CN103756931B - 一株克里本类芽孢杆菌及其应用 - Google Patents
一株克里本类芽孢杆菌及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一株克里本类芽孢杆菌及其菌剂的制备方法和应用。本发明所提供的克里本类芽孢杆菌，其拉丁名为Paenibacillus kribbensis，菌种代号为TRCC82001，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号为：CGMCCNo.7996。本菌株生产性状好，代谢产物抑菌效果好；同时对水稻稻瘟病、纹枯病抑菌活性强，发酵液经无菌处理后稀释100倍对水稻稻瘟病、纹枯病的抑制效果均在80％以上。而且，该菌株及其代谢产物抑菌谱广，可用于制备广谱性抑制病原真菌的生防制剂，防治植物真菌病害。
Description
技术领域
本发明属于生物技术防治领域，具体涉及一株克里本类芽孢杆菌(Paenibacilluskribbensis)及其菌剂的制备和在抑制病原真菌与防治植物真菌病害中的应用。
背景技术
植物病害是现代农业生产中，对植物产量产生影响的因素，据FAO资料，全世界每年因植物遭受病害侵袭导致的损失占作物生产总量的10％-15％，随着农业种植产业结构的调整，农作物病害的控制与防治越来越为人们所重视。植物病原真菌引起的植物病害为植物三大病害之首，占所有植物病害的70％。一些农作物主要发生的病害如水稻稻瘟病、水稻纹枯病；小麦锈病、小麦白粉病；玉米大、小斑病、纹枯病；蔬菜霜霉病等，以及农作物采收后和贮存期发生的病害多为真菌性病害。长期以来，防治植物病害所使用的农药大多是化学杀菌剂，且杀菌剂品种单一，植物病原菌对不少品种已产生了严重的抗性。此外，由于长期大量使用少数几种杀菌剂，致使土壤中农药残毒积累，导致环境污染，破坏了土壤和植物体内的微生物平衡，使得植物病害发生更为频繁，甚至影响人类的身体健康。因此迫切需要开发具有不同作用机理的、结构新颖、安全有效环保的杀菌剂，尤其是“无公害食品”生产的生物源杀菌剂。
克里本类芽孢杆菌(Paenibacillus kribbensis)属于原核生物界，厚壁菌门，杆菌纲，芽孢杆菌目，芽孢杆菌科，类芽孢杆菌属。通过研究发现该菌株在培养过程中能产生胞外抑菌物，对供试的13种植物病原真菌都有抑生长活性，抗菌谱广，对稻瘟病、水稻纹枯病病原菌较为敏感，是一株具有研究和开发应用前景的生防菌株。关于克里本类芽孢杆菌的抗真菌生物活性物质的研究报道较少。本发明报道了一株具有农用生物活性的克里本类芽孢杆菌。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一株新的克里本类芽孢杆菌，该菌株经过发酵后产生具有强烈地、广谱地抑制病原真菌的活性代谢产物，该菌株及其活性代谢产物可用于制备广谱抑制病原真菌的生防制剂，用于防治植物真菌病害。
本发明所提供的克里本类芽孢杆菌菌株是(Paenibacillus kribbensis)TRCC82001，菌株于2013年8月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号为：CGMCC No.7996。
本发明另提供一种生防制剂，该生防制剂的活性成分为所述的克里本类芽孢杆菌(Paenibacillus kribbensis)TRCC82001CGMCC No.7996的代谢产物，或／和所述克里本类芽孢杆菌(Paenibacillus kribbensis)TRCC82001CGMCC No.7996。所述的代谢产物是从克里本类芽孢杆菌(Paenibacillus kribbensis)TRCC82001CGMCC No.7996的菌体发酵液中获得。
本发明中所述的生防制剂分为三种：生防制剂1，菌体与代谢物的混合制剂，是所述克里本类芽孢杆菌(Paenibacillus kribbensis)TRCC82001CGMCC No.7996的发酵液，内含有述克里本类芽孢杆菌(Paenibacillus kribbensis)TRCC82001CGMCC No.7996菌体及其代谢物；生防制剂2，菌体，是所述克里本类芽孢杆菌(Paenibacillus kribbensis)TRCC82001CGMCC No.7996的菌体，包括营养体和芽孢；生防制剂3，代谢产物，是所述克里本类芽孢杆菌(Paenibacillus kribbensis)TRCC82001CGMCC No.7996的无菌发酵液。
本发明的所述的生防制剂具体按照以下A)或B)的方法获得：
A)将所述克里本类芽孢杆菌(Paenibacillus kribbensis)TRCC82001CGMCCNo.7996用改良的固体察氏培养基II活化后挑取单菌落或菌苔接种到装量为摇瓶20％-30％体积的改良的液体察氏培养基II中。30摄氏度，180r／min振荡培养84小时，所获得的发酵液即为所述生防制剂1。
