CN102115496A - 一种抗微生物肽Pc-CATH1及其基因、化学合成方法和应用 - Google Patents
一种抗微生物肽Pc-CATH1及其基因、化学合成方法和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102115496A CN102115496A CN 201010530926 CN201010530926A CN102115496A CN 102115496 A CN102115496 A CN 102115496A CN 201010530926 CN201010530926 CN 201010530926 CN 201010530926 A CN201010530926 A CN 201010530926A CN 102115496 A CN102115496 A CN 102115496A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cath1
- antimicrobial peptide
- gene
- peptide
- arginine
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
一种环颈雉(Equus asinus)的抗微生物肽Pc-CATH1及其基因，化学合成方法和在生物制药领域的应用，属于生物医学技术领域。Pc-CATH1是环颈雉Cathelicidin基因编码的一种直链多肽，Pc-CATH1全序列为：精氨酸-异亮氨酸-赖氨酸-精氨酸-苯丙氨酸-色氨酸-脯氨酸-缬氨酸-缬氨酸-异亮氨酸-精氨酸-苏氨酸-缬氨酸-缬氨酸-丙氨酸-甘氨酸-酪氨酸-天冬酰胺-亮氨酸-酪氨酸-精氨酸-丙氨酸-异亮氨酸-赖氨酸-赖氨酸-赖氨酸。编码Pc-CATH1前体的基因由607个核苷酸组成，其中编码成熟肽部分的为第367-445位核苷酸。Pc-CATH1分子量更小、杀菌作用更强、更广谱，对多种临床耐药菌有非常强的杀灭作用。结构简单，不含有二硫键及环状结构，方便化学合成及基因工程制备。此外还具有无溶血性、无细胞毒性及超强的血清稳定性等有益特点。
Description
技术领域
本发明提供一种来源于环颈雉(Phasianus colchicus)的cathelicidin家族广谱抗微生物肽Pa-CATH1及其基因，化学合成方法和应用，属于生物医学技术领域。
背景技术
Cathelicidin是一类由N端信号肽区域、中间保守cathelin结构域和C端高度特异的成熟肽区域构成的具有多功能的抗菌肽家族，在几乎所有种类的动物体内(哺乳类、鸟类、两栖类和鱼类)都有发现。与防御素(defensin)一样，Cathelicidin是包括人类在内的大多数脊椎动物所特有的宿主防御肽，构成了脊椎动物自然免疫反应的关键组分，是连接自然免疫和特异性免疫的桥梁。Cathelicidin具有广谱的抗菌活性，不仅对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、某些真菌以及病毒具有非常强的杀菌活性，而且对许多临床耐药细菌同样具有作用。除此之外，Cathelicidin还具有许多其他生物学活性，如对多种免疫细胞(中性粒细胞、单核细胞、肥大细胞和T细胞)具有趋化作用、诱导肥大细胞脱粒和组织胺释放、调节巨噬细胞转录、促进伤口愈合、诱导血管发生、诱导变异细胞系细胞凋亡和淋巴细胞活化等。Cathelicidin基因的缺失或异常表达都将导致人类严重疾病的发生。最新研究发现，***性红斑狼疮和牛皮癣的发病与人体内Cathelicidin LL-37的过度表达有关。由于具有如此众多的活性，Cathelicidin一直是国际上研究的热点。针对Cathelicidin的药用开发则蕴含着巨大的临床治疗药物制备价值。
由于近年来抗生素的滥用，导致致病性微生物耐药性的问题日益严重，在临床上已经出现了大量能够完全耐受青霉素等传统抗生素的微生物。最近，一种携带编写NDM-1酶基因的“超级病菌”的出现，罪魁祸首正是抗生素的滥用和误用。这种酶可分解β-内酰胺环结构，因此可使目前为止临床最常用的抗生素，包括青霉素与头孢菌素，以及新发展的头霉素类、硫霉素类、单环β-内酰胺类等其他非典型β-内酰胺类抗生素失效。而Cathelicidin家族抗微生物肽的杀菌机制是通过破坏细菌细胞膜的完整性介导的：通过静电相互作用吸引并结合到带负电的细菌细胞膜表面，进一步在细菌细胞膜上形成跨膜的孔洞，导致细菌细胞内容物的外泄，从而导致细菌细胞的死亡。除此之外，越来越多的文献报道表明抗菌肽还具有其他的杀菌机制，如抑制细菌细胞壁合成、改变细菌细胞质膜抑制隔膜形成、激活自溶素、抑制细胞内酶活性、抑制DNA、RNA和蛋白质的合成等。正是由于作用方式的不同，Cathelicidin介导的杀菌作用远远快于传统抗生素，并且不会产生耐药性。体外抗微生物测试中，大多数Cathelicidin成熟肽可以在微摩尔和亚微摩尔的浓度下快速杀死广泛的微生物。Cathelicidin成熟肽表现抗微生物肽的典型特征：大多数Cathelicidin成熟肽分子量小于5000，中性pH条件 下带净正电荷，缘于它们含有多个碱性氨基酸残基；富含疏水碱基，整体具有两亲性的拓扑结构。
