CN102229659A - 黑斑蛙抗菌肽及其基因和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种黑斑蛙抗菌肽及其基因和应用，属于生物医学技术领域。黑斑蛙抗菌肽是中国两栖类动物黑斑蛙基因编码的一种单链多肽，黑斑蛙抗菌肽是中国两栖类黑斑蛙抗菌肽基因编码的一种单链多肽，分子量1495.85道尔顿，等电点9.0，黑斑蛙抗菌肽全序列为：缬氨酸-异亮氨酸-脯氨酸-异亮氨酸-缬氨酸-丝氨酸-甘氨酸-亮氨酸-亮氨酸-丝氨酸-丝氨酸-亮氨酸-亮氨酸-甘氨酸-赖氨酸。其编码基因由333个核苷酸组成，其中编码成熟部分的为第142–186位核苷酸。人工合成的黑斑蛙抗菌肽具有很强的抗菌作用，同时其安全性高，并且还具有序列简单、合成方便的优点，可做为新型抗感染药物进行应用。
Description
技术领域
本发明提供一种黑斑蛙(Rana nigromaculata)抗菌肽及其基因和应用，属于生物医学技术领域。
背景技术
在中国的中药和民族医药中，许多两栖类动物被作为药用材料并被广泛的应用，如中华蟾蜍（Bufo gargarizans）、大蹼铃蟾（Bombina maxima）和黑斑蛙（Rana nigromaculata）等。这些两栖类动物的皮肤和内脏具有广泛的药理活性和临床疗效，已报道药理活性有广谱抗菌、抗肿瘤、抗病毒、镇痛、免疫调节等，具有生物医药产业开发的价值。目前也存在着一个主要的问题，就是在中药和民族医药中，药用材料是以整体的方式进行炮制及应用的，其成分的复杂性可能会造成药物活性成分不能更好发挥作用，因而从传统药物中寻找特定的活性单体物质是中药现代化的重要内容之一。
在国外，两栖类皮肤特定药理活性单体化合物的寻找已经成为新药发明的热点。如从非洲爪蟾（Xenopus laevis）体内分离的maganin具有强大的抗菌功能，目前已完成两个三期临床试验并取得较好结果，虽然未被美国食品与药品监督局批准上市，但其临床前研究仍在进行中。
我国对两栖类药物的应用有悠久的历史，但对其活性成分和药理性质的研究主要集中于生物碱等有机小分子，对其皮肤活性蛋白肽类物质的研究还较少。黑斑蛙是我国传统中药材的一种，广泛分布于东亚各地，其广泛分布可能与其适应环境能力较强有关，关于黑斑蛙抗菌肽的报道较少。
将本发明的黑斑蛙抗菌肽氨基酸全序列及其编码基因分别在蛋白质数据库和基因数据库进行比对搜索，均未发现有任何相同序列信息。
发明内容
本发明的目的是基于现有技术基础，提供一种新的具有强烈抗菌活性的黑斑蛙抗菌肽及其基因和应用。
黑斑蛙抗菌肽是中国两栖类黑斑蛙抗菌肽基因编码的一种单链多肽，分子量1495.85道尔顿，等电点9.0，黑斑蛙抗菌肽全序列为：缬氨酸-异亮氨酸-脯氨酸-异亮氨酸-缬氨酸-丝氨酸-甘氨酸-亮氨酸-亮氨酸-丝氨酸-丝氨酸-亮氨酸-亮氨酸-甘氨酸-赖氨酸。
黑斑蛙抗菌肽基因通过从黑斑蛙皮肤提取总RNA、反转录、设计引物及PCR方法筛选得到，扩增引物长度为23个核苷酸，其序列为5’–ATGTTCACCACAAAGAAATCCAT-3’，PCR另一扩增引物为逆转录过程中加入的接头引物，其序列为5’-TCGACGATTAGGCGGCCGACATGT-3’，将所获得的阳性单克隆进行基因核苷酸序列测定，基因测序结果表明编码黑斑蛙抗菌肽的基因由333个核苷酸组成，自5’端至3’端序列为:
atgttcacca tgaagaaatc cctcttactc cttttcttcc ttggaaccat caacttatct 60
ctctgtgagc aagagagaga tgccgatgag gaagaaagaa gagatgatcc atatgaaacg 120
gatactgaag tgcaaaaacg agttatacca attgtgtcag gtctgctctc tagtttgttg 180
gggaagtagc caaaaatttt gaaactttaa aaatggaaaa ggaaatcatc tgatgtgata 240
tatcatttag ctaaatgctc aacagatgtc ttataaaaaa taaataaata tgttgcatgc 300
gaaaaaaaaa aaaaaaaaag aaaaaaaaaa aaa 333