B)将所述克里本类芽孢杆菌(Paenibacillus kribbensis)TRCC82001CGMCCNo.7996用改良的固体察氏培养基II活化后挑取单菌落或菌苔接种到装量为摇瓶20％-30％体积的改良的液体察氏培养基II中。30摄氏度，180r／min振荡培养84小时，将所获得的发酵液进行离心分离，获得上清液与固体沉淀。所获得的固体即为所述生防制剂2；上清液经灭菌即为所述生防制剂3。
所述改良的察氏培养基II配方如下：
加无菌水定量至100％，如若是固体培养基则加入1.5-2％的琼脂，pH7-8。
所述生防制剂为下述1)-2)中的任一生防制剂：
1)用于防治植物真菌病害的生防制剂；
2)用于抑制病原真菌的生防制剂。
所述的克里本类芽孢杆菌(Paenibacillus kribbensis)TRCC82001CGMCCNo.7996在制备下述1)-2)中任一生防制剂中的应用也属于本发明的保护范围：
1)用于防治植物真菌病害的生防制剂；
2)用于抑制病原真菌的生防制剂。
上述生防制剂和生防制剂的应用中，所述病原真菌为下述中至少一种：稻瘟病(Phyricularia grisea(Cooke)Sacc.)、水稻纹枯病(Thanatephorus cucumeris(Frank)Donk)、小麦根腐病(Drechslera SoFokiniana(Sacc.)Subram.Gain)、荔枝炭疽病(Colletotrichum litchi)、玉米大斑病菌(Exerohilum turcicum)、玉米小斑病菌(Helminthosporium maydis)、玉米黄斑病菌(Curvularia lunata)、玉米基茎腐病菌(Fusarium graminearum)、棉花黄萎病菌(Verticillium dahliae)、西瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.niveum)、辣椒炭疽病菌(Colletotrichum capsici)、白菜黑斑病菌(Alternaria brassicae(Berk.)Sace.)、葱紫斑病菌(Alternaria porri(Ell.)Cifferri)。
在本发明的一个实施例中，所述的植物真菌病害为水稻稻瘟病，病原菌为灰梨孢(Phyricularia grisea(Cooke)Sacc.)；所述植物为水稻，所述水稻品种为欣荣优08。
所述生防制剂的制备方法也属于本发明的保护范围。制备方法如下：将所述的克里本类芽孢杆菌(Paenibacillus kribbensis)TRCC82001CGMCC No.7996的代谢产物，或／和所述克里本类芽孢杆菌(Paenibacillus kribbensis)TRCC82001CGMCC No.7996做为活性成份，获得所述的生防制剂。所述的代谢产物是从克里本类芽孢杆菌(Paenibacilluskribbensis)TRCC82001CGMCC No.7996的菌体发酵液中获得。
本发明的所述的生防制剂具体按照以下A)或B)的方法获得：
A)将所述克里本类芽孢杆菌(Paenibacillus kribbensis)TRCC82001CGMCCNo.7996用改良的固体察氏培养基II活化后挑取单菌落或菌苔接种到装量为摇瓶20％-30％体积的改良的液体察氏培养基II中，30摄氏度，180r／min振荡培养84小时，所获得的发酵液即为所述生防制剂1。
B)将所述克里本类芽孢杆菌(Paenibacillus kribbensis)TRCC82001CGMCCNo.7996用改良的固体察氏培养基II活化后挑取单菌落或菌苔接种到装量为摇瓶20％-30％体积的改良的液体察氏培养基II中。30摄氏度，180r／min振荡培养84小时，将所获得的发酵液进行离心分离，获得上清液与固体沉淀。所获得的固体即为所述生防制剂2；上清液经灭菌即为所述生防制剂3。
所述改良的察氏培养基II配方如下：
加无菌水定量至100％，如若是固体培养基则加入1.5-2％的琼脂，pH7-8。
本发明所提供的克里本类芽孢杆菌(Paenibacillus kribbensis)TRCC82001CGMCC No.7996具有如下优点：
1、本发明所提供的克里本类芽孢杆菌(Paenibacillus kribbensis)TRCC82001CGMCC No.7996及其无菌发酵液具有强烈的广谱抗菌活性，对稻瘟病(Phyricularia grisea(Cooke)Sacc.)、水稻纹枯病(Thanatephorus cucumeris(Frank)Donk)、小麦根腐病(Drechslera SoFokiniana(Sacc.)Subram.Gain)、荔枝炭疽病(Colletotrichum litchi)、玉米大斑病菌(Exerohilum turcicum)、玉米小斑病菌(Helninthosporium maydis)、玉米黄斑病菌(Curvularia lunata)、玉米基茎腐病菌(Fusarium graminearum)、棉花黄萎病菌(Verticillium dahliae)、西瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporumf.sp.niveum)、辣椒炭疽病菌(Colletotrichum capsici)、白菜黑斑病菌(Alternaria brassicae(Berk.)Sace.)、葱紫斑病菌(Alternaria porri(Ell.)Cifferri)效果突出。
