CN103808749A - 一种鉴别连翘衍生品的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种鉴别连翘衍生品的方法，包括：1）取连翘衍生品直接作为含有活性成分组的连翘木脂素和苯乙醇苷特征提取物；2）对所述连翘木脂素和苯乙醇苷特征提取物进行IGD核磁共振碳谱指纹图谱检测，根据指纹图谱得到特征提取物中若干个活性成分特征峰峰强度；并用相同方式测定出所述各活性成分相应标准参照品的特征峰峰强度；3）通过定量分析手段得到所述标准参照品的绝对含量；4）利用所述特征峰峰强度的比值和所述绝对含量，计算出连翘衍生品中各活性成分的含量及活性成分组的含量。本发明可以反映连翘衍生品中含有哪些木脂素类和苯乙醇苷类化合物以及它们之间的比例，达到对连翘衍生品质量鉴定的目的。

Description

一种鉴别连翘衍生品的方法
技术领域
本发明属于天然药用植物的鉴别领域，具体地，涉及一种鉴别连翘衍生品的方法。
背景技术
连翘是中国临床常用传统中药之一，为木犀科（Oleaceae）连翘属（Forsythia）植物连翘（Forsythia suspensa（Thunb.）Vahl）的干燥果实，果实初熟尚带绿色时采收称为青翘，果实熟透颜色发黄时采收称为老翘。连翘归肺、心、小肠经，药性微寒，味苦，具有清热解毒、消肿散结、疏散风热的功效[国家药典委员会.中华人民共和国药典2010年版一部.中国医药科技出版社，159.]。其活性成分主要为木脂素类和苯乙醇苷类化合物，具有抗病毒、抗炎、抗菌、抗氧化、降血酯、保肝等作用[王金梅，等.天然产物研究与开发2007，19:153.]。
定性鉴别上述某类成分或定量测定其某种活性成分含量，已成为评价连翘衍生品质量的重要方法（例如中国药典2010版是对连翘衍生品中木脂素类成分连翘苷和苯乙醇苷类成分连翘酯苷进行定性和定量分析）；这种针对单一成分进行定性、定量分析的质量检测模式不能有效控制中药提取物的内在质量，无法满足当前对于客观有效地评价和控制连翘及其制剂质量的迫切要求。
指纹图谱是目前国际公认的控制中药或天然药物质量最有效的方式之一。人们凭借实用的指纹图谱不仅可确认该产品的真伪，同时能判断其稳定性。目前，连翘衍生品的木脂素和苯乙醇苷类化合物的指纹图谱研究工作，集中在HPLC指纹图谱[①[国家药典委员会.中华人民共和国药典2010年版一部.中国医药科技出版社，381.②孙国祥,等.中成药2007,29(2):161.]、毛细管电泳指纹图谱（HPCE法）[孙国祥,等.色谱2006,24(2):196.]、高效液相色谱-质谱联用法（LC-MS）[Qu HH,et al.MICROCHEMICAL JOURNAL,2008;89(2):159]等。其中主流方法HPLC指纹图谱由于受非色谱条件（如色谱柱内径、长度、固定相牌号、载体粒度、流动相流速、混合流动相各组分比例、柱温、进样量、检测器灵敏度等）影响较大和需用标准品等等原因，重复性和可行性均存在许多局限性；HPCE法虽以其高效、快速、简便且柱不易受污染而优于HPLC法，但仍存在重现性较差、线性范围窄和灵敏度较低等不足；单一LC-MS分析方法由于中药复方的复杂性和缺乏标准品的现状，MS还有离子化程度和基质干扰等问题，通常不足以对多种成分进行准确的结构定性。
IGD核磁共振碳谱偶联（IGD13C NMR coupling）指纹图谱技术，也叫反门控去偶核磁共振碳谱偶联指纹图谱技术，该技术是在已研究多年的核磁共振氢谱（1H NMR）指纹图谱技术[赵天增，等.1HNMR指纹法鉴定植物中药，中草药2000，31(11)：868-870]的基础上联合其他技术（例如目前应用最广泛的高效液相（HPLC）指纹图谱技术[谢培山等，中药色谱指纹图谱，人民卫生出版社，2005]）提出的一种新的非单一手段综合指纹图谱技术。目前为止，对于连翘衍生品及相关产品，并未见用IGD核磁共振碳谱偶联指纹图谱技术进行鉴别的报道和技术内容的披露。
连翘衍生品的品质不在于某个单一成分，其疗效是多个成分协同配比的结果。因此，建立不仅能控制连翘衍生品活性成分，而且能控制这些活性成分之比例的IGD核磁共振碳谱偶联指纹图谱势在必行。连翘衍生品核磁共振碳谱偶联指纹图谱的研究与应用，不仅可以解决我国连翘衍生品评价的难题，也为加强连翘衍生品内在成分研究的***化与标准化，实现与国际接轨提供了科学的保证。随着该技术在其他中药提取物中的推广应用，该技术的重大科学价值必将日趋突出。
发明内容
为了解决现有技术的问题，本发明的目的是提供一种鉴别连翘衍生品的方法。
为了实现上述目的，本发明提供的鉴别连翘衍生品的方法，包括以下步骤：
1）取连翘衍生品直接作为含有活性成分组（连翘木脂素和苯乙醇苷）的连翘木脂素和苯乙醇苷特征提取物；
2）对所述连翘木脂素和苯乙醇苷特征提取物进行IGD核磁共振碳谱指纹图谱检测，根据指纹图谱得到连翘木脂素和苯乙醇苷特征提取物中若干个活性成分特征峰峰强度；并用相同方式（IGD核磁共振碳谱指纹图谱）测定出所述各活性成分相应标准参照品的特征峰峰强度；
3）通过定量分析手段得到所述标准参照品的绝对含量；
4）利用所述特征峰峰强度（各活性成分特征峰峰强度及相应标准参照品的特征峰峰强度）的比值和所述标准参照品的绝对含量，计算出连翘衍生品中各活性成分的含量及该类活性成分的总含量，即活性成分组的含量。
其中，采用具有获得清晰IGD核磁共振碳谱指纹图谱的提取工艺作为所述连翘木脂素和苯乙醇苷特征提取物的提取方式。
其中，步骤2）中，对连翘木脂素和苯乙醇苷特征提取物进行IGD核磁共振碳谱指纹图谱检测，溶解连翘木脂素和苯乙醇苷特征提取物的溶剂为氘代甲醇（CD3OD）或氘代二甲基亚砜（DMSO-d6），优选氘代二甲基亚砜；连翘木脂素和苯乙醇苷特征提取物和相应溶剂的质量体积比为55:1～65:1（mg：mL），优选60:1。
其中，步骤2）中，连翘木脂素和苯乙醇苷特征提取物中，木脂素类活性成分的特征峰为C-7吸收峰，其化学位移为δC83.0～88.0。
优选地，选择C-7′作为特征峰进一步区别木脂素类活性成分中的连翘苷和表松脂素-4-β-D-葡萄糖苷，它们的化学位移为δC81.0～82.0。
连翘木脂素和苯乙醇苷特征提取物中，苯乙醇苷类活性成分的特征峰为C-9′吸收峰，其化学位移为δC165.0～170.0。
优选地，选择C-1或C-6作为特征峰进一步区别苯乙醇苷类活性成分中的连翘酯苷A和连翘酯苷H，它们的化学位移分别为δC119.0～120.0和δC129.0～130.0。
其中，步骤2）中，根据特征峰峰强度的大小和位置，对连翘木脂素和苯乙醇苷特征提取物中若干个活性成分进行排序。
进一步地，步骤2）中，根据特征峰峰强度的大小和位置，对连翘木脂素和苯乙醇苷特征提取物中的活性成分：连翘苷、表松脂素-4-β-D-葡萄糖苷、松酯素-β-D-葡萄糖苷、连翘酯素、1-羟基-松脂素4″-O-葡萄糖苷、连翘酯苷A、连翘酯苷H、连翘酯苷I、连翘酯苷F进行排序。
其中，步骤2）中，所述峰强度可以采用峰高法、面积积分法或重量法计算。
其中，步骤3）中，所述定量分析手段为：高效液相（HPLC）法。
进一步地，当鉴别连翘木脂素类活性成分时，所述高效液相法的条件包括：
流动相为乙腈：水=(20～30):(70～80)，优选25：75；检测波长为277nm。
进一步地，当鉴别苯乙醇苷类活性成分时，所述高效液相法的条件包括：
流动相为乙腈：冰醋酸溶液=(10～20):(80～90)，优选15：85；检测波长为330nm。
其中，步骤3）中，所述标准参照品的绝对含量是指：用定量分析手段测定的标准参照品的质量百分含量。
