CN103808751B - 一种鉴别金银花药材或衍生品的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种鉴别金银花药材或衍生品的方法，包括：对金银花药材或衍生品进行提取，得到含有活性成分组的金银花有机酸或/和环烯醚萜苷特征提取物；对特征提取物进行IGD核磁共振碳谱指纹图谱检测，根据指纹图谱得到有机酸或/和环烯醚萜苷特征提取物中若干个活性成分特征峰峰强度；并用相同方式测定出各活性成分相应标准参照品特征峰峰强度；通过定量分析手段测定得到标准参照品的绝对含量；利用特征峰峰强度的比值和标准参照品的绝对含量，计算出金银花药材或衍生品中各活性成分的含量及活性成分组的含量。本发明可以反映金银花中含有哪些金银花有机酸或/和环烯醚萜苷类化合物以及它们之间的比例，达到对金银花药材品种和质量鉴定的目的。
Description
技术领域
本发明属于天然药用植物的鉴别领域，具体地，涉及一种鉴别金银花药材或衍生品的方法。
背景技术
金银花（Loniceraejaponicaeflos）是忍冬科植物忍冬（looonicerajaponicaThunb.）的干燥花蕾或带初开的花，为我国著名的中药材。金银花归肺、心、胃经，药性寒，味甘，具有清热解毒、疏散风热的功效[国家药典委员会.中华人民共和国药典2010年版一部.中国医药科技出版社，205]。其活性成分主要为有机酸、环烯醚萜苷和黄酮类化合物，具有抑菌抗病毒、解热消炎、保肝利胆、降血脂、止血、抗氧化作用等作用[①张守平，等.中国中医药信息杂志2007，14(3):84.②王力川.安徽农业科学2009，37(5):2036.]。
定性鉴别上述某类活性成分或定量测定某种活性成分含量，已成为评价金银花及其制剂质量的重要方法。但这种针对单一成分进行定性、定量分析的质量检测模式不能有效控制中药材的内在质量，无法满足当前对于客观有效地评价和控制金银花及其制剂质量的迫切要求。
指纹图谱技术是目前国际公认的控制中药或天然药物质量最有效的方法。人们凭借实用的指纹图谱不仅可确认该产品的真伪，同时能评价其质量。目前，金银花药材及其制剂的指纹图谱研究工作，集中在HPLC指纹图谱[①白雪梅,等.中成药2004,26(7):521.②熊艳,等.中国中药杂志2009,34(8):1015.]、毛细管电泳指纹图谱（HPCE法）[孙国祥,等.色谱2007,25(1):96.]、高效液相色谱-质谱联用法（LC-MS）[张倩,等.中国中药杂志,2012,37(23):3564.]等。其中主流方法HPLC指纹图谱由于受非色谱条件（如色谱柱内径、长度、固定相牌号、载体粒度、流动相流速、混合流动相各组分比例、柱温、进样量、检测器灵敏度等）影响较大和多组分定量需用多个标准品等等原因，重复性和可行性均存在许多局限性；HPCE法虽以其高效、快速、简便且柱不易受污染而优于HPLC法，但仍存在重现性较差、线性范围窄和灵敏度较低等不足；单一LC-MS分析方法由于中药复方的复杂性和缺乏标准品的现状，MS还有离子化程度和基质干扰等问题，通常不足以对多种成分进行准确的结构定性。
IGD核磁共振碳谱偶联（IGD13CNMRcoupling）指纹图谱技术，也叫反门控去偶核磁共振碳谱偶联指纹图谱技术，该技术是在已研究多年的核磁共振氢谱（1HNMR）指纹图谱技术[赵天增，等.1HNMR指纹法鉴定植物中药，中草药2000，31(11)：868-870]的基础上联合其他技术（例如目前应用最广泛的高效液相（HPLC）指纹图谱技术[谢培山等，中药色谱指纹图谱，人民卫生出版社，2005]）提出的一种新的非单一手段综合指纹图谱技术。目前为止，鉴别金银花药材或衍生品，利用IGD核磁共振碳谱偶联指纹图谱技术并未见相关报道和技术内容的披露。
金银花的品质不在于某个单一成分，其疗效是多个成分协同配比的结果。因此，建立不仅能控制金银花活性成分，而且能控制这些活性成分之比例的IGD核磁共振碳谱偶联指纹图谱势在必行。金银花药材或衍生品核磁共振碳谱偶联指纹图谱的研究与应用，不仅可以解决我国金银花药材或衍生品鉴别和评价的难题，也为加强金银花药材或衍生品内在成分研究的***化与标准化，实现与国际接轨提供了科学的保证。随着该技术在其他中药材或衍生品中的推广应用，该技术的重大科学价值必将日趋突出。
发明内容
为了解决现有技术的问题，本发明的目的在于提供一种鉴别金银花药材或衍生品的方法，该方法利用了IGD核磁共振碳谱偶联指纹图谱技术。
为了实现上述目的，本发明提供的鉴别金银花药材或衍生品的方法，包括以下步骤：
1）对金银花药材或衍生品进行提取，得到含有活性成分组（有机酸或/和环烯醚萜苷）的金银花有机酸或/和环烯醚萜苷特征提取物；
2）对所述金银花有机酸或/和环烯醚萜苷特征提取物进行IGD核磁共振碳谱指纹图谱检测，根据指纹图谱得到所述金银花有机酸或/和环烯醚萜苷特征提取物中若干个活性成分特征峰峰强度；并用相同方式（IGD核磁共振碳谱指纹图谱）测定出所述各活性成分相应标准参照品的特征峰峰强度；
3）通过定量分析手段测定得到所述标准参照品的绝对含量；
4）利用所述特征峰峰强度（各活性成分特征峰峰强度及相应标准参照品的特征峰峰强度）的比值和所述标准参照品的绝对含量，计算出金银花药材或衍生品中各有机酸或/和环烯醚萜苷类活性成分的含量及主要活性成分的总含量，即活性成分组的含量。
