CN101845092A - 家畜驴的一种抗微生物肽Ea-CATH1及其基因和应用 - Google Patents

Abstract

一种家畜驴(Equus asinus)的微生物肽Ea-CATH1及其基因和在生物制药领域的应用，属于生物医学技术领域。Ea-CATH1是驴Cathelicidin基因编码的一种直链多肽，Ea-CATH1全序列为：赖氨酸-精氨酸-精氨酸-甘氨酸-丝氨酸-缬氨酸-苏氨酸-苏氨酸-精氨酸-酪氨酸-谷氨酰胺-苯丙氨酸-亮氨酸-甲硫氨酸-异亮氨酸-组氨酸-亮氨酸-亮氨酸-精氨酸-脯氨酸-赖氨酸-赖氨酸-亮氨酸-苯丙氨酸-丙氨酸。编码Ea-CATH1前体的基因由550个核苷酸组成，其中编码成熟肽部分的为第391-465位核苷酸。Ea-CATH1分子量更小、杀菌作用更强、更广谱，对多种临床耐药菌有非常强的杀灭作用。结构简单，不含有二硫键及环状结构，方便化学合成及基因工程制备。此外还具有无溶血性、及超强的血清稳定性等有益特点。

Description

家畜驴的一种抗微生物肽Ea-CATH1及其基因和应用

技术领域

本发明提供家畜驴(Equus asinus)的一种cathelicidin家族广谱抗微生物肽Ea-CATH1及其基因和应用，属于生物医学技术领域。

背景技术

Cathelicidin是一类由N端信号肽区域、中间保守cathelin结构域和C端高度特异的成熟肽区域构成的具有多功能的抗菌肽家族，在几乎所有种类的动物体内(哺乳类、鸟类、两栖类和鱼类)都有发现。与防御素(defensin)一样，Cathelicidin是包括人类在内的大多数脊椎动物所特有的宿主防御肽，构成了脊椎动物自然免疫反应的关键组分，是连接自然免疫和特异性免疫的桥梁。Cathelicidin具有广谱的抗菌活性，不仅对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、某些真菌以及病毒具有非常强的杀菌活性，而且对许多临床耐药细菌同样具有作用。除此之外，Cathelicidin还具有许多其他生物学活性，如对多种免疫细胞(中性粒细胞、单核细胞、肥大细胞和T细胞)具有趋化作用、诱导肥大细胞脱粒和组织胺释放、调节巨噬细胞转录、促进伤口愈合、诱导血管发生、诱导变异细胞系细胞凋亡和淋巴细胞活化等。Cathelicidin基因的缺失或异常表达都将导致人类严重疾病的发生。最新研究发现，***性红斑狼疮和牛皮癣的发病与人体内Cathelicidin LL-37的过度表达有关。由于具有如此众多的活性，Cathelicidin一直是国际上研究的热点。针对Cathelicidin的药用开发则蕴含着巨大的临床治疗药物制备价值。

由于近年来抗生素的滥用，导致致病性微生物耐药性的问题日益严重，在临床上已经出现了大量能够完全耐受青霉素等传统抗生素的微生物。Cathelicidin成熟肽表现抗微生物肽的典型特征：大多数Cathelicidin成熟肽分子量小于5000，中性pH条件下带净正电荷，缘于它们含有多个碱性氨基酸残基；富含疏水碱基，整体具有两亲性的拓扑结构。体外抗微生物测试中，大多数Cathelicidin成熟肽可以在微摩尔和亚微摩尔的浓度下快速杀死广泛的微生物。Cathelicidin抗微生物肽的杀菌机制是通过破坏细菌细胞膜的完整性介导的：通过静电相互作用吸引并结合到带负电的细菌细胞膜表面，进一步在细菌细胞膜上形成跨膜的孔洞，导致细菌细胞内容物的外泄，从而导致细菌细胞的死亡。而传统抗生素主要是作用于细菌细胞内的一些酶类。正是由于作用方式的不同，Cathelicidin介导的杀菌作用远远快于传统抗生素，并且不易产生耐药性。除此之外，越来越多的文献报道表明抗菌肽还具有其他的杀菌机制，如抑制细菌细胞壁合成、改变细菌细胞质膜抑制隔膜形成、激活自溶素、抑制细胞内酶活性、抑制DNA、RNA和蛋白质的合成等。