目前，国外有许多公司正在进行抗微生物肽的研究开发，已有多种抗菌肽进入临床试验阶段。如来源于人lactoferrin的hLF-1-1用于治疗骨髓干细胞移植相关的感染，已进入临床II期。来源于非洲爪蟾magainin的MSI-78对糖尿病患者的足部溃疡有显著疗效且副作用小，已进入临床III期试验阶段。来源于猪protegrin的IB-367用于***患者口腔溃疡，已进入临床I期试验。除此之外，一些用于伤口愈合，内毒素感染，肿瘤，病毒感染的抗菌肽也已进入临床试验阶段。
由于世界范围内对Cathelicidin的研究历史并不长，我国在此类活性多肽家族的研究还鲜有报道。环颈雉为我国雉科中分布最广的鸟，兼具观赏、食用、药用价值，是一种重要的经济禽类。明朝李时珍的《本草纲目》认为环颈雉肉性味甘、酸、温，具有补中益气之功；对下痢、消渴、小便频繁有一定的治疗作用。《医学入门》称它能“治痰气止喘”。《医林纂要》认为它还有“益肝、和血”的作用。然而，对其药用价值背后的分子生物学和分子药理学基础还尚未有报道。
本发明的环颈雉抗微生物肽Pc-CATH1分子量更小，比至今已经鉴定的大多数cathelicidins均小(如金环蛇cathelicidin-BF：30个氨基酸，鸡fowlicidin2：32个氨基酸等)。杀菌作用更强(相比较于传统抗生素氨苄青霉素和卡那霉素，及人cathelicidin LL-37)、更广谱，对多种临床耐药菌有非常强的杀灭作用。结构简单，不含有二硫键及环状结构。杀菌动力学数据显示其杀菌作用时间迅速、且对多种临床耐药菌有非常强的杀灭作用。此外还具有无溶血性、及超强的血清稳定性等有益特点。
发明内容
本发明提供一种在亚微摩尔剂量下即具有很强的抗微生物活性的来源于环颈雉的一种抗微生物肽，Pc-CATH1及其基因、化学合成方法和应用。
为了实现本发明的目的，本发明提供了如下技术方案：
Pc-CATH1是环颈雉Cathelicidin基因编码的一种直链多肽，含有26个氨基酸残基，理论等电点(pI)为11.60，理论分子量为3175.9，含有8个碱性氨基酸残基(4个精氨酸和4个赖氨酸)，无酸性氨基酸残基，静电荷为+8，说明它是一种碱性多肽。Pc-CATH1不含半胱氨酸，因此没有分子内和分子间二硫键，结构简单。Pc-CATH1全序列为：精氨酸-异亮氨酸-赖氨酸-精氨酸-苯丙氨酸-色氨酸-脯氨酸-缬氨酸-缬氨酸-异亮氨酸-精氨酸-苏氨酸-缬氨酸-缬氨酸-丙氨酸-甘氨酸-酪氨酸-天冬酰胺-亮氨酸-酪氨酸-精氨酸-丙氨酸-异亮氨酸-赖氨酸-赖氨 酸-赖氨酸。
基因测序结果表明编码环颈雉Pc-CATH1前体cathelicidin的基因由607个核苷酸组成，自5’端至3’端序列为：
1 ATGCTGAGCT GCTGGGTGCT GGTGCTGGCG CTGCTGGGGG GGGCCTGCGC CCTCCCGGCC
61 ATGCTGAGCT GCTGGGTGCT GGTGCTGGCG CTGCTGGGGG GGGCCTGCGC CCTCCCGGCC
121CCCCTGGGCT ACTCCCAGGC TCTGGCCCAG GCTGTGGACT CCTACAACCA ACGGCCTGAG
181GTGCAGAATG CCTTCCGGCT GCTCAGCGCC GACCCCGAGC CCGGCCCGAA CGTCCAGCTG
241GGCTCCCTGC ACAACCTCAA CTTCACCATC ATAGAGACGC GGTGCCAGGC GCGCTCGGGC
301GCCCAGCTCG ACAGCTGCGA GTTCAAGGAG GACGGGCTCG TCAAGGACTG CGCTGCGCCC
361GTGGTGCTGC AAGGCGGCCG CGCCACGTTC GATGTCACCT GCGTGGAGTC CGTGGCTGAC
421CCTGTCCGCA TCAAGCGCTT CTGGCCAGTG GTCATCAGGA CTGTGGTTGC AGGATACAAC
481CTCTACCGGG CAATCAAGAA GAAATGAGCC ATCCCCAGAG CTGCTGTCAC CAATGTCCCC
541TTGCTGCTTT CCATCCAATA AAGGTGTTTC CCAGCCTAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA
601AAAAAAA
编码环颈雉cathelicidin成熟肽Pc-CATH1为第367-445位核苷酸，其氨基酸序列为：Arg1 Ile2 Lys3 Arg4 Phe5 Trp6 Pro7 Val8 Val9 Ile10 Arg11 Thr12 Val13 Val14 Ala15 Gly16 Tyr17 Asn18Leu19 Tyr20 Arg21 Ala22 Ile23 Lys24 Lys25 Lys26
Pc-CATH1的化学合成方法：
根据编码环颈雉cathelicidin抗微生物肽基因推断的成熟肽Pc-CATH1氨基酸序列，用自动多肽合成仪(433A，Applied Biosystems)合成其全序列。通过HPLC反相柱层析脱盐纯化，并确定其纯度大于95％。用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF)测定其分子量。