进一步地，连翘木脂素和苯乙醇苷特征提取物中，木脂素类活性成分和苯乙醇苷类活性成分的标准参照品为连翘苷或连翘酯苷A。
其中，步骤4）中，计算各活性成分的含量的偶联公式为：
W n = W 1 M n h n M 1 h 1 ; 其中：
W1为步骤3）用定量分析手段测定的连翘衍生品中某一活性成分对应的标准参照品的绝对含量；
M1为所述连翘衍生品中某一活性成分对应的标准参照品的分子量/定量峰对应的碳个数；
h1为由IGD核磁共振碳谱指纹图谱测定的连翘衍生品中某一活性成分对应的标准参照品的特征峰峰强度；
Wn为连翘衍生品中某一活性成分的质量百分含量；
Mn为连翘衍生品中某一活性成分的分子量/定量峰对应的碳个数；
hn为由IGD核磁共振碳谱指纹图谱测定的连翘衍生品中某一活性成分的特征峰峰强度；该类活性成分的总含量就是同类的各活性成分的Wn相加之和，即活性成分组的含量。
上述公式的推导过程为：
Figure BDA0000463966010000052
本发明方法所述活性成分组，是连翘衍生品中的活性成分组。所述连翘木脂素和苯乙醇苷特征提取物指该提取物中含有连翘木脂素和苯乙醇苷类活性成分，活性成分组即指相应同类活性成分的总和。
其中，所述连翘衍生品包括：连翘提取物或连翘天然药物。
本发明所述的连翘提取物或衍生品，包括连翘植物的各个部位，如根、皮、茎、叶、花和果实等的提取物或衍生品。
进一步地，所述连翘提取物可以包括：连翘果提取物，连翘木脂素或苯乙醇苷提取物、黄酮提取物、三萜酸提取物，或者连翘叶提取物等。
本发明各活性成分的含量及该类活性成分的总含量的计算，是通过偶联公式将IGD核磁共振碳谱和分析定量手段偶联。和现有技术相比，本发明采用IGD13C NMR偶联指纹图谱具有下面几个特点：
①稳定性（重复性）：IGD13C NMR得到的化学位移数据为小数点后第二位，分辩性好，重复性好；HPLC、GC的非色谱条件（如色谱柱内径、长度、固定相牌号、载体粒度、流动相流速、混合流动相各组分比例、柱温、进样量、检测器灵敏度等）改变等，得到的保留时间数据变化很大，意味着整体色谱图形的变异，重复性不好。
②整体性（全面性）：IGD13C NMR指纹图谱中包含样品中的每一个活性成分碳的相应谱峰；HPLC、GC、UV、IR、MS不存在这种关系。
③可靠性（单一性）：IGD13C NMR谱峰与样品中不同活性成分及其不同基团上的碳是严格的一一对应关系；HPLC、GC、UV、IR、MS不存在这种关系。
④可行性（易辨性）：IGD13C NMR指纹图谱规律性很强，一般情况下，可归属图谱中的每一个碳峰；HPLC、GC需要对照品；IR不易解析；UV信息量少；MS则有离子化程度和基质干扰等问题。
IGD核磁共振碳谱指纹图谱只能表明特征提取物中有哪些活性成分，以及这些活性成分之间的定量比例，而这些活性成分的绝对含量必须通过标准参照品和其他分析定量手段，再通过偶联公式而得到。
本发明所具有的优势如下：
1、本发明的的四个步骤是一个整体，缺一不可；四个步骤都有各自的独到之处；如若分开或简单组合则不能检测药用植物中复杂成分的比例和含量。
众所周知，虽然中药、植物源农药是历史悠久的药物，但其分析检测一直是个难题。因此，特别需要一种方法能够鉴别植物品种及其提取物中的各种活性成分，并且将其定量，然后选择出最好的提取物成分或其组合物，以便充分发挥其效果。另外，中药、植物源农药走出国门的障碍之一是没有组成成分及其定量标识，原因即为目前现有技术解决鉴别植物品种和评价植物源产品质量的定性和定量分析方面存在着很大的局限性（具体见本申请背景技术描述的内容）。事实证明，IGD核磁共振碳谱偶联指纹图谱技术正是解决这个问题的关键技术，这在见本申请说明书中已有说明。
2、虽然常规提取工艺为普通技术人员所熟知，但却从未有人将得到清晰图谱和具有代表性的活性成分组作为标准来选择工艺参数得到特征提取物。利用此方法，会使最终对于提取物的鉴别效果更好，这是本发明的难点之一，也是本发明的创新点之一。
3、IGD13C NMR偶联指纹图谱是多个活性成分的混合谱，不可避免会引起一根根棒峰的拥挤，甚至重叠。为了使计算结果准确，选择化学位移差别较大的活性成分组中各活性成分碳峰指定特征峰是必要的。由于不同类型化合物碳谱差别很大，特征峰的选择可以***；相同类型化合物碳谱差别很小，很多谱峰重叠严重，需有深厚的核磁共振波谱知识指导，经多方比较、反复考虑，才能选择较好的特征峰；而特征峰选择不好，是没有办法对活性成分组进行准确定量分析的，这也正是本发明需要解决的问题。根据连翘中木脂素类和苯乙醇苷类成分的特点，选择C-7作为特征峰区别木脂素类成分，并选择C-7′作为特征峰进一步区别重叠的该类成分；选择C-9′作为特征峰区别苯乙醇苷类成分，并选择C-1或C-6作为特征峰进一步区别重叠的该类成分。所以，根据不同活性成分的特点需要选择不同的活性成分碳峰指定特征峰也是本申请的又一创新点。
4、由于特征峰化学位移差别很小，很多情况下，仅在小数点后第1位差别，所以特征峰的排序是确定主要活性成分及其比例的关键，没有深厚的核磁共振波谱知识和分离基础，很难确定特征峰代表的活性成分及其比例，也就无法对活性成分组进行准确定性定量分析，根据连翘中木脂素类和苯乙醇苷类成分的碳谱核磁数据的特点，对两类成分的特征峰进行了准确排序；这是本发明的难点之一，也是本发明的创新点之一。
5、偶联计算关键是选择标准品和定量分析技术的选择。分析定量手段可以选择高效液相、气相色谱、薄层色谱法和称量法等，标准参照品可以是某一活性成分作为内标，也可以是外加参照品作为外标。根据连翘中木脂素类和苯乙醇苷类成分的特点，分析定量手段选择的为液相，标准参照品选择的是连翘苷或连翘酯苷（根据不同情况可有不同选择）。这是本发明的难点之一，也是本发明的创新点之一。
本发明采用IGD核磁共振碳谱指纹图谱对连翘衍生品进行鉴别，可以反映连翘衍生品中含有哪些连翘木脂素类和苯乙醇苷类以及它们之间的比例，达到对连翘衍生品质量鉴定的目的。线性范围宽，灵敏度高，重复性和可行性好。不仅能够有效控制连翘衍生品的内在质量，也可以满足当前对于客观有效地评价和控制连翘质量的迫切要求。总体来看，不仅可以解决我国连翘衍生品评价的难题，也为加强连翘衍生品内在成分研究的***化与标准化，实现与国际接轨提供了科学的保证。
附图说明
图1-a为实施例1自制栾川青翘木脂素和苯乙醇苷提取物的IGD核磁共振碳谱指纹图谱。
图1-b、1-c和1-d为实施例1自制栾川青翘木脂素和苯乙醇苷提取物的IGD核磁共振碳谱指纹图谱特征峰局部拉宽放大图。
图2-a为实施例2市售连翘提取物的IGD核磁共振碳谱指纹图谱。
图2-b和2-c为实施例2市售连翘提取物的IGD核磁共振碳谱指纹图谱特征峰局部拉宽放大图。
图3-a为实施例3自制栾川连翘叶木脂素和苯乙醇苷提取物甲（沉淀法）的IGD核磁共振碳谱指纹图谱。
图3-b、3-c和3-d为实施例3自制栾川连翘叶木脂素和苯乙醇苷提取物甲（沉淀法）的IGD核磁共振碳谱指纹图谱特征峰局部拉宽放大图。
图4-a为实施例4自制禹州连翘叶木脂素和苯乙醇苷提取物（树脂法）IGD核磁共振碳谱指纹图谱。
图4-b、4-c和4-d为实施例4自制禹州栾川连翘叶木脂素和苯乙醇苷提取物（树脂法）IGD核磁共振碳谱指纹图谱特征峰局部拉宽放大图。
图5-a为实施例5自制栾川连翘叶木脂素和苯乙醇苷提取物乙（树脂法）的IGD核磁共振碳谱指纹图谱。
图5-b、5-c和5-d为实施例5自制栾川连翘叶木脂素和苯乙醇苷提取物乙（树脂法）的IGD核磁共振碳谱指纹图谱特征峰局部拉宽放大图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
