残渣，将残渣溶于100ml丙酮中。在真空中浓缩丙酮溶液以除去残留的吡啶和丙酸。此步骤重复三次。使残渣溶于苯中，冷冻干燥后得到油状丙酰基-A82810的钠盐。

将油状物质溶于5ml乙晴中，然后加到用乙晴装填的含有20ml硅胶（Woelm，100-200μm）的柱中。用100ml乙晴洗涤柱子，用乙晴∶丙酮展开〔（9∶1）、（4∶1）、（7∶3）和（1∶1）依次各用100ml〕，最后用100ml丙酮展开，按每份25ml收集。

通过硅胶薄层层析监测洗脱过程，薄层层析用乙晴∶丙酮（1∶1）展开，然后用香子兰醛-H₂SO₄喷雾进行检测。合并含有大部分丙酰基-A82810钠盐的组分（13-23号），在真空中浓缩成残渣。将残渣溶于二噁烷中，冷冻干燥后得到47ml所需酯。

通过FDMS分析，分子量＝920。

图4给出了在CHCl₃中的红外光谱，图中显示在下列频率（cm^-1）具有最大吸收：2975、2971、2935、2879、2831、1571、1457、1398、1380、1364、1359、1321、1237、1225、1216、1213、1191、1163、1116、1093、1076、1068、1054、1027、1010、1001、990、980、945、940、929和861。

实例9-11

利用实例7-8的方法能够制备下述A82810的酯衍生物：

正庚酰基-A82810

戊酰基-A82810

叔丁酰基-A82810

实例12 A82810 4-溴苯基脲烷衍生物的制备：

200mg A82810的钠盐溶于25ml苯中，在搅拌下加入在25ml苯中的225mg4-溴苯基异氰酸酯。加入一滴三乙胺，混合物在室温下搅拌160小时。通过过滤分离形成的沉淀，滤液冷冻干燥后得到400mg A82810 4-溴苯基脲烷衍生物（钠盐）。

通过场解吸质谱（FDMS）分析，分子量＝1061。

图5给出了在CHCl₃中的红外光谱，图中显示在下列频率（cm^-1）具有最大吸收：2969、2935、2879、2830、1727、1589、1570、1517、1489、1460、1399、1379、1363、1344、1316、1306、1287、1265、1247、1238、1216、1211、1192、1163、1146、1116、1102、1093、1075、1068、1054、1025、1009、1000、990、979、943、923和861。

实例13-22

利用实例12的方法能够制备下述A82810的脲烷衍生物：

A82810 4-氯苯基脲烷

A82810 4-硝基苯基脲烷

A82810 4-甲基苯基脲烷

A82810 苯基脲烷

A82810 4-碘苯基脲烷

A82810 4-氟苯基脲烷

A82810 环己基脲烷

A82810 2-苯乙基脲烷

A82810 2-（苯基）环丙基脲烷

A82810 4-苯氧苯基脲烷

实例23 A82810甲基醚衍生物的制备：

将酸形式A82810溶于甲醇中;加入1/2体积的水。使溶液静置，直至形成醚衍生物为止。使溶液在真空下蒸发。产品通过（例如）硅胶层析后得到A82810甲基醚衍生物。

实例24-26

利用与实例23相同的方法和合适的醇或硫醇，能够制备下述A82810的醚衍生物：

A82810正丙基醚衍生物

A82810甲基硫醚衍生物

A82810正丁基醚衍生物

实例27 A82810的层析鉴别：

1.薄层层析

吸附剂：硅胶

层开***：乙晴∶丙酮（1∶1）

检测：枯草芽孢杆菌

R_f＝0.25

（在此***中，A82810的R_f值大约为0.44，用香子兰醛喷雾检测）。

2.高效液相层析

吸附剂：Waters μ Bondapak C18（4×300mm柱）

溶剂***：CH₃CN∶H₂O（9∶1）

含有1%HOA_C

检测：折射计

流速：3.0ml/分

保留时间：5.37分^a

^a为了比较，A80190在此***中的保留时间约为4.65分钟。

实例28 增效组合物的抗球虫菌活性

新孵化出的小鸡在无球虫菌的环境中饲养7天。在第8天的上午，称重小鸡，并分成不同的处理组。

在实验期间，每组小鸡（每组通常4或5只小鸡）都关在一套笼子里。对每套笼子内的小鸡都提供预计的恒定光照、饲料的任意摄取（每个实验都包括非药物和药物处理）和水。实验开始后两天，对要进行感染的小鸡用球虫卵囊的纯悬液作嗉囊插管。每次试验所用的卵囊剂量要能够在未用药物处理的动物中产生球虫病的临床症状。

