CN103834596B

CN103834596B - 一种枯草芽孢杆菌shou003、抗弧菌蛋白及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN103834596B
Application number: CN201410084416.6A
Authority: CN
Inventors: 张庆华; 郭婧; 王娟; 封永辉; 宋增福; 陈彪; 张永华
Original assignee: Shanghai Maritime University
Current assignee: Shanghai Maritime University
Priority date: 2014-03-10
Filing date: 2014-03-10
Publication date: 2017-02-08
Anticipated expiration: 2034-03-10
Also published as: CN103834596A

Abstract

本发明提供了一种枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）shou003、抗弧菌蛋白及其制备方法与应用，通过在健康大黄鱼的肠道中筛选出一株枯草芽孢杆菌shou003（于2013年11月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M2013571），并在该枯草芽孢杆菌shou003发酵液中提取到一种抗弧菌蛋白，该抗弧菌蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO：1所示，其中，枯草芽孢杆菌shou003以及抗弧菌蛋白对水产病原菌，尤其是病原弧菌具有良好的抑制作用，并且枯草芽孢杆菌shou003对温度、NaCl、胃液、肠液以及胆盐具有良好耐受性，能广泛应用于水产养殖过程中的病菌防治；在此基础上，本发明提供上述枯草芽孢杆菌shou003最优的发酵培养方法以及抗弧菌蛋白的制备方法。

Description

一种枯草芽孢杆菌shou003、抗弧菌蛋白及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，尤其涉及一种枯草芽孢杆菌shou003、抗弧菌蛋白及其制备方法与应用。

背景技术

弧菌病(Vibriosis)是由弧菌属(Vibrio)细菌引起的，在世界各地养殖鱼、虾、蟹及贝类等水产动物中普遍流行且危害最大的细菌性疾病，对水产养殖业造成的经济损失不可估量。

目前，在水产养殖业用来控制弧菌病的主要手段是抗生素防治，因为抗生素使用起来方便，便于操作，而且其见效比较快，疗效也比较好。然而由于抗生素等化学药物的长期应用及滥用，导致许多细菌已对其逐渐产生耐药性，从而增加了病害的防治难度，且有些药物残留严重，严重危害到人类的健康。

因此人们积极探索使用中草药、免疫制剂、益生菌等新措施防治病害，其中，益生菌作为一种生物防治方法，不仅能够有效的控制病原菌的数量，减少疾病的发生，增强养殖动物的免疫力，而且还能改善养殖生态环境，维护微生态平衡，具有广阔的应用前景。筛选抗菌效果良好的益生菌，对于生物防治弧菌病至关重要。

发明内容

本发明的目的在于提供一种枯草芽孢杆菌shou003，旨在解决现有抗生素防治弧菌病导致的细菌产生耐药性、防治难度增大且会危害人类健康等问题。

本发明的再一目的在于提供上述枯草芽孢杆菌shou003发酵培养的方法。

本发明的再一目的在于提供上述枯草芽孢杆菌shou003的应用。

本发明的再一目的在于提供一种通过上述枯草芽孢杆菌shou003发酵得到的抗弧菌蛋白，该蛋白对病原弧菌具有良好的抑制作用。

本发明的再一目的在于提供上述抗弧菌蛋白的制备方法。

本发明是这样实现的，一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)shou003，于2013年11月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2013571。

本发明进一步提供了上述枯草芽孢杆菌shou003发酵培养的方法，包括以下步骤：

(1)取所述枯草芽孢杆菌shou003菌种接种到活化培养基中，37℃摇床培养18～20h后，在8000r/min条件下离心5min，取沉淀用无菌水洗涤并配成浓度为10⁷CFU/ml菌液；

