CN108753833B - 斑马鱼notch3基因突变体的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了涉及一种斑马鱼notch3基因突变体的制备方法;包括如下步骤:确定notch3基因敲除的靶点位置;以pUC19‑gRNA scaffold质粒为模板,使用引物T7‑notch3‑sfd、tracr rev进行PCR扩增;对PCR产物纯化、体外转录获得gRNA;将gRNA与Cas9蛋白导入斑马鱼胚胎一细胞期中,培养获得稳定遗传的notch3基因突变体。本发明利用CRISPR/Cas9技术,通过选择独特的一段打靶区,使得斑马鱼中的notch3基因被敲除,又不“误伤”其他基因,形成Notch3敲除的斑马鱼;另外,本发明还公开了notch3基因缺失斑马鱼突变体的表型,对于研究Notch信号通路意义重大。
Description
技术领域
本发明涉及一种斑马鱼突变体,具体涉及一种斑马鱼notch3基因突变体的制备方法。
背景技术
CRISPR/Cas***最早是在细菌的适应性免疫***内发现的,其主要功能是对抗入侵的病毒及外源DNA。1987年大阪大学(Osaka University)的研究人员在Escherichiacoli K12的碱性磷酸酶基因附近发现了成簇的规律间隔的短回文重复序列(Clusteredregularly interspaced short palindromic repeat,CRISPR)和CRISPR相关基因(CRISPR-associated genes,Cas gene),目前普遍认为有40%的细菌基因组具有这样的结构。CRISPR技术是最新出现的第三代基因组编辑工具,它能够完成RNA导向的DNA识别及编辑。CRISPR/Cas9基因编辑技术源于一种微生物防御噬菌体DNA或外源质粒入侵的后天免疫***。CRISPR/Cas***的防御机制可以分为三个阶段。第一个阶段称为间隔序列的获得,间隔序列被识别并被整合到CRISPR基因座中两个相邻重复单元之间。第二阶段被称为CRISPR的表达,一个主要的转录本,被RNA聚合酶从CRISPR基因座转录而来。随后,特异性的核酸内切酶将pre-crRNAs切割成小的CRISPR RNAs(crRNAs)。第三个阶段称为干扰或免疫,在crRNA和Cas蛋白形成的复合物中crRNA能识别碱基对,特别是具有完全(或几乎完全)互补的外来DNA(或RNA)的区域。这样便开始了Cas蛋白对特定位点的切割。从细菌到古细菌共有三种类型的CRISPR/Cas***,分别是Type I、II、III,其中Type II的运用最多。Type II中包括标志性的Cas9蛋白,该蛋白主要促进crRNA的成熟,降解侵入的噬菌体DNA或者入侵的外源质粒。目前,CRISPR/Cas9技术已广泛用鱼小鼠、斑马鱼、果蝇、酵母、大米、小麦、细菌等各种生物上,实现了不同生物进化阶段物种的基因编辑。
与锌指核酸酶(Zinc-finger nuclease,ZFN)和转录激活样效应因子核酸酶(transcription activator-like effector nuclease,TALEN)等基因编辑技术相比,CRISPR/Cas9技术有如下优势:
1、Cas9不具有特异性,
2、gRNA体现需要敲除的基因的特异性,靶向精确,作用高效,脱靶率低,
3、廉价便捷,细胞毒性低,
4、CRISPR技术更易于操作,具有更强的可扩展性。
已有研究表明,人NOTCH3基因的突变引起CADASIL综合征,是一种遗传性小动脉疾病,位于19号染色体上的Notch3基因突变所致的遗传性脑小血管疾病,表现为皮质下缺血事件,并导致进行性痴呆伴假性球麻痹。因为涉及病变的位置广,故暂无法通过手术解决,且由于其为遗传性病变,药物治疗效果也欠佳,目前只能通过对症处理,但是病程进行性加重可能是难免的。目前临床无很好的治疗方法,该病已经被西医判了死刑,只能通过药物和适当保健改善生活质量。
Notch3基因突变连锁的血管平滑肌细胞退化与人类“伴有皮质下梗死和白质脑病的常染色体显性遗传性脑动脉病(cerebral autosomal dominant arteriopathy withsubcortical infarcts and leukoencephalopathy,CADASIL)”的发病密切相关,90%以上的CADASIL患者可以检测到Notch3基因突变。目前尚不清楚CADASIL的发病是否由Notch3信号转导通路的改变而直接引起,或者是异常的Notch3堆积间接引起细胞毒性作用导致的,亦或者是两种因素共同作用的结果。CADASIL症状的机制尚不清楚,血管,白质和其他疾病表型的相互依赖机制和程度仍有待澄清。