合成的Pc-CATH1抗菌肽可以溶于灭菌超纯水，用于药理活性检测。
本发明的有益效果在于基因克隆得到编码环颈雉cathelicidin抗微生物肽的基因，通过化学合成方法得到成熟肽Pc-CATH1。该抗微生物肽分子量小、杀菌作用更强(相比较于传统抗生素氨苄青霉素和卡那霉素，及人cathelicidin LL-37)、更广谱，结构简单，不含有二硫键及环状结构，方便化学合成及基因工程制备。杀菌动力学数据显示其杀菌作用时间迅速、且对多种临床耐药菌有非常强的杀灭作用。此外还具有无溶血性、及超强的血清稳定性等有益特点。
附图说明
图1为浓度为1倍MIC的Pc-CATH1的杀菌动力学示意图。
图2为浓度为2倍MIC的Pc-CATH1的杀菌动力学示意图。
图中：CFU：菌落形成单位；
具体实施方式
下面结合技术方案详细叙述本发明的具体实施例，但本发明的内容并不局限于此。
实施例1
抗微生物肽Pc-CATH1前体基因的克隆及基因测序，包括：
采用RNeasy Mini Kit提取环颈雉骨髓总RNA，利用CreatorTM SMARTTM cDNA library建库试剂盒构建环颈雉骨髓cDNA文库。 
Reverse Transcriptase反转录合成cDNA第一链，引物为：
正向Oligo dT引物：5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTACGGCCGGG-3′
反向CDSIII引物：5′-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATGT(30)N-1N-3′(N＝A，G，C，or T；N-1＝A，G，or C).
利用Advantage DNA Polymerase合成第二链，引物为：正向5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3′，反向引物同为CDSIII。
设计两条特异性正向引物(P1、P2)和一条反向非特异性通用引物(CDSIII)，以环颈雉cDNA为模板，采用半巢式PCR的方法扩增cathelicidin的cDNA。
正向P1：5′-AGGATGCTGAGCTGCTGGGT-3′；
正向P2：5′-ATGCTGAGCTGCTGGGTGCT-3′；
反向非特异性通用引物为CDSIII，其序列为：5′-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATGT(30)N-1N-3′(N＝A，G，C，or T；N-1＝A，G，or C)。
所获阳性单克隆进行基因核苷酸序列测定，pGEM-T vector测序通用引物：
正向M13F：5′-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3′；
反向M13R：5′-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3′；
具体步骤如下：
第一步、环颈雉骨髓总RNA提取(以下实验所用器具和试剂均经过处理，无RNase)：
A.从新鲜宰杀的环颈雉各种新鲜组织上分别剪下1g左右的小块，分别放入液氮预冷的细胞冻存管中，然后迅速放入液氮中保存；
B.将保存在液氮中的组织材料取出，放入预冷的研钵内，迅速充分研磨，期间不断向研钵内加入少许液氮；将大约30mg的组织粉末转移至预冷的1.5ml离心管中，向其中分别加入600μl Buffer RLT(裂解液，RNeasy Mini Kit提供)，迅速震荡混匀，室温放置20min后，4℃，12000rpm离心5min；
C.将离心后的上清转移至新的1.5ml离心管中，分别加入等体积的70％乙醇，迅速吸打混匀；将混合液分别转移至离心吸附柱，室温，12000rpm离心15s；弃废液，然后加入700μlBuffer RW1(漂洗液)，4℃，12000rpm离心15s；弃废液，加入500μl Buffer RPE(去蛋白液)，4℃，12000rpm离心15s；弃废液，加入500μl Buffer RPE(去蛋白液)，4℃，12000rpm离心2min；将离心吸附柱转移至新的1.5ml离心管中，然后直接向吸附膜上滴加35μl RNasefree water，室温，12000rpm离心1min；
第二步、cDNA文库的构建
第一链的合成(mRNA反转录)：
A.在新的0.2ml PCR管(无DNase和RNase)中配制下列混合液：
模板RNA 1μg
Oligo dT Primer(50μM) 1μl
dNTP Mixture(10mM each) 1μl
RNase free ddH2O补充至10μl，混匀后，短暂离心；PCR仪中65℃保温5min后，迅速在冰上急冷2min；短暂离心后，在上述管中配制如下反转录反应液：
上述混合液 10μl
5×PrimeScript Buffer 4μl
RNase Inhibitor(40U/μl) 0.5μl