2、本发明所提供的克里本类芽孢杆菌(Paenidacillus kribbensis)TRCC82001CGMCC No.7996的生防制剂2、生防制剂3在水稻稻瘟病的田间试验中，防治效果优于对照药剂1000亿活芽孢／克枯草芽孢杆菌可湿性粉剂20克／亩、250克／升嘧菌酯悬浮剂30毫升／亩。克里本类芽孢杆菌(Paenibacillus kribbensis)TRCC8200l CGMCC No.7996的生防制剂1在水稻稻瘟病的田间试验中防治效果达84.92％。
3、本发明所提供的克里本类芽孢杆菌(Paenibacillus kribbensis)TRCC82001CGMCC No.7996的无菌发酵能经受121摄氏度20分钟的高温处理，仍能保持强烈的抑菌活性。
4、本发明所提供的克里本类芽孢杆菌(Paenibacillus kribbensis)TRCC82001CGMCC No.7996的活性成份制备的三种生防制剂贮藏期长，室温下贮藏二年仍能保持强烈的抑菌活性，这为生物制剂的开发应用提供了良好的依据。
保藏说明
菌株名称：克里本类芽孢杆菌
拉丁名：(Paenibacillus kribbensis)
菌株编号：TRCC82001
保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏机构简称：CGMCC
地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏日期：2013年8月13日
保藏中心登记入册编号：CGMCC No.7996
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法若无特殊说明，均为常规方法。所用的材料、试剂等，若无特殊说明，均可从商业途径获得。
供试菌株：
稻瘟病(Phyricularia grisea(Cooke)Sacc.)：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌株库藏号CGMCC3.3283.
水稻纹枯病(Thanatephorus cucumeris(Frank)Donk)：中国工业微生物菌种保藏中心，菌株库藏号CCAM041076.
小麦根腐病(Helminthosporium sativum)：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌株库藏号CGMCC3.2881.
荔枝炭疽病(Colletotrichum litchi)：广东省微生物菌种保藏中心，菌株库藏号GIM1.751
玉米大斑病菌(Exerohilum turcicum)：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌株库藏号CGMCC3.3114.
玉米小斑病菌(Helminthosporium maydis)：辽宁微生物菌种保藏中心，菌株库藏号LICC30166.
玉米黄斑病菌(Curvularia lunata)：辽宁微生物菌种保藏中心，菌株库藏号LICC30317.
玉米基茎腐病菌(Fusarium graminearum)：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌株库藏号ACCC36258
棉花黄萎病菌(Verticillium dahliae)：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌株库藏号CGMCC3.2869.
西瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.niveum)：中国农业科学院农业微生物菌种保藏中心，菌株库藏号ACCC36367.
辣椒炭疽病菌(Colletotrichum capsici)：中国农业科学院农业微生物菌种保藏中心，菌株库藏号ACCC36182.
白菜黑斑病菌(Alternaria brassicae(Berk.)Sace.)：辽宁微生物菌种保藏中心，菌株库藏号LICC30382.
葱紫斑病菌(Alternaria porri(Ell.)Cifferri)：广东省微生物菌种保藏中心，菌株库藏号GIM1.643.
