CN103675114A

CN103675114A - 一种赤藓糖醇的检测方法

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Publication number: CN103675114A
Application number: CN201210360900.8A
Authority: CN
Inventors: 许波; 贺玉荣
Original assignee: BEIJING GUANHONG TECHNOLOGY GROUP Co Ltd
Current assignee: BEIJING GUANHONG TECHNOLOGY GROUP Co Ltd
Priority date: 2012-09-26
Filing date: 2012-09-26
Publication date: 2014-03-26

Abstract

赤藓糖醇为白色结晶的四碳多元醇类化合物，是新型发酵型低热量甜味剂，在医药、食品、化妆品及化工等领域均有广阔的应用前景，对它的研究目前已成为国际上一个备受关注的热点。本发明提供了一种离子色谱定量检测赤藓糖醇的方法，回收率达85％～90％，同现有气相色谱法、高效液相色谱法、毛细管电泳法等相比，具有准确性高、不用衍生、操作简便、灵敏度高、环境友好和重现性好等优点，是一种实用的检测方法。

Description

一种赤藓糖醇的检测方法

一、技术领域

本发明属于化学分析领域，特别涉及用离子色谱法检测赤藓糖醇的技术。

二、背景技术

赤藓糖醇化学名1，2，3，4-丁四醇，英文名Erythritol，分子式为C₄H₁₀O₄，分子量为122.12，化学结构式如图1所示，熔点126℃，沸点329-331℃，是一种四碳多元醇，外观为白色粉状结晶，有清凉感，发热量低，易结晶。

赤藓糖醇为白色结晶的四碳多元醇类化合物，是一种采用生物技术生产的新型发酵型低热量甜味剂，1999年6月国际食品添加剂专家委员会(JECFA)批准赤藓糖醇作为食用甜味剂，且无需规定ADI值。目前，赤藓糖醇在美国、日本、新西兰、澳大利亚、新加坡、韩国、墨西哥等国已用于食品生产。2007年6月19日我国***公告批准赤藓糖醇作为甜味剂应用于口香糖、固体饮料、调制乳等食品中。赤藓糖醇这种新型糖醇类食品甜味剂，具有热量低、甜味协调、无吸湿性、无龋齿性、稳定性高、不发酵及不会引起肠胃不适等优点。它可通过微生物发酵法生产，得率约50％，并在糖果、饮料、烘焙食品及佐餐食品等食品工业中有着广泛的应用。赤藓糖醇是一种新型的多元醇类甜味剂，广泛存在于真菌类(如海藻、蘑菇等)、水果(甜瓜、葡萄等)以及各类发酵食品中(如葡萄酒、口香糖、清酒、酱油等，在人或动物的组织及体液，如血液、***、尿液中也存在赤藓糖醇成分。

糖醇是一类糖的加氢还原产物，是一种低热、难以消化、甜度较低的新型功能型甜味剂，随着其在食品中的应用日益广泛，关于糖醇类的分析方法也有很多研究。采用HPLC测定糖醇或糖时，糖醇和糖本身在紫外区域或可见光范围没有吸收，也无荧光，多采用示差折光检测器检测，但示差折光检测器灵敏度低，定量水平仅为10^-1g/L数量级。蒸发光散射检测器(Evaporative LightScaltefingDetector，英文缩写词为ELSD)是近年才见报道的检测器，ELSD对不吸收紫外光或荧光的化合物，如糖、氨基酸、甘油三酸脂等脂类检测有很高灵敏度，可以祢补紫外或荧光等检测器的不足。例如，蔡欣欣等使用高效液相色谱-蒸发光散射检测法建立了食品中果糖、葡萄糖、蔗糖、乳糖和麦芽糖的分析方法；于趁等人研究了高效液相色谱-蒸发光散射法测定了无糖糕饼中糖醇的含量。气相色谱法测定糖类，具有选择性好、样品用量少、快速、灵敏度高等优点，近年来在国内外得到了广泛应用。采用气相色谱法测定糖类，遇到的主要问题是糖类本身没有足够的挥发性，必须先转化为挥发性衍生物才可以进行测定。对于多糖，需首先将其降解为结构简单的单糖或寡糖，然后将其衍生成易挥发、热稳定的衍生物，通过对降解糖衍生物的定性、定量测定，可得到多糖的基本组成和结构。Adams等使用GC法对植物组织萃取液中的有机酸、蔗糖、葡萄糖、果糖、甘露醇、山梨醇等衍生产物进行了分析研究。离子色谱法是近年来最活跃，发展最快的液相色谱领域之一。离子色谱法检测糖和糖醇的原理是糖类、糖醇类分子具有电化学活泼性及在强碱溶液中呈离子化状态，在高pH值的淋洗液中，它们会部分或全部以阴离子形式存在，可以在阴离子交换柱上被保留并得到分离。离子色谱法检测糖主要使用金电极的脉冲安培检测器，因为当施加一个电位在金电极上，糖易在金电极表面发生氧化反应。在碱性条件下，用金电极检测糖非常灵敏，可检测pmol/L的糖，而且不需衍生反应和复杂的样品纯化处理。另外，直流安培检测器不能用于糖的检测，主要是因为糖氧化产物对电极产生不可逆的污染。