使小鸡再生长7天后终止实验。称量每组小鸡，测定每组消耗掉的饲料量。由这些测量计算出小鸡的最终重量和饲料利用率。然后处死所有的小鸡，检查肠和盲肠，看是否存在有球虫诱导的损伤。

某些试验还包括测定卵囊的产生。进行这种测定时，在卵囊脱落期间收集每组小鸡所产生的粪便。然后稀释粪便，用血细胞计数器计数卵囊。此测定用来表明此寄生虫在小鸡内的繁殖能力，并因此对于药物控制动物感染的能力提供准确的测定。

表Ⅵ-ⅩⅩⅣ总结了用本发明的增效组合物以此方式测试时观察到的结果。

（接下页）

表Ⅵ.单独和结合使用A82810针对聚集艾美球虫（Eimeria acervulina）株59和纤细艾美球虫株155¹的抗球虫活性

总损伤等级

82810（ppm）

苯胺

（ppm）²0 0.5 1.0 1.5 2.0

0 1.0 12.1 10.7 8.4 5.4

4 12.4 7.6 6.3 4.0 3.5

8 10.9 6.8 3.7 3.6 2.5

12 10.4 6.2 4.9 2.1 4.3

16 10.8 6.5 3.6 1.0 0.5

体重增加，控制百分比

A82810（ppm）

苯胺

（ppm）²0 0.5 1.0 1.5 2.0

0 67 60 81 85 92

4 75 81 98 96 97

8 68 84 89 101 101

12 73 93 93 92 91

16 76 86 97 94 97

1球虫的离子载体敏感株

22，4-二硝基-N-〔4-（1，1，2，2-四氟乙氧基）苯基〕-6-（三氟甲基）苯胺

表Ⅶ.单独和结合使用A82810针对聚集艾美球虫株FS-316和纤细艾美球虫株FS-456¹的抗球虫活性

总损伤等级

A82810（ppm）

苯胺

（ppm）²0 0.5 1.0 1.5 2.0

0 9.7 8.7 9.3 7.7 9.6

4 9.6 8.3 7.2 6.5 4.3

8 7.9 5.9 7.5 3.6 3.3

12 6.5 3.6 3.5 2.0 2.0

16 4.2 2.9 1.6 1.5 1.1

体重增加，控制百分比

A82810（ppm）

苯胺

（ppm）²0 0.5 1.0 1.5 2.0

0 89 87 89 95 93

4 90 89 89 93 98

8 94 87 94 95 98

12 88 96 95 90 95

16 87 94 94 90 93

1 球虫的离子载体抗性株

2 2，4-二硝基-N-〔4-（1，1，2，2-四氟乙氧基）苯基〕-6-（三氟甲基）苯胺

表Ⅷ.单独和结合使用A82810针对聚集艾美球虫株FS-316和纤细艾美球虫株FS-456¹的抗球虫活性

体重增加，控制百分比

A82810（ppm）

化合物

（ppm）²0 0.5 1.0 1.5 2.0

0 80 81 77 85 80

8 76 88 86 83 89

10 77 86 88 91 92

12 75 89 88 91 91

14 70 88 88 87 90

肠损伤的平均等级

A82810（ppm）

化合物

（ppm）²

0 8.1 2.3 3.3 3.0 1.2

8 5.9 2.9 1.1 1.3 1.2

10 4.8 1.7 1.4 0.7 2.6

12 5.9 2.0 1.1 0.4 0.5

14 4.5 1.5 1.3 2.0 1.4

盲肠损伤的平均等级

A82810（ppm）

化合物

（ppm）²0 2.5 3.0 3.5 4.0

0 3.3 3.2 2.9 3.2 3.0

8 3.3 3.1 3.4 3.3 3.1

10 3.2 3.3 2.8 2.6 3.0

12 3.1 3.3 2.9 2.7 2.8

14 2.8 3.1 2.8 3.6 2.0

1 球虫的离子载体抗性株

2 2·4-二硝基-N-〔4-（1，1，2，2-四氟乙氧基）苯基〕-6-（三氟甲基）苯胺

表Ⅸ.单独和结合使用A82810针对聚集艾美球虫株FS-316和纤细艾美球虫株FS-456¹的抗球虫活性

体重增加，控制百分比

