CN104082344A - 阿萨尔基亚芽孢杆菌在防治棉花黄萎病上的用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种拮抗菌阿萨尔基亚芽孢杆菌(Bacillus axarquiensis)对棉花黄萎病的防治作用，采用琼脂平板扩散法，通过初筛和复筛，分离得到一株对棉花黄萎病菌(Verticillium dahliae)具有较强抑菌活性的拮抗菌株TUBP1。通过对形态观察、生理生化实验、16S rDNA和gyrB的基因序列分析，确定该菌株为阿萨尔基亚芽孢杆菌(Bacillus axarquiensis)；采用生长速率法和牛津杯法分别测定了发酵液对棉花黄萎病菌抑菌活性，对棉花黄萎病菌菌丝生长抑制率为78.62％±3.48％，抑菌圈直径为21±3.86mm；温室盆栽试验中，TUBP1生防效果为42.56％，小区试验中，TUBP1生防效果为40.16％。离体活体试验证明拮抗菌Bacillus axarquiensis可用于棉花黄萎病防治的药物。

Description

阿萨尔基亚芽孢杆菌在防治棉花黄萎病上的用途

技术领域

本发明涉及阿萨尔基亚芽孢杆菌在防治棉花黄萎病上的应用,属于农业技术领域。

背景技术

棉花黄萎病(Cotton verticillium wilt)是由大丽轮枝菌(Verticillium dahliaeKleb)引起的一种土传维管束真菌性病害，也是棉花生产上毁灭性病害之一，严重影响棉花产量和质量。棉花黄萎病菌可以通过种子、土壤和带菌病株等多种方式和途径传播，并可以形成微菌核在土壤中存活很多年，防治上非常困难。20世纪90年代以来，棉花黄萎病逐年加重，并造成巨大的经济损失。据不完全统计，导致每年减产10％～30％。

利用生物防治棉花黄萎病备受人们关注。生物防治无污染、无残留、对人畜安全无毒，且不易使病原菌产生耐药性，生产工艺较简单，有些生防菌还能促进农作物生长，受到许多研究者的青睐。拮抗微生物种类有霉菌、放线菌、细菌，其中研究最多的是芽孢杆菌(Bacillus spp.)，因为芽孢杆菌分布广泛，繁殖速度快、抗逆能力强。新疆棉田以连作为主，而对防治新疆棉花黄萎病的生物杀菌剂非常有限，所以获得新疆棉花黄萎病菌高效拮抗菌是前提条件。阿萨尔基亚芽孢杆菌(Bacillus axarquiensis)是芽孢杆菌的一个种，具有繁殖快、抗逆性强等特点，具有作为优势生防细菌的潜力。

据文献调研，目前对阿萨尔基亚芽孢杆菌研究局限于其分类学方面，而对其生物活性方面未见相关研究，特别是其对棉花黄萎病防病作用未见相关报道。本课题组通过对南疆地区连作15年棉花根部土壤中拮抗细菌的分离、筛选、盆栽试验和小区试验等，筛选出一株对棉花黄萎病菌的拮抗菌株。本研究通过形态、生理生化及分子生物学手段明确其分类学地位，并进一步通过盆栽和小区试验确定其对棉花黄萎病防治作用，为开发新疆连作棉田棉花黄萎病优良生防菌剂奠定基础。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供阿萨尔基亚芽孢杆菌在防治棉花黄萎病中的用途。在本发明中，通过离体、盆栽和小区试验证实了阿萨尔基亚芽孢杆菌对棉花黄萎病具有很好防治作用。

离体试验：采用生长速率法和牛津杯法检测阿萨尔基亚芽孢杆菌发酵液离体对棉花黄萎病菌抑制作用，生长速率法和牛津杯法对棉花黄萎病菌都有抑制作用，采用生长速率法测阿萨尔基亚芽孢杆菌发酵液离体对棉花黄萎病菌抑制率为78.62±3.48％，牛津杯法测阿萨尔基亚芽孢杆菌发酵液离体对棉花黄萎病菌抑菌圈直径为21±3.86mm。由离体试验结果表明阿萨尔基亚芽孢杆菌对抗棉花黄萎病菌有抑制作用。

盆栽试验：由温室盆栽试验结果可知，阿萨尔基亚芽孢杆菌对棉花黄萎病有一定生防作用。接种后30～120d对照组棉花黄萎病病情指数为10.87～39.88，而阿萨尔基亚芽孢杆菌处理组病情指数为3.85～21.28。表明阿萨尔基亚芽孢杆菌能降低棉花黄萎病的发生。接种后30～120d，阿萨尔基亚芽孢杆菌发酵液对棉花黄萎病菌相对防效为36.54％～42.56％。