目前，国外有许多公司正在进行抗微生物肽的研究开发，已有多种抗菌肽进入临床试验阶段。如来源于人lactoferrin的hLF-1-1用于治疗骨髓干细胞移植相关的感染，已进入临床II期。来源于非洲爪蟾magainin的MSI-78对糖尿病患者的足部溃疡有显著疗效且副作用小，已进入临床III期试验阶段。来源于猪protegrin的IB-367用于***患者口腔溃疡，已进入临床I期试验。除此之外，一些用于伤口愈合，内毒素感染，肿瘤，病毒感染的抗菌肽也已进入临床试验阶段。

由于世界范围内对Cathelicidin的研究历史并不长，我国在此类活性多肽家族的研究还鲜有报道。家畜驴是我国本土养殖的具有多种经济价值的大牲畜之一，全国范围分布的大大小小的肉驴养殖场多达上千家。由于驴的饲养成本低，驴肉本身的营养价值高，所以驴肉生产是一项极具开发潜力的新型肉食品，此外，驴是具有较高药用价值的动物，肉用驴的皮经煎煮浓缩制成的固体胶称阿胶，又称驴皮胶，是我国的传统中药材。其肉、皮、骨、毛、蹄、***、脂肪和乳亦可以入药。然而，对其活性成分和药理性质的研究主要集中于有机小分子，对其活性蛋白肽类物质研究还尚未有报道。

本发明的家畜驴抗微生物肽Ea-CATH1分子量更小，比至今已经鉴定的大多数cathelicidins均小(如金环蛇cathelicidin-BF 30个氨基酸，鸡fowlicidin232个氨基酸等)。杀菌作用更强(相比较于传统抗生素氨苄青霉素和卡那霉素，及人cathelicidin LL-37)、更广谱，对多种临床耐药菌有非常强的杀灭作用。结构简单，不含有二硫键及环状结构。杀菌动力学数据显示其杀菌作用时间迅速、且对多种临床耐药菌有非常强的杀灭作用。此外还具有无溶血性、及超强的血清稳定性等有益特点。

发明内容

本发明提供一种在亚微摩尔剂量下即具有很强的抗微生物活性的家畜驴的一种抗微生物肽Ea-CATH1及其基因和应用。

为了实现本发明的目的，本发明提供了如下技术方案：

家畜驴抗微生物肽Ea-CATH1是驴Cathelicidin基因编码的一种直链多肽，含有25个氨基酸残基，理论等电点(pI)为12.02，理论分子量为3060.75，含有7个碱性氨基酸残基(4个精氨酸和3个赖氨酸)，无酸性氨基酸残基，静电荷为+7，说明它是一种碱性多肽。Ea-CATH1不含半胱氨酸，因此没有分子内和分子间二硫键，结构简单。

Ea-CATH1全序列为：赖氨酸-精氨酸-精氨酸-甘氨酸-丝氨酸-缬氨酸-苏氨酸-苏氨酸-精氨酸-酪氨酸-谷氨酰胺-苯丙氨酸-亮氨酸-甲硫氨酸-异亮氨酸-组氨酸-亮氨酸-亮氨酸-精氨酸-脯氨酸-赖氨酸-赖氨酸-亮氨酸-苯丙氨酸-丙氨酸。

