CN103788180B - 中华大蟾蜍抗菌肽bg-lw18及其编码基因和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了中华大蟾蜍抗菌肽BG-LW18及其编码基因和应用，所述抗菌肽具有选自序列表SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，中华大蟾蜍抗菌肽BG-LW18具有显著的抗肿瘤作用，且具有结构简单、人工合成方便特点。它可以应用于抗肿瘤的药物的制备，用于人和动物的治疗。

Description

中华大蟾蜍抗菌肽BG-LW18及其编码基因和应用

技术领域

本发明属生物医学领域，具体涉及中华大蟾蜍抗菌肽BG-LW18及其编码基因和应用。

背景技术

中华大蟾蜍为无尾两栖类蟾蜍属动物，广泛分布于我国大部分地区，是传统中药蟾酥和蟾皮的主要基源动物，有具有解毒散结、消积利水、杀虫消疳的功效。从中华大蟾蜍Bufo bufo gargarizans Cantor的干燥皮提取精制而成的水溶性制剂-华蟾素，目前广泛应用于多种中晚期肿瘤，如原发性肝癌、胃癌、肺癌、结肠癌、胰腺癌等。

国内外学者发现两栖动物皮及其分泌物含有丰富的抗菌肽，这类多肽通常含有10～50个氨基酸残基，成熟的多肽来源于前体蛋白的水解，大多数抗菌肽由于富含碱性氨基酸而带净正电荷。抗菌肽具有很多优点：消炎、抗感染、抗真菌、抗肿瘤、促进伤口愈合等作用，这些功能使抗菌肽可能成为良好应用前景的临床候选药物。

发明内容

本发明的目的是提供了中华大蟾蜍抗菌肽BG-LW18及其编码基因和应用，所述抗菌肽BG-LW18具有显著的抗肿瘤作用，其具有结构简单、合成成本低和抗菌谱系广等优点。

为了实现本发明的目的，本发明提供了如下技术方案：

中华大蟾蜍抗菌肽BG-LW18，其具有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。

含有所述的中华大蟾蜍抗菌肽BG-LW18的蛋白前体，其具有SEQ IDNO:2所示的氨基酸序列。

所述的中华大蟾蜍抗菌肽BG-LW18的蛋白前体的编码基因，其具有SEQID NO:1所示的核苷酸序列。

所述的中华大蟾蜍抗菌肽BG-LW18的蛋白前体的编码基因，使用T7启动子序列和SP6启动子序列筛选获得所述编码基因，

所述T7启动子序列为5’-TAATACGACTCTATAGGGA-3’；

所述SP6启动子序列5’-CATACGATTTAGGTGACACTATAG-3’。

本发明还提供了所述的中华大蟾蜍抗菌肽BG-LW18在制备用于抗肿瘤的药物中的应用。

所述抗菌肽BG-LW18在6.25ug/ml时，对肝癌肿瘤细胞的抑制效果显著。

所述抗菌肽BG-LW18在3.125μg/ml时，对乳腺癌细胞的抑制效果显著。

所述抗菌肽BG-LW18在25μg/ml时，对脑神经瘤细胞的抑制效果显著。

与现有技术相比，本发明的优点和技术效果是：本发明在中华大蟾蜍毒液腺cDNA文库中获得了具有广谱抗菌活性的抗菌肽BG-LW18，并将本发明的中华大蟾蜍抗菌肽BG-LW18全序列氨基酸序列经蛋白质数据库进行搜寻比较，未发现有任何相同成熟肽，所述抗菌肽BG-LW18具有创新性。

本发明通过实验证明两栖动物来源的中华大蟾蜍抗菌肽BG-LW18具有显著的抗肿瘤的作用，尤其是对临床耐药肿瘤细胞有很好的抑制作用，且应用范围广泛，与其它来源的抗菌多肽相比，该组抗菌肽具有结构简单、人工合成方便、抗菌谱系广等有益特点。可以应用于抗微生物感染和抗肿瘤的药物的制备，用于人和动物的治疗。具有良好的市场应用前景。