若无特别指出，本发明使用的物料均为本领域的常规物料，未提及的操作方法也为本领域常规的方法。
本发明中，乙醇的浓度均为体积百分比。
一、连翘衍生品IGD核磁共振碳谱指纹图谱研究
（1）连翘木脂素和苯乙醇苷特征提取物（CET）的获得
取连翘衍生品直接作为连翘木脂素和苯乙醇苷特征提取物（CET）
（2）连翘木脂素和苯乙醇苷特征提取物的IGD核磁共振碳谱指纹图谱检测
取连翘木脂素和/或苯乙醇苷特征提取物30mg，溶于0.5mL氘代二甲基亚砜（DMSO-d6）或氘代甲醇中，作IGD核磁共振碳谱指纹图谱检测，即得连翘木脂素和苯乙醇苷IGD核磁共振碳谱指纹图谱。
（3）连翘木脂素类和苯乙醇苷特征提取物的IGD核磁共振碳谱指纹图谱解析
①鉴别
连翘木脂素和苯乙醇苷特征提取物（CET）IGD核磁共振碳谱指纹图谱中，清楚地显示连翘木脂素类和苯乙醇苷类化合物的特征信号，连翘苷、松酯素-β-D-葡萄糖苷、连翘酯苷A、连翘酯苷H、连翘酯苷I等均有相应的NMR信号。
②连翘木脂素和苯乙醇苷特征提取物中的各活性成分特征峰选取
根据不同活性成分的特点需要选择不同的活性成分碳峰指定特征峰。选择原则如下：①同类化合物的指定特征峰最好为各个化合物位置相同的碳碳峰；②每个化合物的指定特征峰与其他碳峰之间化学位移差别较大；③各个化合物的指定特征峰之间化学位移差别较大；④影响各个化合物的指定特征峰本身的化学位移效应差别较大。
由于连翘木脂素类和苯乙醇苷特征提取物中含有一系列木脂素类和苯乙醇苷类化合物（活性成分），碳峰交叉得较多，为了测定各活性成分的比例，必须选择化学位移差别较大相应峰作为特征峰。为此，经实际考察，选择δC83.0～88.0左右一组C-7叔碳碳峰作为木脂素类活性成分碳峰指定特征峰，选择δC165.0～170.0左右一组C-9′羰基碳碳峰作为苯乙醇苷类活性成分碳峰指定特征峰；其原因为木脂素类化合物C-7叔碳和苯乙醇苷类化合物C-9′羰基碳与其他碳化学位移差别较大，易识别；且不同类型化合物和同类型不同化合物C-9′羰基碳碳峰之间化学位移也有一定差别。优选地，可选择C-7′作为特征峰进一步区别木脂素类活性成分中C-7特征峰重叠的连翘苷和表松脂素-4-β-D-葡萄糖苷，它们的化学位移为δC81.0～82.0；可选择C-1或C-6作为特征峰进一步区别苯乙醇苷类活性成分中的C-9′特征峰重叠的连翘酯苷A和连翘酯苷H，它们的化学位移分别为δC119.0～120.0和δC129.0～130.0。
③标准参照品的选择
连翘苷是连翘药材及其提取物，以及连翘木脂素和苯乙醇苷特征提取物中主要木脂素类活性成分，其C-7化学位移约为δC86.7（DMSO-d6）与其他主要木脂素类和苯乙醇苷类成分在此没有重叠；连翘酯苷A是连翘药材及其提取物中主要苯乙醇苷类活性成分，其C-1或C-6的化学位移分别为δC119.0～120.0和δC129.0～130.0，与其他主要木脂素类和苯乙醇苷类成分在此没有重叠；因此，选择连翘苷或连翘酯苷作为2类活性成分的标准参照品。
（4）采用HPLC法测定连翘衍生品中连翘苷和连翘酯苷的含量
①连翘苷含量测定
i）色谱条件（参照2010版药典）
流动相为乙腈：水=25：75；
色谱柱：C18（250*4.6mm，5um）；
检测波长：277nm。
ii）连翘苷标准参照品溶液的配制
精确称取连翘苷5mg，置50mL容量瓶中，用甲醇溶解稀释至刻度，摇匀后即得连翘苷标准参照品溶液。
iii）含有连翘木脂素类活性成分的供试品溶液的制备
准确称取供试品：连翘衍生品（如连翘提取物）200mg于100mL容量瓶中，加适量甲醇（30-40mL）溶解，超声振荡后稀释至刻度，即连翘衍生品供试品溶液（如连翘提取物供试品溶液）。
iv）测定法
分别精密吸取连翘苷标准参照品溶液与含有连翘木脂素类活性成分的供试品溶液（即上述连翘衍生品供试品溶液）各20μ1，注入液相色谱仪，测定，即得连翘苷含量。
v）连翘衍生品中连翘苷绝对含量计算
由下式计算含有木脂素类活性成分的供试品溶液中连翘苷质量浓度：
C X = C R × A X A R
CX：含有木脂素类活性成分的供试品溶液中连翘苷质量浓度（ug/mL）；
CR：连翘苷标准参照品溶液质量浓度（ug/mL）；
AX：含有木脂素类活性成分的供试品溶液的峰面积；
AR：连翘苷标准参照品溶液的峰面积。
vi）由下式计算连翘衍生品中连翘苷质量百分含量
Figure BDA0000463966010000122
W连翘苷（%）：连翘衍生品中连翘苷质量百分含量；
CX：含有木脂素类活性成分的供试品溶液中的连翘苷质量浓度(ug/mL)；
m：称取的连翘衍生品的质量(mg)。
②连翘酯苷含量测定
i）色谱条件（参照2010版药典）
流动相为乙腈：冰醋酸溶液=15：85；
色谱柱：C18（250*4.6mm，5um）；
检测波长：330nm。
ii）连翘酯苷标准参照品溶液的配制
精确称取连翘酯苷5mg，置50mL容量瓶中，用甲醇溶解稀释至刻度，摇匀后即得连翘酯苷标准参照品溶液。
iii）含有连翘苯乙醇苷类活性成分的供试品溶液的制备
准确称取供试品：连翘衍生品（如连翘提取物）200mg于100mL容量瓶中，加适量甲醇（30-40mL）溶解，超声振荡后稀释至刻度，即连翘衍生品供试品溶液（如连翘提取物供试品溶液）。
iv）测定法
分别精密吸取连翘酯苷标准参照品溶液与含有连翘苯乙醇苷类活性成分的供试品溶液（即上述连翘衍生品供试品溶液）各20μ1，注入液相色谱仪，测定，即得连翘苷含量。
v）连翘衍生品中连翘酯苷绝对含量计算
由下式计算含有苯乙醇苷类活性成分的供试品溶液中连翘苷质量浓度：
C X = C R × A X A R
CX：含有苯乙醇苷类活性成分的供试品溶液中连翘酯苷质量浓度（ug/mL）；
CR：连翘酯苷标准参照品溶液质量浓度（ug/mL）；
AX：含有苯乙醇苷类活性成分的供试品溶液的峰面积；
AR：连翘酯苷标准参照品溶液的峰面积。
vi）由下式计算连翘衍生品中连翘酯苷质量百分含量
Figure BDA0000463966010000141
W连翘酯苷（%）：连翘衍生品中连翘酯苷质量百分含量；
CX：含有苯乙醇苷类活性成分的供试品溶液中的连翘酯苷质量浓度(ug/mL)；
m：称取的连翘衍生品的质量(mg)。
（5）通过偶联公式计算连翘衍生品中木脂素类或苯乙醇苷类各个主要活性成分的含量及总量，即木脂素类或苯乙醇苷类活性成分组的含量
W n = W 1 M n h n M 1 h 1
W1：连翘衍生品中标准参照品连翘苷或连翘酯苷的质量百分含量；
M1：标准参照品连翘苷或连翘酯苷的分子量/定量峰对应的碳个数；
h1：由IGD核磁共振碳谱指纹图谱测定的标准参照品连翘苷或连翘酯苷的特征峰峰强度（峰高）；
Wn：连翘衍生品中某一木脂素类或苯乙醇苷类活性成分的质量百分含量；
Mn：连翘衍生品中某一木脂素类或苯乙醇苷类活性成分的分子量/定量峰对应的碳个数；
hn：由IGD核磁共振碳谱指纹图谱测定的连翘衍生品中某一木脂素类或苯乙醇苷类活性成分特征峰峰强度（峰高）。
二、仪器、试剂与材料
主要仪器和设备
核磁共振波谱仪Bruker DPX400型。
质谱仪：Waters Micromass公司Q-Tof MicroTM型。
半制备高效液相色谱仪：Waters600型。
高效液相色谱仪：Agilent1200型。
2000mL蒸馏烧瓶、5000mL蒸馏烧瓶、球型冷凝管、2000mL分液漏斗。
DE-52AA旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂。