有报道称,用定向诱导基因组局部突变技术(Targeting induced local lesionsin genomes,TILLING)筛选出的由化学诱变剂甲基磺酸乙酯(EMS)诱变产生的Notch3基因定点突变斑马鱼,可以较好的作为CADASIL动物模型。该方法获得的突变体与本发明利用CRISPR/Cas9技术制备的突变体在最终编码的氨基酸个数及存活时间上存在差别。TILLING方法筛选出的突变体编码669个氨基酸,多数突变体在15dpf前死亡,少部分能存活到2个月,但通常也在长成成鱼前死亡。而本发明用CRISPR/Cas9制备的突变体只编码156个氨基酸,在11~15dpf死亡数量较多,且通常在16dpf之前全部死亡。
虽然CRISPR-Cas9敲除技术广泛应用于小鼠,斑马鱼,果蝇,拟南芥等模式生物,但利用该技术对斑马鱼1号染色体全基因敲除后获得有表型的突变体比例仅占5%,可见获得有明显表型的突变体比例极低,可能原因有:1)与选取的目的基因有关;2)与基因上选取的靶点有关。因此,只有选取了合适的基因和特异敲除的靶位点同时存在的条件下,才有可能出现特征性的表型变化。
发明内容
本发明的目的在于提供一种斑马鱼notch3基因突变体的制备方法。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的:
本发明涉及一种斑马鱼notch3基因突变体的制备方法,所述方法包括如下步骤:
S1、确定notch3基因敲除的靶点在斑马鱼notch3的基因序列的第四个外显子上;
S2、根据步骤S1确定的靶点序列设计扩增引物;
S3、以pUC19-gRNA scaffold质粒为模板,使用引物T7-notch3-sfd、tracr rev进行PCR扩增;
S4、对步骤S3的PCR产物进行纯化,体外转录获得gRNA;
S5、将gRNA与Cas9蛋白导入斑马鱼中;
S6、培养获得稳定遗传的斑马鱼notch3基因突变体。
优选的,步骤S2中,所述靶点序列为GGCATCTGCATGAATACACA(SEQ ID NO.2)。
优选的,步骤S3中,pUC19-gRNA scaffold质粒模板序列为:GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTT(SEQ IDNO.1)。
优选的,步骤S3中,所述引物T7-notch3-sfd的序列为TAATACGACTCACTATAGGCATCTGCATGAATACACAGTTTTAGAGCTAGAAATAGC(SEQ ID NO.3)。
优选的,步骤S3中,所述引物tracr rev的序列为AAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCAC(SEQ ID NO.4)。
优选的,步骤S4中,所述gRNA的序列为TAATACGACTCACTATAGGCATCTGCATGAATACACAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTT(SEQ ID NO.7)。
优选的,步骤S5中,将gRNA与Cas9蛋白导入斑马鱼具体为:将gRNA与Cas9蛋白混合,显微注射到斑马鱼一细胞期胚胎中;其中,gRNA终浓度为100ng/μL,Cas9蛋白终浓度为800ng/μL。
优选的,步骤S6具体包括如下步骤:
A1、对导入gRNA与Cas9蛋白的斑马鱼进行notch3基因敲除检测,确定notch3 F0靶点突变效率;
A2、将notch3 F0基因检测敲除成功的成鱼与野生型斑马鱼外交,得到F1胚胎;经基因型鉴定获得notch3 F1突变体斑马鱼;
A3、将相同突变的notch3 F1突变体斑马鱼内交,获得notch3 F2突变体斑马鱼;
A4、鉴定为F2中notch3基因敲除的纯合子即所述稳定遗传的斑马鱼notch3基因突变体。
优选的,步骤A1中,notch3基因敲除检测采用的引物序列为F:TGCCAATGGTGCTCGTTGTA(SEQ ID NO.5)和R:TCACTGCCTGGAAAGGGAAA(SEQ ID NO.6)。