基因测序结果表明编码家畜驴抗微生物肽Ea-CATH1前体cathelicidin的基因由550个核苷酸组成，自5’端至3’端序列为：

1   ATGGAGACCC AGAGGGACAG TTGTTCCCTG GGCTGGTGGT CACTGTTGCT ACTGCTACTG

61  GGCCTGATGA TCCCTCTGGC CACCACTCAG GCCCTCAGCT ACAAGGAGGC CGTACTCCGT

121 GCCGTGGATG GCCTCAACCA GTGGTCCTCA GATGAGAATC TCTACCGCCT CCTGGAGCTG

181 GACCCTCTGC CCAAGGGAGA CGAGGCCCCA GACACCCCAA AGCCTGTGAG CTTCACGGTC

241 AAGGAGACTG TGTGCCCCAG GACAACGCAG CAGCCACTGG AGCAGTGTGA CTTCAAGGAG

301 AATGGGCTGG TGAAACAGTG TGTGGGGACA GTCATCCTGG ACCCGGTTAA GGCCTCCGTT

361 GACATCGGTT GTGATGAGCC CCAGCGTGTC AAGAGACGCG GCTCGGTGAC TACTCGTTAC

421 CAGTTCCTGA TGATTCACCT TCTTCGACCT AAGAAGCTTT TCGCCTAGAA TCGGCTTGCC

481 CTGGCTTGGG CTTCTGGACT CTGAAAAATA AATTATGTGA AAGCCGCTTA AAAAAAAAAA

541 AAAAAAAAAA

编码家畜驴cathelicidin成熟肽Ea-CATH1为第391-465位核苷酸，其氨基酸序列为：Lys¹ Arg² Arg³ Gl^y4 Ser⁵ Val⁶ Thr⁷ Thr⁸ Arg⁹ Tyr¹⁰ Gln¹¹ Phe¹² Leu¹³ Met¹⁴ Ile¹⁵ His¹⁶ Leu¹⁷ Leu¹⁸Arg¹⁹ Pro²⁰ Lys²¹ Lys²² Leu²³ Phe²⁴ Ala²⁵

Ea-CATH1的化学合成方法：

根据编码家畜驴cathelicidin抗微生物肽基因推断的成熟肽Ea-CATH1氨基酸序列，用自动多肽合成仪(433A，Applied Biosystems)合成其全序列。通过HPLC反相柱层析脱盐纯化，并确定其纯度大于95％。用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF)测定其分子量。

家畜驴抗微生物肽Ea-CATH1合成的抗菌肽可以溶于灭菌超纯水，用于药理活性检测。

本发明的有益效果在于基因克隆得到编码家畜驴cathelicidin抗微生物肽基因，通过化学合成方法得到成熟肽Ea-CATH1。该抗微生物肽分子量更小、杀菌作用更强(相比较于传统抗生素氨苄青霉素和卡那霉素，及人cathelicidin LL-37)、更广谱，结构简单，不含有二硫键及环状结构，方便化学合成及基因工程制备。杀菌动力学数据显示其杀菌作用时间迅速、且对多种临床耐药菌有非常强的杀灭作用。此外还具有无溶血性、及超强的血清稳定性等有益特点。

具体实施方式

下面结合技术方案详细叙述本发明的具体实施例，但本发明的内容并不局限于此。

实施例1

家畜驴抗微生物肽Ea-CATH1前体基因的克隆及基因测序，包括：

采用RNeasy Mini Kit提取驴脾脏总RNA，利用

Reverse Transcriptase反转录合成cDNA第一链。设计两条特异性正向引物(P1、P2)和一条反向非特异性通用引物(CDSIII)，以单链cDNA为模板，采用半巢式PCR的方法扩增驴cathelicidin基因的cDNA。

正向P1：5′-GGACCATGGAGACCCAGAGG-3′；

正向P2：5′-ATGGAGACCCAGAGGGACAGTT-3′；

反向非特异性通用引物为CLONTECH公司Creator^TM SMART^TM cDNA LibraryConstruction Kit中的3’PCR Primer引物CDSIII，其序列为：5′-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATGT(30)N_-1N-3′(N＝A，G，C，or T；N_-1＝A，G，orC)。