其中，采用具有获得清晰IGD核磁共振碳谱指纹图谱的提取工艺作为所述金银花有机酸或/和环烯醚萜苷特征提取物的提取方式。
其中，步骤1）中，金银花有机酸或/和环烯醚萜苷特征提取物的制备方法，包括：称取金银花药材或饮片进行粉碎，加入20～25%乙醇回流提取或超声提取2～3次，每次提取1～2小时，过滤后合并滤液，减压浓缩；取浓缩后的滤液，用大孔吸附树脂装柱，以水-乙醇体系冲柱，收集不同洗脱部分，减压蒸干，即得金银花有机酸或/和环烯醚萜苷特征提取物。
进一步地，所述金银花药材或饮片与20～25%乙醇的质量体积比为1：(6～10)（g:mL）。
进一步地，大孔吸附树脂的重量为浓缩后的滤液重量的1～2倍。
进一步地，所述回流提取的温度为90～95℃，超声提取的温度为50～60℃。
进一步地，金银花药材或饮片粉碎后过24～65目筛。
进一步地，所述大孔吸附树脂的型号为HP-20、D-101、D-201、SP-825或SP-70。
进一步地，所述大孔吸附树脂的径高比为8～15：1，优选10～12:1。
其中，步骤2）中，对金银花有机酸或/和环烯醚萜苷特征提取物进行IGD核磁共振碳谱指纹图谱检测，溶解金银花有机酸或/和环烯醚萜苷特征提取物的溶剂为氘代氯仿（CDCl3）、氘代甲醇（CD3COCD3）或氘代二甲基亚砜（DMSO-d6），优选氘代甲醇。金银花有机酸或/和环烯醚萜苷特征提取物与相应溶剂的质量体积比为55:1～65:1（mg：mL），优选60:1。
除金银花饮片外，其他金银花衍生品，如金银花有机酸或/和环烯醚萜苷提取物可直接作为金银花有机酸或/和环烯醚萜苷特征提取物，用上述方法进行鉴别。
其中，步骤2）中，金银花有机酸或/和环烯醚萜苷特征提取物中的活性成分特征峰为酯羰基吸收峰，其化学位移为δC164.0～167.0（用氘代DMSO-d6溶解金银花有机酸或/和环烯醚萜苷特征提取物时）或δC168.0～170.0（用氘代甲醇溶解金银花有机酸或/和环烯醚萜苷特征提取物时）。
其中，步骤2）中，根据特征峰峰强度的大小和位置，对所述金银花有机酸或/和环烯醚萜苷特征提取物中若干个活性成分进行排序。
进一步地，步骤2）中，根据特征峰峰强度的大小和位置，对所述金银花有机酸或/和环烯醚萜苷特征提取物中的活性成分：绿原酸、绿原酸丁酯、Vanillicacid7-O-β-D-(6-O-benzoylglucopyranoside)、绿原酸丁酯+3，4-O-双咖啡酰基奎宁酸乙酯、阿魏酸、咖啡酸乙酯、α-莫诺苷+Secologanindimethylacetal、β-莫诺苷、獐牙菜苷、金吉苷进行排序。
其中，步骤2）中，所述峰强度可以采用峰高法、面积积分法或重量法计算。
其中，步骤3）中，所述定量分析手段为：高效液相（HPLC）法。
进一步地，当检测金银花有机酸或/和环烯醚萜苷特征提取物时，所述高效液相的条件包括：流动相为乙腈：0.4%磷酸溶液=(10～20):(80～95)，优选13：87；检测波长为240nm。
其中，步骤3）中，所述标准参照品的绝对含量是指：用定量分析手段测定的标准参照品的质量百分含量。
进一步地，金银花有机酸或/和环烯醚萜苷特征提取物中的活性成分的标准参照品为绿原酸。
其中，步骤4）中，计算各活性成分的含量的偶联公式为：
W1为步骤3）用定量分析手段测定的金银花药材或衍生品中某一活性成分对应的标准参照品的绝对含量；
M1为所述金银花药材或衍生品中某一活性成分对应的标准参照品的分子量/定量峰对应的碳个数；
h1为由IGD核磁共振碳谱指纹图谱测定的金银花药材或衍生品中某一活性成分对应的标准参照品的特征峰峰强度；
Wn为金银花药材或衍生品中某一活性成分的质量百分含量；
Mn为金银花药材或衍生品中某一活性成分的分子量/定量峰对应的碳个数；
hn为由IGD核磁共振碳谱指纹图谱测定的金银花药材或衍生品中某一活性成分的特征峰峰强度；该类活性成分的总含量就是同类的各活性成分的Wn相加之和，即活性成分组的含量。
上述公式的推导过程为：
本发明方法所述活性成分组，既可以是金银花单味药材中的活性成分组，也可是金银花衍生品中的活性成分组。所述金银花有机酸或/和环烯醚萜苷特征提取物指该提取物中含有金银花有机酸类或/和环烯醚萜苷类活性成分，活性成分组即指相应同类活性成分的总和。
其中，所述金银花衍生品包括：金银花饮片、金银花提取物（如金银花有机酸提取物、金银花环烯醚萜苷提取物或金银花黄酮提取物，或者它们中两种或两种以上的组合）或金银花天然药物。
本发明所述的金银花药材，包括金银花植物的各个部位，如根、皮、茎、叶、花和果实等。
本发明各活性成分的含量及该类活性成分的总含量的计算，是通过偶联公式将IGD核磁共振碳谱和分析定量手段偶联。和现有技术相比，本发明采用IGD13CNMR偶联指纹图谱具有下面几个特点：
①稳定性（重复性）：IGD13CNMR得到的化学位移数据为小数点后第二位，分辩性好，重复性好；HPLC、GC的非色谱条件（如色谱柱内径、长度、固定相牌号、载体粒度、流动相流速、混合流动相各组分比例、柱温、进样量、检测器灵敏度等）改变等，得到的保留时间数据变化很大，意味着整体色谱图形的变异，重复性不好。