RNase free dH2O补充至20μl体系，混匀后，短暂离心；在PCR仪中完成以下程序：42℃，60min；70℃，15min；4℃，保存。cDNA保存于-80℃。
第二链的合成：
第一链cDNA 2μl
去离子水 80μl
10×Advantage 2 PCR buffer 10μl
50×dNTP Mix 2μl
5’PCR primer 2μl
CDS III/3’PCR primer 2μl
50×Advantage 2 Polymerase Mix 2μl
第三步、采用半巢式PCR进行环颈雉cathelicidin的基因克隆筛选
引物使用前先12000rpm离心5min，然后根据标明的摩尔数加入相应体积的ddH2O溶解至20μM的浓度。以合成的骨髓cDNA为模板，以P1和CDSIII为引物，进行第一次PCR扩 增。在0.2ml PCR管中加入下列试剂(总体积20μl)：
ddH2O 8μl
cDNA 模板 1μl
正向引物P1(20μM) 0.5μl
反向引物CDSIII(20μM) 0.5μl
2×Pfu PCR MasterMix 10μl
混匀后，短暂离心。PCR条件为：94℃变性1min；20个循环：94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min；72℃延伸10min；4℃保存。反应结束后，取5μl产物于1％琼脂糖凝胶电泳检测目的条带。
取上步PCR产物1μl加入99μl ddH2O稀释100倍作为模板，以P2和CDSIII为引物，进行第二次PCR扩增。在0.2ml PCR管中先后加入下列试剂(总体积20μl)：
ddH2O 7μl
一次PCR产物稀释液模板 1μl
正向引物P2(20μM) 1μl
反向引物CDSIII(20μM) 1μl
2×Pfu PCR Master Mix 10μl
PCR条件为：94℃变性5min；25个循环：94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min；72℃延伸10min；4℃保存。反应结束后，取5μl，1％琼脂糖凝胶电泳检测目的条带。
扩增完成后用胶回收试剂盒(天根生物)进行目的片段回收。将回收的目的DNA片段与测序载体pGEM-T vector连接，转化进CaCl2-MgCl2法制备好的DH5α感受态细胞。取100μl转化菌液均匀涂布在含有100μlg/ml氨苄青霉素(Amp)的LB琼脂培养基平板上；表面晾干后，放在37℃恒温培养箱中倒置培养12-16h。挑取单菌落用M13引物PCR检测***片段大小。挑取阳性菌落，摇菌提取质粒，使用Applied Biosystems DNA sequencer，model ABIPRISM 377进行核苷酸测序。
第四步、环颈雉cathelicidin的基因序列测定和结果：
基因测序结果表明编码Pc-CATH1前体cathelicidin的基因由607个核苷酸组成，自5’端至3’端序列为：
1 ATGCTGAGCT GCTGGGTGCT GGTGCTGGCG CTGCTGGGGG GGGCCTGCGC CCTCCCGGCC
61 ATGCTGAGCT GCTGGGTGCT GGTGCTGGCG CTGCTGGGGG GGGCCTGCGC CCTCCCGGCC
121CCCCTGGGCT ACTCCCAGGC TCTGGCCCAG GCTGTGGACT CCTACAACCA ACGGCCTGAG
181GTGCAGAATG CCTTCCGGCT GCTCAGCGCC GACCCCGAGC CCGGCCCGAA CGTCCAGCTG
241GGCTCCCTGC ACAACCTCAA CTTCACCATC ATAGAGACGC GGTGCCAGGC GCGCTCGGGC
301GCCCAGCTCG ACAGCTGCGA GTTCAAGGAG GACGGGCTCG TCAAGGACTG CGCTGCGCCC
361GTGGTGCTGC AAGGCGGCCG CGCCACGTTC GATGTCACCT GCGTGGAGTC CGTGGCTGAC
421CCTGTCCGCA TCAAGCGCTT CTGGCCAGTG GTCATCAGGA CTGTGGTTGC AGGATACAAC
481CTCTACCGGG CAATCAAGAA GAAATGAGCC ATCCCCAGAG CTGCTGTCAC CAATGTCCCC
541TTGCTGCTTT CCATCCAATA AAGGTGTTTC CCAGCCTAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA
601AAAAAAA
环颈雉cathelicidin编码区的cDNA核苷酸的序列表为：序列长度为607个碱基，序列类型：核酸，链数：单链，拓扑学：直链状，序列种类：cDNA，来源：环颈雉骨髓。
编码环颈雉cathelicidin成熟肽Pc-CATH1为第367-445位核苷酸，其氨基酸序列为：Arg1 Ile2 Lys3 Arg4 Phe5 Trp6 Pro7 Val8 Val9 Ile10 Arg11 Thr12 Val13 Val14 Ala15 Gly16 Tyr17 Asn18Leu19 Tyr20 Arg21 Ala22 Ile23 Lys24 Lys25 Lys26