附图说明

图1是本发明中华大蟾蜍抗菌肽BG-LW18的cDNA及其蛋白质序列，其中斜体加框序列为推导的中华大蟾蜍抗菌肽的成熟序列。

图2表明本发明抗菌肽BG-LW18对肝癌细胞HepG2的作用。

图3表明本发明抗菌肽BG-LW18对乳腺癌细胞MCF-7的作用。

图4表明本发明抗菌肽BG-LW18对脑神经瘤细胞Neuro-2a的作用。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案做进一步详细的说明。

实施例1

一、中华大蟾蜍抗菌肽BG-LW18的基因克隆

1、总RNA的提取

将中华大蟾蜍放于玻璃烧杯中，加入几滴***，收集毒液腺分泌物（也可以直接使用收集好的毒液腺分泌物），立即放入液氮中。称重后取20mg分泌物于液氮中研磨至粉末状。加入10ml总RNA提取缓冲液（Trizol溶液，美国GIBCO/BRL产品），于20ml玻璃匀浆器中匀浆30分钟。然后加入等体积的酚/氯仿溶液，剧烈混匀。室温放置10分钟后，4℃,12000rpm离心10分钟，弃沉淀，上清液加入等体积的异丙醇，室温放置10分钟。4℃,12000rpm离心10分钟，沉淀用75％乙醇洗一次，晾干，管底沉淀物即为总RNA。

2、mRNA的分离

采用美国Promega公司的mRNA分离纯化试剂盒。取中华大蟾蜍毒腺总RNA500μg溶于500μl经DEPC处理然后高压灭菌的水中，放入65℃水浴10分钟。加入3μl的Oligo（dT）探针和13μl20×SSC溶液，混匀，放置室温冷却，称为A液。磁珠（SA-PMP）的洗涤：将磁珠（随mRNA分离纯化试剂盒）轻轻混匀，至磁力架吸附30秒，弃上清，加0.5×SSC0.3ml，至磁力架吸附30秒，最后加0.1ml0.5×SSC悬浮，称为B液。将A液加入B液中，室温放置10分钟，至磁力架吸附30秒，弃上清，用0.1×SSC洗涤4次。然后弃上清，加0.1ml DEPC水悬浮，至磁力架吸附30秒，将上清移至新的试管中，加入0.15ml DEPC水重新悬浮,至磁力架吸附30秒，将上清移至上述试管,则上清中为纯化的mRNA。加入1/10体积的3M乙酸钠,pH5.2,等体积异戊醇,于-70℃放置30分钟,然后于4℃，12000rpm离心10分钟,弃上清，沉淀溶于10μl DEPC水中。

3、cDNA文库构建。

采用美国GIBCO/BRL公司SuperScriptTM质粒cDNA文库构建试剂盒。

3.1、cDNA第一链合成（mRNA反转录）：于1.5ml试管中加入2.0μl NotI引物和7μl mRNA，3μl DEPC水，70℃保温10分钟，立即放入冰浴冷却，然后加入4μl5×第一链合成缓冲液，2μl0.1M DTT，1μl10mM dNTP混合物，再加入1μl SuperScript II反转录酶，于42℃保温1小时后放入冰浴。

3.2、cDNA第二链合成：在第一链合成试管中加入：95μl DEPC水，30μl5×第二链合成缓冲液，3μl10mM dNTP混合物，1μl大肠杆菌DNA连接酶，4μl大肠杆菌DNA多聚酶I，1μl大肠杆菌RNA酶，反应总体积150μl，混匀后于16℃保温2小时；加入2μl T4DNA多聚酶继续保温5分钟。

3.3、DNA的抽提和乙醇沉淀：加入等体积酚/氯仿/异戊醇（25/24/1）混合物抽提，12000rpm离心5分钟，取180μl上层溶液转移到干净的试管中，加入70μl7.5M乙酸铵，0.5ml无水乙醇，12000rpm离心20分钟，弃上清，沉淀用75%乙醇洗一次，晾干。

3.4、Sal I adapter的连接：上述沉淀溶于25μl DEPC水中，加入10μl5×T4DNA连接酶缓冲液，10μl SalI adapter，5μl T4DNA连接酶，反应总体积50μl，于16℃保温16小时。重复上述DNA的抽提和乙醇沉淀过程，沉淀溶解于41μl DEPC水中。

3.5、Not I酶水解：于cDNA溶液中加入5μl React3缓冲液，4μl NotI酶，反应体积50μl，于37℃保温2小时。重复上述DNA的抽提和乙醇沉淀过程，沉淀溶解于100μl TEN缓冲液中。