A82810（ppm）

化合物

（ppm）²0 4 5 6

0 89 87 95 98

16 91 89 89 86

18 91 90 89 87

20 84 91 86 87

22 88 89 84 85

24 85 92 85 84

肠损伤的平均等级

A82810（ppm）

化合物

（ppm）²0 4 5 6

0 5.3 2.8 1.3 1.7

16 2.3 0 0 0

18 1.1 0 0 0

20 1.8 0 0 0

22 3.0 0 0 0

24 0.8 0 0 0

盲肠损伤的平均等级

A82810（PPm）

化合物

（ppm）²0 4 5 6

0 3.2 3.2 2.3 3.2

16 2.9 1.0 0.8 0.6

18 3.0 0.4 0.5 0.5

20 2.9 1.2 0.8 0.6

22 2.6 1.2 0.4 0.5

24 1.6 0.8 1.6 0.3

1 球虫的离子载体抗性株

表Ⅹ.单独和结合使用A82810针对聚集艾美球虫株FS-316¹的抗球虫活性

体重增加，控制百分比

A82810（ppm）

化合物

（ppm）²0 0.5 1.0 1.5 2.0

0 69 72 73 73 76

4 74 75 71 76 83

8 71 81 80 81 79

12 82 83 87 84 87

16 75 87 82 84 90

肠损伤的平均等级

A82810（ppm）

化合物

（ppm）²0 0.5 1.0 1.5 2.0

0 8.5 7.3 7.8 7.9 8.8

4 6.9 7.1 8.4 7.5 6.5

8 8.4 6.4 7.3 5.9 4.3

12 6.3 5.3 4.8 2.4 0.3

16 5.8 0.1 0.9 0.1 0.1

1 球虫的离子载体抗性株

表Ⅺ.单独和结合使用A82810针对大艾美球虫（Eimeria maxima）株FS-177¹的抗球虫活性

肠损伤等级

A82810（ppm）

化合物

（ppm）²0 1.5 2.0

0 4.0 3.7 3.6

8 3.8 0.4 2.5

12 3.9 1.3 0.8

16 3.3 0 1.1

体重增加，控制百分比

A82810（ppm）

化合物

（ppm）²0 1.5 2.0

0 69 79 92

8 77 91 88

12 84 88 86

16 87 94 87

1 球虫的离子载体敏感株

表Ⅻ.单独和结合使用A82810针对大艾美球虫株FS-177¹的抗球虫活性

肠损伤的平均等级

A82810（ppm）

化合物

（ppm）²0 2 6 10

0 3.4 1.9 0.6 0.2

8 2.6

12 2.2 0.1 0.3 0.5

16 2.3 0.1 0.3 0.1

体重增加，控制百分比

A82810（ppm）

化合物

（ppm）²0 2 6 10

0 105 107 108 102

8 79

12 88 111 105 101

16 102 114 107 91

1 球虫的离子载体敏感株

表ⅩⅢ.单独和结合使用A82810针对大艾美球虫株LIT-626¹的抗球虫活性

体重增加，控制百分比

A82810（ppm）

化合物

（ppm）²0 1.25 1.5 1.75 2.0

0 98 99 102 101 94

8 94 97 94 99 95

10 99 95 92 97 97

12 93 94 89 97 95

14 98 95 93 92 94

肠损伤的平均等级

A82810（ppm）

化合物

（ppm）²0 1.25 1.5 1.75 2.0

0 4.0 3.7 3.3 4.0 3.3

8 2.5 1.5 3.7 0.3 2.0

10 3.5 0.9 1.0 3.4 1.2

12 1.8 2.9 1.8 2.1 0.8

14 3.8 1.2 1.7 2.2 1.3

1 球虫的离子载体抗性株

表ⅩⅣ.单独和结合使用A82810针对大艾美球虫株FS-410¹的抗球虫活性