(2)将所述菌液按发酵培养基1％体积的接种量接种至发酵培养基中，在4～40℃、pH为4～7条件下摇床培养10～16h，得到枯草芽孢杆菌shou003发酵液。

优选地，在步骤(1)中，所述活化培养基包括以下按质量份计各组分：

蛋白胨 9～10份，

牛肉浸出粉 2～3份，

氯化钠 4～5份；

在步骤(2)中，所述发酵培养基pH为5，且所述发酵培养基包括以下按质量份计各组分：

麦芽糖 1～2份，

牛肉膏 1～2份，

CaCl₂ 0.2～0.3份。

蛋白胨 10份，

牛肉浸出粉 3份，

氯化钠 5份；

在步骤(2)中，所述发酵培养基包括以下按质量份计各组分：

麦芽糖 2份，

牛肉膏 2份，

CaCl₂ 0.3份。

本发明进一步提供了上述枯草芽孢杆菌shou003在水产养殖中的应用。

优选地，所述枯草芽孢杆菌shou003用于抑制水产病原菌。

优选地，所述水产病原菌包括副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、迟缓爱德华菌(Edwardsiella tarda)。

本发明进一步提供了一种抗弧菌蛋白，通过对上述枯草芽孢杆菌shou003的胞外产物进行浓缩提取得到，该抗弧菌蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明进一步提供了上述抗弧菌蛋白的制备方法，包括以下步骤：

(1)将权利要求1所述的枯草芽孢杆菌shou003在营养琼脂斜面上活化后接种于营养肉汤培养基，28℃恒温振荡培养18～20h，在9600r/min、4℃条件下离心20min，取上清液经0.22μm微孔滤膜过滤，得到过滤液体；

(2)用硫酸铵沉淀法对所述过滤液体提取，获得抗弧菌蛋白提取液。

优选地，所述硫酸铵沉淀法包括以下步骤：取芽孢杆菌过滤液50ml，加入固体硫酸铵使溶液达到质量百分比浓度70％，4℃下过夜，于8000r/min离心20min后得沉淀物，沉淀用0.05M Tris-HCl缓冲液溶解，透析48h后取袋内物质，即为该浓度硫酸铵沉淀所获得的蛋白。

本发明克服现有技术的不足，提供一种枯草芽孢杆菌shou003、抗弧菌蛋白及其制备方法与应用，通过在健康大黄鱼的肠道中筛选出一株枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)shou003(于2013年11月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M 2013571)，并通过该枯草芽孢杆菌shou003发酵提取到一种抗弧菌蛋白，该抗弧菌蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，其中，枯草芽孢杆菌shou003以及抗弧菌蛋白对水产病原菌，尤其是病原弧菌具有良好的抑制作用，并且枯草芽孢杆菌shou003对胃液、肠液以及胆盐均有较好的耐受性，在70℃的高温下仍具有活性并能生长，对常见的抗生素敏感，没有可转移的耐药因子，且对实验动物安全无副作用，说明该菌具有益生菌的特性，能够应用于水产养殖过程中的病菌防治，不仅能够有效的控制病原菌的数量，减少疾病的发生，增强养殖动物的免疫力，而且还能改善养殖生态环境，维护微生态平衡，具有广阔的应用前景。在此基础上，本发明提供了上述枯草芽孢杆菌shou003最优的发酵培养方法以及抗弧菌蛋白的制备提取方法。

附图说明

图1是本发明实施例3中枯草芽孢杆菌shou003对温度的耐受性试验结果；

图2是本发明实施例3中枯草芽孢杆菌shou003对NaCl的耐受性试验结果；

图3是本发明实施例3中枯草芽孢杆菌shou003对人工胃液的耐受性试验结果；

图4是本发明实施例3中枯草芽孢杆菌shou003对人工肠液的耐受性试验结果；

图5是本发明实施例3中枯草芽孢杆菌shou003对胆盐的耐受性试验结果；

图6是本发明实施例7中抗弧菌蛋白的SDS-PAGE电泳结构图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1 枯草芽孢杆菌shou003的分离