小区试验：阿萨尔基亚芽孢杆菌对棉花黄萎病有一定生防作用。接种后60～140d对照组棉花黄萎病病情指数为13.87～49.08，病情指数呈增长趋势，接种后140d病情指数达到最大值为49.08，而阿萨尔基亚芽孢杆菌处理组病情指数分别为3.85～21.28，阿萨尔基亚芽孢杆菌对棉花黄萎病有一定生防效果，其相对生防值为38.04％～40.16％。接种后130d，阿萨尔基亚芽孢杆菌发酵液对棉花黄萎病菌相对防效最大为43.07％。接种后140d，相对防效为40.16％。

总之，本发明阿萨尔基亚芽孢杆菌对棉花黄萎病菌有拮抗作用，可用于棉花黄萎病防治。可用阿萨尔基亚芽孢杆菌发酵液浸泡棉花种子或灌于棉花根部。从另一个角度看，本发明还公开了一种防治棉花黄萎病的生物农药，其中含有阿萨尔基亚芽孢杆菌或发酵液。所以，本发明还公开了阿萨尔基亚芽孢杆菌在制备防治棉花黄萎病的生物农药上的用途。

附图说明

图1为本发明拮抗菌TUBP1的菌体形态(A：光学显微镜；B：扫描电镜)。

图2为本发明基于16S rDNA(A)和gyrB(B)基因序列BLAST结果构建TUBP1***发育树。

图3为本发明Bacillus axarquiensis发酵液体外抗棉花黄萎病菌活性(A：正面；B：背面；1：生长速率法；2：牛津杯法)。

具体实施方式

实施例1：拮抗菌初筛和复筛

棉花黄萎病菌菌液制备：大丽轮枝菌V.dahliae ATCC36211接种含PDA培养基平板上，25℃培养15d，平板加入无菌水，刮取孢子，用血球计数板计数，调整菌液浓度为6×10⁶孢子·mL^-1，备用。

拮抗细菌的分离和筛选：按常规分离土壤细菌方法进行。将分离纯化的单菌落接种于NA培养基上，180r·min37℃培养48h，用6mm打孔器制成菌饼。PDA培养基上涂布200μL6×10⁶mL^-1棉花黄萎病菌孢子悬浮液，再将分离纯化菌株菌饼反接于平板内。25℃培养4d，筛选产生抑菌圈的拮抗细菌。

本实验从土样中共分离得到219株菌株，其中健康土壤中127株(占54.7％)，发病土壤中92株(占42.6％)(表1)，经初筛获得23株产生抑菌圈直径较大、抑菌能力较强的菌株。对初筛菌株进行了复筛，其中抗活性强的有16株菌株：抑菌圈直径大于10mm的菌株12株(表2)，其中TUBP1菌株的抑菌圈直径为21±3.86mm。

表1 不同部位分离拮抗菌株数

表2 12株拮抗细对棉花黄萎病菌抑菌圈直径

注：a：拮抗菌来源于健康植株根际土壤；b：拮抗菌来源于发病植株根际土壤。

实施例2：拮抗细菌TUBP1形态及生理生化鉴定。将活化的拮抗细菌TUBP1菌株接种于NA平板上37℃培养48h，并进行革兰氏染色，观察菌落形态及菌体和芽孢以及生理生化鉴定(甲基红试验、淀粉水解试验、糖醇类发酵试验、荧光色素试验等)。

棉花黄萎病菌拮抗菌株TUBP1的菌落和形态特征，TUBP1在NA培养基上生长，TUBP1单菌落呈圆形，表面皱缩、干燥、无光泽、不透光，边缘不光滑、乳白色(图1A)，革兰氏染色呈阳性(G+)，而且具有芽孢，运动性、异染粒实验呈阳性。扫面显微镜下观察，菌体呈杆状(图1B)

棉花黄萎病菌拮抗菌株TUBP1生理生化测定结果，棉花黄萎病菌拮抗菌株TUBP1生理生化测定结果见表3，将菌株TUBP1形态及生理生化特征与《常见细菌***鉴定手册》中相应属、种进行对照，其与芽孢杆菌属的典型特征基本一致，初步鉴定菌株TUBP1属于芽孢杆菌属(Bacillus spp.)。

表3 生理生化试验结果

项目	实验现象	现象分析	结果
				产氨试验	出现黄褐色沉淀	试验菌能产氨气	+
过氧化氢酶试验	产生大量气泡	试验菌具有过氧化氢酶	+
				甲基红试验	呈桔黄色	试验菌产生的酸可进一步代谢	+
V-P试验	变红	能够利用V-P培养基	+
				淀粉水解试验	有透明圈	试验菌能产生淀粉酶	+
荧光色素试验	无荧光	试验菌不产生荧光色素	–
				酒石酸盐利用	绿色，大量沉淀	试验菌不利用酒石酸盐	–
硝酸盐还原试验	培养基变玫瑰红	试验菌具有硝酸盐还原酶	+
				苯丙氨酸脱氢酶试验	不变色	试验菌不产生苯丙氨酸脱氨酶	–
脲酶试验	不变色	试验菌不产生脲酶	–
				明胶液化试验	明胶液化	试验菌液化明胶	+
硫化氢的产生试验	纸条变黑	试验菌能产生硫化氢	+
				糖醇类发酵试验	培养基变黄	试验菌能发酵产酸	+

