CN105675758A - 一种同时检测含乳制品中多种糖及糖醇的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种同时检测含乳制品中多种糖及糖醇的方法,所述方法为HPLC-示差折光检测法,其特征在于所述HPLC的色谱条件为:色谱柱采用酰胺键合柱,流动相为丙酮、水和三乙胺的单流动相,等度洗脱;柱温:70℃;流速:0.8ml/min;进样量:10μL。本发明检测方法可适用于牛奶、糕点、糖果、奶粉等含乳制品。通过对样品进行简单处理即可检测,该方法快捷,回收率高,方法的线性范围宽,相关系数好,检出限低,填补了乳制品中糖及糖醇同时检测的空白。
Description
技术领域
本发明涉及一种牛奶、糕点、糖果、奶粉等含乳制品中糖和糖醇的检测方法,特别涉及一种同时检测上述食品中山梨糖醇、麦芽糖醇、木糖醇、果糖、葡萄糖、蔗糖、乳糖的高效液相色谱检测方法。
背景技术
目前糖类检测方法的研究中,主要有高效液相色谱(HPLC)-荧光检测法(FLD),HPLC-示差折光法(RID),离子色谱法,高效液相色谱-质谱联用法(HPLC-MS/MS),高效气相色谱质谱联用法(GC-MS/MS)。HPLC-FLD法虽然灵敏度较高,但是具有较强的选择性;离子色谱法具有较好的重复性和准确性,但是糖类能在电极表面还原样品中某些分子;HPLC-MS/MS法和GC-MS/MS法虽然具有高分离、高选择、高灵敏的特性,但是其设备昂贵,操作复杂,通用性较差;现行国标中对单、双糖、糖醇的检测方法主要为化学还原法和HPLC-示差折光检测法(RID),但前者费时,操作繁琐,并且只能对具有还原性的糖进行定量检测,无法准确定性;而HPLC-示差折光检测法(RID)具有操作简便,灵敏度高的优点,是常用的方法。
在国标及日常糖类检测的液相色谱柱方面,目前较常使用的色谱柱是氨基柱,虽然氨基柱在糖类分析中有较高的灵敏度和分离度,但是氨基柱连通的HPLC-示差折光检测器(RID)灵敏度高,***较难平衡。而且氨基容易水解,当样品通过时,水解产物可以与样品一同进入检测器检测造成干扰。在长时间的使用过程中,流动相通过氨基柱时氨基基团会有脱落,存在噪声;当样品纯度不高时,噪声也会很大,氨基柱的柱效下降很快。氨基柱的柱效下降是由氨基本身特性决定的,使用后的常规保养是起不到太大作用的,所以导致氨基柱的使用寿命较短。
同时,目前用于糖类检测的HPLC常采用反相***,在流动相的选择上,多选择乙腈和水为流动相,通过乙腈与水不同比例的混合达到分离特定糖类的目的。但是在氨基柱-乙腈水***的分析中,随着检测糖类数量的增加,氨基柱的柱效下降,部分糖类不能有效的分离。为了增大分离度,就需要不断调整乙腈水的比例,但是当有机相乙腈比例增大到一定程度后,氨基柱有效键合就会被破坏,从而降低柱寿命。
鉴于不同国家对糖及糖醇的不同要求和食品标签强制性标准的施行,以及进一步监督食品生产,预防不法商贩利用糖类添加剂的美味、廉价等优点,达到某种营养指标,对食品进行非法添加,所以需要对常用糖及糖醇进行检测。为了缩短检测周期,提高工作效率,需要建立一种食品中多种糖及糖醇的同时检测方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种高速、准确、有效的同时检测含乳制品中多种糖及糖醇的高效液相色谱分析方法,以大大减轻逐个检测的工作量,提高检测效率,保证产品的质量。
本发明选择WatersXbridgeAmide柱作为HPLC色谱柱,Amide柱是酰胺键合柱,相对于氨基键合柱的稳定性更高,柱流失减少,与示差折光检测器(RID)结合噪音较小,***易平衡,且Amide柱pH耐受性极佳,耐高温,随着柱温的升高,糖及糖类分析分离度明显增强,在70℃以上单糖分析效果最强,最高耐受温度为90℃,柱效下降慢,且柱子使用寿命更长。
