CN110514777A - 一种啤酒中多种糖、糖醇及醇类同时快速检测的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种啤酒中多种糖、糖醇及醇类同时快速检测的方法，属于分析化学领域,本发明采用积分脉冲安培‑离子色谱法，通过优化前处理检测方法，研究影响组分分离的实验因素，建立一次性同时检测啤酒中23种糖类、糖醇、醇类（2,3‑丁二醇、乙醇、甲醇、丙三醇、赤藓糖醇、木糖醇、岩藻糖、***糖醇、山梨醇、海藻糖、核糖醇、甘露醇、2‑脱氧‑D‑葡萄糖、甘露糖、蜜二糖、葡萄糖、麦芽糖醇、果糖、乳糖、核糖、蔗糖、棉子糖、麦芽糖）的方法，解决了对啤酒中糖类、糖醇及醇类多组分准确分析的技术难题，该方法快速、准确、灵敏，实现了多类别多组分的同时分析，对啤酒成份检测做出重要的贡献。

Description

一种啤酒中多种糖、糖醇及醇类同时快速检测的方法

技术领域

本发明属于分析化学领域，具体涉及一种啤酒中多种糖、糖醇及醇类同时快速检测的方法。

背景技术

啤酒是以麦芽和啤酒花为原料，经过糊化、糖化、液态发酵后酿制而成的酒精饮料，啤酒中含有多种维生素、氨基酸、糖类、糖醇类等成分。糖类化合物是一类多羟基醛或酮及其衍生物，是人体生命活动的能源物质，是许多食品和饮料的重要成分。糖醇是糖类的醛基或酮基被还原后的物质，通常是由对应的糖经过催化氢化而生成的甜味剂，具有预防糖尿病、热量低、口感好等优点。醇类是某些发酵食品中的重要组分，某些醇类有益于人体健康，但某些醇类例如丁二醇，具有一定的毒性。糖类的分析一直是分析化学的难点之一，目前食品安全国家标准《预包装食品营养标签通则》中规定，必须在食品的标签中明确标注食品的能量，即糖类的含量。基于糖醇和醇类在某些食品中的特殊性能和作用，这两类组分含量的检测也非常重要。

啤酒中糖、糖醇和醇类是其重要组分部分，其含量的大小直接关乎啤酒的质量和品质。目前，糖类、糖醇、醇类的分析方法主要有液相色谱法、液质联用法、气相色谱法、酶电极法、离子色谱法。液相色谱法方便通用，但灵敏度低，对于复杂基质的样品检测困难。气相色谱法灵敏度高，但是需要衍生，定量重复性差，不适宜做准确定量分析。酶电极法一般只对一种糖类进行检测，具有较好的专一性，但是不能进行多组分同时检测。

目前，人们对于啤酒中多种糖、糖醇及醇类同时检测的方法虽然有所研究，但在目前资料库中所能检索到的仅仅是对某一类组分（如单纯的糖类或醇类）或者同时检测的组分数量较少（仅对10种左右的糖和糖醇同时分析），不能满足日益增长的检测需求，因此，研究并建立一种适用性强、选择性好、灵敏度高的多种糖、糖醇及醇类同时检测的方法，具有重要的现实意义和应用价值。

发明内容

本发明的目的是针对上述现有技术的不足，采用积分脉冲安培-离子色谱法，优化前处理检测方法，通过对组分分离的影响因素的研究，建立了一次性同时检测啤酒中23种糖类、糖醇及醇类的方法，该方法快速、简便、灵敏度高、稳定性好，实现了快速分析和绿色分析，解决了啤酒中糖、糖醇及醇类多组分同时分析的技术问题。

为达到上述目的，本发明公开了一种啤酒中23种糖、糖醇及醇类同时检测的方法，其检测步骤如下；

步骤一、混合标准溶液的配置：

将2,3-丁二醇、乙醇、甲醇、丙三醇、赤藓糖醇、木糖醇、岩藻糖、***糖醇、山梨醇、海藻糖、核糖醇、甘露醇、 2-脱氧-D-葡萄糖、甘露糖、蜜二糖、葡萄糖、麦芽糖醇、果糖、乳糖、核糖、蔗糖、棉子糖、麦芽糖的标准溶液按需要配置混合标准溶液；