吲哚试验	培养基变红	试验菌具有色氨酸水解酶	+
				柠檬酸盐利用试验	培养基变桃	柠檬酸盐被利用	+

注：(阴性为–，阳性为+)

实施例3：棉花黄萎病菌拮抗菌TUBP1基于16S rDNA和gyrB基因序列BLAST结果的***进化分析

拮抗细菌TUBP1基因序列PCR扩增，16S rDNA的PCR扩增，提取拮抗细菌TUBP1基因组DNA为模板，采用通用引物进行16S rDNA序列PCR扩增。扩增产物克隆并送上海生工生物工程技术服务有限公司测序，结果如SEQ ID No1所示。

gyrB基因序列的PCR扩增，提取拮抗菌TUBP1DNA，并采用简并引物UP-1S(5'GAA GTCATCATGACCGTTCTGCA3',SEQ ID No2)和UP-2Sr(5'AGCAGGGTAC GG ATGTGCG A GCC3',SEQ ID No3)扩增gyrB基因，反应条件:95℃5min；95℃30s，58℃45s，72℃2min，30个循环；72℃10min。扩增产物克隆并送上海生工生物工程技术服务有限公司测序，结果如SEQ ID No4所示。

基于16S rDNA和gyrB基因***发育树的构建，将TUBP1菌株的16S rDNA和gyrB序列与GenBank中所有已测定的原核生物进行BLAST比较。根据比较结果，利用PHYLD program构建***发育树，再利用Treeview重建。***进化距离根据Kimura模型估算，用MEGA5.0(Molecular Evolutionary GeneticsAnalysis)软件采用邻接法(Neighbor-Joining)聚类分析，并构建出***进化树。同时，重复取样100次进行自展值(Bootstrap value)分析来评估***进化树的拓扑结构的稳定性。

将拮抗菌TUBP1的16S rDNA序列与GenBank中所有已测定的原核生物16srDNA序列进行比较，得到抗菌TUBP1相关菌株的进化距离并构建了***发育树(图2A)。图2A表明，供试菌株与芽孢杆菌属的标准菌株同源相似度大部分在99％以上，初步将此菌株归为芽孢杆菌属，同时TUBP1与标准菌株Bacillusaxarquiensis(DQ993670)的同源性最为接近(相似度为99.80％)。以gyrB基因序列比对结果构建***发育树(图2B)，利用gyrB基因也可以准确鉴定菌株TUBP1为Bacillus axarquiensis(相似度为99.00％)。因此，根据16S rDNA序列和gyrB相似性分析，在结合形态学观察以及生理生化测试，确定拮抗菌TUBP1为Bacillus axarquiensis。

实施例4：离体抑菌活性试验测定，发酵液制备：将拮抗菌Bacillus axarquiensis菌株接种于NA培养液中，37℃，180r·min^-1条件下，培养48h，离心(6000r·min^-120min)，取上清液，上清液经微孔滤膜(0.22μm)过滤除菌，分装，置于4℃冰箱保存备用。

生长速率法抗菌试验：100mL PDA培养基中加入20mL无菌发酵液，摇匀后倒入灭菌的平板中，待其铺平凝固，在其中央接入棉花黄萎病菌菌饼。以不加入拮抗菌的发酵液为对照组，每个处理重复6次；25℃培养15d，测量菌落生长直径。计算菌落直径和生长抑制率：菌落直径(cm)＝测量菌落直径平均值-0.09，菌落生长抑制率(％)＝(对照组菌落直径-处理组菌落直径)/对照组菌落直径×100.