本发明选择丙酮、水和三乙胺为流动相,***为正相***,结合WatersXbridgeAmide柱,耐酸碱性极佳,耐高温,机器噪音小,***易平衡,且对糖及糖类分离度高,灵敏度高,分析效果好,随着检测样品数量的增加,柱效下降慢;当大量检测后为了防止柱效下降,主要流动相丙酮、水比例不需改变,仅仅调整三乙胺的加入量即可保持柱效,且三乙胺加入量很小,对色谱柱填充物不会造成影响,色谱柱寿命长。
本发明采用的具体技术方案如下:
一种同时检测含乳制品中多种糖及糖醇的方法,所述方法为HPLC-示差折光检测法,其特征在于所述HPLC的色谱条件为:色谱柱采用酰胺键合柱,流动相为丙酮、水和三乙胺的单流动相,等度洗脱;柱温为70℃,流速为0.8mL/min,进样量为10μL。
上述酰胺键合柱具体型号为WatersXbridgeAmide。
上述流动相的组成为:丙酮:水=77:23(V/V),每1000mL流动相加入0.115-0.345mL三乙胺;当目标物分离度下降时,在上述范围内适当增加三乙胺的量。
本发明具体的检测步骤如下:
(1)糖单标溶液的配制:分别准确称取山梨糖醇、麦芽糖醇、木糖醇、果糖、葡萄糖、蔗糖、乳糖配制成标准储备液,待用;
(2)标准工作溶液的配制:分别取上述浓度的标准储备液,配制成标准工作溶液;
(3)样品的制备:取样品5.00-20.00g,加水溶解,再加入沉淀剂混合摇匀,最后加入水定容至50mL,混匀后,离心机离心6000r/min,4℃条件下离心5min,取上清液,用0.22μm针头滤膜过滤,滤液供检测;
(4)样品检测:选择液相外标法定量,按照一定浓度配制标准工作溶液,用标准溶液的浓度和相应单体峰面积信号做工作曲线,根据待测样品中单体的响应峰面积和样品量,利用公式1进行计算:
(1)
式中:
X—试样中待测组分的含量(mg/g),
C—从标准曲线计算得到待测组分的浓度(mg/mL),
V1—试样溶液定容的体积(mL),
m—称取样品的质量(g)。
上述步骤(3)中所述的沉淀剂为亚铁***-乙酸锌、0.5%乙酸、氢氧化钠-硫酸铜溶液中的一种或多种。
所述的亚铁***-乙酸锌溶液的浓度分别为乙酸锌22wt%,亚铁***10.6wt%。
本发明检测方法可适用于牛奶、糕点、糖果、奶粉等含乳制品。检测结果表明:本发明检测样品分析谱图基线平稳,保留时间稳定,目标物与干扰物可以完全分离,由于以上基质涵盖了绝大多数检测样品基质的高糖分,高粘度,高干扰等特点,大量进样后,机器性能及谱图仍然稳定,且分离度好,没有较大波动,以上表明此方法对样品检测的适用性好,且抗干扰能力强。
本发明的有益效果:建立了多种糖及糖醇山梨糖醇、麦芽糖醇、木糖醇、果糖、葡萄糖、蔗糖、乳糖同时检测的液相色谱方法,样品前处理简单,方法快捷,灵敏度高,回收率高,方法的线性范围宽,相关系数好,检出限低,适用性良好,填补了国内以上糖及糖醇同时检测的空白,大大提高了工作效率。
附图说明
图1七种糖及糖醇高效液相色谱图。
图2牛奶样品的高效液相色谱图。
图3糕点样品的高效液相色谱图。
图4糖果样品的高效液相色谱图。
图5奶粉样品的高效液相色谱图。
图6采用全新氨基柱检测的糖类高效液相色谱图。
图7采用氨基柱检测100次后糖类的高效液相色谱图。
图8采用氨基柱检测300次后糖类的高效液相色谱图。
图9采用酰胺柱和乙腈-水检测糖类的高效液相色谱图。
图10采用酰胺柱和丙酮-水检测糖类的高效液相色谱图。
图11采用酰胺柱检测500次后糖类的高效液相色谱图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例,并通过对比例来进一步详细说明本发明。