DEF-6020型真空干燥箱：上海精宏实验设备有限公司。
青翘、老翘（河南栾川、禹州，2012年采摘自当地）、市售连翘提取物（西安康培基生物科技有限公司），药材经河南省农业大学朱长山教授鉴定；连翘苷，化学对照品，实验室自制（经光谱数据鉴定）。
试剂：色谱纯（甲醇，天津市四友精细化学品有限公司）及分析纯（天津市化学试剂一厂）。
三、基础研究
（1）连翘衍生品中主要活性成分的结构及核磁共振碳谱数据
Figure BDA0000463966010000151
连翘苷：R1=Me,R2=Glc
连翘酯素：R1=Me,R2=H
表松脂素-4-β-D-葡萄糖苷：R1=H,R2=Glc
表松酯素-4′-O-葡萄糖苷：R1=Glc,R2=H
松酯素-β-D-葡萄糖苷:R1=H,R2=Glc
Figure BDA0000463966010000162
1-羟基-松脂素4″-O-葡萄糖苷
Figure BDA0000463966010000163
连翘兰A：R=H
连翘兰B：R=Me
Figure BDA0000463966010000164
连翘酯苷A
Figure BDA0000463966010000171
连翘酯苷B
连翘酯苷H
Figure BDA0000463966010000173
连翘酯苷F
Figure BDA0000463966010000174
连翘酯苷I
Figure BDA0000463966010000181
连翘酯苷J
Figure BDA0000463966010000182
正丁氧基连翘酯苷
连翘苷（Phillyrin）
13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δC:135.2(C-1),110.3(C-2),148.8
(C-3),145.8(C-4),115.1(C-5),118.0(C-6),86.5(C-7),53.9
(C-8),70.2(C-9),131.2(C-1′),109.3(C-2′),148.5(C-3′),146.0
(C-4′),111.4(C-5′),117.4(C-6′),81.1(C-7′),49.2(C-8′),68.9
(C-9′),55.4,55.4,55.6(3OMe)，100.0(Glc-1),73.1(Glc-2),76.7
(Glc-3),69.6(Glc-4),76.9(Glc-5),60.6(Glc-6)。
连翘酯素（Phillygenin）
13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δC:132.2(C-1),110.2(C-2),147.4*
(C-3),145.9(C-4),115.1(C-5),118.5(C-6),86.9(C-7),53.8
(C-8),70.2(C-9),131.1(C-1′),109.4(C-2′),148.4(C-3′),147.6*
(C-4′),111.5(C-5′),117.5(C-6′),81.3(C-7′),49.3(C-8′),68.7
(C-9′),55.4,55.4,55.5(3OMe)。（*归属可互换）
表松脂素-4-β-D-葡萄糖苷（epipinoresinol-4-β-D-glucoside）
13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δC:135.3(C-1),110.4(C-2),148.9(C-3),145.9(C-4),115.1(C-5),118.1*(C-6),86.6(C-7),54.0(C-8),70.2(C-9),129.6(C-1′),109.7(C-2′),147.3(C-3′),145.2(C-4′),115.1(C-5′),117.9*(C-6′),81.4(C-7′),49.3(C-8′),69.0(C-9′),55.5,55.6(2OMe)，100.1(Glc-1),73.2(Glc-2),76.8**(Glc-3),69.6(Glc-4),77.0*(Glc-5),60.6(Glc-6)。（*归属可互换）
松酯素-β-D-葡萄糖苷[(+)-pinoresinol-β-D-glucoside]
13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δC:135.2(C-1),115.1(C-2),148.9(C-3),145.9(C-4),114.8(C-5),118.6(C-6),85.1(C-7),53.5(C-8),70.9(C-9),132.1(C-1′),110.4(C-2′),148.9(C-3′),148.9(C-4′),115.1(C-5′),118.6(C-6′),84.8(C-7′),53.5(C-8′),70.9(C-9′),55.6(2OMe)，100.0(Glc-1),73.1(Glc-2),76.9(Glc-3),69.6(Glc-4),76.9(Glc-5),60.6(Glc-6)。（*归属可互换）
1-羟基-松脂素4″-O-葡萄糖苷（Hydroxypinoresinol-4″-O-β-D-glucoside）
13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δC:135.3(C-1),110.9(C-2),148.9(C-3),145.9(C-4),115.2(C-5),118.4(C-6),85.1(C-7),60.8(C-8),70.3(C-9),128.0(C-1′),112.4(C-2′),146.9(C-3′),146.0(C-4′),114.6(C-5′),120.2(C-6′),87.2(C-7′),91.0(C-8′),74.8(C-9′),55.6,55.8(2OMe)，100.1(Glc-1),73.2(Glc-2),76.8(Glc-3),69.6(Glc-4),77.0(Glc-5),60.6(Glc-6)。（*归属可互换）
连翘兰A（forsythialan A）
13C NMR(75MHz,CDCL3)δ:132.30(C-1),110.04(C-2),146.84(C-3),114.06(C-4),145.57(C-5),120.08(C-6),83.85(C-7),52.22(C-8),61.35(C-9),129.42(C-1′),110.39(C-2′),146.85(C-3′),150.84(C-4′),114.07(C-5′),123.81(C-6′),197.99(C-7′),49.62(C-8′),70.78(C-9′)，56.07(OCH3-3)，55.96(OCH3-3′)。
连翘兰B（forsythialan B）
13C NMR(75MHz,CDCL3)δ:132.32(C-1),108.97(C-2),146.85(C-3),114.04(C-4),145.62(C-5),120.11(C-6),83.88(C-7),52.25(C-8),61.42(C-9),129.79(C-1′),110.67(C-2′),149.27(C-3′),153.71(C-4′),10.15(C-5′),123.16(C-6′),197.96(C-7′),49.66(C-8′),70.80(C-9′)，56.01(OCH3-3)，56.01(OCH3-3′)。
表松酯素-4′-O-葡萄糖苷（epipinoresinol-4′-O-glucoside）