体重增加，控制百分比

A82810（PPm）

化合物

（ppm）²0 2.5 3.0 3.5 4.0

0 86 90 88 88 91

8 90 90 92 92 86

10 90 93 94 87 87

12 88 91 96 90 98

14 92 92 89 90 91

肠损伤的平均等级

A82810（ppm）

化合物

（ppm）²0 2.5 3.0 3.5 4.0

0 3.8 3.8 3.1 3.5 2.2

8 3.8 2.8 1.3 2.8 1.7

10 3.8 2.7 1.4 3.2 1.0

12 3.7 0.8 0.7 0.3 1.1

14 3.3 1.4 1.2 0 0

1 球虫的离子载体抗性菌

表ⅩⅤ.单独和结合使用A82810针对大艾美球虫株FS-410¹的抗球虫活性

体重增加，控制百分比

A82810（ppm）

化合物

（ppm）²0 1.25 1.5 1.75

0 93 93 82 91

9 90 95 98 94

10 94 92 98 89

11 87 96 94 95

12 84 91 91 92

肠损伤的平均等级

A82810（ppm）

化合物

（ppm）²0 1.25 1.5 1.75

0 4.0 4.0 3.3 3.8

9 4.0 2.4 3.8 3.6

10 3.8 2.2 2.3 2.8

11 3.7 1.6 2.5 2.6

12 4.0 3.1 3.0 2.3

1 球虫的离子载体抗性株

表ⅩⅥ.单独和结合使用A82810针对大艾美球虫株FS-410¹的抗球虫活性

体重增加，控制百分比

A82810（ppm）

化合物

（ppm）²0 4 5 6

0 65 74 74 81

16 71 93 88 88

18 76 90 82 89

20 81 90 83 90

22 79 89 87 87

24 83 86 80 82

肠损伤的平均等级

A82810（ppm）

化合物

（ppm）²0 4 5 6

0 3.3 4.0 4.0 4.0

16 4.0 0.5 0 0.7

18 3.1 0 0 0.2

20 3.4 0.5 0 0

22 3.7 0 0 0.2

24 2.6 0 0.3 0

1 球虫的离子载体抗性株

表ⅩⅦ.单独和结合使用A82810针对大艾美球虫株FS-410¹的抗球虫活性

损伤等级

A82810（ppm）

化合物

（ppm）²0 2 6 10

0 3.9 2.3 2.7 2.4

8 3.3

12 2.9 2.1 1.4 1.1

16 2.4 1.9 1.1 0.8

体重增加，控制百分比

A82810（ppm）

化合物

（ppm）²0 2 6 10

0 65 85 89 88

8 68

12 59 90 88 85

16 74 90 79 83

卵囊生成的降低百分比

A82810（ppm）

化合物

（ppm）²0 2 6 10

0 0 18 18 36

8 4

12 0 12 39 59

16 0 35 73 78

1 球虫的离子载体抗性株

表ⅩⅧ.单独和结合使用A82810针对大艾美球虫株FS-410¹的抗球虫活性

肠损伤等级

A82810（ppm）

化合物

（ppm）²0 1.5 2.0

0 4.0 4.0 4.0

8 4.0 1.5 2.3

12 3.9 2.3 0.9

16 3.3 0.6 1.1

体重增加，控制百分比

A82810（ppm）

化合物

（ppm）²0 1.5 2.0

0 89 87 89

8 91 95 100

12 95 96 99

16 93 92 96

1 球虫的离子载体抗性株

表ⅩⅨ.单独和结合使用A82810针对聚集艾美球虫H&C和纤细艾美球虫Wis¹的抗球虫活性

肠损伤的平均等级

A82810（ppm）

化合物

（ppm）²0 2 6 10

0 6.2 1.2 0.4 0.3

8 6.0

12 5.1 1.0 0 0.4

16 4.7 0.4 0.5 0.1