本发明涉及的仪器与设备:1100HPLC(美国Agilent公司)配示差折光检测器;WatersXbridgeAmide(3.5μm,4.6*250mm,美国Waters公司);PL602-S天平(Mettler-Toledo公司);CR22GⅢ离心机(日本HITACHI);移液枪(10--100μL,20-200μL,100-1000μL,5000μL,Eppendorf公司);0.22μm滤膜(德国Membrana公司)。
本发明HPLC的流动相为丙酮、水和三乙胺的单流动相(丙酮:水=77:23(V/V),每1000mL流动相加入0.230mL三乙胺),等度洗脱;柱温为70℃,流速为0.8mL/min,进样量为10μL。
本发明涉及的试剂与材料:麦芽糖醇、木糖醇、山梨糖醇、蔗糖、乳糖、果糖、葡萄糖,纯度均>99%;丙酮(色谱纯);三乙胺(优级纯)。
实施例1:牛奶样品中七种糖及糖醇的检测
(1)七种糖单标溶液的配制:分别准确称取山梨糖醇、麦芽糖醇、木糖醇、果糖、葡萄糖、蔗糖、乳糖配制成标准储备液,其中乳糖的标准储备液浓度均为100mg·mL-1,木糖醇、果糖、山梨糖醇、葡萄糖、蔗糖的标准储备液浓度均为150mg·mL-1,麦芽糖醇的标准储备液浓度为200mg·mL-1,待用;标准系列浓度见表1。
表1七种糖标准储备液浓度及标准系列溶液浓度
(2)标准工作溶液的配制:木糖醇标准工作溶液60mg·mL-1:取150mg·mL-1木糖醇标准储备液4.00mL入10mL容量瓶中,加水定容至刻度;果糖标准工作溶液60mg·mL-1:取150mg·mL-1果糖标准储备液4.00mL入10mL容量瓶中,加水定容至刻度;山梨糖醇标准工作溶液60mg·mL-1:取150mg·mL-1山梨糖醇标准储备液4.00mL入10mL容量瓶中,加水定容至刻度;葡萄糖标准工作溶液60mg·mL-1:取150mg·mL-1葡萄糖标准储备液4.00mL入10mL容量瓶中,加水定容至刻度;蔗糖标准工作溶液60mg·mL-1:取150mg·mL-1蔗糖标准储备液4.00mL入10mL容量瓶中,加水定容至刻度;麦芽糖标准工作溶液50mg·mL-1:取200mg·mL-1麦芽糖标准储备液2.50mL入10mL容量瓶中,加水定容至刻度;乳糖标准工作溶液50mg·mL-1:取100mg·mL-1乳糖标准储备液5.00mL入10mL容量瓶中,加水定容至刻度。
如下表2所示,七种糖及糖醇的标准曲线线性均在0.98以上,线性较好,线性范围为0.40-60mg/mL,最低定量限为0.27-0.50mg/mL,线性范围比较大,且灵敏度较高。
表2七种糖及糖醇曲线方程、相关系数、线性范围及检出限表
名称 | 曲线方程 | 相关系数 | 线性范围/(mg·mL-1) | 检出限/(mg·mL-1) |
木糖醇 | y=43931.3954*Amt+2333.0999 | 0.9997 | 0.50-20 | 0.34 |
果糖 | y=90992.2377*Amt-25104.5176 | 0.9896 | 1.00-50 | 0.50 |
山梨糖醇 | y=95026.3683*Amt-13944.083 | 0.9855 | 0.40-20 | 0.27 |
葡萄糖 | y=96751.3872*Amt-26577.662 | 0.9888 | 1.00-40 | 0.43 |
蔗糖 | y=96225.0497*Amt-28558.309 | 0.9878 | 1.00-50 | 0.21 |
麦芽糖醇 | y=100888.370*Amt-16364.615 | 0.9907 | 0.60-60 | 0.28 |
乳糖 | y=98278.6544*Amt-6355.2131 | 0.9918 | 0.75-50 | 0.49 |
(3)以牛奶为检测基质,样品的制备:充分混匀样品,取样品10.00-20.00g,加水混合,加入2.5mL乙酸锌22wt%,2.5mL亚铁***10.6wt%,混匀,再加入水定容至50mL,混匀后,离心机离心6000r/min,4℃条件下离心5min,取上清液,用0.22μm针头滤膜过滤,滤液供检测;