13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δC:132.2*(C-1),110.2(C-2),147.4(C-3),145.9(C-4),114.8(C-5),118.6(C-6),86.9(C-7),53.8(C-8),68.8(C-9),132.3*(C-1′),109.9(C-2′),148.5(C-3′),145.4(C-4′),115.1(C-5′),117.5(C-6′),81.1(C-7′),49.2(C-8′),68.8(C-9′),55.5,55.6(2OMe)，100.0(Glc-1),73.2(Glc-2),76.8(Glc-3),69.6(Glc-4),76.9(Glc-5),60.6(Glc-6)。（*归属可互换）
连翘酯苷A[Forsythoside A(forsythiaside)]
13C NMR(100Mz,DMSO)δ:129.2(C-1),115.5(C-2),144.9(C-3),143.5(C-4),116.3(C-5),119.5(C-6),35.1(C-7),70.3(C-8),125.4(C-1′),114.8(C-2′),145.6(C-3′),148.6(C-4′),115.8(C-5′),121.4(C-6′),145.6(C-7′),113.6(C-8′),165.9(C-9′),102.9(Glc-1),73.0(Glc-2),73.5(Glc-3),71.0(Glc-4),73.9(Glc-5),66.1(Glc-6),100.5(Rha-1),70.6(Rha-2),70.6(Rha-3),71.9(Rha-4),68.4(Rha-5),17.8(Rha-6)
13C NMR(100Mz,CD3OD)δ:131.4(C-1),116.4(C-2),146.1(C-3),144.7(C-4),117.2(C-5),121.3(C-6),36.7(C-7),72.4(C-8),127.7(C-1′),115.3(C-2′),146.9(C-3′),149.8(C-4′),116.6(C-5′),123.2(C-6′),147.7(C-7′),114.7(C-8′),168.3(C-9′),104.5(Glc-1),75.2(Glc-2),75.8(Glc-3),72.4(Glc-4),74.8(Glc-5),67.7(Glc-6),102.3(Rha-1),72.3(Rha-2),
72.1(Rha-3),74.0(Rha-4),69.9(Rha-5),18.0(Rha-6)。
连翘酯苷B（Forsythoside B）
13C NMR(125Mz,CD3OD)δ:131.4(C-1),115.3(C-2),146.0(C-3),144.5(C-4),116.3(C-5),121.3(C-6),36.5(C-7),72.2(C-8),127.6(C-1′),114.7(C-2′),146.7(C-3′),149.6(C-4′),116.5(C-5′),123.2(C-6′),148.0(C-7′),117.1(C-8′),168.2(C-9′),104.1(Glc-1),81.6(Glc-2),76.0(Glc-3),70.4(Glc-4),74.4(Glc-5),68.3(Glc-6),103.0(Rha-1),72.2(Rha-2),72.0(Rha-3),73.7(Rha-4),70.8(Rha-5),18.4(Rha-6)，110.9(APi-1),78.0(APi-2),80.6(APi-3),75.0(APi-4),65.6(APi-5)。
连翘酯苷H（Forsythoside H）
13C NMR(100Mz,DMSO)δ:129.1(C-1),115.4(C-2),144.9(C-3),143.5(C-4),116.2(C-5),119.6(C-6),35.1(C-7),69.8(C-8),125.5(C-1′),114.8(C-2′),145.6(C-3′),148.5(C-4′),115.8(C-5′),121.3(C-6′),145.2(C-7′),114.2(C-8′),165.7(C-9′),100.2(Glc-1),73.4(Glc-2),74.1(Glc-3),70.7(Glc-4),75.5(Glc-5),66.6(Glc-6),100.7(Rha-1),70.5(Rha-2),70.3(Rha-3),72.0(Rha-4),68.4(Rha-5),18.0(Rha-6)。
连翘酯苷F（Forsythoside F）
13C NMR(100Mz,DMSO)δ:129.2(C-1),115.5(C-2),144.9(C-3),143.5(C-4),116.4(C-5),119.6(C-6),35.0(C-7),69.4(C-8),125.4(C-1′),114.7(C-2′),145.9(C-3′),148.6(C-4′),115.8(C-5′),121.5(C-6′),145.6(C-7′),113.3(C-8′),166.0(C-9′),102.2(Glc-1),73.0(Glc-2),78.9(Glc-3),70.3(Glc-4),73.2(Glc-5),68.8(Glc-6),101.3(Rha-1),71.7(Rha-2),71.7(Rha-3),76.3(Rha-4),70.4(Rha-5),18.2(Rha-6),103.8(Xyl-1),74.4(Xyl-2)，78.8(Xyl-3)，70.5(Xyl-4)，65.6(Xyl-5)。
连翘酯苷I（Forsythoside I）
13C NMR(100Mz,DMSO)δ:129.5(C-1),115.5(C-2),144.7(C-3),143.5(C-4),116.3(C-5),119.5(C-6),35.1(C-7),70.2(C-8),125.6(C-1′),114.9(C-2′),145.3(C-3′),148.2(C-4′),115.7(C-5′),121.3(C-6′),144.9(C-7′),114.7(C-8′),166.1(C-9′),102.7(Glc-1),71.4(Glc-2),77.5(Glc-3),68.1(Glc-4),75.1(Glc-5),66.5(Glc-6),100.7(Rha-1),70.6(Rha-2),70.4(Rha-3),71.9(Rha-4),68.4(Rha-5),17.9(Rha-6)。
连翘酯苷J（Forsythoside J）
13C NMR(100Mz,DMSO)δ:129.2(C-1),115.4(C-2),144.9(C-3),143.5(C-4),116.2(C-5),119.6(C-6),35.0(C-7),69.8(C-8),125.5(C-1′),114.8(C-2′),145.6(C-3′),148.5(C-4′),115.8(C-5′),121.3(C-6′),145.1(C-7′),114.2(C-8′),165.7(C-9′),100.1(Glc-1),73.3(Glc-2),74.1(Glc-3),70.0(Glc-4),75.7(Glc-5),65.7(Glc-6),104.0(Xyl-1),73.3(Xyl-2),76.6(Xyl-3),69.6(Xyl-4),68.2(Xyl-5)。
正丁氧基连翘酯苷[(-)-Suspensaside B）