实施例2
Pc-CATH1的化学合成方法：
I、根据编码环颈雉cathelicidin基因推断的成熟肽Pc-CATHl氨基酸序列，用自动多肽合成仪(Applied Biosystems)合成其全序列，通过HPLC反相柱层析脱盐纯化。
II、分子量测定采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF)。
实施例3
抗微生物肽Pc-CATH1的药理实验：
1.Pc-CATH1抗菌活性检测：
将化学合成的Pc-CATH1以2mg/ml的浓度溶解在无菌超纯水中；用接种环挑取新活化的微生物，然后均匀涂布在新的LB琼脂板上；将直径0.5cm的圆形无菌滤纸片放在上述琼脂板上，然后向纸片上滴加10μl Pc-CATH1样品溶液；放入37℃恒温培养箱中培养12-24h；观察抑菌圈形成与否，将对Pc-CATH1敏感的菌株记录下来。
2.Pc-CATH1对敏感菌株最小抑菌浓度(Minimum Inhibitory Concentration，MIC)的测定。该实验以人cathelicidin LL-37、传统抗生素氨苄青霉素和卡那霉素作阳性对照，无菌液体LB作阴性对照；最小抑菌浓度的定义为肉眼可以观察到的完全抑制微生物生长的最低多肽浓度，或者是光吸收值不高于阴性对照5％的最低浓度。
挑取新活化的微生物，接种至无菌液体LB培养基，37℃恒温振荡器中200rpm培养10-16h至对数生长期；用紫外分光光度计测菌液600nm光波处的吸光值，吸光值为1时，浓度大约为109cfu/ml，将菌液用无菌液体LB培养基稀释至106cfu/ml，冰上待用；在96微孔板上配制浓度梯度为200μg/ml、100μg/ml、50μg/ml、25μg/ml、12.5μg/ml、6.25μg/ml、3.13μg/ml、1.56μg/ml、0.78μg/ml、0.39μg/ml、0.20μg/ml的经0.22μm孔径膜过滤的Pc-CATH1样品溶液，每孔50μl；每孔加入50μl上述稀释菌液；在恒温振荡器中37℃，100rpm振荡 培养10-16h；使用酶标仪测600nm吸光值或肉眼观察；上述实验重复3次，取平均值。另取一块96孔板，同样操作，仅是每孔多加100mMNaCl，仍然重复3次，取平均值。
由表1可见，Pc-CATH1对测试的微生物具有广谱的抗菌活性，特别是对临床分离的耐药性菌株。与氨苄青霉素、卡那霉素和LL-37的最小抑菌浓度值相比，Pc-CATH1拥有更强的抗菌效力。在全部32株菌株中，革兰氏阳性菌(G+)与革兰氏阴性菌(G-)及真菌相比，G+对Pc-CATH1极其敏感，最小抑菌浓度大多在0.09-2.95μM范围内。Pc-CATH1甚至对耐常规抗生素的菌株亦有强大的杀菌效果，如对溶血葡萄球菌临床分离株(IS 2401，DRa)的最小抑菌浓度浓度为甚至仅为0.09μM。Pc-CATH1对金黄色葡萄球菌ATCC2592(G+)和一种重要的院内感染致病菌，嗜麦芽寡养单胞菌(G-)，抗菌活性也非常强，最小抑菌浓度分别为0.18μM和0.74μM。此外，Pc-CATH1还具有非常强的抗真菌活性，对白色念珠菌ATCC2002和黏液菌的最小抑菌浓度分别达到0.18μM和0.37μM。不仅如此，Pc-CATH1对一种困扰全世界大量人口，可引起面部严重痤疮的痤疮丙酸杆菌，也显示出了极强的抗菌活性，最小抑菌浓度仅为0.74μM。
表1 Pc-CATH1的最小抑菌浓度(MIC)
*MIC：最小抑菌浓度，浓度值为3次重复实验的平均值；LL-37：人cathelicidin，ND：2mg/ml剂量纸片抑菌试验无明显活性；＞100μg/ml：2mg/ml剂量纸片抑菌试验有抑菌圈，100μg/ml剂量无抑菌活性；IS：临床分离菌株，Dra：耐头孢他啶、头孢哌酮和氨曲南，DRb：耐复方新诺明、红霉素、环丙沙星和青霉素。以上结果为三次独立重复实验平均值。
3.Pc-CATH1杀菌动力学测定：
该实验分别选用大肠杆菌ATCC25922(G-)进行测试；阴性对照是无菌去离子水，阳性对照是氨苄青霉素。挑取新活化的细菌单克隆，接种至新鲜无菌液体LB培养基，37℃，200rpm振荡培养10-16h，至对数生长期；测定菌液浓度，稀释至106cfu/ml；取三份上述菌液，各1ml，其中一份加入Pc-CATH1，使其终浓度为1倍(或2倍)MIC，第二份作为阴性对照，第三份中加入阳性对照，并迅速分别取样，稀释1000倍后，进行平板计数；将三份菌液放置于恒温振荡器中37℃，100rpm震荡培养；分别于0min、5min、10min、15min、20min、30min和60min取样，稀释1000倍后进行平板计数；结果如图1、图2所示。
如图1、图2中所示，Pc-CATH1的杀菌速度基本上2倍于氨苄青霉素。Pc-CATH1对金 黄色葡萄球菌ATCC2592的抗菌活性是致死性的。经过上述浓度Pc-CATH1处理2小时后的金黄色葡萄球菌，不能在琼脂平板上恢复生长。
4.Pc-CATH1的血清稳定性
该实验以人血清作阴性对照。制备人血清：取人5ml新鲜血液，37℃静置1h；4℃放置8-16h；4℃，4000rpm离心20min；小心吸出上层的血清，转移至无菌的1.5ml离心管中。