改良的察氏培养基II，配方如下：
加水定量至100％，如若是固体培养基则加入1.5-2％的琼脂，pH7-8，121摄氏度灭菌20分钟。
牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，配方如下：
加水定量至100％，pH7.0-7.2，121摄氏度灭菌20分钟。
PDA培养基，马铃薯200g切成小块，加水煮烂(煮沸20～30分钟)，用纱布过滤后，加入葡萄糖20g，琼脂15g，再补足水至1000毫升，pH自然，121摄氏度灭菌20分钟。
水稻品种为欣荣优08：江西省种子公司，欣荣Ax先恢9898杂交选配的杂交早稻组合。
实施例1、克里本类芽孢杆菌(Paenibacillus kribbensis)TRCC82001CGMCCNo.7996的分离、鉴定。
一、克里本类芽孢杆菌(Paenibacillus kribbensis)TRCC82001CGMCC No.7996的分离：克里本类芽孢杆菌(Paenibacillus kribbensis)TRCC82001CGMCC No.7996，是从华南农业大学植物标本园的土壤中分离得到。方法如下：从华南农业大学植物标本园采集土壤样品，称取土壤1.0g，放入加有99mL无菌水的三角烧瓶中，振荡均匀，即为稀释10-2的土壤悬液。然后用十倍梯度稀释，依次制备10-3、10-4、10-5、10-6、10-7稀释度的土壤稀释液。用无菌称器吸取0.1mL各浓度土壤稀释液，以无菌操作技术接种在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基平板上，涂布均匀，每个浓度5个重复。接种的平板于30摄氏度恒温培养2～5d后，挑取单菌落继续接种到牛肉膏蛋白胨琼脂培养基平板，培养条件同上，培养纯化，获得纯培养。以水稻稻瘟病、纹枯病等病原真菌作为靶目标，利用对峙法分别在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、PDA培养基平板上进行拮抗菌的初筛。对初筛具有拮抗活性的菌株进行液体摇瓶发酵，发酵液经无菌细菌过滤膜过滤获得无菌发酵液。利用牛津杯法进一步测定无菌发酵液滤液对病原菌生长发育的影响，利用温室盆栽接种试验验证无菌发酵液对水稻稻瘟病、纹枯病的温室防治效果，最终筛选出防效优良的生防菌株，将筛选获得的一株细菌编号为TRCC82001。
二、菌株TRCC82001的鉴定：
分别从形态学、生理生化及16S rRNA序列同源性三个方面对所获得的菌株TRCC82001进行了分类鉴定。
(1)形态学鉴定：
将菌株TRCC82001梯度稀释法涂布牛肉膏蛋白胨琼脂培养基平板，30摄氏度培养18-24h，观察菌落的形态、大小、边缘、表面、凹凸度、透明度；然后进行革兰氏染色及芽孢染色，在显微镜下观察其菌体形态。
显微镜下菌株TRCC82001菌体形态见附图1；结果表明，在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上培养30摄氏度恒温培养48h，菌落乳白色、脓状、近圆形、边缘整齐、菌落***，表面粘稠。显微镜下TRCC82001菌株的菌体形态呈杆状，均匀分布，可形成芽孢，芽孢圆形，革兰氏染色呈阳性。
(2)生理生化特性分析：
根据《伯杰氏细菌鉴定手册》，对TRCC82001菌株进行生理生化鉴，鉴定结果如下表1。
(3)16S rRNA序列同源性分析：
TRCC82001菌株总DNA的提取：
①TRCC82001菌株经PDA活化后，取一环接种到100mL改良的察氏培养基II液体培养基中，取对数生长期(14小时-18小时)的发酵液1.5mL，8000r／min离心5min，收集菌体，重复2-3次。
②将菌体沉淀悬于400μLTE缓冲液，加入50mg/mL的溶菌酶溶液20μL，37摄氏度、4-24h温育。
③加入400μL“SDS”Buffer提取缓冲液，65摄氏度温育45min，每隔15min颠倒振荡一次，冷却至室温。
④加入400μL的Tris饱和酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)，混匀后4摄氏度、12000r／min离心10min。上清液用等体积的氯仿抽提1次。
⑤然后上清用1倍体积的冰冷异丙醇沉淀DNA，加3mol/L KAc2-3滴，用70％的乙醇洗涤。将DNA粗提物溶于400μLTE缓冲液中，加入20μLRNAase(1mg／mL)，37摄氏度温育30min。重复步骤④、⑤各一次。