本发明所述的枯草芽孢杆菌shou003(Bacillus subtilis)通过在健康大黄鱼的肠道分离得到，分离方法具体为：

首先用75％的酒精进行体表消毒；无菌条件下解剖，取出肠道，75％酒精棉球擦拭肠管外壁，无菌生理盐水反复冲洗。制备肠道总菌悬液时(包括肠壁和肠内容物)，先用无菌棉线分别结扎前肠、中肠及后肠部位，各取约0.5cm长的组织混合在一起作为样品，称重后按1∶10(w/v)的比例加入灭菌生理盐水混合，用灭菌匀浆器充分研磨均匀，研磨的样品设为10^-1，再用灭菌生理盐水对10^-1样品进行倍比稀释至10^-6，各稀释度样品均置于漩涡混合仪上振荡均匀。分别取各稀释度样品0.1ml涂布于锰营养琼脂、硫代硫酸盐柠檬酸盐胆盐蔗糖琼脂(TCBS)、伊红美蓝琼脂(EMB)、海水琼脂(2216E)、淡水琼脂(FWA)及营养琼脂培养基平板，另做两个平行对照。其中锰营养琼脂平板置60℃处理2h后于28℃培养1～2d，其他平板直接置28℃培养1～2d。观察并记录各平板上的菌落特征。

实施例2 枯草芽孢杆菌shou003的发酵培养

(1)取所述枯草芽孢杆菌shou003菌种接种到活化培养基中，37℃摇床培养18～20h后，在8000r/min条件下离心5min，取沉淀用无菌水洗涤并配成浓度为10⁷CFU/ml菌液；其中，活化培养基的制备过程为：蛋白胨9g，牛肉浸出粉2g，氯化钠4g，加蒸馏水1000ml，加热溶解后分装烧瓶，经121℃灭菌15min。

(2)将所述菌液按发酵培养基1％体积的接种量接种至发酵培养基中，在4～40℃、pH为4条件下摇床培养10～16h，得到枯草芽孢杆菌shou003发酵液；所述发酵培养基的制备过程为：麦芽糖1g，牛肉膏1g，CaCl₂0.2g，加蒸馏水1000ml，加热溶解后分装烧瓶，经121℃灭菌15min。

实施例3 枯草芽孢杆菌shou003的耐受性

用接种环挑取枯草芽孢杆菌shou003斜面菌种接种到活化培养基中，37℃摇床培养18～20h后，8000r/min离心5min弃上清，用无菌水洗涤3次，最后用无菌水制成菌液，利用麦氏比浊管将菌液浓度调至10⁷CFU/ml，用于对温度、NaCl、胃液、肠液以及胆盐的耐受性试验。

(1)耐温性

取12支粗试管分成4组，每组3个重复平行，每支加入10ml发酵培养基，灭菌后将枯草芽孢杆菌shou003以1％的接种量分别接种于12支试管中，然后分别于70℃、80℃、90℃和100℃处理30min后，于37℃下培养12h后取样测各组菌液600nm处的OD值。

试验结果如图1所示，经70℃处理后，芽孢杆菌仍能够生长，但是随着处理温度的升高，OD值逐渐降低；在80℃和90℃高温的作用下，细菌的生长受到影响，但是还是能生长，而在100℃作用后，细菌的生长受到抑制，基本不生长。

(2)耐盐性

在发酵培养基中加入NaCl，使其质量分数分别为0‰、5‰、20‰、50‰、70‰、100‰，分装于250ml三角烧瓶中，每瓶100ml，将芽孢杆菌菌悬液以1％接种量接入上述培养基中，于37℃摇床中培养12h后，测600nm处的OD值。

试验结果如图2所示，枯草芽孢杆菌shou003在生长过程中对NaCl有一定的需求，在0～35‰的范围内，细菌生长良好，在5‰的NaCl浓度时生长最好，当浓度超过5‰之后，随着浓度的升高，菌的生长受到一定抑制，但盐度为50‰细菌生长还好。一般海水的平均盐度，以太平洋海水为例，为35‰，所以，本菌对海水和淡水盐度均能适应，适应范围比较宽。

(3)耐胃液性

用1mol/L HCl将灭菌的蒸馏水进行稀释，使无菌水的pH分别为1.5、2.5和3.5，每个pH分别取100ml至250ml三角瓶中，121℃灭菌30min；冷却至50℃以下后，每个三角瓶中加入0.5g胃蛋白酶混匀；将芽孢杆菌的菌悬液按1％的接菌量加入三角烧瓶中，于37℃摇床中培养，分别测定各芽孢杆菌在0、1、2、3h的OD_600nm。