本发明选取的斑马鱼notch3基因,是Notch受体之一,在发育上起重要作用。在人类19号染色体上Notch3基因突变会造成遗传性脑血管疾病;在Notch3敲除的小鼠中,脑组织形态正常,但脑血管异常。斑马鱼notch3基因位于斑马鱼3号染色体上,全长7921bp,编码2468个氨基酸,含有34个外显子和33个内含子。本发明根据T7启动子的靶位点选择规律,选取了比较靠前的、位于Notch3基因第4个外显子上的靶点,F0敲除效率超过50%。制备的-2、-8和-11bp三种类型的突变体分别形成了158、156和218个氨基酸的截短蛋白。
本发明利用CRISPR/Cas9制备的突变体具有躯干弯曲的明显表型,少数突变体还伴有不同程度的颅内出血,并且不同缺失类型的突变体产生的表型一致。经χ2检验,同一批斑马鱼中,躯干弯曲的数量与没有表型的数量符合1∶3的分离规律。突变体在11~15dpf死亡数量较多,且通常在16dpf之前全部死亡。这说明本发明靶点的选择巧妙,获得的多种突变体之间的表型一致,为今后研究相应的疾病提供了可靠的材料保障。
与现有技术相比,本发明具有如下有益效果:
1、首次在斑马鱼中利用CRISPR/Cas9技术获得notch3突变体;
2、notch3突变体可稳定遗传,方便对notch3功能的深入研究;
3、notch3-/-突变体有明显表型,并且纯合致死;
4、利用CRISPR/Cas9技术,设计独特的一段打靶区,使得斑马鱼中的notch3基因被敲除,又不“误伤”其他基因,形成Notch3敲除的斑马鱼。
附图说明
图1为notch3基因F0敲除检测示意图;其中,a为notch3 F0斑马鱼胚胎PCR产物,b为T7E1内切酶酶切鉴定结果,c为PCR产物测序结果;
图2为notch3 F0 germline transmission检测结果;
图3为F1-notch3成年斑马鱼基因型检测结果;其中,a为部分T7E1内切酶酶切鉴定结果;b为PCR产物连接转化挑单克隆测序结果;
图4为notch3-/-表型图;其中,a为野生型斑马鱼,b为notch3-/-斑马鱼;
图5为notch3-/-驱干弯曲表型比例示意图;
图6为notch3-/-颅内出血在驱干弯曲表型中所占比例示意图;
图7为notch3-/-突变体斑马鱼最大存活天使统计曲线图;
图8为notch3(-2bp)基因型鉴定结果;其中,a为sibling表型图,b为notch3-/-表型图,c为sibling第一次T7E1内切酶酶切鉴定结果,d为notch3-/-第一次T7E1内切酶酶切鉴定结果,e为sibling第二次T7E1内切酶酶切鉴定结果,f为notch3-/-第二次T7E1内切酶酶切鉴定结果;
图9为notch3(-8bp)基因型鉴定结果;其中,a为sibling表型图,b为notch3-/-表型图,c为sibling第一次T7E1内切酶酶切鉴定结果,d为notch3-/-第一次T7E1内切酶酶切鉴定结果,e为sibling第二次T7E1内切酶酶切鉴定结果,f为notch3-/-第二次T7E1内切酶酶切鉴定结果;
图10为notch3(-10bp)基因型鉴定结果;其中,a为sibling表型图,b为notch3-/-表型图,c为sibling第一次T7E1内切酶酶切鉴定结果,d为notch3-/-第一次T7E1内切酶酶切鉴定结果,e为sibling第二次T7E1内切酶酶切鉴定结果,f为notch3-/-第二次T7E1内切酶酶切鉴定结果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明,但不以任何形式限制本发明。应当指出的是,对本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干调整和改进。这些都属于本发明的保护范围。
实施例
1材料及设备
1.1实验用鱼
本实验中所用的斑马鱼均为AB品系,购置于中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所斑马鱼平台。
1.2质粒
pUC19-gRNA scaffold质粒来源于文献:Chang N,Sun C,Gao L,Zhu D,Xu X,ZhuX,Xiong JW,Xi JJ.Genome editing with RNA-guided Cas9 nuclease in zebrafishembryos,Cell Res,2013,23(4):465-472。
在gRNA产物合成中用到的pUC19-gRNA scaffold质粒模板序列为:
GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTT(SEQ ID NO.1)。
1.3主要试剂