⑥取上清液于新的离心管中，加入2倍体积无水乙醇和3mol／LKAc2-3滴-20摄氏度放置60min，取出11000r／min离心20min，然后用70％的乙醇洗涤一次。
⑦晾干，加入15-20μL TE中，1％琼脂糖电泳检测(2-3μL)DNA的分离情况。将DNA浓度调至100mg／uL，备作PCR模板。
TRCC82001菌株16S rDNA的PCR扩增：
以提取的菌株总DNA作为基因扩增模版，采用细菌16S rDNA通用引物，27f：5`-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3`，1492r：5`-GGTTACCTTGTTACGACTT-3`，进行PCR反应体系：DNA(70ng／μL)模板2μL；dNTP Mixture(2.5mmol／L)2.5μL；1495F(20μmol／L)1.5μL；27F(20μmol／L)1.5μL；E xTaqDNA聚合酶0.2μL；10×ExTaq Buffer(Mg2+pluse)5μL；补足ddH2O到50μL。PCR条件为：94摄氏度预变性3min；然后94摄氏度变性1min、55摄氏度退火1min、72摄氏度延伸3min，共30个循环；最后72摄氏度延伸5min。用1.0％琼脂糖凝胶检测PCR产物，达到纯度后送生物技术服务有限公司测序。
TRCC82001菌株16S rDNA序列分析及构建***发育树：
PCR产物回收纯化并经行DNA测序后，与GenBank中所有已测定的原核生物的16SrDNA序列比较同源性，构建TRCC82001菌株***发育树(附图2、附图3)。结果表明TRCC82001菌株与AF391123(Paenibacillus kribbensis)相似度为98.90％，并且其菌体形态和生理生化指标符合(Paenibacillus kribbensis)的特征，所以可以鉴定TRCC82001菌株为(Paenibacillus kribbensis)。后经中科院微生物研究所将(Paenibacillus kribbensis)命名为克里本类芽孢杆菌。TRCC82001菌株于2013年8月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.7996。
实施例2、克里本类芽孢杆菌(Paenibacillus kribbensis)TRCC82001CGMCCNo.7996及其代谢产物的抑菌活性测定。
一、克里本类芽孢杆菌(Paenibacillus kribbensis)TRCC82001CGMCC No.7996菌体及
其抑菌代谢产物的热稳定性。
取克里本类芽孢杆菌(Paenibacillus kribbensis)TRCC82001CGMCC No.7996，30摄氏度，180r／min振荡培养84小时的稀释100倍的发酵液6份，其中5份分别于40摄氏度、60摄氏度、80摄氏度、100摄氏度、120摄氏度下处理30min；另一份不做处理，作为对照组，每个处理5个重复。分别接平板做菌体存活和对稻瘟病抑菌试验，结果如下表2。结果显示，发酵抑菌代谢物在100摄氏度以下的温度环境下稳定，对稻瘟病的抑菌率在79.71％～89.00％，而超过100摄氏度后，抑菌率只有55.15％。进一步试验证明，95摄氏度30min能杀死发酵液中活体并且不影响代谢产物的抑菌效果。
二、克里本类芽孢杆菌(Paenibacillus kribbensis)TRCC82001CGMCC No.7996及其无菌发酵液的制备。
将所述克里本类芽孢杆菌(Paenibacillus kribbensis)TRCC82001CGMCCNo.7996用改良的固体察氏培养基II活化后挑取单菌落或菌苔接种到装量为摇瓶20％-30％体积的改良的液体察氏培养基II中。30摄氏度，180r／min振荡培养84小时，将所获得的发酵液经95摄氏度，35min灭菌后得到无活菌发酵液。
三、克里本类芽孢杆菌(Paenibacillus kribbensis)TRCC82001CGMCC No.7996拮抗真菌活性的测定。