取900μl血清，加入100μl 10mg/ml的Pc-CATH1样品，混匀后37℃温育，分别在0h、3h、6h、12h、24h、36h、48h、60h和72h时取出少许混合样品，测定其对金黄色葡萄球菌(IS)的MIC。结果显示，Pc-CATH1在与人血清共孵育72h后，对金黄色葡萄球菌ATCC2592仍保留了很强的抗菌能力(MIC 0.37μM)。
5.Pc-CATH1的溶血活性分析
该实验以1％Triton X-100作阳性对照，以生理盐水作阴性对照。制备红细胞：取1ml人血，置于15ml离心管中，加入10ml生理盐水，混匀后2000rpm离心5min，用生理盐水重悬，重复离心至上清液不呈红色为止；用1ml生理盐水重悬红细胞沉淀，取少量重悬液加入小烧杯中，用生理盐水稀释至呈微红色；每种测试样品制备1000μl体系：
10μl多肽样品+990μl红细胞稀释液 Pc-CATH1(终浓度为20μg/ml)
10μl 1‰Triton X-100+990μl红细胞稀释液 阳性对照
10μl生理盐水+990μl红细胞稀释液 阴性对照
Pc-CATH1和阴、阳性对照各做3个重复体系。37℃温育30min，3000rpm离心5min；收集上清200μl，分别测540nm处光吸收值，计算3个重复的平均值；溶血率＝(样品540nm光吸收值-阴性对照)×100％/(阳性对照-阴性对照)。
实验结构表明，在10μg/ml(3.15μM)剂量下的Pc-CATH1对人血红细胞的溶血率仅为3.6％；显示了Pc-CATH1对微生物细胞的强选择性。
6.Pc-CATH1细胞毒性实验
人脐静脉内皮细胞系HUVEC和大鼠巨噬细胞系RAW264.7用DMEM+10％FBS培养基培养。培养的细胞稀释接种到96孔板中(2×104per well)，细胞培养箱中培养过夜使细胞贴壁。然后加入不同浓度的Pc-CATH1样品，继续培养48小时。MTT法检测Pc-CATH1对HUVEC和RAW264.7细胞的细胞毒性。
实验结果表明Pc-CATH1对两株细胞的半数致死浓度(IC50)值均为150μg/ml(47.25μM)，远远高于其对绝大多数细菌的MIC值。说明Pc-CATH1在平均MIC值浓度下对人体正常细胞不具有毒性作用，使Pc-CATH1的开发应用成为可能。
Claims (4)
1.一种抗微生物肽Pc-CATH1，是环颈雉Cathelicidin基因编码的一种直链多肽，其特征是其全序列为：精氨酸-异亮氨酸-赖氨酸-精氨酸-苯丙氨酸-色氨酸-脯氨酸-缬氨酸-缬氨酸-异亮氨酸-精氨酸-苏氨酸-缬氨酸-缬氨酸-丙氨酸-甘氨酸-酪氨酸-天冬酰胺-亮氨酸-酪氨酸-精氨酸-丙氨酸-异亮氨酸-赖氨酸-赖氨酸-赖氨酸。
2.权利要求1所述抗微生物肽Pc-CATH1的基因，其特征在于编码环颈雉抗微生物肽Pc-CATH1前体cathelicidin的基因由607个核苷酸组成，自5’端至3’端序列为：
1 ATGCTGAGCT GCTGGGTGCT GGTGCTGGCG CTGCTGGGGG GGGCCTGCGC CCTCCCGGCC
61 ATGCTGAGCT GCTGGGTGCT GGTGCTGGCG CTGCTGGGGG GGGCCTGCGC CCTCCCGGCC
121CCCCTGGGCT ACTCCCAGGC TCTGGCCCAG GCTGTGGACT CCTACAACCA ACGGCCTGAG
181GTGCAGAATG CCTTCCGGCT GCTCAGCGCC GACCCCGAGC CCGGCCCGAA CGTCCAGCTG
241GGCTCCCTGC ACAACCTCAA CTTCACCATC ATAGAGACGC GGTGCCAGGC GCGCTCGGGC
301GCCCAGCTCG ACAGCTGCGA GTTCAAGGAG GACGGGCTCG TCAAGGACTG CGCTGCGCCC
361GTGGTGCTGC AAGGCGGCCG CGCCACGTTC GATGTCACCT GCGTGGAGTC CGTGGCTGAC
421CCTGTCCGCA TCAAGCGCTT CTGGCCAGTG GTCATCAGGA CTGTGGTTGC AGGATACAAC
481CTCTACCGGG CAATCAAGAA GAAATGAGCC ATCCCCAGAG CTGCTGTCAC CAATGTCCCC
541TTGCTGCTTT CCATCCAATA AAGGTGTTTC CCAGCCTAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA
601AAAAAAA
编码环颈雉cathelicidin成熟肽Pc-CATH1为第367-445位核苷酸，其氨基酸序列为：Arg1 Ile2 Lys3 Arg4 Phe5 Trp6 Pro7 Val8 Val9 Ile10 Arg11 Thr12 Val13 Val14 Ala15 Gly16 Tyr17 Asn18Leu19 Tyr20 Arg21 Ala22 Ile23 Lys24 Lys25 Lys26