编码黑斑蛙成熟抗菌肽的序列为第145–186 位核苷酸，其编码的氨基酸序列为:Vla Ile Pro Ile Vla Ser Gly Leu Leu Ser Ser Leu Leu Gly Lys。
本发明采用自动多肽合成仪合成黑斑蛙抗菌肽全序列，通过HPLC反相C18柱层析脱盐、纯化后用HPLC方法鉴定其纯度，以基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）测定其精确分子量，并用自动氨基酸测序仪测定其氨基酸序列。
本发明的有益效果在于:
由黑斑蛙抗菌肽编码基因推导其氨基酸结构，采用自动多肽合成仪合成的黑斑蛙抗菌肽具有广谱抗菌活性，且无溶血作用。该黑斑蛙抗菌肽具有结构简单、人工合成方便、抗菌活性强、抗菌谱广和无明显副作用的特点。
具体实施方式
下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明的内容并不局限于此。
实施例1 ：黑斑蛙抗菌肽基因克隆
1、黑斑蛙皮肤总RNA提取：
A. 活体黑斑蛙用水清洗干净，放入液氮中速冻4小时，取皮肤组织，称重，取300mg皮肤组织，加入10ml总RNA提取缓冲液(Trizol溶液，美国Invitrogen公司产品 )，于20ml玻璃匀浆器中匀浆10分钟。
B.加入等体积酚/氯仿溶液，振荡混匀，室温放置10分钟，4℃，12000rpm离心10分钟，吸取上层水相液体。
C.上清液中加入1/2体积的异丙醇，室温放置10分钟，4℃下7500g离心10分钟，沉淀用75%乙醇洗一次，晾干，管底沉淀物即为黑斑蛙皮肤总RNA 。
2、黑斑蛙皮肤RNA逆转录合成cDNA第一链
黑斑蛙皮肤RNA逆转录合成cDNA第一链采用日本TAKARA公司的Reverse Transcriptase M-MLV (RNase Hˉ)试剂盒进行。
A.取黑斑蛙皮肤总RNA 500μg 溶于 500μl DEPC 水中待用。
B.在0.2ml 无菌无RNA酶的离心管加入1μl 黑斑蛙皮肤RNA、1μl逆转录引物（5’-TCGACGATTAGGCGGCCGACATGTTTTTTTTTTTTTCTTT-3’）及4ul DEPC水，混匀后70℃保温10分钟后迅速在冰上急冷5分钟。
C.瞬时离心使模板RNA/引物的变性溶液聚集于离心管底部。
D.加入2ul 5×M-MLV 缓冲液、0.5ul dNTP混合物（各10 mM）、0.25ul RNase Inhibitor（40 U/μl）、0.25ul RTase M-MLV（RNase Hˉ）（200 U/μl）和1ul DEPC水，42℃保温1小时后，70℃保温15分钟后冰上冷却，得到的cDNA溶液可直接用于黑斑蛙抗菌肽编码基因的扩增。
3、黑斑蛙抗菌肽编码基因的扩增
A.95℃预热PCR仪。
B.将2μl cDNA第一链（第2步骤中的产物）、75.5μl 去离子水、10μl PCR 缓冲液、8μl dNTP混合物（各2.5uM）、2μl 5’PCR引物(5’–ATGTTCACCACAAAGAAATCCAT-3’)、2μl 3’ PCR引物(5’-TCGACGATTAGGCGGCCGACATGT-3)以及0.5μl 大肠杆菌DNA聚合酶放入离心管中进行反应。
C.在PCR仪中按以下程序扩增：
(1) 预变性
95℃ 5分秒钟
(2) 25个循环：
95℃ 30 秒钟
56℃ 30秒钟
72℃ 30秒钟
(3) 后扩增
72℃ 5分钟
D.循环结束后，将PCR 产物用TIANGEN 公司的DNA产物纯化试剂盒进行抽提回收，步骤如下：
(1) 将PCR产物与等体积的膜结合缓冲液颠倒混匀，然后将混和液转入离心纯化柱，室温静置5分钟，使DNA充分与硅胶膜结合。12000 rpm 离心1分钟，倒掉收集管中的废液。
(2) 加入700 μl的漂洗液（含乙醇）于离心纯化柱中，12000 rpm 离心1分钟，倒掉收集管中的废液。
(3) 重复步骤（2）。
(4) 12000 rpm 离心3分钟。
(5) 将离心纯化柱置于新的离心管中。
(6) 加入30μl超纯水，在室温下静置5分钟。
(7) 12000 rpm离心1分钟，管底物即为纯化过的黑斑蛙抗菌肽编码基因PCR产物。
4、大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备：
