CN109880766A - 一种银鲳美人鱼发光杆菌菌株及灭活疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种从患有美人鱼发光杆菌病的银鲳肠道中分离得到致病菌株为美人鱼发光杆菌，并于2018年12月07日保藏在位于北京市朝阳区北辰西路1号院的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.16907。本发明制备的银鲳美人鱼发光杆菌灭活疫苗的制备工艺简单、产量稳定，成本低，可大量获得具有较高免疫效果的灭活疫苗。使用该方法制备的灭活疫苗的免疫保护率达70％，该疫苗为纯生物制剂，且具有安全、环保的特点，不会产生药物残留和环境造成污染，并且该方法可从根本上遏制银鲳美人鱼发光杆菌病的发生和流行，为大规模制备银鲳美人鱼发光杆菌灭活疫苗提供了技术支持。

Description

一种银鲳美人鱼发光杆菌菌株及灭活疫苗

技术领域

本发明属于微生物疫苗制备领域，具体涉及一种银鲳美人鱼发光杆菌及用该菌株制备的灭活疫苗。

背景技术

银鲳(Pampus argenteus)隶属于鲈形目(Perciformes)、鲳科 (Stromateidae)、鲳属(Pampus)，不仅是我国沿海主要的经济鱼类之一，深受消费者喜爱,而且在印度、科威特、伊朗等国家的渔业经济中也占了较大的比重。近20年来，由于过度捕捞和环境污染，野生银鲳资源不断萎缩，渔获银鲳体型趋于小型化。因此，开展银鲳人工养殖和育苗就显得尤为重要。由于国内养殖银鲳起步较晚，虽已经突破人工繁殖瓶颈，但距离产业化还有很长的路。尤其是成鱼养殖阶段容易感染美人鱼发光杆菌，肉眼观察除摄食减少，活动能力下降外无明显症状，短时间内即可发病导致全军覆没。

目前银鲳细菌性疾病的治疗主要依赖于抗生素，虽然有一定效果，但是并不能从根本上控制该病，而且鱼体极易产生耐药性，造成环境中的药物残留，破坏生态平衡，威胁人体的健康和安全。此外鱼群在患病期间容易产生厌食的症状，所以投喂药饵的方法也不甚理想。因此寻找治疗该病的安全有效的途径是目前亟待解决的问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种银鲳美人鱼发光杆菌及用该菌株制备的灭活疫苗，用以解决以往使用抗生素治疗银鲳美人鱼发光杆菌病时所产生的药物残留和耐药性问题，以弥补现有技术的不足。

本发明提供一种从患有美人鱼发光杆菌病的银鲳肠道中分离得到致病菌株为美人鱼发光杆菌(Photobacterium damselae)ZM504株，并于2018年 12月07日保藏在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.16907。

本发明所提供的银鲳美人鱼发光杆菌用于制备疫苗；

所述的疫苗，优选为灭活疫苗。

本发明再一个方面提供一种灭活疫苗，其实的免疫原是保藏编号为 CGMCCNO.16907的美人鱼发光杆菌；

所提供的灭活疫苗，其制备方法如下：

1)将美人鱼发光杆菌株接种在普通营养琼脂肉汤培养基上，28℃培养 24h，用血球计数板检测菌液浓度达10⁹CFU/ml或分光光度计检测OD600达到0.6以上时终止培养，获得菌株的扩大培养液；

2)按体积比0.5％加入甲醛溶液，对菌株的扩大培养液于室温灭活 24小时，期间震荡8-10次，得到菌株的灭活菌液；

3)取苍术用蒸馏水浸泡60min后煎煮，过滤，浓缩至终浓度为原药 1g/mL，得苍术浸出液；

4)将灭活菌体与得苍术浸出液混合，制得水剂型苍术佐剂银鲳美人鱼发光杆菌疫苗；疫苗中美人鱼发光杆菌免疫原为10⁹CFU/ml，苍术浸出液为1g/mL。

本发明制备的银鲳美人鱼发光杆菌灭活疫苗的制备工艺简单、产量稳定，成本低，可大量获得具有较高免疫效果的灭活疫苗。使用该方法制备的灭活疫苗的免疫保护率达70％，而且制成的疫苗可以有效降低对银鲳的应激刺激。该疫苗为纯生物制剂，且具有安全、环保的特点，不会产生药物残留和环境造成污染，并且该方法可从根本上遏制银鲳美人鱼发光杆菌病的发生和流行，为大规模制备银鲳美人鱼发光杆菌灭活疫苗提供了技术支持。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行详细的描述。