3.权利要求1所述Pc-CATH1的化学合成方法，其特征在于根据编码环颈雉cathelicidin抗微生物肽基因推断的成熟肽Pc-CATH1氨基酸序列，用自动多肽合成仪合成其全序列；通过HPLC反相柱层析脱盐纯化，并确定其纯度大于95％；用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱测定其分子量。
4.权利要求2所述抗微生物肽Pc-CATH1基因的应用，其特征在于，合成的Pc-CATH1抗菌肽具有杀菌作用，溶于灭菌超纯水，用于药理活性检测。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 201010530926 CN102115496A (zh) | 2010-11-03 | 2010-11-03 | 一种抗微生物肽Pc-CATH1及其基因、化学合成方法和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 201010530926 CN102115496A (zh) | 2010-11-03 | 2010-11-03 | 一种抗微生物肽Pc-CATH1及其基因、化学合成方法和应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN102115496A true CN102115496A (zh) | 2011-07-06 |
Family
ID=44214435
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN 201010530926 Pending CN102115496A (zh) | 2010-11-03 | 2010-11-03 | 一种抗微生物肽Pc-CATH1及其基因、化学合成方法和应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN102115496A (zh) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103421100A (zh) * | 2012-05-22 | 2013-12-04 | 中国科学院动物研究所 | 一种抗菌肽及其制备方法和应用 |
| CN104761629A (zh) * | 2015-03-05 | 2015-07-08 | 大连理工大学 | 一种广谱高效抗微生物肽Pb-CATH-OH1及其基因、制备方法和应用 |
| CN105254736A (zh) * | 2015-09-02 | 2016-01-20 | 大连理工大学 | 源于缅甸蟒的cathelicidin家族广谱抗微生物肽Pb-CATH4及其基因、制备与应用 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101412753A (zh) * | 2008-09-27 | 2009-04-22 | 中国科学院昆明动物研究所 | 金环蛇抗菌肽cathelicidin-BF及其基因和应用 |
-
2010
- 2010-11-03 CN CN 201010530926 patent/CN102115496A/zh active Pending
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101412753A (zh) * | 2008-09-27 | 2009-04-22 | 中国科学院昆明动物研究所 | 金环蛇抗菌肽cathelicidin-BF及其基因和应用 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 《Developmental and Comparative Immunology》 20101026 Yipeng Wang, et al. Molecular cloning and characterization of novel cathelicidin-derived myeloid antimicrobial peptide from Phasianus colchicus 第35卷, 第3期 2 * |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103421100A (zh) * | 2012-05-22 | 2013-12-04 | 中国科学院动物研究所 | 一种抗菌肽及其制备方法和应用 |
| CN103421100B (zh) * | 2012-05-22 | 2015-11-18 | 中国科学院动物研究所 | 一种抗菌肽及其制备方法和应用 |
| CN104761629A (zh) * | 2015-03-05 | 2015-07-08 | 大连理工大学 | 一种广谱高效抗微生物肽Pb-CATH-OH1及其基因、制备方法和应用 |
| CN104761629B (zh) * | 2015-03-05 | 2017-12-26 | 大连理工大学 | 一种广谱高效抗微生物肽Pb‑CATH‑OH1及其基因、制备方法和应用 |