DNA Clean&Contentrator-5(ZYMO RESEARCH,D4004),普通DNA纯化试剂盒(TIANGEN,DP204-03),T7in vitro Transcription Kit(Ambion,AM1314),乙醇(无水乙醇)(国药集团化学试剂有限公司,10009218),GenCrispr NLS-Cas9-NLS(金斯瑞,Z03389-25),Premix TaqTM(Ex TaqTM Version 2.0plus dye)(TAKARA,RR902),DNAMarker I(TIANGEN,MD101-02),T7endonuclease 1(NEW ENGLANDInc.,M0302L),快速质粒小提试剂盒(TIANGEN,DP105),DH5α感受态细胞(TIANGEN,CB101-03),2BEasyTaqPCR SuperMix(+dye)(TAKARA,AS111-12),LB Broth(上海生工,D915KA6602),LBBroth agar(上海生工,D911KA6566),pMDTM19-T Vector Cloning Kit(TAKARA,6013)。
1.4主要仪器
PCR仪(品牌:BIO-RAD,型号:c1000TouchTMThermal Cycler),小离心机(品牌:eppendorf,型号:Centrifuge 5424),震荡混匀仪(品牌:VORTEX-GENIE,型号:G560E),紫外分光光度计(品牌:Thermo Scientific,型号:Nanodrop 2000C),电泳仪(品牌:BIO-RAD,型号:PowerPac Basic),照胶仪(品牌:BIO-RAD,型号:Gel Doc EZ Imager),电子天平(品牌:METTLER TOLEDO,型号:AL104),玻璃毛细管(品牌:WPI,型号:TW100F-4),Milli-Q Direct8超纯水***(品牌:Millipore,型号:Milli-Q Direct 8),垂直拉针仪(品牌:NARISHIGE,型号:PC-10),恒温摇床(品牌:Innova,型号:40R),磨针器(品牌:NARISHIGE,型号:EG-400),微量注射泵(品牌:WARNER,型号:PLI-100A),恒温水浴锅(品牌:精宏,型号:H1401438,DK-8D),4℃冰箱(品牌:Haier,型号:HYC-610),-40℃低温冰箱(品牌:Haier,型号:DW-40L508),-80℃超低温冰箱(品牌:Pana-sonic,型号:MDF-U53V),高压蒸汽灭菌锅(品牌:SANYO,型号:MLS-3780)。
2实验方法
2.1 gRNA合成
(1)靶点设计
a、下载序列:在Ensembl数据库查找并下载斑马鱼notch3的基因序列。
b、靶点设计:利用http://zifit.partners.org/ZiFiT/ChoiceMenu.aspx网站在notch3基因ATG之后的外显子序列上设计靶点(表1)。notch3设计靶点在第四个外显子上。
c、靶点特异性检测:在NCBI网站将设计的靶点序列通过blast比对,验证靶位点特异性。
d、亲本检测:将用于基因敲除的野生型斑马鱼剪尾并用碱裂解法获得基因组DNA,进行PCR扩增靶点附近的一段序列。
e、酶切检测:用T7E1内切酶酶切检测野生型斑马鱼,看T7E1酶能否将扩增的片段切开,若切不开,则可用于后续敲除检测;若被切开,则需要根据扩增序列信息选择特异性的酶进行酶切检测。
f、测序鉴定:将PCR产物送测序,峰图及序列比对,确认亲本为纯合子,不存在自然突变,从而保证后续制备的突变体为基因敲除后造成的。
表1 notch3靶位点序列
(2)设计检测引物:设计的引物应保证距离靶点两侧大于100bp,并且上下游引物到靶点的距离与下游引物到靶点的距离应相差大于100bp,至少50bp。引物扩增应具备特异性,扩增片段约500bp。引物在上海生工生物工程股份有限公司合成(表2)。
表2实验所用引物信息
(3)gRNA产物合成:以pUC19-gRNA scaffold质粒为模板,使用引物T7-notch3-sfd、tracr rev和2×EasyTaq PCR Super Mix(+dye)扩增片段并用试剂盒纯化。
(4)体外转录:
表3反应体系
Nuclease-free Water | to 20μL |
DNA template | 1μg |
10×Transcription Buffer | 2μL |
10mM ATP | 1μL |
10mM CTP | 1μL |
10mM GTP | 1μL |