所获阳性单克隆进行基因核苷酸序列测定，pMD19-T vector测序通用引物：

正向M 13F：5′-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3′；

反向M13R：5′-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3′；

具体步骤如下：

第一步、驴脾脏总RNA提取(以下实验所用器具和试剂均经过处理，无RNase)：

A.从新鲜宰杀的驴各种新鲜组织上分别剪下1g左右的小块，分别放入液氮预冷的细胞冻存管中，然后迅速放入液氮中保存并带回实验室；

B.将保存在液氮中的组织材料取出，放入预冷的研钵内，迅速充分研磨，期间不断向研钵内加入少许液氮；将大约30mg的组织粉末转移至预冷的1.5ml离心管中，向其中分别加入600μl Buffer RLT(裂解液，RNeasy Mini Kit提供)，迅速震荡混匀，室温放置20min后，4℃，12000rpm离心5min；

C.将离心后的上清转移至新的1.5ml离心管中，分别加入等体积的70％乙醇，迅速吸打混匀；将混合液分别转移至离心吸附柱，室温，12000rpm离心15s；弃废液，然后加入700μlBuffer RW1(漂洗液)，4℃，12000rpm离心15s；弃废液，加入500μl Buffer RPE(去蛋白液)，4℃，12000rpm离心15s；弃废液，加入500μl Buffer RPE(去蛋白液)，4℃，12000rpm离心2min；将离心吸附柱转移至新的1.5ml离心管中，然后直接向吸附膜上滴加35μl RNase free water，室温，12000rpm离心1min；

第二步、cDNA第一链的合成(mRNA反转录)

A.在新的0.2ml PCR管(无DNase和RNase)中配制下列混合液：

模板RNA                                 1μg

Oligo dT Primer(50μM)                  1μl

dNTP Mixture(10mM each)                 1μl

RNase free ddH2O补充至10μl，混匀后，短暂离心；PCR仪中65℃保温5min后，迅速在冰上急冷2min；短暂离心后，在上述管中配制如下反转录反应液：

上述混合液                                10μl

5×PrimeScript Buffer                     4μl

RNase Inhibitor(40U/μd)                  0.5μl

Reverse Transcriptase(200U/μl)            0.5μl

RNase free dH2O补充至20μl体系，混匀后，短暂离心；在PCR仪中完成以下程序：42℃，60min；70℃，15min；4℃，保存。cDNA保存于-80℃。

第三步、采用半巢式PCR进行驴cathelicidin的基因克隆筛选

引物使用前先12000rpm离心5min，然后根据标明的摩尔数加入相应体积的ddH₂O溶解至20μM的浓度。以合成的脾脏cDNA单链为模板，以P1和CDSIII为引物，进行第一次PCR扩增。在0.2ml PCR管中加入下列试剂(总体积20μl)：

ddH2O                                8μl

cDNA单链模板                         1μl

正向引物P1(20μM)                    0.5μl

反向引物CDSIII(20μM)                0.5μl

2×Pfu PCR MasterMix                 10μl

混匀后，短暂离心。PCR条件为：94℃变性1min；20个循环：94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min；72℃延伸10min；4℃保存。反应结束后，取5μl产物于1％琼脂糖凝胶电泳检测目的条带。

取上步PCR产物1μl加入99μl ddH₂O稀释100倍作为模板，以P2和CDSIII为引物，进行第二次PCR扩增。在0.2mlPCR管中先后加入下列试剂(总体积20μl)：

ddH2O                                7μl

一次PCR产物稀释液模板                1μl

正向引物P2(20μM)                    1μl

反向引物CDS III(20μM)               1μl

2×Pfu PCR MasterMix                 10μl

PCR条件为：94℃变性5min；25个循环：94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min；72℃延伸10min；4℃保存。反应结束后，取5μl，1％琼脂糖凝胶电泳检测目的条带。

扩增完成后用胶回收试剂盒(天根生物)进行目的片段回收。将回收的目的DNA片段与测序载体pMD19-T vector连接，转化进CaCl₂-MgCl₂法制备好的DH5α感受态细胞。取100μl转化菌液均匀涂布在含有100μlg/ml氨苄青霉素(Amp)的LB琼脂培养基平板上；表面晾干后，放在37℃恒温培养箱中倒置培养12-16h。挑取单菌落用M13引物PCR检测***片段大小。挑取阳性菌落，摇菌提取质粒，使用Applied Biosystems DNA sequencer，model ABIPRISM 377进行核苷酸测序。