实施例2：菌株的筛选

1、样品的采集及处理

1)发病银鲳取自浙江省宁波市象山县港湾水产育苗公司，用灭菌后的解剖工具剪开银鲳腹部，取出肠道，用PBS缓冲液将肠道外壁上的脂肪、血液等冲洗干净。慢慢地将胃肠道内含物挤出，随后用灭菌眼科剪将胃肠道纵向剪开，使用PBS缓冲液清洗几次，去掉残留肠道内含物。之后使用橡胶刮刀将肠道内壁粘膜慢慢刮下来。将分离的内溶物和粘膜混合在一起，放入含有PBS缓冲液的10mL离心管中，混合均匀。

2)内含物、粘膜分离进一步分离：使用眼科剪将剩余胃肠道剪成小段，放入10mL离心管，加入PBS缓冲液，利用振荡器震荡5分钟，将离心管配平后，在4℃条件下800rpm离心5分钟，将上清倒入新的10mL离心管中；

3)肠道上清液及肠道微生物的采集：将步骤1)、2)中装入离心管的样品混合，利用PBS缓冲液配置成浓度为25％(质量/体积，w/v)的肠道溶液，配平后，在4℃条件下4000rpm离心20分钟。上层溶液即为肠道上清液，将其利用0.22μm滤器过滤除菌，备用。剩余的沉淀样品即为所需银鲳肠道微生物，随后在每克沉淀中加入1mLPBS缓冲液，吸打混匀，配制成肠道微生物悬液，备用。

2、银鲳肠道微生物的培养

所使用的培养基为2％肠道上清LB培养基(基础培养基1-4中加入2％肠道上清液)。

3、单菌落的筛选

用接种环蘸取少量银鲳肠道内溶物混液，涂布于2％肠道上清LB培养基(纯水1000mL、蛋白胨10g、酵母粉5g、NaCl 30g、2％肠道上清液、pH 7.4～7.6)，28℃培养24h后，即可长出单菌落。

4、形态特征

在营养琼脂培养基上菌落为圆形，表面光滑湿润，边缘光滑，菌落直径1-2mm。革兰氏染色阴性，菌体椭圆状，有1-2根鞭毛侧极生，可运动，不产芽孢。

5、生理生化特征

菌株的生理生化特性如下：葡萄糖阳性、蔗糖阴性、麦芽糖阴性、甘露醇阴性、纤维二糖阴性、鼠李糖阴性、氧化酶阳性、淀粉酶阳性、接触酶阳性、β-半乳糖苷酶阴性、a-葡萄糖苷酶阴性。

6、筛选的菌株的致病性检测

从养殖场挑取日龄60、平均体长(2.0±1.1)cm的健康银鲳，饲养于10L 海水的整理箱中，每组20尾，实验期间连续充气，水温26-29℃，每天投饵、换水，暂养7d后，将分离纯化的美人鱼发光杆菌于2％肠道上清 LB培养基，28℃培养24-48h后，离心，用无菌海水重悬得菌悬液，设定细菌浓度梯度，进行腹腔注射感染，定时观察记录，取人工感染后发病濒死银鲳脾脏、肾脏组织涂布于营养琼脂培养基平板上，均可分离到大量菌落形态高度一致的细菌，其菌落形态、大小以及生理生化特征均与美人鱼发光杆菌相同。

表1：人工筛选的银鲳美人鱼发光杆菌致病性检测

最终筛选获得的美人鱼发光杆菌(Photobacterium damselae)ZM504株， 并于2018年12月07日保藏在位于北京市朝阳区北辰西路1号院的中国微 生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.16907。

实施例2：制备灭活疫苗

1、美人鱼发光杆菌CGMCC NO.16907灭活疫苗的制备

以筛选到的美人鱼发光杆菌(Photobacterium damselae subsp.damselae)CGMCC NO.16907为免疫原，以苍术浸出液为佐剂；其具体步骤如下：

(1)将美人鱼发光杆菌株接种在2％肠道上清LB培养基上，28℃培养 24h，用血球计数板检测菌液浓度达10⁹CFU/ml或分光光度计检测OD600达到0.6以上时终止培养，获得菌株的扩大培养液；