10mM UTP | 1μL |
T7 Enzyme Mix | 2μL |
注意:最后添加10×Transcription Buffer和T7 Enzyme mix
混匀并短暂离心后,37℃孵育80min;之后向体系中加入1μL TURBO DNase并混匀,短暂离心后37℃孵育15min。
(5)纯化gRNA:
a、向20μL体外转录体系中加入2.5μL 4M的LiCl和100μL无水乙醇,混匀并短暂离心后放于-80℃冰箱至少1h。
b、到时间后从冰箱取出,4℃,12000rmp,离心15min。弃上清后用70%乙醇清洗沉淀。4℃,8000rmp,离心5min。弃上清后将离心管放于通风橱中使乙醇挥发干净。
c、根据沉淀大小加入适量DEPC水溶解gRNA沉淀。
d、用Nanodrop检测浓度和OD值并用电泳检测。
所述gRNA的序列为TAATACGACTCACTATAGGCATCTGCATGAATACACAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTT(SEQ IDNO.7)。
2.2显微注射
将gRNA与Cas9蛋白(南京金斯瑞生物科技有限公司购买[GenCrisprNLS-Cas9-NLS(金斯瑞,Z03389-25)])混合,利用显微注射仪器将混合后的物质注射到斑马鱼一细胞期胚胎中,每次注射都留一批未注射的同批次胚胎作为对照组。混合注射终浓度:gRNA为100ng/μL,Cas9蛋白为800ng/μL。
2.3检测敲除是否成功及敲除效率(T7EI酶切检测)
a、提取鱼卵基因组
每组5枚卵,加35μL 50mM NaOH,95℃孵育20 min,中间取出振荡,短暂离心一次。之后加3.5μL 1M的Tris·HCl(pH≈8.0),剧烈振荡混匀后离心。
b、PCR扩增目的片段
根据靶点附近设计的引物F:TGCCAATGGTGCTCGTTGTA(SEQ ID NO.5)和R:TCACTGCCTGGAAAGGGAAA(SEQ ID NO.6)扩增目的片段。
表4 PCR反应体系
H<sub>2</sub>O | to 25μL |
酶 | 12.5μL |
F | 0.5μL |
R | 0.5μL |
Template | 10ng |
PCR反应条件:
98℃预变性2sec;98℃变性10sec,58℃退火30sec,72℃延伸1min,共34个循环;72℃再延伸5min;4℃保存。
2%琼脂糖凝胶120V电泳27min。
c、T7E1内切酶酶切检测
表5
H<sub>2</sub>O | to 10μL |
PCR产物 | 5μL |
Buffer | 1.1μL |
95℃孵育5min,冷却至室温,加0.25μLT7E1酶,37℃孵育45min。
d、电泳检测
电泳后利用凝胶电泳成像仪对电泳的琼脂糖凝胶成像,观察目的条带,判断敲除是否成功。
2.4 notch3纯合突变体斑马鱼形态学观察
notch3 F2斑马鱼从受精之后密切观察表型变化,观察到表型后,进行数目统计看是否符合孟德尔遗传定律,并对有表型斑马鱼先用MS222麻醉,然后再用2%的甲基纤维素固定拍照。
2.5不同缺失类型突变体表型拍照及基因型鉴定
不同的缺失类型中有相一致的表型,对不同缺失类型的表型斑马鱼先用MS222麻醉,然后再用2%的甲基纤维素固定拍照,并进行基因型鉴定,再送测序确定。
3实验结果
3.1 notch3突变体的构建
3.1.1 notch3 F0基因敲除检测结果
T7E1酶切结果显示notch3基因敲除成功。利用Image Lab 5.1软件计算敲除效率达到50%以上。测序峰图显示在20bp靶点处出现套峰,证明敲除成功(图1)。
3.1.2notch3 F0 germline transmission检测结果
取7尾notch3 F0基因检测敲除成功的成鱼与野生型斑马鱼外交,得到的F1胚胎5枚一管,取3管进行T7E1酶切鉴定,酶切结果显示,有4尾斑马鱼将突变传递给后代(图2),其中雌鱼1尾,雄鱼3尾。
3.1.3 notch3F1突变体斑马鱼检测
剪尾检测85尾notch3(外交)斑马鱼,经T7E1检测到29条阳性斑马鱼,进行TA克隆,其中有14尾鱼发生有效突变。
发生有效突变的14尾斑马鱼中-2bp的突变体筛选到2尾雄鱼;-8bp的突变体筛选到11尾,4雌7雄;-10bp的突变体筛选到1尾雄鱼(图3)。
3.1.4 notch3突变体斑马鱼形态学观察