步骤二、待测样品前处理：

将啤酒待检样品超声处理30 min（去除二氧化碳），取啤酒待检样品0.100 g，加入超纯水约150 mL，摇匀静置15 min，调节稀释液pH值至5.0～6.5，全部转移至200 mL容量瓶中，采用超纯水定容至刻度，摇匀、静置15 min，取10.0 mL溶液，先过已经预活化的IC-H10柱（去除重金属离子），再过0.22 μm水相滤膜，最后过已经预活化的IC-RP柱，弃去前3 mL，收集后段清液，待上机检测。

步骤三、离子色谱条件及多级梯度淋洗条件

色谱分离柱：DionexCarboPacTM MA1(4×250 mm)；

保护柱：DionexCarboPacTM MA1 (4×50 mm)；

工作电极：Gold；

参比电极：AgCl电极；

流动相：A:1000 mmol/L NaOH溶液,B：超纯水；

流速：0.45 mL/min；

柱温：29 ℃；

进样量：10μL；

多级梯度淋洗条件：

多级梯度淋洗程序为：0.0-75.0 min时，淋洗液NaOH浓度为480.0 mmol/L；75.0-80.0min，淋洗液NaOH浓度为480.0-600.0 mmol/L；80.0-105.0 min，淋洗液NaOH浓度为600.0mmol/L；105.0-110.0 min，淋洗液NaOH浓度为600.0-480.0 mmol/L；110.0-120.0 min，淋洗液NaOH浓度为480.0 mmol/L；详见表1。

表1 离子色谱淋洗条件

步骤四、校准曲线绘制：

将步骤一中配置的混合标准溶液按照步骤三给出的色谱分析条件与多级梯度淋洗条件使用离子色谱仪进行检测，以待测组分质量浓度为横坐标，以待测组分峰面积为纵坐标，来绘制校准曲线，外标法定量；

步骤五、样品溶液的检测：

将步骤二中所得清液按照步骤三给出的色谱分析条件与多级梯度淋洗条件使用离子色谱仪进行检测，并计算结果；

步骤六、结果计算：

通过步骤四混合标准溶液所测得的结果来校正步骤五所测得计算结果，从而计算出所测啤酒中各组分含量。

作为优选；上述溶液均使用电阻率为18.2 MΩ·cm的超纯水配制。

有益效果：

1、啤酒中糖、糖醇和醇类多组分物质同时检测，一直是本分析领域的技术难题，本发明一次性同时测定了啤酒中23种糖、糖醇及醇类，大幅提高了检测工作效率，降低了检测人力物力成本，具有良好的经济效益和社会应用价值。

2、同时分离检测啤酒中23种糖类、糖醇、醇类是一项技术难度很大的工作。为了提高组分的整体分离度，经过多次实验对比，本发明选择在前75 min内采用480 mmol/L的氢氧化钠溶液进行等度淋洗，在80 min后采用600 mmol/L的氢氧化钠溶液进行色谱柱的强力冲洗，去除影响待测组分的干扰物，可以大幅度提高检测的准确度。

3、本发明深入考察分析了多级梯度淋洗条件、初始淋洗浓度、色谱柱温度、溶液pH值等实验影响因素，通过研究解析各种实验因素的影响机理，找出了最优实验分析条件，最大程度地提高了多组分同时检测时方法的准确性。

4、本发明通过研究发现，溶液pH值对啤酒中23种组分同时检测具有重要影响，pH值的变化直接导致某些组分的测定含量发生大幅波动。通过调节溶液pH值至5.0～6.5的范围内，可以大幅提高检测的准确度和精密度。