| CN105254736A (zh) * | 2015-09-02 | 2016-01-20 | 大连理工大学 | 源于缅甸蟒的cathelicidin家族广谱抗微生物肽Pb-CATH4及其基因、制备与应用 |
| CN105254736B (zh) * | 2015-09-02 | 2018-06-08 | 大连理工大学 | 源于缅甸蟒的cathelicidin家族广谱抗微生物肽Pb-CATH4及其基因、制备与应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Arockiaraj et al. | Crustin, a WAP domain containing antimicrobial peptide from freshwater prawn Macrobrachium rosenbergii: immune characterization | |
| Fan et al. | Ctriporin, a new anti-methicillin-resistant Staphylococcus aureus peptide from the venom of the scorpion Chaerilus tricostatus | |
| CN101412753A (zh) | 金环蛇抗菌肽cathelicidin-BF及其基因和应用 | |
| Zhuang et al. | Three new piscidins from orange-spotted grouper (Epinephelus coioides): Phylogeny, expression and functional characterization | |
| CN103665111B (zh) | 一种青环海蛇抗菌肽Hc-CATH的改造体HC-15及其制备方法和应用 | |
| Ntwasa et al. | Coleopteran antimicrobial peptides: prospects for clinical applications | |
| Arasu et al. | Bacterial membrane binding and pore formation abilities of carbohydrate recognition domain of fish lectin | |
| CN102190718B (zh) | 重组对虾蛋白sf-p9及制备方法和应用 | |
| Cui et al. | Identification and functional characterization of an uncharacterized antimicrobial peptide from a ciliate Paramecium caudatum | |
| CN104761629B (zh) | 一种广谱高效抗微生物肽Pb‑CATH‑OH1及其基因、制备方法和应用 | |
| Huo et al. | Molecular characterization, antibacterial activity and mechanism analyzation of three different piscidins from black rockfish, Sebastes schlegelii | |
| CN102115496A (zh) | 一种抗微生物肽Pc-CATH1及其基因、化学合成方法和应用 | |
| CN102816223B (zh) | 细鳞鱼Cathelicidin抗微生物肽CATH_BRALE及其基因、制备、应用 | |
| CN101845092A (zh) | 家畜驴的一种抗微生物肽Ea-CATH1及其基因和应用 | |
| CN102516382B (zh) | 一种海南湍蛙抗微生物肽Hainanenin-5及其基因、应用 | |
| CN104478996A (zh) | 一种新型阳离子抗菌肽及其应用 | |
| CN104910265B (zh) | 一种合江棘蛙抗菌肽及其编码序列的基因与应用 | |
| CN104910266A (zh) | 一种武夷湍蛙抗菌肽及其编码基因和应用 | |
| CN102796176B (zh) | 一种昆嵛林蛙抗菌肽Kunyuenin及其制备和应用 | |
| CN101724632B (zh) | 牛蛙皮肤活性肽及其基因和在制药中的应用 | |
| CN106749596A (zh) | 东方铃蟾生物活性肽、基因及其在制药中的应用 | |
| CN103467580B (zh) | 人工抗菌肽ma-d4的制备方法及其应用 | |
| CN105254736B (zh) | 源于缅甸蟒的cathelicidin家族广谱抗微生物肽Pb-CATH4及其基因、制备与应用 | |
| CN103936845A (zh) | 一种源于中华鳖的抗微生物肽及其基因、制备方法和应用 | |
| CN104119434B (zh) | 黑眶蟾蜍抗菌肽及其基因和应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Open date: 20110706 |