体重增加，控制百分比

A82810（ppm）

化合物

（ppm）²0 2 6 10

0 65 98 91 80

8 62

12 64 95 90 76

16 69 97 90 65

1 球虫的离子载体敏感株

表ⅩⅩ.单独和结合使用A82810针对聚集艾美球虫株FS-273和纤细艾美球虫株FS-456¹的抗球虫活性

损伤等级

A82810（ppm）

化合物

（ppm）²0 2 6 10

0 8.9 7.2 3.7 2.0

8 9.4

12 8.4 4.9 1.2 1.2

16 8.0 1.6 2.0 0.9

体重增加，控制百分比

A82810（ppm）

化合物

（ppm）²0 2 6 10

0 63 68 89 86

8 70

12 72 86 92 82

16 74 95 89 83

卵囊生成的降低百分比

A82810（ppm）

化合物

（ppm）²0 2 6 10

0 0 22 65 83

8 17

12 18 84 94 100

16 20 95 99 99

1 球虫的离子载体抗性株

表ⅩⅩⅠ.单独和结合使用A82810对未感染小鸡生长的影响

体重增加，控制百分比

A82810（ppm）

化合物

（ppm）²0 1.25 1.5 1.75 2.0

0 - 98 101 105 99

8 100 100 103 98 102

10 101 102 98 97 100

12 94 98 102 97 97

14 98 99 99 100 96

表ⅩⅩⅡ.单独和结合使用A82810针对聚集艾美球虫株59和纤细艾美球虫株155¹的抗球虫活性

总损伤等级

A82810（ppm）

化合物

（ppm）²0 1.5 2.0

0 11.5 8.9 4.5

4 11.2 3.7 1.9

8 8.7 2.2 0.8

12 5.0 1.3 0.8

16 4.4 1.3 0.3

体重增加，控制百分比

A82810（ppm）

化合物

（ppm）²0 1.5 2.0

0 70 93 97

4 80 92 105

8 78 101 98

12 80 93 92

16 92 92 102

1 球虫的离子载体敏感株

2 4-氯-N-〔2，4-二硝基-6-（三氟甲基）苯基〕-1-萘胺

表ⅩⅩⅢ.单独和结合使用A82810针对大艾美球虫株FS-177¹的抗球虫活性

肠损伤等级

A82810（ppm）

化合物

（ppm）²0 1.5 2.0

0 3.9 3.5 3.3

4 3.8 3.1 0.8

8 3.8 1.3 1.5

12 3.2 1.0 0.3

16 1.0 0.5 0.5

体重增加，控制百分比

A82810（ppm）

化合物

（ppm）²0 1.5 2.0

0 87 99 100

4 87 95 98

8 80 88 97

12 85 88 93

16 84 87 86

1 球虫的离子载体敏感株

2 4-氯-N-〔2、4-二硝基-6-（三氟甲基）苯基〕-1-萘胺

表ⅩⅩⅣ.单独和结合使用A82810针对聚集艾美球虫株59和纤细艾美球虫株155¹的抗球虫活性

体重增加，控制百分比

A82810（ppm）

化合物

（ppm）²0 1.25 1.5 1.75

0 70 87 30 82

4 73 79 84 83

8 66 94 91 88

12 72 84 87 85

16 67 76 79 70

肠损伤的平均等级

A82810（ppm）

化合物

（ppm）²0 1.25 1.5 1.75

0 6.0 6.0 3.6 2.3

4 6.2 3.7 3.4 3.1

8 6.9 1.3 0.3 0.4

12 6.6 0.5 2.1 0.3

16 3.8 1.8 0 0.8

盲肠损伤的平均等级

A82810（ppm）

化合物

（ppm）²0 1.25 1.5 1.75

0 3.2 3.2 2.6 2.0

4 2.9 2.9 2.8 2.6

8 3.5 2.6 2.3 1.6