5、本发明分析了色谱柱温度对检测的影响，色谱柱温度每一摄氏度的变化，就会使某些组分重叠。在29 ℃柱温时，恰好能实现23种组分的有效分离。

6、本发明方法操作简便快速、灵敏准确，经过简单前处理，即可上机检测，23种组分在70 min内即可全部出峰。

7、在本发明检测方法中并没有使用或产生对人类健康、生态环境有毒害的溶剂、试剂、副产物，同时所用耗材很少，具有绿色、环保、节约的技术优点。

附图说明

图1为23种糖、糖醇及醇类混合标准溶液的离子色谱图。

图2为不同流速下标准溶液的离子色谱图。

图3为不同初始淋洗液浓度下混合标准溶液的离子色谱图。

图4为不同柱温下混合标准溶液的离子色谱图。

图5为5种常见啤酒样品的离子色谱图。

附图中各编号对应的物质:1. 2,3-丁二醇（2,3-Butanediol）；2. 乙醇（Alcohol）；3. 甲醇（Methanol）；4. 丙三醇（Glycerol）；5. 赤藓糖醇（Erythritol）；6. 木糖醇（Xylitol）；7. 岩藻糖（Fucose）；8. ***糖醇（Arabinitol）；9. 山梨醇（Sorbitol）；10. 海藻糖（Trehalose）；11. 核糖醇（Ribitol）；12.甘露醇（Mannitol）；13.2-脱氧-D-葡萄糖（2-Deoxy-D-glucose）；14. 甘露糖（mannose）；15. 蜜二糖（Melibiose）；16. 葡萄糖（Glucose）；17. 麦芽糖醇（Maltitol）；18. 果糖（Fructose）；19. 乳糖（Lactose）；20 核糖（Ribose）；21. 蔗糖（Sucrose）；22.棉子糖（Raffinose）；23.麦芽糖（Maltose）。

具体实施例

实施例一：一种啤酒中23种糖、糖醇及醇类同时检测的方法

1.仪器和试剂

离子色谱仪（Thermo Scientific公司 ICS5000+），配备电化学检测器和自动进样器（AS-SP）；Milli-Q超纯水仪(美国Millipore公司)；智能超声波清洗器（上海之信仪器有限公司DL-360E）；电子天平（梅特勒公司ML802/02）；实验用水：超纯水（电阻率18.2MΩ.cm）；糖类、糖醇、醇类标准品或标准试剂（纯度>98%）；氢氧化钠溶液（50%w/w，FisherChemical）；盐酸（优级纯）；IC-RP10柱（Agela Technologies）；IC-H10柱（AgelaTechnologies）。

2.离子色谱条件

色谱分离柱：Dionex CarboPac^TM MA1(4×250 mm)，保护柱：Dionex CarboPac^TM MA1(4×50 mm)；积分脉冲安培检测；工作电极：Gold(Au)；参比电极：AgCl电极；电位波形：Gold,Carbo,Quad；流动相：NaOH淋洗液；流速：0.45 mL/min；柱温：29 ℃；进样量：10μL。初始淋洗浓度：480 mmol/L NaOH溶液。

3.多级梯度淋洗条件

多级梯度淋洗程序为：0.0-75.0 min时，淋洗液NaOH浓度为480.0 mmol/L；75.0-80.0min，淋洗液NaOH浓度为480.0-600.0 mmol/L；80.0-105.0 min，淋洗液NaOH浓度为600.0mmol/L；105.0-110.0 min，淋洗液NaOH浓度为600.0-480.0 mmol/L；110.0-120.0 min，淋洗液NaOH浓度为480.0 mmol/L；详见表1。

4.混合标准溶液的配置

将2,3-丁二醇、乙醇、甲醇、丙三醇、赤藓糖醇、木糖醇、岩藻糖、***糖醇、山梨醇、海藻糖、核糖醇、甘露醇、2-脱氧-D-葡萄糖、甘露糖、蜜二糖、葡萄糖、麦芽糖醇、果糖、乳糖、核糖、蔗糖、棉子糖、麦芽糖的标准溶液按需要配置一定浓度的混合标准溶液。

5.前处理方法

取啤酒样品约10 g，超声30min（去除二氧化碳）。准确取啤酒待检样品0.10 g，加入超纯水约150 mL，摇匀静置15 min，调节稀释液的pH值至5.0～6.5，全部转移至200 mL容量瓶中，采用超纯水定容至刻度，摇匀、静置15 min，取10.0 mL溶液，先过已经预活化的IC-H10柱，再过0.22 μm水相滤膜，最后过已经预活化的IC-RP柱，弃去前3 mL，收集后段清液，待上机检测。

