CN101613384A - 一种二羟基苯乙醇葡萄糖甙化合物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种通过酸碱处理和色谱分离技术从传统中药连翘制备二羟基苯乙醇葡萄糖甙新化合物的方法，该化合物***命名为1－(2，5－二羟基)苯乙基－β－D－吡喃葡萄糖甙。其主要工艺步骤为将中药连翘粉碎，水煎煮提取，乙醇醇沉，再加入一定量碳酸氢钠或碳酸钠，反应，调至pH值为2－3，旋转蒸发得到浸膏；浸膏进一步分离得到该化合物。本发明是一种纯度高、重现性好、周期短的(2，5－二羟基)苯乙醇葡萄糖甙新化合物的制备方法。用于苯乙醇甙类化合物标准品制备和药理活性进一步研究。

Description

一种二羟基苯乙醇葡萄糖甙化合物及其制备方法

技术领域

本发明涉及苯乙醇甙类化合物，具体地说是一种二羟基苯乙醇葡萄糖甙新化合物及其制备和分离方法，其是一种通过酸碱处理和色谱分离技术从传统中药连翘中制备分离出来的新化合物。

背景技术

苯乙醇甙类化合物具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗氧化、增强记忆等作用(靖会等.时珍国医国药.2006，17(3)：440；朴景华等.中国药理学通报.2001，17(6)：625；胡克杰等.中国中医药研究.2001，8(2)：89)。

汪毫等于西藏胡黄连根中分离并鉴定了六个苯乙醇甙类化合物(汪毫等.中国中药杂质.2004，29(6)：531)；郑晓珂等于石胆草中先后分离并鉴定了九个苯乙醇甙类化合物(郑晓珂等.药学学报.2003，38(2)：116；郑晓珂等.中草药.2002，33(10)：881)；王满元等于红药中分离并鉴定了五个苯乙醇甙类化合物(王满元等.中国中药杂质.2005，30(24)：1921)。以上苯乙醇甙类化合物均为3，4-二羟基(或相应羟基取代后)的苯乙醇甙类化合物；另外文献还有报道4-羟基苯乙醇甙类化合物(如红景天甙。李建新等.中草药.1998，29(10)：659；陈纪军等.云南植物研究.1999，21(4)：525)。至今未见有关2，5-二羟基苯乙醇甙类化合物的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种苯乙醇甙类化合物，该化合物的***命名为1-(2，5-二羟基)-苯乙基-β-D-吡喃葡萄糖甙；以满足苯乙醇甙类化合物标准品制备，药理活性进一步研究及工业应用的需要；其是一种用木犀科植物连翘制备(2，5-二羟基)-苯乙醇葡萄糖甙的新化合物；其制备产物纯度高、重现性好、生产周期短。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

1)连翘水提物的制备：将连翘原药材粉碎，定量称取，煎煮提取2-4次，每次煎煮时间1-3小时，每次加入连翘8-12倍重量的水煮沸，合并提取液，浓缩至相对密度为1.01-1.20g/ml的浸膏；

2)连翘醇沉组分的制备：浸膏用2-5倍体积的水混悬并加乙醇使乙醇浓度达50％-70％，室温静置12-24小时，过滤，滤液浓缩至无醇味，得到连翘醇沉组分；

3)连翘酸碱处理后浸膏的制备：连翘醇沉组分加入碳酸氢钠或碳酸钠反应，按碳酸氢钠或碳酸钠于水溶液中的饱和计量加入，放置，用酸调至pH值为2-4，旋转蒸发至干，再用80-95％乙醇溶解，上清液旋转蒸发，得到相对密度1.20-1.35g/ml的浸膏A；

4)连翘大孔树脂组分的制备：浸膏A加入水溶解后上大孔树脂柱，溶液经大孔树脂乙醇水梯度洗脱，洗脱液中醇的体积浓度从15％向95％变化，收集醇的体积浓度为15％时的目标洗脱液旋转蒸发得大孔树脂组分一；