12 3.0 1.8 1.4 0.7

16 2.9 1.7 0.9 0.5

1球虫的离子载体敏感株

2 4-溴-N-〔2、4-二硝基-6-三氟甲基）苯基〕-1-萘胺

实例29 控制球虫病的含有A82810的鸡饲料

根据下述配方制备用以使鸡快速生长的平衡的高能饲料：

成分 % 磅

碾碎的黄玉米 50 1，000

精磨大豆粉，溶剂提取的去壳的 50%蛋白质 31.09 621.8

动物脂肪（牛脂） 6.5 130

干鱼粉，具有可溶物（60%蛋白） 5.0 100

玉米酒糟 4.0 80

磷酸二钙，饲料级 1.8 36

碳酸钙 0.8 16

维生素预混合物（具有维生素A、D、E、K和

B₁₂胆碱、烟酸、泛酸、核黄素、生物素、用葡萄

糖作为膨胀剂） 0.5 10

微量矿物质预混合物（含有MnSO₄、ZnO、

KI、FeSO₄、CaCO₃） 0.2 4

2-氨基-4-羟基丁酸（蛋氨酸的羟基类似物） 0.1 2

A82810（钠盐） 0.01 0.2

根据标准的饲料混合技术使这些物质混合。饲喂这种饲料的鸡再加上水的随意饮用，可保护其不受球虫病的影响;而体重增加与喂以未加药物的同样饲料的无球虫病小鸡差不多。

实例30-32

控制球虫病的A82810增效的鸡饲料组合物

如实例29所述制备鸡饲料，但是用下述A82810的增效结合物作为活性组分：

组分 ppm

A82810 0.25-10

2、4-二硝基-N-〔4-（1，1，2，2-四氟

乙氧基）苯基〕-6-（三氟甲基）苯胺 4-24

组分 ppm

A82810 0.25-10

4-氯-N-〔2、4-二硝基-6-（三氟甲

基）苯基〕-1-萘胺 4-24

组分 ppm

A82810 0.25-10

4-溴-N-〔2、4-二硝基-6-（三氟甲

基）苯基〕-1-萘胺 4-24

实例33 含有A82810的改善的肉牛饲料

如下述制备平衡的高粮肉牛饲料：

成分 % 磅

精磨玉米 67.8 1356

碾碎的玉米穗轴 10 200

脱水苜蓿粉，17%蛋白 5 100

去壳大豆粉，溶剂提取的，50%蛋白 9.9956 199.912

甘蔗糖蜜 5 100.0

脲 0.6 12.0

A82810（N_a盐） 0.0044 0.088

磷酸二钙，饲料级 0.5 10.0

碳酸钙 0.5 10.0

氯化钠 0.3 6.0

微量矿物质预混合物 0.03 0.6

维生素A和D₂预混合物^＊0.07 1.4

维生素E预混合物^＊＊0.05 1.0

丙酸钙 0.15 3.0

^＊每磅含有：2，000，000国际单位维生素A;227，200国际单位维生素D₂和385.7克大豆饲料，加有1%油。^＊＊具有可溶物的干玉米酒糟，每磅含有20，000国际单位的d-α-乙酸生育酚酯

将混合饲料制成丸。如果每只动物平均每天摄入15磅饲料，则此饲料将为每只动物每天提供大约300mg的A82810（钠盐）。

实例34 A82810改进的猪饲料

如下述制备平衡的猪产仔饲料：

成分 % 磅/吨

碾碎的黄玉米 65.10 1302

去壳的大豆油粉，溶剂提取的 18.50 370

干的甜菜果肉 10.00 200

磷酸二钙 2.90 58

碳酸钙 1.20 24

猪维生素预混合物¹1.10 22

盐（NaCl） 0.55 11

氯化胆碱，25% 0.35 7

微量矿物质预混合物²0.15 3

维生素A预混合物³0.10 2

蛋氨酸的羟基类似物 0.05 1

总计 100.00 2000

1 每公斤预混合物含有：77，161usp单位维生素D₂;2，205国际单位维生素E;441mg核黄素;1，620mg泛酸;2，205mg烟酸;4.4mg维生素B₁₂;441mg维生素K;19，180mg胆碱;110mg叶酸;165mg吡哆醇;110mg硫胺素;22mg生物素。

2 每公斤预混合物含有：50克硫酸锰形式的锰;100克碳酸锌形式的锌;50克硫酸亚铁形式的铁;5克氧化铜形式的铜;1.5克碘化钾形式的碘和最多150克而最少130克的碳酸钙形式的钙。