对于糖醇的分析，采用气相色谱法或气相色谱质谱法测定时，由于糖醇的沸点较高，难以气化，须将其转化为挥发性的衍生物才能进行GC测定。采用HPLC测定糖醇时，由于其本身在紫外区域或可见光范围没有吸收，也无荧光，所以，糖醇多采用示差折光检测器检测，但示差折光检测器灵敏度低，定量水平仅为10^-1g/L数量级。通过衍生化的方法将样品组分制备成具有紫外吸收或能发出荧光的物质，用紫外、二极管阵列或荧光检测器，分析灵敏度可大大提高，定量水平达到10^-2g/L数量级，但样品制备操作繁杂，且需要选择合适的衍生化试剂。离子色谱法和现有的气相色谱法、高效液相色谱法、毛细管电泳法等相比，具有不用衍生、操作方便、灵敏度高和环境友好的优点，对糖醇的检测准确性和重现性也很好。

三、发明内容

本发明的具体研究内容主要分为以下几个部分：

1.确定实际样品检测的前处理方法。样品前处理需要注意以下四个方面：糖醇损失越少越好；前处理步骤越少越好；操作越简单越好；耗时耗材越少越佳。前处理一般包括提取、除杂、过滤膜三个步骤，然后上仪器分析。糖醇属于水溶性物质，所以采用二次水对样品进行稀释和提取，超声是最为常用并简单有效的促溶提取方式，可以加速样品中的糖醇释放溶解至水溶液中，本专利采用水溶、超声提取的方法，通过试验确定超声提取时间。经水溶稀释并超声后有残渣的物质，使用8000r/min-9000r/min的转速下离心10min-60min，以除去固体不溶物(水溶后澄清的物质可省去此步)，取溶有糖醇的上清液部分过经0.2μm-0.3μm尼龙滤膜过滤，留取滤液作离子色谱分析备用。

2.通过筛选色谱柱，探索流动相的浓度、流速、柱温等因素对糖醇分离效果的影响，综合各因素，确定离子色谱分析赤藓糖醇的最佳色谱条件。对已建立的方法进行方法学考察，确定各糖醇的检出限、测定限以及线性范围。

由于糖醇属于营养型物质，标准品直接用水配制很容易染菌，所以采用的配制方法应能够保证各待测成分均可得到准确定性的基础之上，可适当提高标准品的保质时间。通过查阅相关文献，选择20mg/L的叠氮化钠代替水配制标准品，赤藓糖醇溶液为5.0mg/L。

糖醇为弱酸类物质，pKa值12～14。在强碱性溶液中当其PH值大于糖的pKa值时，糖会部分或全部离解，以阴离子形式存在于溶液中，因此可以使用氢氧化钠作为淋洗液，进行阴离子交换分离。脉冲安培检测器是近年新发展起来的检测器，选择它的主要优势体现在它的检测条件与淋洗液分离条件相一致，无需衍生，它同样要求糖、糖醇以及醇类化合物在强碱性条件下以羟基阴离子的形式存在。由于羟基的氧化电位较低(0.1V)，所以基体干扰少，可以获得较好的重现性和准确性。

通过比较四种不同填料的可用于糖醇分析的阴离子交换色谱柱，筛选适合赤藓糖醇分析的色谱柱。对于流动相氢氧化钠，在其他条件固定的情况下，通过比较四种流动相浓度1000mmol/L、750mmol/L、500mmol/L和250mmol/L对糖醇的分离效果和保留时间的影响，选择适宜的氢氧化钠浓度作为等度浓度或者梯度浓度洗脱条件。在其他条件不变的情况下，通过比较0.2ml/min、0.3ml/min、0.4ml/min和0.5ml/min等不同流速对糖醇和糖的保留时间和分离效果的影响，选择适合赤藓糖醇分析的流动相等度流速或梯度流速。选择不同的柱温：20℃、30℃、35℃和40℃进行试验，考察柱温赤藓糖醇保留特性的影响。

本发明获得了一种赤藓糖醇的定量测定方法，回收率达85％～90％，具有准确性高、不用衍生、操作简便、灵敏度高、环境友好和重现性好等优点，是一种实用的检测方法。

四、附图说明

图1赤藓糖醇的化学结构式。

五、具体实施方式

实施例1

本发明选用离子色谱和阴离子交换柱进行糖醇的色谱分析，在强碱性溶液中当其PH值大于糖醇的pKa值时，糖醇会部分或全部离解，以阴离子形式存在于溶液中，鉴于糖醇的pKa值在12～14，因此使用较大浓度氢氧化钠作为淋洗液，进行阴离子交换分离，对其浓度进行试验加以确定。