供试的病原真菌为：稻瘟病(Phyricularia grisea(Cooke)Sacc.)、水稻纹枯病(Thanatephorus cucumeris(Frank)Donk)、小麦根腐病(Drechslera SoFokiniana(Sacc.)Subram.Gain)、荔枝炭疽病(Colletotrichum litchi)、玉米大斑病菌(Exerohilumturcicum)、玉米小斑病菌(Helminthosporium maydis)、玉米黄斑病菌(Curvularialunata)、玉米基茎腐病菌(Fusarium graminearum)、棉花黄萎病菌(Verticilliumdahliae)、西瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.niveum)、辣椒炭疽病菌(Colletotrichum capsici)、白菜黑斑病菌(Alternaria brassicae(Berk.)Sace.)、葱紫斑病菌(Alternaria porri(Ell.)Cifferri)。
取获得无活菌发酵液按1：99的比例加到灭过菌改良的液体察氏培养基II中，倒平板，待平板冷却后，在平板中央接入直径为0.5cm的各致病菌菌饼，每株致病菌重复5个平板。另每个致病菌做5个不合无菌发酵液的空白对照。接种后，平板置于30摄氏度恒温培养箱中，培养3天。观察并测量各平板菌落直径，测量计算结果如下表3。
表3结果表明，克里本类芽孢杆菌(Paenibacillus kribbensis)TRCC82001CGMCCNo.7996所产生的抗菌物质对所用病原真菌均具有抑菌活性，对水稻纹枯病、小麦根腐病、稻瘟病、荔枝炭疽等病原真菌的抑菌活性超过80％。对玉米大斑病菌，玉米小斑病菌等9种供试病原真菌的抑菌活性高于60％。
实施例3、克里本类芽孢杆菌(Paenibacillus kribbensis)TRCC82001CGMCCNo.7996的无菌发酵液温室及田间应用试验。
一、克里本类芽孢杆菌(Paenibacillus kribbensis)TRCC82001CGMCC No.7996的无菌发酵液温室栽培防治试验：
水稻品种为欣荣优08，从江西省种子公司购买，按照水稻盆栽试验方法浸种、催芽后，待胚根长至2cm左右后，选择长势一致的水稻苗移栽至塑料方盆中土培，长至3叶期，在根茎部接种水稻纹枯病病菌，同时观测发病情况。结果见附图4。
试验结果表明，空白对照组的叶片3天后铺满水稻纹枯病菌菌丝，5天后叶片枯萎变黄，7天后形成大量菌核；而经克里本类芽孢杆菌(Paenibacillus kribbensis)TRCC82001CGMCC No.7996的无菌发酵液处理的叶片没有出现枯萎现象，叶片仍保持绿色，水稻纹枯病菌菌丝没有扩散，几乎没有形成菌核，表现出良好的抑菌活性。防治统计结果表明，克里本类芽孢杆菌(Paenibacillus kribbensis)TRCC82001CGMCC No.7996无菌发酵液100倍稀释对水稻纹枯病具有较好的防效，防效达80％以上。
二、克里本类芽孢杆菌(Paenibacillus kribbensis)TRCC82001CGMCC No.7996的无菌发酵液防治稻瘟病田间防治试验：
试验设在江西省吉安市吉州区白塘街道吉南村早稻田内。试验设置6个处理，4次重复，24个小区，每个小区67m2，采用常规喷雾法施药，每亩药液用量45kg，分别于水稻破口期和齐穗期施药两次。
药后15天调查各处理对穗瘟病的防效。调查方法按对角线五点取样，每点调查10处，共50处，分别记录病穗数、病穗发病严重程度。药效按如下公式计算：
克里本类芽孢杆菌(Paenibacillus kribbensis)TRCC8200l CGMCC No.7996的无菌发酵液防治水稻稻瘟病，每亩用量150-450毫升，在水稻破口期、齐穗期各打一次药，药后15天三个用量的防效分别是69.99％、75.21％和84.92％，其低剂量150毫升每亩的防效低于对照药剂处理B和处理C，差异显著；中剂量225毫升每亩的防效与对照药剂处理C相当，差异不显著，且高于对照药剂处理B的防效，差异显著；试验药剂各剂量处理间的防效差异显著。药效试验典型效果见附图5。
表1TRCC82001菌株生理生化测定结果
表2不同处理温度对菌体及代谢物抑菌活性的影响
表3TRCC82001CGMCC No.7996拮抗真菌活性的测定结果
| 病原真菌 | 菌落直径／cm | CK／cm | 抑制率／％ |
| 水稻纹枯病菌 | 1.50 | 6.98 | 85.67(±0.52) |
| 稻瘟病菌 | 1.60 | 7.13 | 84.57(±0.25) |
| 玉米大斑病菌 | 2.24 | 7.12 | 75.56(±1.46) |
| 玉米小斑病菌 | 3.12 | 7.43 | 64.74(±1.30) |
| 玉米黄斑病菌 | 2.35 | 7.52 | 75.40(±0.84) |
| 玉米基茎腐病菌 | 3.24 | 7.12 | 61.52(±0.57) |