试验结果如图3所示，枯草芽孢杆菌shou003对人工胃液具有较好的耐受性，在pH为3.5时，菌体受到的影响较小，细菌数量降低了约30％；而随着pH的降低，酸性的增强，菌体生长受到的抑制作用也逐渐增强，在pH为1.5的胃液环境下，作用2h后，菌体数量降低到原来的48.9％。

(4)耐肠液性

取0.68g磷酸二氢钾溶解于100ml水中，然后用1mol/L的NaOH将pH调至6.8，121℃灭菌30min，冷却至50℃以下后，每个三角烧瓶中加入1g胰蛋白酶混匀；将芽孢杆菌的菌悬液按1％的接菌量加入三角烧瓶中，于37℃摇床中培养，分别测定各芽孢杆菌在0、1、2、3h的OD_600nm。

试验结果如图4所示，枯草芽孢杆菌shou003在模拟肠液条件下生长3h，前2个小时，细菌的含量随时间的延长逐渐降低，而3h后，细菌的含量反而升高，与初始值相比仅降低了9％，该枯草芽孢杆菌对肠液有很好的耐受性。

(5)耐胆盐性

在发酵培养基中加入胆盐，使其质量分数分别为0.25％、0.5％、1％、1.5％和2％，分装于250ml的三角烧瓶中，每瓶100ml，121℃灭菌30min；将芽孢杆菌的菌悬液按1％的接菌量加入三角烧瓶中，于37℃摇床中培养，分别于0、1、2、3h测定OD_600nm。

试验结果如图5所示，枯草芽孢杆菌在含胆盐条件下生长3h，前2个小时，细菌含量随时间的延长逐渐降低，而3h后，细菌含量反而升高，说明该枯草芽孢杆菌对胆盐具有较好的耐受性，在胆盐含量较高时，芽孢杆菌虽不能生长，但不致死亡。

实施例4 枯草芽孢杆菌shou003对抗生素的敏感性

取0.1ml芽孢杆菌菌悬液涂布于检测培养基平板上，待菌液被吸收后，贴上药敏纸片于37℃培养16h后，测量抑菌圈直径。试验所用抗生素以及结果如下表1所示：

表1 枯草芽孢杆菌shou003对抗生素的敏感性

枯草芽孢杆菌shou003对18种常用饲用抗生素均较敏感，用于畜禽饲料是安全的，具有作为益生菌的潜质，同时，在使用时应注意避免与抗生素同时使用。

实施例5 枯草芽孢杆菌shou003的安全性

血平板：将营养肉汤培养基中过夜培养的待测菌株划线接种于羊血平板上，37℃培养24h，根据菌落周围透明圈的形成，来判断溶血素的产生，并以溶藻弧菌Va-Y(扬州大学付立霞老师惠赠，已在文献：“王娟，封永辉，蔡立胜，王建，曲宪成，张庆华(通讯作者)。来自大黄鱼肠道的弧菌拮抗菌的筛选与鉴定，海洋与湖沼，2010，41(5)：707-713.”中公开)作为阳性对照。

小鼠：将营养肉汤中培养18h的菌株，离心去培养基，用0.85％的生理盐水梯度稀释为9×10¹⁰CFU/ml，9×10⁹CFU/ml，9×10⁸CFU/ml三个浓度。然后腹腔注射感染小鼠，1ml/只，每组6只，生理盐水作为阴性对照，溶藻弧菌Va-Y作为阳性对照(9×10⁹CFU/ml)。喂养一周后，观察小鼠生长情况。

异育银鲫：方法同小鼠实验，腹腔注射感染鲫鱼，1ml/尾，每组10尾，生理盐水作为阴性对照，溶藻弧菌Va-Y作为阳性对照(9×10⁹CFU/ml)。喂养一周后，观察鲫鱼生长情况。

通过平板溶血试验发现，溶藻弧菌Va-Y在血平板上有溶血现象，而枯草芽孢杆菌shou003在血平板上未观察到溶血现象，初步表明该菌株不产生溶血素，不具有潜在的致病性。