②整体性（全面性）：IGD13CNMR指纹图谱中包含样品中的每一个活性成分碳的相应谱峰；HPLC、GC、UV、IR、MS不存在这种关系。
③可靠性（单一性）：IGD13CNMR谱峰与样品中不同活性成分及其不同基团上的碳是严格的一一对应关系；HPLC、GC、UV、IR、MS不存在这种关系。
④可行性（易辨性）：IGD13CNMR指纹图谱规律性很强，一般情况下，可归属图谱中的每一个碳峰；HPLC、GC需要对照品；IR不易解析；UV信息量少；MS则有离子化程度和基质干扰等问题。
IGD核磁共振碳谱指纹图谱只能表明特征提取物中有哪些活性成分，以及这些活性成分之间的定量比例，而这些活性成分的绝对含量必须通过标准参照品和其他分析定量手段，再通过偶联公式而得到。
本发明的优势在于：
1、本发明中的四个步骤是一个整体，缺一不可；四个步骤都有各自的独到之处；如若分开或简单组合则不能检测药用植物中复杂成分的比例和含量。
众所周知，虽然中药、植物源农药是历史悠久的药物，但其分析检测一直是个难题。因此，特别需要一种方法能够鉴别植物品种及其提取物中的各种活性成分，并且将其定量，然后选择出最好的提取物成分或其组合物，以便充分发挥其效果。另外，中药、植物源农药走出国门的障碍之一是没有组成成分及其定量标识，原因即为目前现有技术解决鉴别植物品种和评价植物源产品质量的定性和定量分析方面存在着很大的局限性（具体见本申请背景技术描述的内容）。事实证明，IGD核磁共振碳谱偶联指纹图谱技术正是解决这个问题的关键技术，这已在本申请的说明书中体现出来。
2、虽然常规提取工艺为普通技术人员所熟知，但却从未有人将得到清晰图谱和具有代表性的活性成分组作为标准来选择工艺参数得到特征提取物。利用此方法，会使最终对于提取物的鉴别效果更好，这是本发明的难点之一，也是本发明的创新点之一。
3、IGD13CNMR偶联指纹图谱是多个活性成分的混合谱，不可避免会引起一根根棒峰的拥挤，甚至重叠。为了使计算结果准确，选择化学位移差别较大的活性成分组中各活性成分碳峰指定特征峰是必要的。由于不同类型化合物碳谱差别很大，特征峰的选择可以***；相同类型化合物碳谱差别很小，很多谱峰重叠严重，需有深厚的核磁共振波谱知识指导，经多方比较、反复考虑，才能选择较好的特征峰；而特征峰选择不好，是没有办法对活性成分组进行准确定量分析的，这也正是本发明需要解决的问题。根据金银花中绿原酸类和环烯醚萜苷类成分的特点，选择酯羰基峰作为特征峰区别2类成分。所以，根据不同活性成分的特点需要选择不同的活性成分碳峰指定特征峰也是本申请的又一创新点。
4、由于特征峰化学位移差别很小，很多情况下，仅在小数点后第1位差别，所以特征峰的排序是确定主要活性成分及其比例的关键，没有深厚的核磁共振波谱知识和分离基础，很难确定特征峰代表的活性成分及其比例，也就无法对活性成分组进行准确定性定量分析，根据金银花中绿原酸类和环烯醚萜苷类成分的碳谱核磁数据的特点，对两类成分的特征峰进行了准确排序；这是本发明的难点之一，也是本发明的创新点之一。
5、偶联计算关键是选择标准品和定量分析技术的选择。分析定量手段可以选择高效液相、气相色谱、薄层色谱法和称量法等，标准参照品可以是某一活性成分作为内标，也可以是外加参照品作为外标。根据金银花中绿原酸类和环烯醚萜苷类成分的特点，分析定量手段选择的为液相，标准参照品选择的是绿原酸。这是发明的难点之一，也是本发明的创新点之一。
本发明所涉及的研究项目受质检公益性行业科研专项经费资助项目（项目编号：2012104019-1）。
本发明采用IGD核磁共振碳谱指纹图谱对金银花药材或衍生品进行鉴别，可以反映金银花药材或衍生品中含有哪些金银花活性成分以及它们之间的比例，达到对金银花药材或衍生品品种和质量鉴定的目的。线性范围宽，灵敏度高，重复性和可行性好。不仅能够有效控制金银花药材或衍生品的内在质量，也可以满足当前对于客观有效地评价和控制金银花质量的迫切要求。总体来看，不仅可以解决我国金银花药材或衍生品鉴别和评价的难题，也为加强金银花药材或衍生品内在成分研究的***化与标准化，实现与国际接轨提供了科学的保证。
附图说明
图1-a为实施例1市售金银花药材A有机酸或/和环烯醚萜苷特征提取物的IGD核磁共振碳谱指纹图谱。
图1-b为实施例1市售金银花药材A有机酸或/和环烯醚萜苷特征提取物的IGD核磁共振碳谱指纹图谱特征峰局部拉宽放大图。
图2-a为实施例2市售金银花药材B有机酸或/和环烯醚萜苷特征提取物的IGD核磁共振碳谱指纹图谱。
图2-b为实施例2市售金银花药材B有机酸或/和环烯醚萜苷特征提取物的IGD核磁共振碳谱指纹图谱特征峰局部拉宽放大图。
图3-a为实施例4市售绿原酸20%金银花提取物（上禾）的IGD核磁共振碳谱指纹图谱。
图3-b为实施例4市售绿原酸20%金银花提取物（上禾）的IGD核磁共振碳谱指纹图谱特征峰局部拉宽放大图。
图4-a为实施例5自制金银花提取物的IGD核磁共振碳谱指纹图谱。
图4-b为实施例5自制金银花提取物的IGD核磁共振碳谱指纹图谱特征峰局部拉宽放大图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
若未特别说明，本发明中使用的物料均为本领域的常规物料，未提及的操作方法也为本领域的常规方法。