3.6、DNA分级分离：将cDNA样品过柱（试剂盒中含有）后，去除小于300bp核苷酸的cDNA，cDNA大于300bp的组分合并，体积为200μl，加入5μl酵母tRNA，100μl7.5M乙醇胺，0.6ml无水乙醇，12000rpm离心20分钟，弃上清，沉淀用75%乙醇洗一次，晾干，沉淀溶于20μl TEN缓冲液中。

3.7、合成的cDNA连接到pSPORT1质粒：取10μl溶解于TEN缓冲液中的cDNA，加入4μl5×T4DNA连接酶缓冲液，1μl pSPORT1质粒（Not I-SalI酶水解，50ng），4μl DEPC水，1μl T4DNA连接酶，反应体积20μl，室温3小时。

3.8、大肠杆菌HB101感受态细胞的制备：挑取单个HB101菌落，接种于3ml不含氨苄青霉素的LB培养基中，37℃培养过夜，次日取上述菌液按比例1：100再接种于50ml LB培养液中，37℃振荡2小时，待菌液在540nm的OD值为0.4时，4℃，2000rpm离心8分钟，弃上清，沉淀用0.1M CaCl₂重悬，再以2000rpm离心8分钟，弃上清，沉淀以适量0.1M CaCl₂重悬，分装后置冰浴内备用。

3.9、连接产物的转化：取上述连接产物5μl加入100μl感受态细胞，冰浴60分钟，42℃热休克60秒，再置冰浴5分钟，加入无氨苄青霉素的SOC培养基0.9ml，37℃振荡培养1小时，取200μl涂布于含氨苄青霉素的LB平皿上（15cm直径）。37℃培养16小时，每个LB平皿用5ml LB液体培养基洗涤菌落，加10%的甘油于液氮保存的所构建中华大蟾蜍毒腺cDNA文库大约含1.8×10⁵个克隆。

4、中华大蟾蜍抗菌肽BG-LW18的基因克隆。

采用cDNA文库构建质粒pSPORT1的通用引物T7启动子序列(5’-TAATACGACTCTATAGGGA-3’)(SEQ ID No:4)以及SP6启动子序列(5’-CATACGATTTAGGTGACACTATAG-3’)(SEQ ID No:5)鉴定每个克隆的***片段大小。通过对2000多个***片段>400bp的克隆的测序，结合核酸及蛋白质的序列比较，得到了中华大蟾蜍抗菌肽BG-LW18编码基因，如图1所示，其cDNA由434个核苷酸组成，自5’端至3‘端序列为(SEQ ID NO:1)：

GGCCTAGGCTGACGACGGGTCAGCTGATTTCACTACCTGTGAGTCAGCTCTAGGATAC

AGCAGCATGGTGTGGAGGCTCCTTATGGCTGGGCGACGGCAGAATGTCTCGAGAGGGC

GCTGGTATTCATGGTAGGATCGGAGTTGTTGCACGGGACCCACGCTGCGGTCCACCAC

ATGTAGTGCTCTGGGATGAAGCAGAGTTGGGCGCCAAGGGTTGAACGATGGTTGTATT

GTTTGTCCGGCTATTTCAGAGGCCTGGTGGGGCCATTGCATACAGTATTGGGGTAGCA

TGTGCTTAGAGTGGGCATGGTTGTATGTTTTCTGGTACCTGGTTTACATGCGGGGAGC

GTGTCTGCAGTTGGCTCAAGCACGCGTGCTGTGTTTAAGTGATGGTAAATGTGGATCAATGGCGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA

SEQ ID NO:1的核苷酸序列编码的抗菌肽前体蛋白氨基酸序列为(SEQ IDNO:2)：MADDGSADFTTCESALGYSSMVWRLLMAGRRQNVSRGRWYSW。

从上述前体蛋白的序列分析，根据目前对抗菌肽成熟肽加工位点的知识和抗菌肽结构理论，大部分两栖类抗菌多肽在正常pH环境下带净正电荷，分子结构中含有多个赖氨酸（K）或者精氨酸(R)，可以推论在此前体蛋白中，Leu25-Trp42为中华大蟾蜍抗菌肽BG-LW18的成熟序列(SEQ ID NO:3，LLMAGRRQNVSRGRWYSW)。抗菌肽BG-LW18由18个氨基酸组成，理论pI值为12.00，分子量Mw2236.59Da。