3 每公斤预混合物含有6，613，800usp单位的维生素A。

为了制备200磅这种饲料，如下制备预混合物：将10克A82810加至少量溶剂提取的大豆饲料中，在研缽中用研棒磨碎，再加入溶剂提取的大豆饲料将研碎的混合物稀释至一磅。然后将此预混合物加到200磅上述猪饲料中，通过标准技术混合。在这种加有药物的饲料中，每吨饲料基质中含有100克A82810。用此药物饲料在产仔前至少喂养母猪一天，优选喂养七至十天，在产仔后的喂养时间长短视需要而定。

改变预混合物中A82810的数量和/或饲料基质的数量，制备出大量或少量具有不同A82810水平的药物饲料。

喂养母猪的比率为每100磅饲料1.0至10克A82810。药物饲料和水是可以随意摄取的。通常，母猪每天大约消耗6-8磅饲料。

实例35 用于猪仔的A82810制剂

A82810溶于少量乙醇中。将此乙醇溶液悬于聚乙二醇200中。浓缩悬浮液，使每单位剂量的体积为大约0.5-2ml。将这种悬浮液以每磅0.5-50mg的比率喂给幼猪，每天3次通过管饲法进行。

实例36 控制猪痢疾的改进饲料

利用下述组分通过标准方法制备预混合物：

成分含量（g/Kg）

活性化合物 150.0

硅酸钙 20.0

碳酸钙（牡蛎壳粉） 830.0

总重 1000g

利用标准的饲料混合技术，将此预混合物加至市售猪饲料中，得到的最终浓度为大约100克活性化合物/吨饲料。

Claims

1、一种制备下述化合物的方法：式1的抗菌素A82810

其中，R是氢；或它的一种衍生物，其中R是-CONHR₁，R₁是烷基、芳基、烷芳基、芳烷基、卤代芳基、硝基芳基、卤代芳烷基烷氧芳基、芳氧芳基、芳基环烷基、酰基芳基和环烷基；或其酰基或烷基酯；或烷基醚衍生物；或其盐，其特征在于该方法包括在深层通气发酵的条件下，在含有可同化碳源，氮源和无机盐的培养基中，培养纤维马杜拉放线菌(Actinomadura Fibrosa)新种NRRL18348，或其生产A82810的突变体，以制备抗菌素A82810；并且，如果需要的话，还可任意地盐化、酯化、酰基化、形成其醚衍生物，或使之与式R₁-NCO的异氰酸酯反应。

2、根据权利要求1的方法，其特征在于制备抗菌素A82810或其农学上可接受的盐。

3、根据权利要求1的方法，其特征在于制备抗菌素A82810。

4、纤维马杜拉放线菌新种NRRL 18348的生物学纯培养物，或其产生A82810的突变体。

5、一种抗球虫菌的组合物，其特征在于它含有如权利要求1-3中任一项所定义的A82810，以及从由下列构成的一组物质中选择出第二组分;a）硝卡巴嗪，b）4、4′-二硝基对称二苯脲，c）结构式如下的苯胺

其中：

R²是C₁-C₄烷基;

R³是卤素、C₁-C₄氟代烷基，C₁-C₄氟代烷氧基或C₁-C₄氟代烷硫基;

R⁴是卤素;

R⁵是氢或卤素;

m是0、1或2;以及

n是0或1;

前提是，如果存在有R₄取代基，则它不在2位;

d）由下述选择出来的苯胺：2，4-二硝基-N-〔4-（三氟甲氧基）苯基〕-6-（三氟甲基）苯胺、2，4-二硝基-N-〔4-（1，1，2，2-四氟乙氧基）苯基〕-6-（三氟甲基）苯胺或2，4-二硝基-N-〔4-（五氟乙氧基）苯基〕-6-（三氟甲基）苯胺;

e）二氯二甲吡啶酚;或

f）（a）-（e）化合物的药物上可接受的盐;存在于饲料中的各组分的数量在结合起来时至少对对抗一种导致球虫病的艾美球虫株有增效作用。

6、如权利要求5的抗球虫菌组合物，它含有作为活性成分的A82810，或其农学上可接受的盐，以及2，4-二硝基-N-〔4-（1，1，2，2-四氟乙氧基）苯基〕-6-（三氟甲基）苯胺或其农学上可接受的盐。