（1）挑取单个DH5α菌落，接种于3m1不含氨苄青霉素的LB培养基中，37 ℃培养过夜，次日取上述菌液按比例1:100再接种于50m1 LB培养基中，37℃振荡2小时。当OD600值达到0.35时，收获细菌培养物。
（2）将细菌转移到一个50m1预冷的无菌聚丙烯管中，冰上放置10min，使培养物冷却。
（3）培养物于4℃下4100 rpm离心10min，吸出培养液，并将管倒置l min以使残留的培养基流尽。
（4）每50ml初始培养液用30ml预冷的0.1mol/L CaCl2-MgCl2溶液(80mmol/L MgCl2,20mmol/L CaCl2)重悬细胞沉淀。
（5）重悬液于4℃下4100 rpm离心10min，吸出上清液，并将管倒置l min以使残留的液体流尽。
（6）每50m1初始培养物用2m1预冷的0.1mol/L CaCl2溶液重悬细胞沉淀，分装后备用。
5、连接及连接产物的转化：
（1）在微量离心管中加入1 μl Takara pMD19-T simple载体、4μl黑斑蛙抗菌肽编码基因PCR产物及5 μl的连接酶缓冲混合物。
（2）16℃反应3 小时。
（3）全量（10 μl）加入至100μl DH5α感受态细胞中，冰中放置30分钟。
（4）42℃加热90秒钟后，再在冰中放置1分钟。
（5）加入37℃温浴过的LB培养基890μl，37℃缓慢振荡培养60分钟。
（6）取200μl涂布于含有X-Gal、IPTG、氨苄青霉素的LB培养基上，37℃培养16小时以形成单菌落。
6、黑斑蛙抗菌肽基因克隆筛选及鉴定：
挑取上述单菌落于含氨苄青霉素的LB培养基中，37℃缓慢振荡培养4小时，进行PCR扩增，扩增引物及扩增条件与前述黑斑蛙抗菌肽编码基因的扩增条件相同。将经PCR确证的阳性克隆进行质粒提取后，以美国Applied Biosystems3730A全自动核苷酸序列测定仪进行核苷酸序列的测定。测序引物为BcaBESTTM Sequencing Primer M13-47（5’ CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC 3’），基因测序结果自5’端至3’端序列为:
atgttcacca tgaagaaatc cctcttactc cttttcttcc ttggaaccat caacttatct 60
ctctgtgagc aagagagaga tgccgatgag gaagaaagaa gagatgatcc atatgaaacg 120
gatactgaag tgcaaaaacg agttatacca attgtgtcag gtctgctctc tagtttgttg 180
gggaagtagc caaaaatttt gaaactttaa aaatggaaaa ggaaatcatc tgatgtgata 240
tatcatttag ctaaatgctc aacagatgtc ttataaaaaa taaataaata tgttgcatgc 300
gaaaaaaaaa aaaaaaaaag aaaaaaaaaa aaa 333
黑斑蛙抗菌肽基因核苷酸的序列长度为333个碱基，序列类型：核酸；链数：单链；拓扑学：直链状；序列种类：cDNA；来源：黑斑蛙皮肤。
编码黑斑蛙成熟抗菌肽的序列为第142–186 位核苷酸，其氨基酸序列为:Vla Ile Pro Ile Vla Ser Gly Leu Leu Ser Ser Leu Leu Gly Lys。
实施例2 黑斑蛙抗菌肽的制备及药理实验
1、黑斑蛙抗菌肽的制备：
（1）黑斑蛙抗菌肽的制备方法：根据编码黑斑蛙抗菌肽的基因推导出黑斑蛙抗菌肽的氨基酸序列，用自动多肽合成仪合成其全序列，通过HPLC反相C18柱层析脱盐、纯化。
（2）纯化的黑斑蛙抗菌肽用高效液相色谱HPLC方法鉴定其纯度，并采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）测定其精确分子量，最后用自动氨基酸测序仪测定氨基酸序列结构以进行确证。
黑斑蛙抗菌肽是中国两栖类动物黑斑蛙基因编码的一种单链多肽，分子量1495.85道尔顿，等电点9.0，黑斑蛙抗菌肽全序列为：缬氨酸-异亮氨酸-脯氨酸-异亮氨酸-缬氨酸-丝氨酸-甘氨酸-亮氨酸-亮氨酸-丝氨酸-丝氨酸-亮氨酸-亮氨酸-甘氨酸-赖氨酸。
2、黑斑蛙抗菌肽的药理实验：
（1）抗菌活性检测