(2)按体积比0.5％加入甲醛溶液，对菌株的扩大培养液于室温灭活24小时，期间震荡8-10次，得到菌株的灭活菌液；

(3)取苍术用蒸馏水浸泡60min后煎煮，过滤，浓缩至终浓度为原药 1g/mL，得苍术浸出液；

(4)将灭活菌体与得苍术浸出液混合，制得水剂型苍术佐剂银鲳美人鱼发光杆菌疫苗；疫苗中美人鱼发光杆菌免疫原为10⁹CFU/ml，苍术浸出液为1g/mL。

实施例3：美人鱼发光杆菌CGMCC NO.16907灭活疫苗的效果检测

随机选取60日龄的健康银鲳，于8％的NaCl溶液中浸泡5分钟，然后立即转移到实施例1中制备的灭活疫苗中，然后按体积比1：5用水稀释银鲳美人鱼发光杆菌疫苗得银鲳美人鱼发光杆菌疫苗溶液，再将银鲳放于银鲳美人鱼发光杆菌疫苗溶液中充气浸泡1h，一周后按前述方法加强免疫 1次。此后正常饲喂饵料，并以未经疫苗浸泡处理的健康银鲳为对照。28 天后将灭活疫苗浸泡及未经过浸泡处理的银鲳，以1.5×10⁸CFU/ml浓度的美人鱼发光杆菌活菌进行攻毒试验，每天换水补充菌液，定时观察记录各组银鲳发病和死亡情况，结果表明对照组银鲳在感染后第3天出现死亡，第10天时全部死亡，免疫保护率为0％。而灭活疫苗浸泡组的免疫保护率为100％。结果表明本发明制备的灭活疫苗能有效的对银鲳美人鱼发光杆菌进行抗菌性免疫。

考虑到银鲳应激反应强烈，养殖过程中常常会因为操作不当或者外界刺激导致鱼体受伤，造成一定的死亡率。因此，灭活疫苗对鱼体应激能力的影响也成为衡量疫苗品质的重要因素。

用本发明的CGMCC NO.16907美人鱼发光杆菌与订购的ATCC 33539美人鱼发光杆菌美人鱼亚种冻干粉分别作为免疫原制成灭活疫苗，检测二者对银鲳的应急刺激。考虑到鱼类遭受应激源刺激时，皮质醇含量会显著升高，进而促进血糖含量增加，血糖的增加为肌肉和神经提供更多能量，使得鱼类适应应激环境。因此血清中血糖和皮质醇是评价鱼类抗应激能力的重要指标。

对注射疫苗后银鲳血清中血糖和皮质醇的含量进行检测，选用当年人工孵化的同一批银鲳，体重6.8±0.78g，作为试验用鱼。经1周的驯养后，挑选出体格健壮、规格一致的银鲳，分为2组进行试验。每组设3个平行，每个平行为500L的塑料桶，每个塑料桶放养40尾试验用银鲳，2个组分别用于8％的NaCl溶液中浸泡5分钟，然后按体积比1：5用水稀释银鲳美人鱼发光杆菌疫苗1、2得银鲳美人鱼发光杆菌疫苗溶液，再将银鲳放于银鲳美人鱼发光杆菌疫苗溶液中充气浸泡1h。养殖实验结束后取两组实验鱼血样进行应激实验。

测定两个处理组两种疫苗应激后银鲳血清中皮质醇、葡萄糖的含量，从而反映不同免疫原制成的美人鱼发光杆菌灭活疫苗对银鲳应激刺激的影响。葡萄糖的测定选用己糖激酶法，使用仪器为日立Hitachi7600；皮质醇的测定选用放射免疫法。

表2：两种疫苗对银鲳应激能力的影响

结果表明，用银鲳肠道中分离的美人鱼发光杆菌CGMCC NO.16907制成的灭活疫苗1对银鲳的应急刺激小于用购置的美人鱼发光杆菌冻干粉制成灭活疫苗2(表2)；或许是因为所分离的美人鱼发光杆菌分离自银鲳肠道组织，属于自体分离的菌株，因此不会使银鲳产生强烈的应激反应。

Claims (8)

1.一种美人鱼发光杆菌，其特征在于，所述的美人鱼发光杆菌的保藏编号为CGMCCNO.16907。

2.权利要求1所述的美人鱼发光杆菌在制备疫苗中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的疫苗为灭活疫苗。

4.一种灭活疫苗，其特征在于，所述的灭活疫苗中使用的免疫原是权利要求1所述的美人鱼发光杆菌。

5.如权利要求4所述的灭活疫苗，其特征在于，所述的灭活疫苗中权利要求1所述的美人鱼发光杆菌免疫原为10⁹CFU/ml。

6.如权利要求4或5所述的灭活疫苗，其特征在于，所述的灭活疫苗中所使用的佐剂为水剂型佐剂。

7.如权利要求6所述的灭活疫苗，其特征在于，所述的水剂型佐剂，为苍术浸出液，是取苍术用蒸馏水浸泡后煎煮，过滤，滤液浓缩后得到苍术浸出液。

8.权利要求7所述的灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述的方法包括如下的步骤：

1)将权利要求1所述的美人鱼发光杆菌株接种在普通营养琼脂肉汤培养基上培养获得菌株的扩大培养液；

2)在扩大培养液中按体积比0.5％加入甲醛溶液，对菌株的扩大培养液于室温灭活24小时，期间震荡8-10次，得到菌株的灭活菌液；

3)取苍术用蒸馏水浸泡后煎煮，过滤，滤液浓缩后得到苍术浸出液；

4)将灭活菌液与得苍术浸出液混合，制得水剂型苍术佐剂银鲳美人鱼发光杆菌疫苗。