按照上述实验分析条件，对混合标准溶液的23种糖、糖醇及醇类进行检测，其检测结果如图1所示。

实施例二：流速对检测的影响

按照实施例一中的实验分析的条件，在其他条件不变的情况下先后测试淋洗液的流速为0.30 mL/min、0.40 mL/min、0.45 mL/min、0.50 mL/min流速条件下混合标准溶液的组分分离情况，不同流速下混合标准溶液的离子色谱图如图2所示；其淋洗液流速与***压力的关系如表2所示。

表2 淋洗液流速与***压力的关系

将图2和表2相结合可以得出，淋洗液流速越大，***压力越大，组分出峰时间越快，流速从0.30 mL/min增至0.50 mL/min，23种组分总出峰时间由90 min逐渐降至62 min，而***压力由890 psi逐步增大至1455 psi。从图1中看出，在0.30 mL/min时，***压力为890psi，因为流速低，压力较小，导致组分峰宽增大，色谱峰灵敏度明显下降。0.40 mL/min流速时，***压力达到1170 psi，虽然组分灵敏度有所提高，但是组分总出峰时间较长近80min。0.50 mL/min流速时，组分总出峰时间缩短，但是由于***压力较大，组分间的总体分离度变小，尤其是组分10和11，组分18和19之间分离度明显降低。而淋洗液流速在0.45 mL/min时，初始压力为1310 psi，23种组分在70 min内即可全部出峰，且灵敏度和分离度均比较理想。因此，从***稳定性、分离度、灵敏度因素考虑，本发明选择在0.45 mL/min流速下进行实验。

实施例三：多级梯度淋洗条件对检测的影响

按照实施例一中的实验分析的条件，在其他条件不变的情况下先后测试初始淋洗液浓度分别在450、470、480、490、500 mmol/L的条件下混合标准溶液组分分离情况，其混合标准溶液的组分分离情况如图3所示。

从图3中可以看出，初始淋洗浓度在450 mmol/L时，组分7和8、组分19和20的分离度不高，组分10和11几乎重叠；初始淋洗浓度在470 mmol/L时，组分10和11分离度不高；初始淋洗浓度分别为490、500 mmol/L时，组分14和15分离度明显下降，而组分18和19未实现分离；而初始淋洗浓度在480 mmol/L时，这23种组分的整体分离度和灵敏度最为理想。因此，从总体分离度考虑，本发明选择初始淋洗浓度480 mmol/L进行检测。

实施例四：色谱柱温对检测的影响

按照实施例一中的实验分析的条件，在其他条件不变的情况下先后测试在26℃、28℃、29℃、30℃、32℃色谱柱温下混合标准溶液的组分分离情况，其混合标准溶液的组分分离情况如图4所示。

从图4中可以看出，在26℃到32℃温度范围内，随着温度的升高，组分总出峰时间缩短，出峰速率增大。26℃时，组分10和11、组分17和18这两对组分几乎重叠；28℃时，组分10和组分11之间的分离度不高；30℃时，组分18和19之间的分离度较小，不能满足定量分析的要求；32℃时，组分18和组分19完全重叠，组分7和8、组分9和10、组分14和15这三对组分之间的分离度较小；29℃时，23种组分的分离度和灵敏度均较为理想。由此可见，温度对23种组分同时测定有显著的影响，每一摄氏度变化就可能导致两种或几种组分不能有效分离。综上，从提高方法的分离度、灵敏度、选择性角度考虑，本发明选取在29℃柱温下进行实验分析。

实施例五：pH值对检测的影响

按照实施例一中的实验分析的条件，在其他条件不变的情况下，依次配置不同pH值（2.0-12.0）的同一理论浓度的混合标准溶液进行上机检测，实验结果证实，丙三醇、岩藻糖、核糖醇、甘露糖、蜜二糖、葡萄糖、麦芽糖醇、核糖、麦芽糖这9种组分受溶液pH值影响较大，其他组分受pH值影响较小，不同pH值对丙三醇、岩藻糖、核糖醇、甘露糖、蜜二糖、葡萄糖、麦芽糖醇、核糖、麦芽糖检测的影响如图表3所示。