本发明中，甲醇和乙醇的浓度均为体积百分数。
一、金银花药材或衍生品IGD核磁共振碳谱指纹图谱研究
（1）由金银花药材或衍生品提取得到的金银花有机酸或/和环烯醚萜苷特征提取物的IGD核磁共振碳谱指纹图谱
1）金银花有机酸或/和环烯醚萜苷特征提取物的获得
①从金银花药材或饮片中获得
称取金银花药材或饮片粉碎（过24～65目筛），加入体积为6～10倍量、20%～25%（体积比）的乙醇于90～95℃下回流或50～60℃下超声提取2～3次，每次提取1～2小时，过滤后合并滤液，减压浓缩；取浓缩后的滤液，用其重量为1～2倍量的大孔吸附树脂装柱，以水-乙醇体系冲柱，收集不同洗脱部分，即得金银花有机酸或/和环烯醚萜苷特征提取物（CET）。
所述大孔吸附树脂型号为HP-20、D-101、D-201、SP-825或SP-70；所述大孔吸附树脂的径高比为8～15：1，优选10～12:1。
②从其他金银花衍生品中获得
直接取其他金银花衍生品（除金银花饮片外的金银花衍生品，如金银花有机酸或/和环烯醚萜苷提取物）作为金银花有机酸或/和环烯醚萜苷特征提取物。
2）金银花有机酸或/和环烯醚萜苷特征提取物的IGD核磁共振碳谱指纹图谱检测
取金银花有机酸或/和环烯醚萜苷特征提取物，溶于氘代氯仿、DMSO-d6或氘代甲醇中，作IGD核磁共振碳谱指纹图谱检测，即得金银花有机酸或/和环烯醚萜苷IGD核磁共振碳谱指纹图谱。
金银花有机酸或/和环烯醚萜苷特征提取物与相应溶剂的质量体积比为55:1～65:1（mg：mL），优选60:1。
3）金银花有机酸或/和环烯醚萜苷特征提取物的IGD核磁共振碳谱指纹图谱解析
①鉴别
金银花有机酸或/和环烯醚萜苷特征提取物（CET）IGD核磁共振碳谱指纹图谱中，清楚地显示金银花有机酸或/和环烯醚萜苷类化合物的特征信号。
②金银花有机酸或/和环烯醚萜苷特征提取物中的各活性成分特征峰选取
根据不同活性成分的特点需要选择不同的活性成分碳峰指定特征峰。选择原则如下：①同类化合物的指定特征峰最好为各个化合物位置相同的碳碳峰；②每个化合物的指定特征峰与其他碳峰之间化学位移差别较大；③各个化合物的指定特征峰之间化学位移差别较大；④影响各个化合物的指定特征峰本身的化学位移效应差别较大。
由于金银花有机酸或/和环烯醚萜苷特征提取物中含有一系列该类化合物，碳峰交叉得较多，为了测定各活性成分的比例，必须选择化学位移差别较大相应峰作为特征峰。为此，经实际考察，均选择酯羰基碳碳峰作为两类活性成分碳峰指定特征峰，其原因为酯羰基碳与其他碳化学位移差别较大，易识别；且不同化合物羰基碳碳峰之间化学位移也有一定差别。
③标准参照品的选择
绿原酸是金银花有机酸或/和环烯醚萜苷特征提取物中主要活性成分之一，其羰基化学位移与其他主要成分在此没有重叠；因此，选择绿原酸作为标准参照品。
4）采用HPLC法测定金银花药材或衍生品中绿原酸的含量
i）色谱条件（参照2010版药典）
流动相：乙腈：0.4%磷酸溶液=13：87；
色谱柱：C18（250*4.6mm，5um）；
检测波长：240nm。
ii）绿原酸标准参照品溶液的配制
精确称取绿原酸5mg，置50mL容量瓶中，用质量浓度为50%的甲醇溶解稀释至刻度，摇匀后即得绿原酸标准参照品溶液。
iii）含有金银花有机酸和/或环烯醚萜苷活性成分的供试品溶液的制备
准确称取供试品：金银花药材/饮片的粉末0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇50mL，称定重量，加热回流1小时，放冷，用50％甲醇补足重量，滤过，取续滤液，作为金银花药材/饮片供试品溶液。其他金银花衍生品30-50mg，置50mL容量瓶中，用质量浓度为50%的甲醇溶解稀释至刻度，摇匀后即得其他金银花衍生品供试品溶液。
iv）测定法
分别精密吸取绿原酸标准参照品溶液与金银花药材/饮片供试品溶液或衍生品供试品溶液各20μ1，注入液相色谱仪，测定，即得绿原酸含量。
②绿原酸绝对含量计算（金银花药材/饮片或衍生品中绿原酸绝对含量计算）
i）由下式计算金银花药材/饮片或衍生品供试品溶液中绿原酸质量浓度：
CX：金银花药材/饮片或衍生品供试品溶液中绿原酸质量浓度（ug/mL）；
CR：绿原酸标准参照品溶液质量浓度（ug/mL）；
AX：金银花药材/饮片或衍生品供试品溶液的峰面积；
AR：绿原酸标准参照品溶液的峰面积。
ii）由下式计算金银花药材/饮片或衍生品中绿原酸质量百分含量
W1（%）：金银花药材/饮片或衍生品中绿原酸质量百分含量；
CX：金银花药材/饮片或衍生品供试品溶液中的绿原酸质量浓度(ug/mL)；
m：称取的金银花药材或衍生品的质量(mg)。
5）通过偶联公式计算金银花药材或衍生品中有机酸或/和环烯醚萜苷类各个主要活性成分的含量及总量，即有机酸或/和环烯醚萜苷类活性成分组的含量
W1：金银花药材/饮片或衍生品中标准参照品绿原酸的质量百分含量；
M1：标准参照品绿原酸的分子量/定量峰对应的碳个数；
h1：标准参照品绿原酸的特征峰峰强度（峰高）；
Wn：金银花药材/饮片或衍生品中某一有机酸或/和环烯醚萜苷类活性成分的质量百分含量；
Mn：金银花药材/饮片或衍生品中某一有机酸或/和环烯醚萜苷类活性成分的分子量/定量峰对应的碳个数；