13C NMR(100Mz,DMSO)δ:131.8(C-1),115.0(C-2),146.5(C-3),146.3(C-4),116.5(C-5),119.7(C-6),81.9(C-7),75.4(C-8),127.7(C-1′),115.2(C-2′),145.6(C-3′),148.5(C-4′),115.8(C-5′),121.3(C-6′),145.1(C-7′),114.2(C-8′),167.5(C-9′),100.1(Glc-1),73.3(Glc-2),74.1(Glc-3),70.0(Glc-4),75.7(Glc-5),65.7(Glc-6),104.1(Xyl-1),73.3(Xyl-2),76.6(Xyl-3),69.4(Xyl-4),68.2(Xyl-5)。
实施例1：自制栾川青翘木脂素和苯乙醇苷提取物IGD核磁共振碳谱偶联指纹图谱
（1）特征提取物制备
自制栾川青翘木脂素和苯乙醇苷提取物，即采用醇提后大孔吸附树脂精制纯化的方法制备：称取栾川青翘20g，加相当于药材8体积倍量（160mL）的20%乙醇在85℃下回流提取3次，每次1h，过滤，合并滤液，减压浓缩约至无醇味，过滤，滤液上D101树脂柱（它的质量为50g），先后以水、40%乙醇冲柱（冲柱的水和乙醇的体积分别为浓缩后滤液体积的25和40倍），收集40%乙醇洗脱液，减压蒸干，得自制的栾川青翘木脂素和苯乙醇苷提取物0.78g，将其作为特征提取物。
（2）自制栾川青翘木脂素和苯乙醇苷提取物IGD核磁共振碳谱指纹图谱检测
取上步制得的栾川青翘木脂素和苯乙醇苷提取物30mg，溶于0.5mL DMSO-d6中，作IGD核磁共振碳谱检测，即得栾川青翘木脂素和苯乙醇苷提取物IGD核磁共振碳谱指纹图谱。
（3）自制栾川青翘木脂素和苯乙醇苷特征提取物IGD核磁共振碳谱指纹图谱
1）IGD核磁共振碳谱指纹图谱鉴别
栾川青翘木脂素和苯乙醇苷提取物的IGD核磁共振碳谱指纹图谱中，清楚地显示连翘木脂素类化合物的特征信号：δC132.0-136.0,108.0-116.5,144.5-149.0,143.0-146.0,114.0-116.0，118.0-121.0，83.0-88.0,53.0-62.0，68.0-71.0，129.0-133.0,108.0-113.0,146.0-150.0,145.0-154.0,111.0-116.0，117.0-124.0，81.0-82.0或84.5-88.0或197.0-199.0,49.0-51.0或90.0-92.0，68.0-75.0或61.0-62.0分别为木脂素和苯乙醇苷骨架上1,2,3,4,5,6,7,8,9，1′,2′,3′,4′,5′,6′,7′,8′,9′位碳信号；连翘木脂素和苯乙醇苷提取物的IGD核磁共振碳谱指纹图谱中，清楚地显示连翘苯乙醇苷类化合物的特征信号：δC129.0-132.0,115.0-117.0,144.0-147.0,143.0-147.0,116.0-118.0，119.0-122.0，34.5-37.0或81.0-82.0,69.0-76.0，125.0-128.0,104.0-116.0,145.0-146.0,148.0-150.0,115.0-116.0，121.0-124.0，144.0-148.0，113.0-115.0，165.0-170.0分别为木脂素和苯乙醇苷骨架上1,2,3,4,5,6,7,8,1′,2′,3′,4′,5′,6′,7′,8′,9′位碳信号。连翘木脂素和苯乙醇苷类化合物：连翘苷、表松脂素-4-β-D-葡萄糖苷、松酯素-β-D-葡萄糖苷、连翘酯苷A、连翘酯苷H、连翘酯苷I等在IGD核磁共振碳谱指纹图谱中均有相应的NMR信号。IGD核磁共振碳谱指纹图谱见附图1-a，其特征峰局部拉宽放大图见附图1-b、1-c和1-d。
2）自制栾川青翘木脂素和苯乙醇苷提取物中各活性成分比例测定结果如下：
Figure BDA0000463966010000241
（4）HPLC法测定自制栾川青翘木脂素和苯乙醇苷提取物中连翘苷和连翘酯苷质量百分含量，测定结果如下：
Figure BDA0000463966010000242
（5）自制栾川青翘木脂素和苯乙醇苷提取物中木脂素和苯乙醇苷类活性成分质量百分含量测定结果如下：
Figure BDA0000463966010000243
Figure BDA0000463966010000251
从表中可以看出，IGD核磁共振碳谱指纹图谱计算出的连翘酯苷A含量为18.22%，HPLC测定的连翘酯苷A含量为17.44%，二者误差在5%以内。
实施例2：市售连翘提取物IGD核磁共振碳谱偶联指纹图谱
（1）特征提取物选择
直接选择市售连翘提取物（西安康培基生物科技有限公司）作为特征提取物。
（2）市售连翘提取物IGD核磁共振碳谱指纹图谱检测
取市售连翘提取物30mg，溶于0.5mL DMSO-d6中，作IGD核磁共振碳谱检测，即得市售连翘提取物IGD核磁共振碳谱指纹图谱。
（3）市售连翘提取物IGD核磁共振碳谱指纹图谱
1）IGD核磁共振碳谱指纹图谱鉴别
市售连翘提取物的IGD核磁共振碳谱指纹图谱中，清楚地显示连翘木脂素类化合物的特征信号:δC132.0-136.0,108.0-116.5,144.5-149.0,143.0-146.0,114.0-116.0，118.0-121.0，83.0-88.0,53.0-62.0，68.0-71.0，129.0-133.0,108.0-113.0,146.0-150.0,145.0-154.0,111.0-116.0，117.0-124.0，81.0-82.0或84.5-88.0或197.0-199.0,49.0-51.0或90.0-92.0，68.0-75.0或61.0-62.0分别为木脂素和苯乙醇苷骨架上1,2,3,4,5,6,7,8,9，1′,2′,3′,4′,5′,6′,7′,8′,9′位碳信号；市售连翘提取物的IGD核磁共振碳谱指纹图谱中，清楚地显示连翘苯乙醇苷类化合物的特征信号:δC129.0-132.0,115.0-117.0,144.0-147.0,143.0-147.0,116.0-118.0，119.0-122.0，34.5-37.0或81.0-82.0,69.0-76.0，125.0-128.0,104.0-116.0,145.0-146.0,148.0-150.0,115.0-116.0，121.0-124.0，144.0-148.0，113.0-115.0，165.0-170.0分别为木脂素和苯乙醇苷骨架上1,2,3,4,5,6,7,8,1′,2′,3′,4′,5′,6′,7′,8′,9′位碳信号。连翘木脂素和苯乙醇苷类化合物：连翘苷、松酯素-β-D-葡萄糖苷、连翘酯苷A、连翘酯苷H、连翘酯苷F、连翘酯苷I等在IGD核磁共振碳谱指纹图谱中均有相应的NMR信号。IGD核磁共振碳谱指纹图谱见附图2-a，其特征峰局部拉宽放大图见附图2-b和2-c。
2）市售连翘提取物中各活性成分比例测定结果如下：
Figure BDA0000463966010000261
（4）HPLC法测定市售连翘提取物中连翘苷和连翘酯苷质量百分含量，测定结果如下：
市售连翘提取物中连翘苷质量百分含量W连翘苷（%） 0.67%
市售连翘提取物中连翘酯苷质量百分含量W连翘酯苷（%） 10.34%
（5）市售连翘提取物中木脂素和苯乙醇苷类活性成分质量百分含量测定结果如下：
Figure BDA0000463966010000262
Figure BDA0000463966010000271