5)二羟基苯乙醇葡萄糖甙化合物的工业色谱分离：大孔树脂组分一浓缩后采用C18反向色谱柱进样分离，流动相为甲醇水梯度洗脱，洗脱液中醇的体积浓度从5％向45％变化，紫外检测按时间分段收集，一次或一次以上进样，合并同一段时间下的洗脱液，质谱检测，含二羟基苯乙醇葡萄糖甙化合物的目标组分浓缩得组分二；

6)二羟基苯乙醇葡萄糖甙化合物的纯化：将组分二浓缩后C18反向色谱柱进样纯化，流动相乙腈水梯度洗脱，洗脱液中乙腈的体积浓度从3％向25％变化，质谱检测收集目标组分，得到二羟基苯乙醇葡萄糖甙新化合物。

所述酸为盐酸、硫酸或硝酸；所述C18反向色谱柱亦可用硅胶层析柱替换。

本发明具有以下优点：

1.样品信息丰富，本发明采用酸碱处理连翘水提物，得到的化合物I，经Beilstein和SCI Finder查证为一新化合物，且原水提物未检测到该化合物。

2重现性好，采用工业色谱和纯化工厂分离制备***，反相C18为柱填料，制备性能稳定，重现性好。

3样品纯度高，本发明采用工业色谱和纯化工厂分离制备技术，分离能力强，得到的二羟基苯乙醇葡萄糖甙新化合物纯度高。

附图说明

图1为本发明化合物13C-NMR(D2O，400MHz)。

图2为本发明化合物1H-NMR(D2O，400MHz)。

具体实施方式

现结合实例，对本发明做进一步说明。实例仅限于说明本发明，而非对本发明的限定。

实施例1

连翘原药材粉碎，称取1千克，置于50升提取罐中，加10升水煎煮2小时，过滤，滤液保存备用，滤渣中再加10升水煎煮2小时，过滤，滤液与第一次合并，滤渣弃去。将滤液旋转蒸发，得浸膏190ml(相对密度1.05)。浸膏溶于等体积水，加入653毫升95％乙醇，搅拌，静置24小时，过滤，滤渣弃去，滤液浓缩至无醇味，得到连翘醇沉组分142毫升。

连翘醇沉组分用水定容至200毫升，再加28.4克碳酸氢钠，搅拌，反应3小时，放置过夜。逐步加入1∶1盐酸56.8毫升，1∶2的盐酸1.4毫升(此时pH为2左右)。旋转蒸发至干，再用95％乙醇溶解，上清液旋转蒸发，得到连翘酸碱处理后浸膏55毫升(相对密度1.27)。

连翘酸碱处理后浸膏用2.1升水溶解，上清液经NKA-II大孔树脂乙醇水梯度洗脱(pH值用盐酸调至3)，收集15％乙醇洗脱液旋转蒸发得大孔树脂组分一2.8毫升，固含量1.8克。

连翘大孔树脂组分一用工业色谱分离。工业色谱柱柱长400毫米，内径80毫米，色谱填料为10-20微米的C18键合固定相，柱效为15000塔板/米，设定紫外检测波长为270nm，梯度洗脱，多次进样，收集，质谱检测目标组分，合并，旋转蒸发浓缩至10毫升。

上述混合物用纯化工厂进一步纯化。纯化工厂色谱柱为X-Tera Prep MSC18 OBD制备柱(19×100mm，i.d.，50um)。设定负离子质谱检测，梯度洗脱，多次进样，收集目标组分，合并，SPE浓缩，30℃旋转蒸发，得到该化合物5.2毫克。该化合物ESI--TOF精确分子量315.1078，分子式C₁₄H₁₉O₈(PPM-0.6)。

根据核磁数据确定该化合物结构如下，

13C-NMR数据如表1。

表1 13C-NMR(D2O，400MHz)

1H-NMR数据如表2。

表2 1H-NMR(D2O，400MHz)