第四步、驴cathelicidin的基因序列测定和结果：

基因测序结果表明编码家畜驴抗微生物肽Ea-CATH1前体cathelicidin的基因由550个核苷酸组成，自5’端至3’端序列为：

1   ATGGAGACCC AGAGGGACAG TTGTTCCCTG GGCTGGTGGT CACTGTTGCT ACTGCTACTG

61  GGCCTGATGA TCCCTCTGGC CACCACTCAG GCCCTCAGCT ACAAGGAGGC CGTACTCCGT

121 GCCGTGGATG GCCTCAACCA GTGGTCCTCA GATGAGAATC TCTACCGCCT CCTGGAGCTG

181 GACCCTCTGC CCAAGGGAGA CGAGGCCCCA GACACCCCAA AGCCTGTGAG CTTCACGGTC

241 AAGGAGACTG TGTGCCCCAG GACAACGCAG CAGCCACTGG AGCAGTGTGA CTTCAAGGAG

301 AATGGGCTGG TGAAACAGTG TGTGGGGACA GTCATCCTGG ACCCGGTTAA GGCCTCCGTT

361 GACATCGGTT GTGATGAGCC CCAGCGTGTC AAGAGACGCG GCTCGGTGAC TACTCGTTAC

421 CAGTTCCTGA TGATTCACCT TCTTCGACCT AAGAAGCTTT TCGCCTAGAA TCGGCTTGCC

481 CTGGCTTGGG CTTCTGGACT CTGAAAAATA AATTATGTGA AAGCCGCTTA AAAAAAAAAA

541 AAAAAAAAAA

家畜驴抗菌肽cathelicidin的基因核苷酸的序列表为：序列长度为550个碱基，序列类型：核酸，链数：单链，拓扑学：直链状，序列种类：cDNA，来源：家畜驴脾脏。

编码家畜驴cathelicidin成熟肽Ea-CATH1为第391-465位核苷酸，其氨基酸序列为：Lys¹ Arg² Arg³ Gly⁴ Ser⁵ Val⁶ Thr⁷ Thr⁸ Arg⁹ Tyr¹⁰ Gln¹¹ Phe¹² Leu¹³ Met¹⁴ Ile¹⁵ His¹⁶ Leu¹⁷ Leu¹⁸Arg¹⁹ Pro²⁰ Lys²¹ Lys²² Leu²³ Phe²⁴ Ala²⁵

实施例2

Ea-CATH1的化学合成方法：

I、根据编码家畜驴cathelicidin抗微生物肽基因推断的成熟肽Ea-CATH1氨基酸序列，用自动多肽合成仪(433A，Applied Biosystems)合成其全序列，通过HPLC反相柱层析脱盐纯化。

II、分子量测定采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF)。

实施例3

家畜驴抗微生物肽Ea-CATH1的药理实验：

1.Ea-CATH1抗菌活性检测：

将化学合成的Ea-CATH1以2mg/ml的浓度溶解在无菌超纯水中；用接种环挑取新活化的微生物，然后均匀涂布在新的LB琼脂板上；将直径0.5cm的圆形无菌滤纸片放在上述琼脂板上，然后向纸片上滴加10μl Ea-CATH样品溶液；放入37℃恒温培养箱中培养12-24h；观察抑菌圈形成与否，将对Ea-CATH1敏感的菌株记录下来。

2.Ea-CATH1对敏感菌株最小抑菌浓度(Minimum Inhibitory Concentration，MIC)的测定。该实验以人cathelicidin LL-37、传统抗生素氨苄青霉素和卡那霉素作阳性对照，无菌液体LB作阴性对照；最小抑菌浓度的定义为肉眼可以观察到的完全抑制微生物生长的最低多肽浓度，或者是光吸收值不高于阴性对照5％的最低浓度。