hn：金银花药材或衍生品中某一有机酸或/和环烯醚萜苷类活性成分的特征峰峰强度（峰高）。
二、仪器、试剂与材料
主要仪器和设备
核磁共振波谱仪BrukerDPX400型。
质谱仪：WatersMicromass公司Q-TofMicroTM型。
半制备高效液相色谱仪：Waters600型。
高效液相色谱仪：Agilent1200型。
2000mL蒸馏烧瓶、5000mL蒸馏烧瓶、球型冷凝管、2000mL分液漏斗。
DE-52AA旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂。
DEF-6020型真空干燥箱：上海精宏实验设备有限公司。
柱层析硅胶G和薄层层析硅胶H：青岛海洋化工厂。
硅胶层析柱6cm×70cm（直径×高度）。
市售金银花药材A（中原正信公司，2013年6月购自安徽亳州药材市场，产地河南），金银花（中原正信公司，2013年7月购自安徽亳州药材市场，产地河南），均经河南省农业大学朱长山教授鉴定；绿原酸，化学对照品，购自中国药品生物制品检定所。
试剂：色谱纯（甲醇，天津市四友精细化学品有限公司）及分析纯（天津市化学试剂一厂）。
三、金银花药材或衍生品中主要活性成分的结构及核磁共振碳谱数据
绿原酸绿原酸丁酯
原儿茶酸咖啡酸
咖啡酸乙酯阿魏酸
Vanillicacid7-O-β-D-(6-O-benzoylglucopyranoside)
Methylchlorogenate(3-caffeoylquinicacidmethylester)
3，4-O-双咖啡酰基奎宁酸乙酯
马钱苷7-脱氢马钱苷
莫诺苷獐牙菜苷
7-O-甲基-莫诺苷Secologanindimethylacetal
金吉苷（Kingiside）8-epi-KINGISIDE
绿原酸（Chlorogenicacid，C16H18O9）
13CNMR(75MHz,DMSO-d6)δ:73.6(C-1),36.4(C-2),70.5(C-3),70.9(C-4),68.3(C-5),37.3(C-6),175.1(C-7)，125.6(C-1′),114.3(C-2′),145.0(C-3′),146.0(C-4′),115.8(C-5′),121.4(C-6′),148.4(C-7′),114.8(C-8′),165.8(C-9′)。
13CNMR(125MHz,CD3OD)δ:127.8(C-1),115.2(C-2),146.8(C-3),149.6(C-4),116.0(C-5),123.0(C-6),147.1(C-7),115.3(C-8),168.7(C-9);B:76.1(C-1),38.8(C-2),72.0(C-3),73.4(C-4),71.3(C-5),38.2(C-6),177.0(C-7)
绿原酸丁酯
13C-NMR(MHz,DMSO-d6)δ:73.2(C-1),37.3(C-2),69.4(C-3),71.1(C-4),66.9(C-5),35.2(C-6),173.2(C-7),64.2(C-8),30.1(C-9),18.6(C-10),13.6(C-11),125.4(C-1′),114.6(C-2′),145.2(C-3′),148.8(C-4′),115.9(C-5′),121.4(C-6′),145.7(C-7′),113.9(C-8′),165.5(C-9′)。
3，4-O-双咖啡酰基奎宁酸乙酯
13C-NMR(MHz,CD3OD)δ:75.1(C-1),36.8(C-2),75.1(C-3),69.8(C-4),66.0(C-5),41.3(C-6),175.7(C-7),62.5,14.2(-7-OCH2CH3),127.7,127.6(C-1′,1′′),115.2,115.1(C-2′,2′′),146.8,146.8(C-3′,3′′),149.0,149.0(C-4′,4′′),116.5,116.5(C-5′,5′′),123.2,123.1(C-6′,6′′),147.4,147.4(C-7′,7′′),115.0,115.0(C-8′),168.5,168.4(C-9′)。
咖啡酸（C9H8O4）
13CNMR(CD3OD,75MHz)δ:127.8(C-1),115.1(C-2),147.0(C-3),149.4(C-4),115.5(C-5),122.8(C-6),146.8(C-7),116.8(C-8),170.9(C-9)
咖啡酸乙酯（C11H12O4）
13CNMR(CD3OD,75MHz)δ:127.7(C-1),115.0(C-2),146.8(C-3),149.5(C-4),115.2(C-5),122.9(C-6),146.7(C-7),116.5(C-8),169.3(C-9)，61.4,14.6(-OCH2CH3)
阿魏酸（C10H10O4）
13CNMR(125MHz,CD3OD):δC51.9(q,OCH3-3),114.8(d,C-8),115.1(d,C-2),116.4(d,C-5),122.7(d,C-6),127.6(s,C-1),146.6(s,C-4),146.7(s,C-7),149.3(s,C-3),169.5(s,C-9).