实施例2、中华大蟾蜍抗菌肽BG-LW18的制备

1、根据编码中华大蟾蜍抗菌肽BG-LW18的核酸序列推导出成熟抗菌肽的氨基酸序列。分别用全自动多肽合成仪合成它们对应的全序列。通过HPLC反相C18柱层析脱盐、纯化。

2、分子量测定采用快原子轰击质谱法(Fast atom bombardment massspectrometry,FAB-MS)，以甘油：间硝基苄醇：二甲亚砜(1:1:1,V:V:V，体积比)为底物，Cs⁺作为轰击粒子，电流为1μA，发射电压为25Kv。

3、纯化的中华大蟾蜍抗菌肽用高效液相色谱HPLC方法鉴定其纯度，分子量测定采用快原子轰击质谱法，用全自动氨基酸测序仪测定氨基酸序列结构。

所合成中华大蟾蜍抗菌肽的名称以及氨基酸序列如下所示：

BG-LW18（SEQ ID NO:3）：LLMAGRRQNVSRGRWYSW。

实施例3

肝癌细胞HepG2培养于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基。细胞生长至对数生长期时常规消化，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基悬浮，计数细胞密度，调细胞密度至3×10⁴/ml将。细胞接种于96孔板（100μl/孔），贴壁过夜后，加入抗菌肽BG-LW18分别6.25ug/ml，12.5ug/ml，25ug/ml，50ug/ml，100ug/ml，200ug/ml，并设置对照孔和调零孔。每个剂量设置5个复孔，培养48小时后加入20μl MTT（5g/L)。37度，4小时后，加150μl DMSO，酶标仪检测吸光度A490，并以A630作参考。

实验结果如图2所示，相对细胞存活率/%=实验组A490/对照组A490×100%。设置7个浓度：6.25μg/ml，12.5μg/ml，25μg/ml，50μg/ml，100μg/ml，200μg/ml对应HepG2相对细胞存活率分别为70.15%，75.20%，76.58%，82.31%，78.57%，83.56%。因此，抗菌肽BG-LW18在6.25μg/ml时，对肝癌细胞HepG2抑制效果显著。

实施例4

乳腺癌细胞MCF-7培养于含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基。细胞生长至对数生长期时常规消化，用含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基，计数细胞密度，调细胞密度至3×10⁴/ml将。细胞接种于96孔板（100μl/孔），贴壁过夜后，加入抗菌肽BG-LW18分别3.125μg/ml，6.25μg/ml，12.5μg/ml，25μg/ml，50μg/ml，100μg/ml，并设置对照孔和调零孔。每个剂量设置5个复孔，培养48小时后加入20μl MTT（5g/L)。37度，4小时后，加150μl DMSO，酶标仪检测吸光度A490，并以A630作参考。

实验结果如图3所示，相对细胞存活率/%=实验组A490/对照组A490×100%。设置6个浓度：3.125μg/ml，6.25μg/ml，12.5μg/ml，25μg/ml，50μg/ml，100μg/ml对应MCF-7相对细胞存活率分别为48.27%，60.09%，65.70%，69.50%，78.72%，88.83%。因此可知，抗菌肽BG-LW18在3.125μg/ml时，对乳腺癌细胞MCF-7抑制效果显著，IC₅₀=3.77μg/ml。

实施例5

脑神经瘤细胞Neuro-2a培养于含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基。细胞生长至对数生长期时常规消化，用含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基悬浮，计数细胞密度，调细胞密度至3×10⁴/ml将。细胞接种于96孔板（100μl/孔），贴壁过夜后，加入抗菌肽BG-LW18分别3.125μg/ml，6.25μg/ml，12.5μg/ml，25μg/ml，50μg/ml，100μg/ml，并设置对照孔和调零孔。每个剂量设置5个复孔，培养48小时后加入20μl MTT（5g/L)。37度，4小时后，加150μl DMSO，酶标仪检测吸光度A490，并以A630作参考。