挑取新活化的微生物，接种至无菌液体LB培养基，37℃恒温振荡器中200rpm培养10-16h至对数生长期；用分光光度计测菌液600nm光波处的吸光值，吸光值为1时，浓度大约为10⁹cfu/ml，将菌液用无菌液体LB培养基稀释至10⁶cfu/ml；在96微孔板上配制浓度梯度为200μg/ml、100μg/ml、50μg/ml、25μg/ml、12.5μg/ml、6.25μg/ml、3.13μg/ml、1.56μg/ml、0.78μg/ml、0.39μg/ml、0.20μg/ml的经0.22μm孔径膜过滤的Ea-CATH1样品溶液，每孔50μl；每孔加入50μl上述稀释菌液；在恒温振荡器中37℃，100rpm振荡培养10-16h；使用酶标仪测600nm吸光值或肉眼观察；上述实验重复3次，取平均值。

由表1可见，Ea-CATH1对测试的微生物具有广谱的抗菌活性，特别是对临床分离的耐药性菌株。与氨苄青霉素、卡那霉素和LL-37的最小抑菌浓度值相比，Ea-CATH1拥有更强的抗菌效力。在全部32株菌株中，革兰氏阳性菌(G+)与革兰氏阴性菌(G-)及真菌相比，G+对Ea-CATH1更加敏感，最小抑菌浓度大多在0.6-4.7μg/ml范围内。Ea-CATH1甚至对耐全部常规抗生素的菌株亦有强大的杀菌效果，如对屎肠球菌IS091299的最小抑菌浓度浓度为9.4μg/ml。Ea-CATH1对金黄色葡萄球菌ATCC2592和溶血葡萄球菌IS092401(DRa)的抗菌活性最强，最小抑菌浓度皆为0.6μg/ml；对金黄色葡萄球菌(IS)和星形诺卡菌的最小抑菌浓度皆为1.2μg/ml。此外，Ea-CATH1还具有非常强的抗真菌活性，对白色念珠菌ATCC2002和黏液菌的最小抑菌浓度分别达到9.4μg/ml和4.7μg/ml。不仅如此，Ea-CATH1对一种困扰全世界大量人口，可引起面部严重痤疮的痤疮丙酸杆菌，也显示出了极强的抗菌活性，最小抑菌浓度仅为4.7μg/ml。

表1Ea-CATH1的最小抑菌浓度(MIC)

^*MIC：最小抑菌浓度，浓度值为3次重复实验的平均值；LL-37：人cathelicidin，Amp：氨苄青霉素，Kana：卡那霉素；ND：2mg/ml剂量纸片抑菌试验无明显活性；＞100：2mg/ml剂量纸片抑菌试验有抑菌圈，100μg/ml剂量无抑菌活性；IS：临床分离菌株，Dra：耐头孢他啶、头孢哌酮和氨曲南，DRb：耐复方新诺明、红霉素、环丙沙星和青霉素。以上结果为三次独立重复实验平均值。

3.Ea-CATH1杀菌动力学测定：

该实验分别选用金黄色葡萄球菌ATCC2592(G+)和鲍式不动杆菌(IS7178)(G-)两种菌株进行测试；阴性对照是无菌去离子水，阳性对照是氨苄青霉素Amp。

挑取新活化的细菌单克隆，接种至新鲜无菌液体LB培养基，35℃，200rpm振荡培养10-16h，至对数生长期；测定菌液浓度，稀释至10⁶cfu/ml；向菌液中加入多肽样品，分别至终浓度1、5、10倍MIC，然后35℃，100rpm振荡培养；以加入多肽开始计时，分别在0min、10min、30min、1h、1.5h、2h、3h和6h时间点各取1μl菌液，稀释1000倍；分别取50μl稀释菌液涂板；37℃倒置培养10-16h；菌落计数。结果如表2所示。