牛津杯法抑菌试验：在PDA平板中接种棉花黄萎病菌菌饼，25℃培养7d后，菌落周围放入牛津杯并加200μL拮抗细菌Bacillus axarquiensis无菌发酵液(0.22μm微孔滤膜过滤)，25℃继续培养8d后，用游标卡尺计量其抑菌圈直径。

采用生长速率法和牛津杯法检测Bacillus axarquiensis发酵液离体对棉花黄萎病菌抑制作用，由图3可知，生长速率法(图3-1A和图3-1B)和牛津杯法(图3-2A和图3-2B)对棉花黄萎病菌都有抑制作用，采用生长速率法测TUBP1发酵液离体对棉花黄萎病菌抑制率为78.62±3.48％，牛津杯法测Bacillusaxarquiensis发酵液离体对棉花黄萎病菌抑菌圈直径为21±3.86mm。由离体试验结果表明拮抗菌Bacillus axarquiensis对抗棉花黄萎病菌有抑制作用。

实施例5：盆栽试验，拮抗菌Bacillus axarquiensis对棉花黄萎病盆栽防治试验于2012－2013年4－9月在人工气候室进行，温室湿度为60％～80％。温度为(25±5)℃，棉花种子为新陆中36，种子用1％次氯酸钠消毒10min，蒸馏水冲洗，晾干。

拮抗细菌Bacillus axarquiensis接种NB培养基中，37℃180r·min^-1振荡培养48h，5000g离心10min，菌体悬浮无菌2％羧甲基纤维素钠(CMC)，棉花种子浸泡于拮抗细菌Bacillus axarquiensis悬浮液4h(10mL2％CMC中包含200粒棉种和1g拮抗细菌)，以不加拮抗细菌为对照组，晾干，播种前通过稀释平板计数法调整菌液浓度为6×10⁸CFU·mL^-1。

V.dahliae ATCC36211菌株接种于PDA培养基中25℃培养15d，6mm打孔器打孔制成菌饼，接种于PDB培养基中25℃160r·min^-1振荡培养15d，8层无菌纱布过滤，收集分生孢子，用血球计数板调整菌浓度为6×10⁶mL^-1。

棉花黄萎病的防治试验：(1)对照组：V.dahliae ATCC36211；(2)处理组：V.dahliae ATCC36211+拮抗菌；V.dahliae ATCC36211分生孢子接种于无菌土壤调整菌浓度为6×10⁶g^-1，拮抗菌Bacillus axarquiensis浓度为6×10⁸g^-1，每个处理20盆棉花，重复3次(每个处理共60盆)。接种后30d、60d、80d、90d和120d统计病情指数和相对防治效果。

由温室盆栽试验结果(表4)可知，拮抗菌Bacillus axarquiensis对棉花黄萎病有一定生防作用。接种后30～120d对照组棉花黄萎病病情指数为10.87～39.88，而拮抗菌Bacillus axarquiensis处理组病情指数为3.85～21.28。表明拮抗菌Bacillusaxarquiensis能降低棉花黄萎病的发生。接种后30～120d，拮抗菌Bacillusaxarquiensis发酵液对棉花黄萎病菌相对防效为36.54％～42.56％(表4)。

表4 Bacillus axarquiensis盆栽试验防治棉花黄萎病生防效果

实施例6：小区试验，拮抗菌Bacillus axarquiensis对棉花黄萎病的田间药效试验于2012和2013年4－10月，于新疆生产建设兵团农一师12团28连棉田进行，选择常年发生黄萎病较重的地块。小区面积为30m²，随机区组排列。播种时间为2012和2013年4月15日，棉花品种为新陆中36，土壤为沙壤土，肥力中等，灌溉条件较好。一膜4行，每行30株棉花，每个处理120株棉花重复3次，当棉苗长至5～6片真叶时，处理组每株棉苗灌根拮接种抗菌Bacillus axarquiensis50mL(菌浓度为6×10⁸mL^-1)，对照组不接种拮抗菌，接种后60d、90d、110d、130d和140d统计病情指数和相对防治效果，同盆栽试验。

表5 Bacillus axarquiensis田间试验防治棉花黄萎病效果

小区试验结果如表5可知，拮抗菌Bacillus axarquiensis对棉花黄萎病有一定生防作用。接种后60～140d对照组棉花黄萎病病情指数为13.87～49.08，病情指数呈增长趋势，接种后140d病情指数达到最大值为49.08，而Bacillus axarquiensis处理组病情指数分别为3.85～21.28(表5)，拮抗菌Bacillus axarquiensis对棉花黄萎病有一定生防效果，其相对生防值为38.04％～40.16％。接种后130d，拮抗菌Bacillus axarquiensis发酵液对棉花黄萎病菌相对防效最大为43.07％。接种后140d，相对防效为40.16％。

Claims (5)

1.阿萨尔基亚芽孢杆菌在防治棉花黄萎病上的用途。

2.阿萨尔基亚芽孢杆菌在制备防治棉花黄萎病的生物农药上的用途。

3.一种防治棉花黄萎病的生物农药，其中含有阿萨尔基亚芽孢杆菌。

4.权利要求3所述生物农药在防治棉花黄萎病上的用途。

5.一种防治棉花黄萎病的方法，其特征在于，用阿萨尔基亚芽孢杆菌或含有阿萨尔基亚芽孢杆菌的生物农药浸泡棉花种子或灌于棉花根部。