实验结果如图4所示，相对细胞存活率/%=实验组A490/对照组A490×100%。设置6个浓度：3.125μg/ml，6.25μg/ml，12.5μg/ml，25μg/ml，50μg/ml，100μg/ml对应Neuro-2a相对细胞存活率分别为85.94%，83.39%，81.82%，64.18%，80.16%，83.59%。因此可知，抗菌肽BG-LW18在25μg/ml时，对脑神经瘤细胞Neuro-2a抑制效果显著。

综上所述，本发明通过系列实验获得了中华大蟾蜍抗菌肽BG-LW18，并通过抗肿瘤实验证明其对肿瘤细胞有显著抑制作用，而且应用范围广泛，可以应用于肝癌细胞、乳腺癌细胞和脑神经瘤细胞等，效果显著，可以应用于抗肿瘤药物的制备。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

SEQUENCE LISTING

 

<110>  潍坊医学院

 

<120>  中华大蟾蜍抗菌肽BG-LW18及其编码基因和应用

 

<130> 

 

<160>  5    

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  434

<212>  DNA

<213>  中华大蟾蜍

 

<400>  1

ggcctaggct gacgacgggt cagctgattt cactacctgt gagtcagctc taggatacag     60

 

cagcatggtg tggaggctcc ttatggctgg gcgacggcag aatgtctcga gagggcgctg    120

 

gtattcatgg taggatcgga gttgttgcac gggacccacg ctgcggtcca ccacatgtag    180

 

tgctctggga tgaagcagag ttgggcgcca agggttgaac gatggttgta ttgtttgtcc    240

 

ggctatttca gaggcctggt ggggccattg catacagtat tggggtagca tgtgcttaga    300

 

gtgggcatgg ttgtatgttt tctggtacct ggtttacatg cggggagcgt gtctgcagtt    360

 

ggctcaagca cgcgtgctgt gtttaagtga tggtaaatgt ggatcaatgg cgaaaaaaaa    420

 

aaaaaaaaaa aaaa                                                      434

 

 

<210>  2

<211>  42

<212>  PRT

<213>  中华大蟾蜍

 

<400>  2

 

Met Ala Asp Asp Gly Ser Ala Asp Phe Thr Thr Cys Glu Ser Ala Leu

1                    5                         10                       15     

 

 

Gly Tyr Ser Ser Met Val Trp Arg Leu Leu Met Ala Gly Arg Arg Gln

               20                        25                        30         

 

 

Asn Val Ser Arg Gly Arg Trp Tyr Ser Trp

           35                       40         

 

 

<210>  3

<211>  18

<212>  PRT

<213>  人工序列

 

<400>  3

 

Leu Leu Met Ala Gly Arg Arg Gln Asn Val Ser Arg Gly Arg Trp Tyr

1                    5                         10                       15     

 

 

Ser Trp

       

 

 

<210>  4

<211>  19

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  4

taatacgact ctataggga                                                  19

 

 

<210>  5

<211>  24

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  5

catacgattt aggtgacact atag                                            24

 

 

Claims (5)

1.中华大蟾蜍抗菌肽BG-LW18，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。

2.权利要求1所述的中华大蟾蜍抗菌肽BG-LW18在制备用于抗肝癌肿瘤细胞、乳腺癌细胞、脑神经瘤细胞的药物中的应用。

3.根据权利要求2所述的中华大蟾蜍抗菌肽BG-LW18在制备用于抗肝癌肿瘤细胞、乳腺癌细胞、脑神经瘤细胞的药物中的应用，其特征在于：所述抗菌肽BG-LW18在6.25 ug/ml时，对肝癌肿瘤细胞的抑制效果显著。

4.根据权利要求2所述的中华大蟾蜍抗菌肽BG-LW18在制备用于抗肝癌肿瘤细胞、乳腺癌细胞、脑神经瘤细胞的药物中的应用，其特征在于：所述抗菌肽BG- LW18在3.125μg/ml时，对乳腺癌细胞的抑制效果显著。

5.根据权利要求2所述的中华大蟾蜍抗菌肽BG-LW18在制备用于抗肝癌肿瘤细胞、乳腺癌细胞、脑神经瘤细胞的药物中的应用，其特征在于：所述抗菌肽BG- LW18在25 μg/ml时，对脑神经瘤细胞的抑制效果显著。