感染溶藻弧菌Va-Y的小鼠，2天内出现不同程度的中毒现象，而实验小鼠一周后均未出现中毒现象，与对照组无差异，可以判断该菌株对小鼠不具有致病性。

注射溶藻弧菌Va-Y的鲫鱼第二天内全部死亡，而实验小鼠均未出现中毒现象，与空白对照无差异，可以判断该菌株对鲫鱼不具有致病性。

实施例6 抗弧菌蛋白的制备

(2)用硫酸铵沉淀法(参照文献：“汪家政，生物化学，范明.蛋白质技术手册：科学出版社；2000”记载方法操作)对所述过滤液体提取，获得抗弧菌蛋白提取液；其中，硫酸铵加入所述过滤液体后的质量浓度为70％。

在步骤(2)中，所述硫酸铵沉淀法具体包括以下步骤：取芽孢杆菌过滤液50ml，加入固体硫酸铵使溶液达到质量百分比浓度70％，4℃下过夜，于8000r/min离心20min后得沉淀物，沉淀用0.05M Tris-HCl缓冲液溶解，透析48h后取袋内物质，即为该浓度硫酸铵沉淀所获得的蛋白。

(3)拮抗实验检测发现编号为7的蛋白质对溶藻弧菌Va-Y(扬州大学付立霞老师惠赠，已在文献：“王娟，封永辉，蔡立胜，王建，曲宪成，张庆华(通讯作者)。来自大黄鱼肠道的弧菌拮抗菌的筛选与鉴定，海洋与湖沼，2010，41(5)：707-713.”中公开)的生长具有抑制作用。

实施例7 抗弧菌蛋白的检测

(1)取4.9ml蒸馏水，6ml 30％丙烯酰胺，3.8ml 1.5mol/L Tris-HCl，150μl 10％SDS，150μl 10％过硫酸铵，6μl TEMED混合均匀，灌胶到适当高度后，加入1ml无水乙醇封住，待胶体凝固后将乙醇倒出，用吸水纸彻底吸干乙醇；灌满5％浓缩胶：取5.5ml蒸馏水，1.3ml 30％丙烯酰胺，1.0ml 1.5mol/L Tris-HCl，80μl 10％SDS，80μl 10％过硫酸铵，8μlTEMED混合均匀，注入分离胶上层，后立即***梳子，待30min胶体凝固后取出梳子，将1×电泳缓冲液倒入电泳槽，并淹没短玻璃板。

(2)取20μl蛋白提取液与4μl样品缓冲液(5×)混合，于100℃水浴加热3min使蛋白变性，用移液枪以20μl的量注入点样孔，以样品缓冲液作为阴性对照。

(3)进行电泳时，采用浓缩胶中的电压为80V，分离胶中电压为120V，当溴酚蓝前沿跑至距底线1cm时关闭电源。

(4)蛋白凝胶电泳结束后，将凝胶从玻璃板上小心取下，加100ml纯水，水平摇动(30r/min)30min；将纯水倒出，加入染色液100ml，加盖密封，水平摇动(30r/min)1h至过夜；将染色液倒出，加入脱色液100ml，加盖密封，水平摇动(30r/min)；至凝胶的背景降低到可以接受的时候，将脱色液倒出，倒入100ml纯水，扫描凝胶，结果如图6所示，该抗弧菌蛋白的分子量为59KD。

(5)采用生工割胶回收试剂盒(Micro Protein PAGE Recovery Kit，BSP062)进行蛋白质回收。

实施例8抗弧菌蛋白的拮抗实验及测序

(1)将溶藻弧菌Va-Y培养18～20h后用0.85％的灭菌生理盐水洗下菌苔，参照麦氏比浊管调节其浓度为10⁵CFU/ml，取0.1ml涂布于适宜平板上，用涂布棒涂布均匀。

(2)用镊子将4只无菌的牛津杯均匀地放入水平放置的平皿中，吸取0.25ml蛋白溶液于牛津杯中，注意不要溢出牛津杯外。37℃培养24～48h观察有无抑菌圈出现并记录直径。