原儿茶酸
13CNMR(CD3OD,125MHz)δC:123.2(C-1)，115.8(C-2)，146.1(C-3)，151.5(C-4)，117.8(C-5)，123.9(C-6)，170.3(C-7);
13CNMR(DMSO-d6,100MHz)δC:121.7(C-1),116.7(C-2),144.8(C-3),149.8(C-4),115.1(C-5),122.5(s,C-6),167.7(C-7)。
Vanillicacid7-O-β-D-(6-O-benzoylglucopyranoside)（香草酸7-o-β-D–(6-o-苯基吡喃葡萄糖)
13C-NMR(MHz,CD3OD)δ:126.1(C-1),114.3(C-2),150.4(C-3),151.6(C-4),116.5(C-5),124.6(C-6),169.5(C-7),56.5(-OMe),131.2(C-1′),130.6(C-2′),129.6(C-3′),134.4(C-4′),129.6(C-5′),130.6(C-6′),167.7(C-7′)。
Methylchlorogenate(3-caffeoylquinicacidmethylester)[绿原酸甲酯（3-咖啡酰奎尼酸甲酯）]
13C-NMR(MHz,MeOD)δ:75.8(C-1),38.0(C-2),70.3(C-3),72.1(C-4),72.1(C-5),37.7(C-6),175.4(C-7),53.0(OMe),127.6(C-1′),115.1(C-2′),146.9(C-3′),149.7(C-4′),116.5(C-5′),123.0(C-6′),145.7(C-7′),115.0(C-8′),168.2(C-9′)。
马钱苷
13CNMR(100MHz,MeOD)δC:97.71(C-1),152.10(C-3),114.03(C-4),32.15(C-5),42.70(C-6),75.04(C-7),42.16(C-8),46.50(C-9),13.41(C-10),169.52(C-11),51.62(C-12),100.05(C-1′),74.72(C-2′),78.02(C-3′),71.59(C-4′),78.35(C-5′),62.76(C-6′)13CNMR(100MHz,DMSO-d6)δC:96.15(C-1),150.71(C-3),112.21(C-4),30.88(C-5),41.74(C-6),73.11(C-7),40.58(C-8),44.80(C-9),13.62(C-10),167.14(C-11),51.13(C-12),98.63(C-1′),72.18(C-2′),76.64(C-3′),70.05(C-4′),77.31(C-5′),61.12(C-6′)
7-脱氢马钱苷
13CNMR(100MHz,D2O)δC:95.04(C-1),152.60(C-3),110.35(C-4),26.74(C-5),42.52(C-6),225.04(C-7),44.08(C-8),44.87(C-9),12.61(C-10),169.78(C-11),52.26(C-12),99.07(C-1′),73.00(C-2′),75.95(C-3′),69.94(C-4′),76.72(C-5′),61.07(C-6′)
獐牙菜苷
13CNMR(100MHz,DMSO-d6)δC:95.75(C-1),151.60(C-3),105.01(C-4),26.94(C-5),24.45(C-6),67.86(C-7),132.54(C-8),41.69(C-9),120.48(C-10),164.83(C-11),98.27(Glc-1),73.30(Glc-2),76.57(Glc-3),70.22(Glc-4),77.52(Glc-5),61.21(Glc-6)
13CNMR(100MHz,MeOD)δC:98.2(C-1),153.9(C-3),106.0(C-4),28.5(C-5),26.0(C-6),69.7(C-7),133.5(C-8),43.8(C-9),120.1(C-10),168.5(C-11),99.7(C-1′),74.7(C-2′),77.8(C-3′),71.5(C-4′),78.4(C-5′),62.7(C-6′)
α-莫诺苷
13CNMR(100MHz,DMSO-d6)δC:95.38(C-1),152.95(C-3),109.92(C-4),30.30(C-5),36.39(C-6),94.37(C-7),73.74(C-8),39.99(C-9),19.56(C-10),166.51(C-11),51.34(C-12),98.41(C-1′),71.60(C-2′),76.82(C-3′),70.35(C-4′),77.65(C-5′),61.24(C-6′)
13CNMR(CD3OD)97.2(C-1),154.6(C-3),111.0(C-4),34.7(C-5),37.4(C-6),96.1(C-7).75.1(C-8),40.0(C-9),20.0(C-10),168.8(C-11),100.2(C-1′).74.2(C-2′),78.0(C-3′),71.7(C-4′),78.5(C-5′),62.9(C-6′).
β-莫诺苷
13CNMR(100MHz,DMSO-d6)δC:93.98(C-1),153.00(C-3),110.70(C-4),25.74(C-5),33.64(C-6),90.01(C-7),40.12(C-8),40.43(C-9),19.52(C-10),166.47(C-11),51.28(C-12),98.37(C-1′),73.74(C-2′),76.82(C-3′),70.35(C-4′),77.70(C-5′),78.46.(C-5′),61.39(C-6′)
13CNMR(CD3OD)δC:95.8(C-1),154.6(C-3),111.8(C-4),27.6(C-5),34.7(C-6).92.5(C-7),66.0(C-8).40.7(C-9),20.0(C-IO),168.8(C-11),100.2(C-1′),74.2(C-2’),78.0(C-3’),71.7(C-4’),78.5(C-5’),62.9(C-6’).
7-O-甲基-莫诺苷
13CNMR(100MHz,CD3Cl3)δC:95.1(C-1),152.0(C-3),110.7(C-4),29.9(C-5),33.8(C-6),102.4(C-7),71.6(C-8),38.9(C-9),18.4(C-10),166.1(C-11),50.9(C-12),96.7(C-1′),70.7(C-2′),72.0(C-3′),68.6(C-4′),72.5(C-5′),61.6(C-6′)
13CNMR(100MHzCD3Cl3,)δC:94.7(C-1),152.1(C-3),111.7(C-4),26.1(C-5),32.6(C-6),97.7(C-7),64.1(C-8),39.4(C-9),18.6(C-10),166.5(C-11),51.0(C-12),96.7(C-1′),71.0(C-2′),72.0(C-3′),68.6(C-4′),72.5(C-5′),61.7(C-6′)
Secologanindimethylacetal（裂环马钱素二甲基乙缩醛）
13CNMR(100MHz,DMSO-d6)δC:95.7(C-1),151.5(C-3),109.7(C-4),25.2(C-5),31.7(C-6),102.1(C-7),134.5(C-8),43.1(C-9),119.3(C-10),166.6(C-11),98.7(C-1′),73.0(C-2′),77.4(C-3′),69.9(C-4′),76.7(C-5′),61.0(C-6′)
金吉苷
13CNMR(MeOD)δC:94.4(C-1),154.3(C-3),111.4(C-4),28.0(C-5),34.3(C-6),174.3(C-7),76.8(C-8),39.9(C-9),18.4(C-10),168.2(C-11),100.1(C-1′),74.8(C-2′),78.0(C-3′),71.6(C-4′),78.5(C-5′),62.8(C-6′)
8-epi-KINGISIDE（8-表金吉苷）
13CNMR(MeOD)δC:96.3(C-l),154.4(C-3),109.6(C-4),28.1(C-5),34.6(C-6),174.7(C-7),75.8(C-8),41.9(C-9),21.7(C-lo),168.3(C-11).52.0(OMe),100.7(C-l'),74.7(C-2'),78.5(C-3'),71.7(C-4'),77.9(C-5'),62.9(C-6').