采用二倍稀释法进行最小抑制浓度（minimal inhibitory concentration, MIC）的检测，受试菌株为金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌和白假丝酵母菌。
三种菌株接种于LB固体培养基上，37℃培养箱中倒置培养。待菌落长出后，用接种环挑取单菌落转接到LB液体培养基中，37℃培养箱震荡培养至对数生长期。在紫外分光光度计上检测菌液OD600，根据1 OD600=1×109 CFU/ml将菌液用液体LB培养基稀释至2×105 CFU/ml。在无菌96孔板各孔中预先加入100 μl LB液体培养基，然后在第一孔中加入100 μl稀释到一定浓度的经0.22μm微孔滤膜过滤除菌的抗菌肽样品，混匀后取100 μl 加入第2孔，依次倍比稀释，从第10孔吸出100 μl弃去，至此二倍浓度梯度样品即制备好。各孔的浓度分别为320 ug/ml、160 ug/ml、80ug/ml、40 ug/ml、20 ug/ml、10 ug/ml、5 ug/ml、2.5 ug/ml 、1.25 ug/ml和0.625ug/ml。同时设立阴性对照和阳性对照。
以肉眼观察未见微生物生长浓度为最小抑制浓度。
（2）溶血活性检测
人静脉采血，将人静脉血与阿氏液按1:1比例混合置于离心管中，1000 rpm离心5 min，生理盐水洗涤至上清液不再呈红色为止。将已进行洗涤的红细胞加生理盐水稀释成107-108/ml浓度的悬浮液。上述稀释好的红细胞悬浮液与溶解于生理盐水的不同浓度的样品37℃保温30 min，再于1000 rpm离心5 min，上清液于540 nm测吸收值。阴性对照使用生理盐水，阳性对照使用Triton X-100。各孔的浓度分别为500ug/ml、400 ug/ml、300 ug/ml、200 ug/ml、100ug/ml和50 ug/ml。根据测得的吸光度值计算样品的溶血率。
从以上的抗菌和溶血活性实验结果显示，黑斑蛙抗菌肽对菌株均具有良好的抗菌活性，其中对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌和白假丝酵母菌的最小抑制浓度（MIC）分别为5ug/ml、2.5 ug/ml和5ug/ml，且在500 ug/ml浓度时仍没有明显的溶血活性。这表明黑斑蛙抗菌肽具有很强的抗菌作用，同时其安全性高，可做为新型抗菌药物进行应用。
Claims (4)
1.黑斑蛙抗菌肽是中国两栖类动物黑斑蛙基因编码的一种单链多肽，其特征是分子量1495.85道尔顿，等电点9.0，多肽氨基酸全序列为：缬氨酸-异亮氨酸-脯氨酸-异亮氨酸-缬氨酸-丝氨酸-甘氨酸-亮氨酸-亮氨酸-丝氨酸-丝氨酸-亮氨酸-亮氨酸-甘氨酸-赖氨酸。
2.权利要求1所述黑斑蛙抗菌肽的基因核苷酸序列，其特征在于：cDNA 由333 个核苷酸组成，其自5’端至 3’端序列为:
atgttcacca tgaagaaatc cctcttactc cttttcttcc ttggaaccat caacttatct 60
ctctgtgagc aagagagaga tgccgatgag gaagaaagaa gagatgatcc atatgaaacg 120
gatactgaag tgcaaaaacg agttatacca attgtgtcag gtctgctctc tagtttgttg 180
gggaagtagc caaaaatttt gaaactttaa aaatggaaaa ggaaatcatc tgatgtgata 240
tatcatttag ctaaatgctc aacagatgtc ttataaaaaa taaataaata tgttgcatgc 300
gaaaaaaaaa aaaaaaaaag aaaaaaaaaa aaa 333。
3.根据权利要求2所述的黑斑蛙抗菌肽基因核苷酸序列，其特征在于，第142–186位核苷酸编码黑斑蛙抗菌肽成熟序列，其氨基酸序列为：Vla Ile Pro Ile Vla Ser Gly Leu Leu Ser Ser Leu Leu Gly Lys。
4.权利要求1所述的黑斑蛙抗菌肽的应用，其特征是作为新型抗感染药物。
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