表3 溶液pH值对9种组分测定含量的影响

从表3中可以看出，丙三醇和葡萄糖测定含量在强酸和强碱性条件下，均出现了一定程度的增大，这是因为很多组分在一定pH值条件下（如强酸或强碱环境），容易生成一定量的葡萄糖，而丙三醇是一种三元醇，具有三个羟基，在强酸或者强碱条件下，更容易离子化，检测含量增大；岩藻糖、甘露糖、蜜二糖、核糖在酸性条件下测定含量变化不大，而在pH值大于8.3的碱性条件下，测定含量出现了一定程度的降低，特别是蜜二糖在pH值11.0时，测定含量仅有中性时的64.8%；核糖醇在pH值小于4.1酸性条件下和pH值大于8.3的碱性条件下，测定含量出现了一定波动，影响了定量分析；麦芽糖在酸性和碱性条件下，测定含量均出现了降低，这是因为此时麦芽糖容易发生水解等反应。从表3中看出，在pH值5.0-6.5的弱酸条件下，9种组分测定含量变化很小，波动全部在3.8%以内，说明此时组分离子含量稳定。因此，综合考虑23种组分物化特性、解离程度、灵敏度等影响因素，本发明选择在pH值5.0-6.5的弱酸条件进行测定分析。

实施例六：线性范围与检出限

配置不同浓度的混合标准溶液，使用实施例1中的实验仪器及色谱条件进行校准曲线拟合。通过色谱峰信噪比来计算待测组分的检出限（S/N=3），在0.10 mg/L～10.0 mg/L浓度范围内，进行了7个不同浓度水平（0.10、0.20、0.40、1.0、2.0、4.0、10.0 mg/L）混合标准溶液的检测和线性拟合。其结果如表4所示。

表4 测定组分的线性范围、线性方程、相关系数及检出限（S/N=3）

Y：峰面积（nC．min），X：质量浓度（mg/L）

从表4可以得到23种组分线性相关系数R²全部大于0.999，其中有18种组分相关系数R²大于0.9995，同时23种组分线性方程的截距的绝对值均小于0.008，这充分说明在此实验条件下，23种组分同时测定方法稳定、线性良好。除了甲醇和乙醇外，其他21种组分检出限在0.0109～0.2069 mg/L之间。

实施例七：回收率与精密度的测定

随机抽取3种啤酒样品，依次向3个样品中添加浓度级别水平分别为0.20 mg/L、1.00mg/L、2.00 mg/L的混合标准溶液，每个浓度水平进行6次平行测定实验，来验证不同啤酒基质测定时方法的回收率和精密度，根据基质浓度、添加浓度和添加后测定浓度计算回收率。表5列出三浓度水平、六次平行检测的平均回收率和RSD数据。

表5 测定组分的回收率及精密度（RSD）（n=6）

从表5中可以看出，在0.20 mg/L添加浓度水平下，仅有甲醇的回收率是79.70%，但能够满足食品理化检验技术要求（测定含量小于0.10 mg/L，回收率应在60%～120%）。23种糖类、糖醇、醇类组分在三种基质中三浓度水平下的回收率在79.70%～107.13%之间，测定数据RSD在1.78%～10.85%范围内。这充分说明，三种基质、六次平行检测回收率数据结果符合食品理化检测要求，该检测方法准确性高、精密度好。

实施例八：实际样品的测定

依次抽取5种常见啤酒（啤酒-1、啤酒-2、啤酒-3、黑啤酒-1、黑啤酒-2），按照实施例一中离子色谱条件和前处理步骤，进行了实际样品中23种糖类、糖醇、醇类组分含量的检测分析，图5是实际样品测定离子色谱图，表6是检测组分数据结果