将notch3+/-F1斑马鱼内交,观察F2中notch3-/-突变体表型,3dpf斑马鱼破膜后出现躯干弯曲,少数出现颅内出血(图4)。对有表型的突变体斑马鱼数量进行三次统计,都约占总胚胎数量25%,符合孟德尔遗传定律(图5)。而颅内出血的突变体斑马鱼比例较低,不到躯干弯曲纯合子的20%(图6)。notch3-/-在11~15dpf死亡数量较多,最大存活天数约为16dpf(图7)。
3.1.5不同缺失类型突变体表型拍照及基因型鉴定
(1)共检测notch3(-2bp)sibling和notch3-/-各10尾,经第一次酶切检测,sibling中有5尾杂合子(编号1、3、7、9、10);经第二次酶切检测,sibling中有5尾野生型(编号2、4、5、6、8),notch3-/-10尾均为纯合子(图8)。
(2)共检测notch3(-8bp)sibling和notch3-/-各十尾,经第一次酶切检测,sibling中有7尾杂合子(编号1、3、4、5、6、8、10);经第二次酶切检测,sibling中有3尾野生型(编号2、7、9),notch3-/-10尾均为纯合子(图9)。
(3)共检测notch3(-10bp)sibling和notch3-/-各十尾,经第一次酶切检测,sibling中有7尾杂合子(编号1、3、5、6、7、8、9);经第二次酶切检测,sibling中有3尾野生型(编号2、4、10),notch3-/-10尾均为纯合子(图10)。
综上所述,本发明首次在斑马鱼中利用CRISPR/Cas9技术获得notch3突变体。作为首例利用CRISPR-Cas9方法敲除的Notch3基因模式动物斑马鱼,可以排除人为因素干预,对于Notch3基因的功能研究意义重大,同时与传统基因敲除的技术相比,周期短,使得Notch3基因更快的被敲除。目前有Notch3基因敲除的小鼠,但小鼠中纯合突变的胚胎发育正常,纯合子突变体可以发育成成熟个体,并且可育,这一特征与本发明制备的斑马鱼纯合突变体明显不同。而且,Notch3基因敲除小鼠对缺血性中风表现出更高的易感性。现有的CADASIL小鼠都没有完全成为人类疾病的模型,因此小鼠的Notch3突变体和CADASIL动物模型之间存在差异。
Claims (4)
1.一种斑马鱼notch3基因突变体的制备方法,其特征在于,所述方法包括如下步骤:
S1、确定notch3基因敲除的靶点在斑马鱼notch3基因序列的第四个外显子上;
S2、根据步骤S1确定的靶点序列设计扩增引物;所述靶点序列为如SEQ ID NO.2所示的序列;
S3、以pUC19-gRNA scaffold质粒为模板,使用引物T7-notch3-sfd、tracr rev进行PCR扩增;所述引物T7-notch3-sfd的序列为如SEQ ID NO.3所示的序列;所述引物tracr rev的序列为如SEQ ID NO.4所示的序列;
S4、对步骤S3的PCR产物进行纯化,体外转录获得gRNA;所述gRNA的序列为如SEQ IDNO.7所示的序列;
S5、将gRNA与Cas9蛋白导入斑马鱼中;
S6、培养获得稳定遗传的斑马鱼notch3基因突变体;具体包括如下步骤:
A1、对导入gRNA与Cas9蛋白的48hpf斑马鱼进行notch3基因敲除检测,确定notch3 F0靶点突变效率;
A2、将notch3 F0基因检测敲除成功的成鱼与野生型斑马鱼外交,得到F1胚胎;经基因型鉴定获得notch3 F1突变体斑马鱼;
A3、将相同突变的notch3 F1突变体斑马鱼内交,获得notch3 F2突变体斑马鱼;
A4、鉴定为F2中notch3基因敲除的纯合子即所述稳定遗传的斑马鱼notch3基因突变体;
获得的notch3-/-突变体有躯干弯曲的明显表型,并且纯合致死。
2.根据权利要求1所述的斑马鱼notch3基因突变体的制备方法,其特征在于,步骤S3中,pUC19-gRNA scaffold质粒模板序列为如SEQ ID NO.1所示的序列。
3.根据权利要求1所述的斑马鱼notch3基因突变体的制备方法,其特征在于,步骤S5中,将gRNA与Cas9蛋白导入斑马鱼具体为:将gRNA与Cas9蛋白混合,显微注射到斑马鱼一细胞期胚胎中;其中,gRNA终浓度为100ng/μL,Cas9蛋白终浓度为800ng/μL。
4.根据权利要求1所述的斑马鱼notch3基因突变体的制备方法,其特征在于,步骤A1中,notch3基因敲除检测采用的引物序列为如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的序列。
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