实施例2

连翘原药材粉碎，称取3千克，置于100升提取罐中，加30升水煎煮2小时，过滤，滤液保存备用，滤渣中再加30升水煎煮2小时，过滤，滤液与第一次合并，滤渣弃去。将滤液旋转蒸发，得浸膏570ml(相对密度1.05)。浸膏溶于等体积水，加1959毫升95％乙醇，搅拌，静置24小时，过滤，滤渣弃去，滤液浓缩至无醇味，得到连翘醇沉组分426毫升。

连翘醇沉组分用水定容至600毫升，加85.2克碳酸氢钠，搅拌，反应3小时，放置过夜。逐步加1∶1盐酸170.4毫升，1∶2的盐酸4.1毫升(此时pH为2左右)。旋转蒸发至干，再用95％乙醇溶解，上清液旋转蒸发，得到连翘酸碱处理后浸膏165毫升(相对密度1.27)。

连翘酸碱处理后浸膏用6.3升水溶解，上清液经NKA-II大孔树脂乙醇水梯度洗脱(pH值用盐酸调至3)，收集15％乙醇洗脱液旋转蒸发得大孔树脂组分一8.4毫升，固含量5.4克。

连翘大孔树脂组分一用工业色谱分离。工业色谱柱柱长400毫米，内径80毫米，色谱填料为10-20微米的C18键合固定相，柱效为15000塔板/米，设定紫外检测波长为270nm，梯度洗脱，多次进样，收集，质谱检测目标组分，合并，旋转蒸发浓缩至30毫升。

上述混合物用纯化工厂进一步纯化。纯化工厂色谱柱为X-Tera Prep MSC18 OBD制备柱(19×100mm，i.d.，50um)。设定负离子质谱检测，梯度洗脱，多次进样，收集目标组分，合并，SPE浓缩，30℃旋转蒸发，得到化合物I 15.6毫克。

实施例3

连翘原药材粉碎，称取6.8千克，置于100升提取罐中，加68升水煎煮2小时，过滤，滤液保存备用，滤渣中再加68升水煎煮2小时，过滤，滤液与第一次合并，滤渣弃去。滤液旋转蒸发，得浸膏1292ml(相对密度1.05)。浸膏溶于等体积水，加4.44升95％乙醇，搅拌，静置24小时，过滤，滤渣弃去，滤液浓缩至无醇味，得连翘醇沉组分966毫升。

连翘醇沉组分用水定容至1.36升，加193克碳酸氢钠，搅拌，反应3小时，放置过夜。逐步加1∶1盐酸386毫升，1∶2的盐酸9.3毫升(此时pH为2左右)。旋转蒸发至干，用95％乙醇溶解，上清液旋转蒸发，得到连翘酸碱处理后浸膏374毫升(相对密度1.27)。

连翘酸碱处理后浸膏用14.3升水，溶解，上清液经NKA-II大孔树脂乙醇水梯度洗脱(pH值用盐酸调至3)，收集15％乙醇洗脱液旋转蒸发得大孔树脂组分一19毫升，固含量12.2克。

连翘大孔树脂组分一用工业色谱分离。工业色谱柱柱长400毫米，内径80毫米，色谱填料为10-20微米的C18键合固定相，柱效为15000塔板/米，设定紫外检测波长为270nm，梯度洗脱，多次进样，收集，质谱检测目标组分，合并，旋转蒸发浓缩至68毫升。

此混合物用纯化工厂进一步纯化。纯化工厂色谱柱为X-Tera Prep MSC18 OBD制备柱(19×100mm，i.d.，50um)。设定负离子质谱检测，梯度洗脱，多次进样，收集目标组分，合并，SPE浓缩，30℃旋转蒸发，得到化合物I36毫克。

实施例4

连翘原药材粉碎，称取8千克，置于100升提取罐中，加80升水煎煮2小时，过滤，滤液保存备用，滤渣中再加80升水煎煮2小时，过滤，滤液与第一次合并，滤渣弃去。将滤液旋转蒸发，得浸膏1520ml(相对密度1.05)。浸膏溶于等体积水，加5224毫升95％乙醇，搅拌，静置24小时，过滤，滤渣弃去，滤液浓缩至无醇味，得到连翘醇沉组分1136毫升。