色谱条件为：氢氧化钠作为流动相，柱温30℃，脉冲安培检测器，流速为0.4ml/min，色谱柱为DIONEX Carbopac PA10阴离子分析柱(4mm×250mm)、DIONEX Carbopac PA10阴离子保护柱(4mm×50mm)。流动相浓度a为1000mmol/L，浓度b为750mmol/L，浓度c为500mmol/L，浓度d为250mmol/L，比较a、b、c、d四种浓度下，赤藓糖醇的分析结果。

分析比较以上四种不同浓度的流动相的结果，流动相浓度越大，糖醇的保留时间越短，这种效果随着物质保留特性由弱到强而逐渐明显，流动相氢氧化钠500mmol/L时，赤藓糖醇的分离效果相对来说最好。综合各因素，确定选用500mmol/L的氢氧化钠作为流动相，采用等浓度洗脱。

实施例2

初步拟定色谱条件为：500mmol/L氢氧化钠作为流动相等度洗脱，柱温30℃，脉冲安培检测器(金电极)，色谱柱为DIONEX Carbopac PA10阴离子分析柱(4mm×250mm)、DIONEXCarbopac PA10阴离子保护柱(4mm×50mm)。固定以上的条件，比较不同流动相流速对分析结果的影响，流速a为0.2ml/min，流速b为0.3ml/min，流速c为0.4ml/min，流速d为0.5ml/min。由于Carbopac PA10色谱柱有流速限制，所以考虑比较a、b、c、d这四种流速下，赤藓糖醇的离子色谱分析结果。

当流动相流速为0.2ml/min时，赤藓糖醇的保留时间在21min左右；当流动相流速为0.3ml/min时，赤藓糖醇的保留时间在14min左右；当流动相流速为0.4ml/min时，赤藓糖醇的保留时间在11min左右，而且分离度最好；当流动相流速为0.5ml/min时，赤藓糖醇的保留时间在8min左右；在做色谱分析工作时，最理想的结果应该是分离度越佳越好，因此选用流动相流速为0.4mL/min。

实施例3

研究发现在阴离子交换色谱中，糖醇的保留是一个放热过程(随温度升高，保留减弱)。但是，每种糖醇受温度的影响程度不同。所以，固定以上色谱条件，比较20℃、30℃、35℃、40℃四种不同柱温的分析结果。比较20℃、30℃、35℃、40℃四种不同柱温对应的色谱分析结果，可见，随着柱温的降低，保留时间有所提高。然后，还出现一个现象，当柱温为30℃时，赤藓糖醇和杂质的色谱峰未达到基线分离，柱温为35℃时，赤藓糖醇和杂质的色谱峰是完全分离的，因此，选用柱温为35℃。

实施例4

超声时间的长短应能够保证样品在此时间内均释放出95％以上的糖醇。通常，液体食品和半固体食品，所需超声时间应比固体食品短，胶基糖果是耗时最长的一类食品，所以选择胶基糖果为模型。

先称取一定质量的胶基糖果，用1000ml二次水定容稀释，超声10min、20min、30min、40min、50min、60min时，分别取10ml溶液，经0.22m尼龙滤膜过滤，取滤液供离子色谱分析，计算胶基糖果在对应超声时间溶出的糖醇的质量。结果显示，超声40min之后，赤藓糖醇的溶出量不再增加，可以认为，此时胶基糖果中赤藓糖醇已全部溶出。对于其余普通食品，所需超声时间通常小于该时间。所以，选择超声40min作为赤藓糖醇糖醇的超声提取时间。

Claims

1.一种赤藓糖醇的检测方法，其特征在于采用水溶、超声处理并用膜过滤后，用阴离子交换色谱-脉冲安培定量检测赤藓糖醇。

2.如权利要求1所述的一种赤藓糖醇的检测方法，其特征在于：超声处理为样本水溶后用超声处理10-60min。

3.如权利要求1所述的一种赤藓糖醇的检测方法，其特征在于：膜过滤为取10ml-15ml超声处理后的溶液，经0.2μm-0.3μm尼龙滤膜过滤，取滤液供离子色谱分析。

4.如权利要求1所述的一种赤藓糖醇的检测方法，其特征在于：阴离子交换色谱法的流动相为250mmol/L-1000mmol/L的氢氧化钠作为流动相，流动相流速为0.2mL/min-0.5mL/min。

5.如权利要求1所述的一种赤藓糖醇的检测方法，其特征在于：阴离子交换色谱法的色谱柱为DIONEX Carbopac PA10阴离子分析柱(4mm×250mm)、DIONEX Carbopac PA10阴离子保护柱(4mm×50mm)，柱温为20℃-40℃。

6.如权利要求1所述的一种赤藓糖醇的检测方法，其特征在于：检出限为4.62～100.05μg/L，线性范围均跨三个数量级，精密度、稳定性、重现性试验RSD均小于5％。