表2Ea-CATH1的杀菌动力学

注：CFU：菌落形成单位；×1MIC，×5MIC和×10MIC：1、5和10倍相应的MIC；MIC¹：0.6μg/ml；MIC²：2.4μg/ml；MIC³：4.7μg/ml。

如表2中所示，Ea-CATH1比Amp以更快的动力学发挥抗菌活性。10倍最小抑菌浓度的Ea-CATH1，可以在0.5小时内迅速杀死全部金黄色葡萄球菌(Amp需要2小时)；5倍最小抑菌浓度的Ea-CATH1需要1小时(Amp需要3小时)；1倍最小抑菌浓度的Ea-CATH1需要2小时(Amp需要6小时)。证明Ea-CATH1对金黄色葡萄球菌ATCC2592的抗菌活性是致死性的。经过上述浓度Ea-CATH1处理2小时后的金黄色葡萄球菌，不能在琼脂平板上恢复生长。相比之下，常规Amp不能在2小时内完全清除细菌。

4.Ea-CATH1的血清稳定性

该实验以人血清作阴性对照。制备人血清：取人5ml新鲜血液，37℃静置1h；4℃放置8-16h；4℃，4000rpm离心20min；小心吸出上层的血清，转移至无菌的1.5ml离心管中。

取900μl血清，加入100μl 10mg/ml的Ea-CATH1样品，混匀后37℃温育，分别在0h、3h、6h、12h、24h、36h、48h、60h和72h时取出少许混合样品，测定其对金黄色葡萄球菌(IS)的MIC。

表3Ea-CATH1在人血清中的稳定性

血清稳定性实验结果显示(表3)，Ea-CATH1在与人血清共孵育12小时后，MIC相比孵育前没有任何降低，相反可能由于血清内离子浓度或蛋白的影响，导致其结构上的改变(螺旋结构增多)，从而使孵育初期的抗菌能力比在水中增加了一倍；24-48小时之间，血清中的Ea-CATH1抗菌能力只有稍微的下降；在72小时后，Ea-CATH1对金黄色葡萄球菌(IS)的仍保留了很强的抗菌能力(MIC 9.4μg/ml)。

5.Ea-CATH1的溶血活性分析

该实验以1％Triton X-100作阳性对照，以生理盐水作阴性对照。制备红细胞：取1ml人血，置于15ml离心管中，加入10ml生理盐水，混匀后2000rpm离心5min，用生理盐水重悬，重复离心至上清液不呈红色为止；用1ml生理盐水重悬红细胞沉淀，取少量重悬液加入小烧杯中，用生理盐水稀释至呈微红色；每种测试样品制备1000μl体系：

10μl多肽样品+990μl红细胞稀释液                Ea-CATH1(终浓度为20μg/ml)

10μl 1‰Triton X-100+990μl红细胞稀释液        阳性对照

10μl生理盐水+990μl红细胞稀释液                阴性对照

Ea-CATH1和阴、阳性对照各做3个重复体系。37℃温育30min，3000rpm离心5min；收集上清200μl，分别测540nm处光吸收值，计算3个重复的平均值；溶血率＝(样品540nm光吸收值-阴性对照)×100％/(阳性对照-阴性对照)。