连翘醇沉组分加用水定容至1600毫升，再加227克碳酸氢钠，搅拌，反应3小时，放置过夜。逐步加1∶1盐酸454.4毫升，1∶2的盐酸10.9毫升(此时pH为2左右)。旋转蒸发至干，再用95％乙醇溶解，上清液旋转蒸发，得到连翘酸碱处理后浸膏440毫升(相对密度1.27)。

连翘酸碱处理后浸膏加16.8升水，溶解，上清液经NKA-II大孔树脂乙醇水梯度洗脱(pH值用盐酸调至3)，收集15％乙醇洗脱液旋转蒸发得大孔树脂组分一22.4毫升，固含量14.4克。

连翘大孔树脂组分一用工业色谱分离。工业色谱柱柱长400毫米，内径80毫米，色谱填料为10-20微米的C18键合固定相，柱效为15000塔板/米，设定紫外检测波长为270nm，梯度洗脱，多次进样，收集，质谱检测目标组分，合并，旋转蒸发浓缩至80毫升。

此混合物用纯化工厂进一步纯化。纯化工厂色谱柱为X-Tera Prep MSC18 OBD制备柱(19×100mm，i.d.，50um)。设定负离子质谱检测，梯度洗脱，收集目标组分，合并，SPE浓缩，30℃旋转蒸发，得到化合物I 41.6毫克。

本化合物具有抗氧化、抗衰老作用，可用于化妆品添加剂。

本化合物具有抗病毒、抗肿瘤作用，大量生产可作为医药制剂。

Claims (4)

1.一种二羟基苯乙醇葡萄糖甙化合物，其特征在于：所述化合物结构式如下，

其***命名为1-(2，5-二羟基)苯乙基-β-D-吡喃葡萄糖甙。

2.根据权利要求1所述化合物的制备方法，其特征在于：其为中药连翘提取物酸碱水解后的产物，具体为，

1)连翘水提物的制备：将连翘原药材粉碎，定量称取，煎煮提取2-4次，每次煎煮时间1-3小时，每次加入连翘8-12倍重量的水煮沸，合并提取液，浓缩至相对密度为1.01-1.20g/ml的浸膏；

2)连翘醇沉组分的制备：浸膏用2-5倍体积的水混悬并加乙醇使乙醇浓度达50％-70％，室温静置12-24小时，过滤，滤液浓缩至无醇味，得到连翘醇沉组分；

3)连翘酸碱处理后浸膏的制备：连翘醇沉组分加入碳酸氢钠或碳酸钠反应，按碳酸氢钠或碳酸钠于水溶液中的饱和计量加入，放置，用酸调至pH值为2-4，旋转蒸发至干，再用80-95％乙醇溶解，上清液旋转蒸发，得到相对密度1.20-1.35g/ml的浸膏A；

4)连翘大孔树脂组分的制备：浸膏A加入水溶解后上大孔树脂柱，溶液经大孔树脂乙醇水梯度洗脱，洗脱液中醇的体积浓度从15％向95％变化，收集醇的体积浓度为15％时的目标洗脱液旋转蒸发得大孔树脂组分一；

5)二羟基苯乙醇葡萄糖甙化合物的工业色谱分离：大孔树脂组分一浓缩后采用C18反向色谱柱进样分离，流动相为甲醇水梯度洗脱，洗脱液中醇的体积浓度从5％向45％变化，紫外检测按时间分段收集，一次或一次以上进样，合并同一段时间下的洗脱液，质谱检测，含二羟基苯乙醇葡萄糖甙化合物的目标组分浓缩得组分二；

6)二羟基苯乙醇葡萄糖甙化合物的纯化：将组分二浓缩后C18反向色谱柱进样纯化，流动相乙腈水梯度洗脱，洗脱液中乙腈的体积浓度从3％向25％变化，负离子质谱检测收集目标组分，得到二羟基苯乙醇葡萄糖甙新化合物。

3.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于：所述酸为盐酸、硫酸或硝酸。

4.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于：所述C18反向色谱柱亦可用硅胶层析柱替换。

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