(3)将有抑菌圈产生的抗弧菌蛋白送至上海生工生物有限公司进行质谱鉴定，测序结果如SEQ ID NO：1所示。特定的多肽序列对应着特定的蛋白，从而根据多肽序列鉴定出待检测蛋白。枯草芽孢杆菌shou003的肽指纹图谱中有16条肽段与几丁质酶相匹配，蛋白序列覆盖率约为38％，鉴定结果显示，对弧菌具有抑菌作用的蛋白质为几丁质酶。

实施例9 shou003的抗菌谱测定

参照Smith等的方法(Smith P,Davey S,1993.Evidence for the competitiveexcluding of Aeromonas salmonicida from fish with stress-induciblefurunculosis by a Fluorescent Pseudomonad.Journal of Fish Disease,16:521-524)稍作修改。具体步骤为：用一定量的无菌生理盐水(0.85％NaCl)将活化后的副溶血弧菌(Vp1.2164)、溶藻弧菌(Va-Y)、嗜水气单胞菌(Ah-9)、迟缓爱德华菌(Et-Y)的菌苔洗下，分别吸取100μl加入营养琼脂培养基平板上进行涂布。然后用接种环分别刮取已扩大培养24h的实验菌株在上述平板上点种，并标上相应编号，28℃恒温培养，24～48h进行抑菌圈的观察和测量，结果如下表2所示：

表2 shou003菌株对病原菌的抗菌谱

从表2中可以看出，菌株shou003对两株病原弧菌的拮抗作用较强，对副溶血弧菌(Vp1.2164)和溶藻弧菌(Va-Y)的抑菌圈直径分别达到16mm和9.5mm；而且对水产上常见的两种病原菌，嗜水气单胞菌(Ah-9)、迟缓爱德华菌(Et-Y)的抑菌圈直径分别达到：15.2mm、11.3mm。

相比与现有技术的缺点和不足，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明的枯草芽孢杆菌shou003对病原弧菌具有良好的抑制作用，并且对盐度、胃液、肠液以及胆盐均有较好的耐受性，在70℃的高温下仍具有活性并能生长，对常见的抗生素敏感，没有可转移的耐药因子，且对实验动物安全无副作用，说明该菌具有益生菌的特性，能够应用于水产养殖过程中的病菌防治，有效控制病原菌的数量，减少疾病的发生，增强养殖动物的免疫力，具有广阔的应用前景。

(2)本发明的枯草芽孢杆菌shou003发酵培养的方法为该枯草芽孢杆菌shou003最优的发酵方法，能进行规模化发酵，适于产业化发展。

(3)本发明的抗弧菌蛋白对病原弧菌具有良好的抑制作用，可以制备成单独的试剂或药品，具有良好的应用前景。

(4)本发明的抗弧菌蛋白的制备方法简单，适于产业化发展。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)shou003，于2013年11月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2013571。

2.一种发酵培养权利要求1所述的枯草芽孢杆菌shou003的方法，其特征在于包括以下步骤：

(2)将所述菌液按发酵培养基1％体积的接种量接种至发酵培养基中，在4～40℃、pH为4～7条件下摇床培养10～16h，得到枯草芽孢杆菌shou003发酵液；

在步骤(1)中，所述活化培养基包括以下各组分：

蛋白胨 9～10g/L，

牛肉浸出粉 2～3g/L，

氯化钠 4～5g/L；

在步骤(2)中，所述发酵培养基pH为5，且所述发酵培养基包括以下各组分：

麦芽糖 1～2g/L，

牛肉膏 1～2g/L，

CaCl₂ 0.2～0.3g/L。

3.如权利要求2所述的发酵培养枯草芽孢杆菌shou003的方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述活化培养基包括以下各组分：

蛋白胨 10g/L，

牛肉浸出粉 3g/L，

氯化钠 5g/L；

在步骤(2)中，所述发酵培养基包括以下各组分：

麦芽糖 2g/L，

牛肉膏 2g/L，

CaCl₂ 0.3g/L。

4.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌shou003在制备水产养殖饲料中的应用。

5.如权利要求4所述的枯草芽孢杆菌shou003在制备水产养殖饲料中的应用，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌shou003用于抑制水产病原菌；

所述水产病原菌包括副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、迟缓爱德华菌(Edwardsiellatarda)。