实施例1：市售金银花药材A（中原正信）有机酸和环烯醚萜苷特征提取物IGD核磁共振碳谱偶联指纹图谱
（1）特征提取物制备
称取粉碎（过65目筛）后的市售金银花药材A25克，加入体积为6、6、10倍量（150mL、150mL、250mL）、20%（体积比）的乙醇于90℃下回流提取3次，每次提取1小时，过滤后合并滤液，减压浓缩至无醇味，约500mL，用浓盐酸调pH=1；取调酸后的滤液，用其重量为2倍量的大孔吸附树脂（型号：HP-20，径高比12:1）装柱，以水-乙醇体系冲柱，收集30%洗脱部分，即得金银花A有机酸和环烯醚萜苷特征提取物（CET）。
（2）特征提取物IGD核磁共振碳谱指纹图谱检测
取市售金银花A（中原正信）有机酸和环烯醚萜苷特征提取物30mg，溶于0.5mLDMSO-d6中，作IGD核磁共振碳谱指纹图谱检测，即得金银花A有机酸和环烯醚萜苷IGD核磁共振碳谱指纹图谱。
（3）市售金银花A（中原正信）有机酸和环烯醚萜苷特征提取物IGD核磁共振碳谱指纹图谱
1）IGD核磁共振碳谱指纹图谱鉴别
市售金银花A（中原正信）药材的金银花有机酸和环烯醚萜苷特征提取物(CET)的IGD核磁共振碳谱指纹图谱中，清楚地显示金银花有机酸和环烯醚萜苷类化合物的特征信号。金银花有机酸和环烯醚萜苷类：绿原酸、绿原酸丁酯、咖啡酸乙酯、Vanillicacid7-O-β-D-(6-O-benzoylglucopyranoside)、α-莫诺苷、Secologanindimethylacetal、β-莫诺苷、獐牙菜苷等在IGD核磁共振碳谱指纹图谱中均有相应的NMR信号。IGD核磁共振碳谱指纹图谱见附图1-a，其特征峰局部拉宽放大图见附图1-b。
2）市售金银花A（中原正信）药材的有机酸和环烯醚萜苷特征提取物中各活性成分比例测定结果如下：
（4）市售金银花A（中原正信）药材中绿原酸质量百分含量测定结果如下：
（5）市售金银花A（中原正信）药材中有机酸和环烯醚萜苷类活性成分质量百分含量测定结果如下：
下表中α-莫诺苷+Secologanindimethylacetal的分子式是以α-莫诺苷作为代表的分子式（以下实施例均同实施例1）。
实施例2：市售金银花药材B（中原正信）有机酸和环烯醚萜苷特征提取物IGD核磁共振碳谱偶联指纹图谱
（1）特征提取物制备
称取粉碎（过24目筛）后的市售金银花B（中原正信）饮片25g，加入体积为10、10倍量（250mL、250mL）、25%（体积比）的乙醇于50℃下超声提取2次，每次提取2小时，过滤后合并滤液，减压浓缩至无醇味，约500mL，用浓盐酸调pH=2；取调酸后的滤液；取浓缩后的滤液，用其重量为1倍量的大孔吸附树脂（型号：D-101，径高比12:1）装柱，以水-乙醇体系冲柱，收集35%洗脱部分，即得金银花B有机酸和环烯醚萜苷特征提取物（CET）。
（2）特征提取物IGD核磁共振碳谱指纹图谱检测
取市售金银花B（中原正信）有机酸和环烯醚萜苷特征提取物30mg，溶于0.5mL氘代DMSO-d6中，作IGD核磁共振碳谱指纹图谱检测，即得金银花B有机酸和环烯醚萜苷IGD核磁共振碳谱指纹图谱。
（3）市售金银花B（中原正信）有机酸和环烯醚萜苷特征提取物IGD核磁共振碳谱指纹图谱
1）IGD核磁共振碳谱指纹图谱鉴别
市售金银花B（中原正信）药材的有机酸和金银花环烯醚萜苷特征提取物(CET)的IGD核磁共振碳谱指纹图谱中，清楚地显示金银花有机酸和环烯醚萜苷类化合物的特征信号。金银花有机酸和环烯醚萜苷类：绿原酸、绿原酸丁酯、咖啡酸乙酯、Vanillicacid7-O-β-D-(6-O-benzoylglucopyranoside)、α-莫诺苷、Secologanindimethylacetal、β-莫诺苷、獐牙菜苷等在IGD核磁共振碳谱指纹图谱中均有相应的NMR信号。IGD核磁共振碳谱指纹图谱见附图2-a，其特征峰局部拉宽放大图见附图2-b。
2）市售金银花B（中原正信）药材的有机酸和环烯醚萜苷特征提取物中各活性成分比例测定结果如下：
（4）市售金银花B（中原正信）药材中绿原酸质量百分含量测定结果如下：
（5）市售金银花B（中原正信）药材中有机酸和环烯醚萜苷类活性成分质量百分含量测定结果如下：
实施例3：市售金银花提取物IGD核磁共振碳谱偶联指纹图谱
（1）特征提取物选择
直接选择市售绿原酸20%金银花提取物（湖南长沙上禾生物科技有限公司）作为特征提取物。
（2）特征提取物IGD核磁共振碳谱指纹图谱检测
取上禾绿原酸20%金银花提取物30mg，溶于0.5mL氘代DMSO-d6中，作IGD核磁共振碳谱指纹图谱检测，即得上禾绿原酸20%金银花提取物IGD核磁共振碳谱指纹图谱。
（3）上禾绿原酸20%金银花提取物IGD核磁共振碳谱指纹图谱
1）IGD核磁共振碳谱指纹图谱鉴别
绿原酸20%金银花提取物的的IGD核磁共振碳谱指纹图谱中，清楚地显示金银花有机酸类化合物的特征信号。金银花有机酸类：绿原酸、绿原酸丁酯、3，4-O-双咖啡酰基奎宁酸乙酯、咖啡酸乙酯、阿魏酸等在IGD核磁共振碳谱指纹图谱中均有相应的NMR信号。IGD核磁共振碳谱指纹图谱见附图3-a，其特征峰局部拉宽放大图见附图3-b。
2）上禾绿原酸20%金银花提取物中各活性成分比例测定结果如下：
（4）上禾绿原酸20%金银花提取物中绿原酸质量百分含量测定结果如下：
（5）上禾绿原酸20%金银花提取物中活性成分质量百分含量测定结果如下：
实施例4：自制金银花提取物IGD核磁共振碳谱指纹图谱
（1）特征提取物选择