表6 啤酒样品的测定结果（mg/L）

“－”：未检出

从图5和表6中可以看出，五种啤酒中检出的糖类、糖醇、醇类组分数量依次是12、14、11、16、15种，啤酒中检出有益组分的种类越多、含量越大，其品质越好，实验测定结果与样品实际品质状况完全相符。从检出组分来看，检出含量较大的组分是丙三醇、乙醇、乳糖、葡萄糖、海藻糖、山梨醇、甘露醇等。从啤酒种类来看，黑啤酒中糖类、糖醇比黄啤酒中种类更丰富。

从上面实际样品离子色谱图可以看出，检测基线稳定，峰形尖锐，受其他物质干扰较小，这充分说明该检测方法稳定性良好、准确性高。从实际样品测定结果看，该检测方法操作简便、快速准确、实用性强。

本发明通过对初始淋洗浓度、流速、柱温、溶液pH值等多种实验影响因素的分析讨论，探索出了啤酒中23种糖、糖醇及醇类同时测定的梯度淋洗条件，建立了积分脉冲安培-离子色谱法同时测定23种糖、糖醇及醇类的分析方法。该方法简便、快速、灵敏、准确，适于啤酒中23种糖、糖醇及醇类的快速分析。

本发明的保护内容不局限于以上实施例，在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。

Claims (2)

1.一种啤酒中多种糖、糖醇及醇类同时快速检测的方法，其特征在于包括以下步骤：

步骤一、混合标准溶液的配置：

将2,3-丁二醇、乙醇、甲醇、丙三醇、赤藓糖醇、木糖醇、岩藻糖、***糖醇、山梨醇、海藻糖、核糖醇、甘露醇、 2-脱氧-D-葡萄糖、甘露糖、蜜二糖、葡萄糖、麦芽糖醇、果糖、乳糖、核糖、蔗糖、棉子糖、麦芽糖的标准溶液按需要配置混合标准溶液；

步骤二、待测样品前处理：

将啤酒待检样品超声处理30 min，取啤酒待检样品0.100 g，加入超纯水约150 mL，摇匀静置15 min，调节稀释液pH值至5.0～6.5，全部转移至200 mL容量瓶中，采用超纯水定容至刻度，摇匀、静置15 min，取10.0 mL溶液，先过已经预活化的IC-H10柱，再过0.22 μm水相滤膜，最后过已经预活化的IC-RP柱，弃去前3 mL，收集后段清液，待上机检测；

步骤三、离子色谱条件及多级梯度淋洗条件：

色谱分离柱：Dionex CarboPacTM MA1(4×250 mm)；

保护柱：Dionex CarboPacTM MA1 (4×50 mm)；

工作电极：Gold；

参比电极：AgCl电极；

流动相：A:1000 mmol/L NaOH溶液,B：超纯水；

流速：0.45 mL/min；

柱温：29 ℃；

进样量：10μL；

多级梯度淋洗条件

多级梯度淋洗程序为：0.0-75.0 min时，淋洗液NaOH浓度为480.0 mmol/L；75.0-80.0min，淋洗液NaOH浓度为480.0-600.0 mmol/L；80.0-105.0 min，淋洗液NaOH浓度为600.0mmol/L；105.0-110.0 min，淋洗液NaOH浓度为600.0-480.0 mmol/L；110.0-120.0 min，淋洗液NaOH浓度为480.0 mmol/L；步骤四、校准曲线绘制：

将步骤一中配置的混合标准溶液按照步骤三给出的色谱分析条件与多级梯度淋洗条件使用离子色谱仪进行检测，以待测组分质量浓度为横坐标，以待测组分峰面积为纵坐标，来绘制校准曲线，外标法定量；

步骤五、样品溶液的检测：

将步骤二中所得清液按照步骤三给出的色谱分析条件与多级梯度淋洗条件使用离子色谱仪进行检测，并计算结果；

步骤六、结果计算：

通过步骤四混合标准溶液所测得的结果来校正步骤五所测得计算结果，从而计算出所测啤酒中各组分含量。

2.根据权利要求1所述的一种啤酒中多种糖、糖醇及醇类同时快速检测的方法，其特征在于，上述溶液均使用电阻率为18.2 MΩ·cm的超纯水配制。