实验结构表明，在20μg/ml剂量下的Ea-CATH1对人血红细胞的溶血率仅为1.8％；该剂量是多数最小抑菌浓度的10-30倍。

序列表

<110>National Center for Biotechnology Information

<120>dut2010082001

<130>dut2010082001

<160>1

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>1956

<212>家畜驴抗微生物肽Ea-CATH1前体cathelicidin的基因序列

SEQ ID NO：1

1   ATGGAGACCC AGAGGGACAG TTGTTCCCTG GGCTGGTGGT CACTGTTGCT ACTGCTACTG

61  GGCCTGATGA TCCCTCTGGC CACCACTCAG GCCCTCAGCT ACAAGGAGGC CGTACTCCGT

121 GCCGTGGATG GCCTCAACCA GTGGTCCTCA GATGAGAATC TCTACCGCCT CCTGGAGCTG

181 GACCCTCTGC CCAAGGGAGA CGAGGCCCCA GACACCCCAA AGCCTGTGAG CTTCACGGTC

241 AAGGAGACTG TGTGCCCCAG GACAACGCAG CAGCCACTGG AGCAGTGTGA CTTCAAGGAG

301 AATGGGCTGG TGAAACAGTG TGTGGGGACA GTCATCCTGG ACCCGGTTAA GGCCTCCGTT

361 GACATCGGTT GTGATGAGCC CCAGCGTGTC AAGAGACGCG GCTCGGTGAC TACTCGTTAC

421 CAGTTCCTGA TGATTCACCT TCTTCGACCT AAGAAGCTTT TCGCCTAGAA TCGGCTTGCC

481 CTGGCTTGGG CTTCTGGACT CTGAAAAATA AATTATGTGA AAGCCGCTTA AAAAAAAAAA

541 AAAAAAAAAA

Claims (3)

1.家畜驴的一种抗微生物肽Ea-CATH1，是驴Cathelicidin基因编码的一种直链多肽，其特征是其全序列为：赖氨酸-精氨酸-精氨酸-甘氨酸-丝氨酸-缬氨酸-苏氨酸-苏氨酸-精氨酸-酪氨酸-谷氨酰胺-苯丙氨酸-亮氨酸-甲硫氨酸-异亮氨酸-组氨酸-亮氨酸-亮氨酸-精氨酸-脯氨酸-赖氨酸-赖氨酸-亮氨酸-苯丙氨酸-丙氨酸。

2.权利要求1所述家畜驴抗微生物肽Ea-CATH1的基因，其特征在于编码家畜驴抗微生物肽Ea-CATH1前体cathelicidin的基因由550个核苷酸组成，自5’端至3’端序列为：

  1 ATGGAGACCC AGAGGGACAG TTGTTCCCTG GGCTGGTGGT CACTGTTGCT ACTGCTACTG

 61 GGCCTGATGA TCCCTCTGGC CACCACTCAG GCCCTCAGCT ACAAGGAGGC CGTACTCCGT

121 GCCGTGGATG GCCTCAACCA GTGGTCCTCA GATGAGAATC TCTACCGCCT CCTGGAGCTG

181 GACCCTCTGC CCAAGGGAGA CGAGGCCCCA GACACCCCAA AGCCTGTGAG CTTCACGGTC

241 AAGGAGACTG TGTGCCCCAG GACAACGCAG CAGCCACTGG AGCAGTGTGA CTTCAAGGAG

301 AATGGGCTGG TGAAACAGTG TGTGGGGACA GTCATCCTGG ACCCGGTTAA GGCCTCCGTT

361 GACATCGGTT GTGATGAGCC CCAGCGTGTC AAGAGACGCG GCTCGGTGAC TACTCGTTAC

421 CAGTTCCTGA TGATTCACCT TCTTCGACCT AAGAAGCTTT TCGCCTAGAA TCGGCTTGCC

481 CTGGCTTGGG CTTCTGGACT CTGAAAAATA AATTATGTGA AAGCCGCTTA AAAAAAAAAA

541 AAAAAAAAAA

编码家畜驴cathelicidin成熟肽Ea-CATH1为第391-465位核苷酸，其氨基酸序列为：Lys¹ Arg² Arg³ Gly⁴ Ser⁵ Val⁶ Thr⁷ Thr⁸ Arg⁹ Tyr¹⁰ Gln¹¹ Phe¹² Leu¹³ Met¹⁴ Ile¹⁵ His¹⁶ Leu¹⁷ Leu¹⁸Arg¹⁹ Pro²⁰ Lys²¹ Lys²² Leu²³ Phe²⁴ Ala²⁵。

3.权利要求2所述家畜驴抗微生物肽Ea-CATH1基因的应用，其特征在于，家畜驴抗微生物肽Ea-CATH1合成的抗菌肽具有杀菌作用，溶于灭菌超纯水，用于药理活性检测。