直接选择自制金银花提取物[称取粉碎（过65目筛）后的市售金银花药材（中原正信公司，来源为安徽亳州药材市场，产地河南）50克，加入体积为6、6、10倍量、20%（体积比）的乙醇于90℃下回流提取3次，每次提取1小时，过滤后合并滤液，减压浓缩至无醇味，约500mL，用浓盐酸调pH=2；用乙酸乙酯萃取4次，合并乙酸乙酯液，蒸干，得自制金银花提取物2.22g]作为特征提取物。
（2）特征提取物IGD核磁共振碳谱指纹图谱检测
取自制金银花提取物30mg，溶于0.5mL氘代甲醇中，作IGD核磁共振碳谱指纹图谱检测，即得上禾绿原酸25%金银花提取物IGD核磁共振碳谱指纹图谱。
（3）自制金银花提取物IGD核磁共振碳谱指纹图谱
1）IGD核磁共振碳谱指纹图谱鉴别
自制金银花提取物的的IGD核磁共振碳谱指纹图谱中，清楚地显示金银花有机酸和环烯醚萜苷类化合物的特征信号。金银花有机酸和环烯醚萜苷类：绿原酸、绿原酸丁酯、咖啡酸乙酯、莫诺苷、獐牙菜苷、金吉苷等在IGD核磁共振碳谱指纹图谱中均有相应的NMR信号。IGD核磁共振碳谱指纹图谱见附图4-a，其特征峰局部拉宽放大图见附图4-b。
2）自制金银花提取物中各活性成分比例测定结果如下：
（4）自制金银花提取物中绿原酸质量百分含量测定结果如下：
（5）自制金银花提取物中活性成分质量百分含量测定结果如下：
Claims (9)
1.一种鉴别金银花药材或衍生品的方法，包括以下步骤：
1)对金银花药材或衍生品进行提取，得到含有活性成分组的金银花有机酸或/和环烯醚萜苷特征提取物；
金银花有机酸或/和环烯醚萜苷特征提取物的制备方法，包括：称取金银花药材或饮片进行粉碎，加入20～25％乙醇回流提取或超声提取2～3次，每次提取1～2小时，过滤后合并滤液，减压浓缩；取浓缩后的滤液，用大孔吸附树脂装柱，以水-乙醇体系冲柱，收集不同洗脱部分，减压蒸干，即得金银花有机酸或/和环烯醚萜苷特征提取物；
所述金银花药材或饮片与20～25％乙醇的质量体积比为1：(6～10)；
所述大孔吸附树脂的重量为浓缩后的滤液重量的1～2倍；
所述回流提取的温度为90～95℃，超声提取的温度为50～60℃；
2)对所述金银花有机酸或/和环烯醚萜苷特征提取物分别进行IGD核磁共振碳谱指纹图谱检测，根据指纹图谱得到所述金银花有机酸或/和环烯醚萜苷特征提取物中若干个活性成分特征峰峰强度；并用相同方式测定出所述各活性成分相应标准参照品的特征峰峰强度；
其中，金银花有机酸或/和环烯醚萜苷特征提取物中的活性成分特征峰为酯羰基吸收峰，其化学位移为δC164.0～167.0或δC168.0～170.0；
金银花有机酸或/和环烯醚萜苷特征提取物中的活性成分的标准参照品为绿原酸；
3)通过高效液相手段测定得到所述标准参照品的绝对含量；
所述高效液相的条件包括：流动相为乙腈：0.4％磷酸溶液＝(10～20):(80～95)，检测波长为240nm；
4)利用各活性成分特征峰峰强度及相应标准参照品的特征峰峰强度的比值和所述标准参照品的绝对含量，计算出金银花药材或衍生品中各有机酸或/和环烯醚萜苷类活性成分的含量及两类活性成分组的含量。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，采用具有获得清晰IGD核磁共振碳谱指纹图谱的提取工艺作为所述金银花有机酸或/和环烯醚萜苷特征提取物的提取方式。
3.根据权利要求1～2任意一项所述的方法，其特征在于，所述大孔吸附树脂的型号为HP-20、D-101、D-201、SP-825或SP-70；所述大孔吸附树脂的径高比为8～15：1。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤2)中，对金银花有机酸或/和环烯醚萜苷特征提取物进行IGD核磁共振碳谱指纹图谱检测，溶解金银花有机酸或/和环烯醚萜苷特征提取物的溶剂为氘代氯仿、氘代甲醇或氘代二甲基亚砜。
5.根据权利要求1或2或4所述的方法，其特征在于，步骤2)中，根据特征峰峰强度的大小和位置，对所述金银花有机酸或/和环烯醚萜苷特征提取物中若干个活性成分进行排序。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述高效液相的条件包括：流动相为乙腈：0.4％磷酸溶液＝13：87。
7.根据权利要求1或2或4或6所述的方法，其特征在于，步骤3)中，所述标准参照品的绝对含量是指：用定量分析手段测定的标准参照品的质量百分含量。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤4)中，计算各活性成分的含量的偶联公式为：
W1为步骤3)用定量分析手段测定的金银花药材或衍生品中某一活性成分对应的标准参照品的绝对含量；
M1为所述金银花药材或衍生品中某一活性成分对应的标准参照品的分子量/定量峰对应的碳个数；
h1为由IGD核磁共振碳谱指纹图谱测定的金银花药材或衍生品中某一活性成分对应的标准参照品的特征峰峰强度；
Wn为金银花药材或衍生品中某一活性成分的质量百分含量；
Mn为金银花药材或衍生品中某一活性成分的分子量/定量峰对应的碳个数；
hn为由IGD核磁共振碳谱指纹图谱测定的金银花药材或衍生品中某一活性成分的特征峰峰强度。
9.根据权利要求1或2或4或6或8所述的方法，其特征在于，金银花衍生品包括：金银花饮片、金银花提取物或金银花天然药物。
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