从表中可以看出，IGD核磁共振碳谱指纹图谱计算出的连翘酯苷A含量为10.63%，HPLC测定的连翘酯苷A含量为10.34%，二者误差在5%以内。
实施例3：自制栾川连翘叶的木脂素和苯乙醇苷提取物甲（沉淀法）IGD核磁共振碳谱偶联指纹图谱
（1）特征提取物制备
自制栾川连翘叶木脂素和苯乙醇苷提取物甲，即采用水煮后沉淀精制纯化的方法制备：称取栾川连翘叶20g，加相当于药材8体积倍量（160mL）的水在95℃下回流提取2次，每次1h，过滤，沉淀烘干后用MeOH溶解，过滤，滤液烘干，得自制的栾川叶木脂素和苯乙醇苷提取物1.56g，将其作为特征提取物。
（2）自制连翘叶木脂素和苯乙醇苷提取物甲IGD核磁共振碳谱指纹图谱检测
取上步制得的栾川连翘叶木脂素和苯乙醇苷提取物甲30mg，溶于0.5mL DMSO-d6中，作IGD核磁共振碳谱检测，即得自制栾川连翘叶木脂素和苯乙醇苷提取物IGD核磁共振碳谱指纹图谱。
（3）自制栾川连翘叶木脂素和苯乙醇苷特征提取物甲IGD核磁共振碳谱指纹图谱
1）IGD核磁共振碳谱指纹图谱鉴别
连翘叶木脂素和苯乙醇苷提取物甲的IGD核磁共振碳谱指纹图谱中，清楚地显示连翘木脂素类化合物的特征信号:δC132.0-136.0,108.0-116.5,146.0-149.0,145.0-146.0,114.0-116.0，118.0-121.0，83.0-88.0,53.0-62.0，68.0-71.0或60.0-62.0，128.0-133.0,108.0-113.0,146.0-150.0,145.0-154.0,111.0-116.0，117.0-124.0，81.0-82.0或84.5-88.0或197.0-199.0,49.0-51.0或90.0-92.0，68.0-75.0或61.0-62.0分别为木脂素和苯乙醇苷骨架上1,2,3,4,5,6,7,8,9，1′,2′,3′,4′,5′,6′,7′,8′,9′位碳信号；自制连翘木脂素和苯乙醇苷提取物的IGD核磁共振碳谱指纹图谱中，清楚地显示连翘苯乙醇苷类化合物的特征信号:δC129.0-132.0,115.0-117.0,144.0-147.0,143.0-147.0,116.0-118.0，119.0-122.0，34.5-37.0或81.0-82.0,69.0-76.0，125.0-128.0,104.0-116.0,145.0-146.0,148.0-150.0,115.0-116.0，121.0-124.0，144.0-148.0，113.0-115.0，165.0-170.0分别为木脂素和苯乙醇苷骨架上1,2,3,4,5,6,7,8,1′,2′,3′,4′,5′,6′,7′,8′,9′位碳信号。连翘木脂素和苯乙醇苷类化合物：连翘苷、连翘酯素、松酯素-β-D-葡萄糖苷、1-羟基-松脂素4″-O-葡萄糖苷、连翘酯苷A、连翘酯苷H、连翘酯苷I等在IGD核磁共振碳谱指纹图谱中均有相应的NMR信号。IGD核磁共振碳谱指纹图谱见附图3-a，其特征峰局部拉宽放大图见附图3-b、3-c和3-d。
2）自制栾川连翘叶木脂素和苯乙醇苷提取物甲中各活性成分比例测定结果如下：
Figure BDA0000463966010000281
（4）HPLC法测定自制连翘叶木脂素和苯乙醇苷提取物甲中连翘苷和连翘酯苷质量百分含量，测定结果如下：
（5）自制栾川连翘叶木脂素和苯乙醇苷提取物甲中连翘木脂素和苯乙醇苷类活性成分质量百分含量测定结果如下：
从表中可以看出，IGD核磁共振碳谱指纹图谱计算出的连翘酯苷A含量为7.87%，HPLC测定的连翘酯苷A含量为7.49%，二者误差在5%以内。
实施例4：自制禹州连翘叶的木脂素和苯乙醇苷提取物（树脂法）IGD核磁共振碳谱偶联指纹图谱
（1）特征提取物制备
自制禹州连翘叶木脂素和苯乙醇苷提取物，即采用醇提后大孔吸附树脂精制纯化的方法制备：称取禹州连翘叶20g，加相当于药材8体积倍量（160mL）的水在85℃下回流提取3次，每次1h，过滤，合并滤液，减压浓缩约至无醇味，过滤，滤液上D101树脂柱（它的质量为50g），先后以水、40%乙醇冲柱（冲柱的水和乙醇的体积分别为浓缩后滤液体积的25和40倍），收集40%乙醇洗脱液，减压蒸干，得自制禹州连翘叶木脂素和苯乙醇苷提取物1.79g，将其作为特征提取物。
（2）自制禹州连翘叶木脂素和苯乙醇苷提取物IGD核磁共振碳谱指纹图谱检测
取上步制得的木脂素和苯乙醇苷提取物乙30mg，溶于0.5mLDMSO-d6中，作IGD核磁共振碳谱检测，即得自制连翘叶木脂素和苯乙醇苷提取物乙IGD核磁共振碳谱指纹图谱。
（3）自制禹州连翘叶木脂素和苯乙醇苷特征提取物IGD核磁共振碳谱指纹图谱
1）IGD核磁共振碳谱指纹图谱鉴别
自制禹州连翘叶木脂素和苯乙醇苷提取物的IGD核磁共振碳谱指纹图谱中，清楚地显示连翘木脂素类化合物的特征信号:δC132.0-136.0,108.0-116.5,144.5-149.0,143.0-146.0,114.0-116.0，118.0-121.0，83.0-88.0,53.0-62.0，68.0-71.0或60.0-62.0，128.0-133.0,108.0-113.0,146.0-150.0,145.0-154.0,111.0-116.0，117.0-124.0，81.0-82.0或84.5-88.0或197.0-199.0,49.0-51.0或90.0-92.0，68.0-75.0或61.0-62.0分别为木脂素和苯乙醇苷骨架上1,2,3,4,5,6,7,8,9，1′,2′,3′,4′,5′,6′,7′,8′,9′位碳信号；自制连翘叶木脂素和苯乙醇苷提取物乙的IGD核磁共振碳谱指纹图谱中，清楚地显示连翘苯乙醇苷类化合物的特征信号:δC129.0-132.0,115.0-117.0,144.0-147.0,143.0-147.0,116.0-118.0，119.0-122.0，34.5-37.0或81.0-82.0,69.0-76.0，125.0-128.0,104.0-116.0,145.0-146.0,148.0-150.0,115.0-116.0，121.0-124.0，144.0-148.0，113.0-115.0，165.0-170.0分别为木脂素和苯乙醇苷骨架上1,2,3,4,5,6,7,8,1′,2′,3′,4′,5′,6′,7′,8′,9′位碳信号。连翘木脂素和苯乙醇苷类化合物：连翘苷、松酯素-β-D-葡萄糖苷、1-羟基-松脂素4″-O-葡萄糖苷、连翘酯苷A、连翘酯苷H、连翘酯苷I等在IGD核磁共振碳谱指纹图谱中均有相应的NMR信号。IGD核磁共振碳谱指纹图谱见附图4-a，其特征峰局部拉宽放大图见附图4-b、4-c和4-d。
2）自制禹州连翘叶木脂素和苯乙醇苷提取物中各活性成分比例测定结果如下：
Figure BDA0000463966010000311
（4）HPLC法测定自制禹州连翘叶木脂素和苯乙醇苷提取物中连翘苷和连翘酯苷质量百分含量，测定结果如下：
Figure BDA0000463966010000312
（5）自制禹州连翘叶木脂素和苯乙醇苷提取物中连翘木脂素和苯乙醇苷类活性成分质量百分含量测定结果如下：
Figure BDA0000463966010000321
从表中可以看出，IGD核磁共振碳谱指纹图谱计算出的连翘苷含量为6.99%，HPLC测定的连翘酯苷A含量为6.70%，二者误差在5%以内。
实施例5：自制栾川连翘叶木脂素和苯乙醇苷提取物乙（树脂法）IGD核磁共振碳谱偶联指纹图谱
（1）特征提取物制备