| 棉花黄萎病菌 | 3.14 | 7.32 | 76.39(±0.93) |
| 棉花枯萎病菌 | 2.95 | 6.96 | 64.80(±2.12) |
| 西瓜枯萎病菌 | 2.80 | 7.17 | 67.92(±0.82) |
| 小麦根腐病菌 | 1.40 | 7.12 | 87.34(±0.64) |
| 香蕉炭疽病菌 | 2.76 | 7.10 | 68.17(±1.26) |
| 荔枝炭疽病菌 | 1.64 | 7.22 | 84.21(±1.02) |
| 辣椒炭疽病菌 | 1.94 | 7.04 | 79.55(±0.66) |
| 黄瓜疫霉病菌 | 2.31 | 6.92 | 73.84(±0.39) |
| 白菜黑斑病菌 | 2.01 | 7.12 | 78.79(±0.57) |
| 葱紫斑病菌 | 1.91 | 6.94 | 79.68(±1.39) |
表4TRCC82001CGMCC No.7996田间防治试验药剂设计
表5TRCC82001CGMCC No.7996田间防治水稻稻瘟病试验结果
*各处理数据为三次重复的平均值。差异显著性分析方法采用“DMRT”法进行。
附图说明
图1为克里本类芽孢杆菌(Paenibacillus kribbensis)TRCC82001CGMCC No.7996的扫描电镜显微形态。
图2为克里本类芽孢杆菌(Paenibacillus kribbensis)TRCC82001CGMCC No.7996的16S rDNA序列。
图3为克里本类芽孢杆菌(Paenibacillus kribbensis)TRCC82001CGMCC No.7996基于16sRNA序列构建的***发育树。
图4为克里本类芽孢杆菌(Paenibacillus kribbensis)TRCC82001CGMCC No.7996的无菌发酵液对水稻纹枯病盆栽试验效果。
图5为克里本类芽孢杆菌(Paenibacillus kribbensis)TRCC82001CGMCC No.7996的无菌发酵液对水稻稻瘟病田间试验效果。
Claims (4)
1.一株克里本类芽孢杆菌，其拉丁名为Paenibacillus kribbensis，菌种代号为TRCC82001，该菌株于2013年8月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号为：CGMCC No.7996，该菌株拮抗病原真菌为下述中至少一种：小麦根腐病菌，其拉丁名为Drechslera SoFokiniana(Sacc.)Subram.Gain、稻瘟病菌，其拉丁名为Phyricularia grisea(Cooke)Sacc.、荔枝炭疽病菌，其拉丁名为Colletotrichum litchi、玉米大斑病菌，其拉丁名为Exserohilum turcicum(Pass.)Leonard et Suggs、玉米小斑病菌，其拉丁名为Helminthosporium maydis、玉米黄斑病菌，其拉丁名为Curvularialunata、禾谷镰孢菌，其拉丁名为Fusarium graminearum、棉花黄萎病菌，其拉丁名为Verticillium dahliae、西瓜枯萎病菌，其拉丁名为Fusarium oxysporum f.sp.niveum、辣椒刺盘孢菌，其拉丁名为Colletotrichum capsici、白菜黑斑病菌，其拉丁名为Alternariabrassicae(Berk.)Sace.、葱紫斑病菌，其拉丁名为Alternaria porri(Ell.)Cifferri。
2.一种生防制剂，其活性成分为权利要求1所述的克里本类芽孢杆菌，其拉丁名为Paenibacillus kribbensis，菌种代号为TRCC82001，其保藏号为CGMCC No.7996的无菌发酵液和/或权利要求1所述的克里本类芽孢杆菌，其拉丁名为Paenibacillus kribbensis，菌种代号为TRCC82001，保藏号为：CGMCC No.7996。
3.根据权利要求2所述的生防制剂，其特征在于：所述生防制剂为下述1)-2)中的任一生防制剂：
1)用于防治植物真菌病害的生防制剂；
2)用于抑制病原真菌的生防制剂。
4.权利要求1所述的克里本类芽孢杆菌在制备生防制剂中的应用，其特征在于所述克里本类芽孢杆菌用于制备下述1)-2)中任一种生防制剂：
1)用于防治植物真菌病害的生防制剂；
2)用于抑制病原真菌的生防制剂。
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