自制栾川连翘叶木脂素和苯乙醇苷提取物乙，即采用醇提后大孔吸附树脂精制纯化的方法制备：称取栾川连翘叶20g，加相当于药材8体积倍量（160mL）的水在85℃下回流提取3次，每次1h，过滤，合并滤液，减压浓缩约至无醇味，过滤，滤液上D101树脂柱（它的质量为50g），先后以水、40%乙醇冲柱（冲柱的水和乙醇的体积分别为浓缩后滤液体积的30和40倍），收集40%乙醇洗脱液，减压蒸干，得自制栾川连翘叶木脂素和苯乙醇苷提取物乙1.56g，将其作为特征提取物。
（2）自制栾川连翘叶木脂素和苯乙醇苷提取物乙IGD核磁共振碳谱指纹图谱检测
取上步制得的木脂素和苯乙醇苷提取物乙30mg，溶于0.5mLDMSO-d6中，作IGD核磁共振碳谱检测，即得自制连翘叶木脂素和苯乙醇苷提取物乙IGD核磁共振碳谱指纹图谱。
（3）自制栾川连翘叶木脂素和苯乙醇苷特征提取物乙IGD核磁共振碳谱指纹图谱
1）IGD核磁共振碳谱指纹图谱鉴别
自制栾川连翘叶木脂素和苯乙醇苷提取物乙的IGD核磁共振碳谱指纹图谱中，清楚地显示连翘木脂素类化合物的特征信号:δC132.0-136.0,108.0-116.5,144.5-149.0,143.0-146.0,114.0-116.0，118.0-121.0，83.0-88.0,53.0-62.0，68.0-71.0或60.0-62.0，128.0-133.0,108.0-113.0,146.0-150.0,145.0-154.0,111.0-116.0，117.0-124.0，81.0-82.0或84.5-88.0或197.0-199.0,49.0-51.0或90.0-92.0，68.0-75.0或61.0-62.0分别为木脂素和苯乙醇苷骨架上1,2,3,4,5,6,7,8,9，1′,2′,3′,4′,5′,6′,7′,8′,9′位碳信号；自制栾川连翘叶木脂素和苯乙醇苷提取物乙的IGD核磁共振碳谱指纹图谱中，清楚地显示连翘苯乙醇苷类化合物的特征信号:δC129.0-132.0,115.0-117.0,144.0-147.0,143.0-147.0,116.0-118.0，119.0-122.0，34.5-37.0或81.0-82.0,69.0-76.0，125.0-128.0,104.0-116.0,145.0-146.0,148.0-150.0,115.0-116.0，121.0-124.0，144.0-148.0，113.0-115.0，165.0-170.0分别为木脂素和苯乙醇苷骨架上1,2,3,4,5,6,7,8,1′,2′,3′,4′,5′,6′,7′,8′,9′位碳信号。连翘木脂素和苯乙醇苷类化合物：连翘苷、松酯素-β-D-葡萄糖苷、连翘酯苷A、连翘酯苷H、连翘酯苷I等在IGD核磁共振碳谱指纹图谱中均有相应的NMR信号。IGD核磁共振碳谱指纹图谱见附图5-a，其特征峰局部拉宽放大图见附图5-b、5-c和5-d。
2）自制栾川连翘叶木脂素和苯乙醇苷提取物乙中各活性成分比例测定结果如下：
Figure BDA0000463966010000341
（4）HPLC法测定自制栾川连翘叶木脂素和苯乙醇苷提取物乙中连翘苷和连翘酯苷质量百分含量，测定结果如下：
Figure BDA0000463966010000342
（5）自制栾川连翘叶木脂素和苯乙醇苷提取物乙中连翘木脂素和苯乙醇苷类活性成分质量百分含量测定结果如下：
Figure BDA0000463966010000343
从表中可以看出，IGD核磁共振碳谱指纹图谱计算出的连翘苷含量为7.84%，HPLC测定的连翘酯苷A含量为7.69%，二者误差在5%以内。

Claims (11)

1.一种鉴别连翘衍生品的方法，包括以下步骤：
1）取连翘衍生品直接作为含有活性成分组的连翘木脂素和苯乙醇苷特征提取物；
2）对所述连翘木脂素和苯乙醇苷特征提取物进行IGD核磁共振碳谱指纹图谱检测，根据指纹图谱得到特征提取物中若干个活性成分特征峰峰强度；并用相同方式测定出所述各活性成分相应标准参照品的特征峰峰强度；
3）通过定量分析手段得到所述标准参照品的绝对含量；
4）利用各活性成分特征峰峰强度及相应标准参照品的特征峰峰强度的比值和所述标准参照品的绝对含量，计算出连翘衍生品中各活性成分的含量及活性成分组的含量。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，采用具有获得清晰IGD核磁共振碳谱指纹图谱的提取工艺作为所述连翘木脂素和苯乙醇苷特征提取物的提取方式。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2）中，对连翘木脂素和苯乙醇苷特征提取物进行IGD核磁共振碳谱指纹图谱检测，溶解连翘木脂素和苯乙醇苷特征提取物的溶剂为氘代二甲基亚砜或氘代甲醇。
4.根据权利要求1～3任意一项所述的方法，其特征在于，步骤2）中，连翘木脂素和苯乙醇苷特征提取物中，木脂素类活性成分的特征峰为C-7吸收峰，其化学位移为δC83.0～88.0；优选地，选择C-7′作为特征峰进一步区别木脂素类活性成分中的连翘苷和表松脂素-4-β-D-葡萄糖苷，它们的化学位移为δC81.0～82.0；
连翘木脂素和苯乙醇苷特征提取物中，苯乙醇苷类活性成分的特征峰为C-9′吸收峰，其化学位移为δC165.0～170.0；优选地，选择C-1或C-6作为特征峰进一步区别苯乙醇苷类活性成分中的连翘酯苷A和连翘酯苷H，它们的化学位移分别为δC119.0～120.0和δC129.0～130.0。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤2）中，根据特征峰峰强度的大小和位置，对连翘木脂素和苯乙醇苷特征提取物中若干个活性成分进行排序。
6.根据权利要求1～5任意一项所述的方法，其特征在于，步骤3）中，所述定量分析手段为高效液相法。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，当鉴别连翘木脂素类活性成分时，所述高效液相法的条件包括流动相为乙腈：水=(20～30):(70～80)，优选25：75；检测波长为277nm；
当鉴别苯乙醇苷类活性成分时，所述高效液相法的条件包括流动相为乙腈：冰醋酸溶液=(10～20):(80～90)，优选15：85；检测波长为330nm。
8.根据权利要求1～7任意一项所述的方法，其特征在于，步骤3）中，所述标准参照品的绝对含量是指用定量分析手段测定的标准参照品的质量百分含量。
9.根据权利要求1～8任意一项所述的方法，其特征在于，连翘木脂素和苯乙醇苷特征提取物中的活性成分的标准参照品为连翘苷或连翘酯苷A。
10.根据权利要求1～9任意一项所述的方法，其特征在于，步骤4）中，计算各活性成分的含量的偶联公式为：
W n = W 1 M n h n M 1 h 1 ; 其中：
W1为步骤3）用定量分析手段测定的连翘衍生品中某一活性成分对应的标准参照品的绝对含量；
M1为所述连翘衍生品中某一活性成分对应的标准参照品的分子量/定量峰对应的碳个数；
h1为由IGD核磁共振碳谱指纹图谱测定的连翘衍生品中某一活性成分对应的标准参照品的特征峰峰强度；
Wn为连翘衍生品中某一活性成分的质量百分含量；
Mn为连翘衍生品中某一活性成分的分子量/定量峰对应的碳个数；
hn为由IGD核磁共振碳谱指纹图谱测定的连翘衍生品中某一活性成分的特征峰峰强度。
11.根据权利要求1～10任意一项所述的方法，其特征在于，所述连翘衍生品包括：连翘提取物或连翘天然药物。
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