(4)选择液相外标法定量,按照一定浓度配制标准工作溶液,用标准溶液的浓度和相应单体峰面积信号做工作曲线,根据待测样品中单体的响应峰面积和样品量,利用公式1进行计算:
(1)
式中:
X—试样中待测组分的含量(mg/g),
C—从标准曲线计算得到待测组分的浓度(mg/mL),
V1—试样溶液定容的体积(mL),
m—称取样品的质量(g)。
牛奶样品中七种糖醇的3种不同浓度的检测结果及回收率结果见表3。由步骤(3)可以看出,此方法前处理简单,去除了影响回收和提取的步骤,简便快速。由图2可以看出,目标物被完全分离,液相方法的分离效果好,分离度高。由表3可知7种糖及糖醇回收率均在79%-106%间,回收率较好。综上所述,此发明方法对牛奶的前处理简便快速,液相方法对其中的7种糖及糖醇分离度高,此方法对牛奶的适用性好。
实施例2:糕点样品中七种糖及糖醇的检测
步骤(1)和(2)与实施例1相同;
(3)样品的制备:充分混匀样品,取样品约5.00g,加水溶解混合,加入2.5mL乙酸锌22wt%,2.5mL亚铁***10.6wt%,混匀,定容至50mL,混匀后,离心机离心6000r/min,4℃条件下离心5min,取上清液,用0.22μm针头滤膜过滤,滤液供检测;
选择液相外标法定量,按照一定浓度配制标准工作溶液,用标准溶液的浓度和相应单体峰面积信号作工作曲线,根据待测样品中单体的响应峰面积和样品量,利用公式1进行计算:
(1)
式中:
X—试样中待测组分的含量(mg/g),
C—从标准曲线计算得到待测组分的浓度(mg/mL),
V1—试样溶液定容的体积(mL),
m—称取样品的质量(g)。
七种糖醇的3种不同浓度回收率结果见表3。
由表3可知糕点中7种糖醇回收率均在77%-108%之间,回收率较好。
综上所述,此方法前处理简单,只要简单的稀释定容,即可满足检测的需要,最大限度的去除了影响回收的步骤。由图3可以看出,目标物被完全分离,有效的避开了干扰,液相方法的分离效果好,分离度高。由表3可知7种糖及糖醇回收率均在77%-108%之间,回收率较好。此发明方法对糕点的前处理简便快速,液相方法对其中的7种糖及糖醇分离度高,此方法对糕点的适用性好。
实施例3:糖果样品中七种糖及糖醇的检测
步骤(1)和(2)与实施例1相同;
(3)样品的制备:充分混匀样品,取样品约5.00g,加水溶解混合,加入2.5mL乙酸锌22wt%,2.5mL亚铁***10.6wt%,混匀,定容至50mL,混匀后,离心机离心6000r/min,4℃条件下离心5min,取上清液,用0.22μm针头滤膜过滤,滤液供检测;
选择液相外标法定量,按照一定浓度配制标准工作溶液,用标准溶液的浓度和相应单体峰面积信号作工作曲线,根据待测样品中单体的响应峰面积和样品量,利用公式1进行计算:
(1)
式中:
X—试样中待测组分的含量(mg/g),
C—从标准曲线计算得到待测组分的浓度(mg/mL),
V1—试样溶液定容的体积(mL),
m—称取样品的质量(g)。
糖果中七种糖醇的3种不同浓度回收率结果见表3。由表3可知糖果中7种糖醇回收率均在79%-104%之间,回收率较好。此发明方法对糖果的前处理简便快速,液相方法对其中的7种糖及糖醇分离度高,此方法对糖果的适用性好。
实施例4:奶粉样品中七种糖及糖醇的检测
步骤(1)和(2)与实施例1相同;
(3)样品的制备:充分混匀样品,取样品约5.00g,加水溶解混合,加入2.5mL乙酸锌22wt%,2.5mL亚铁***10.6wt%,混匀,定容至50mL,混匀后,离心机离心6000r/min,4℃条件下离心5min,取上清液,用0.22μm针头滤膜过滤,滤液供检测;
选择液相外标法定量,按照一定浓度配制标准工作溶液,用标准溶液的浓度和相应单体峰面积信号作工作曲线,根据待测样品中单体的响应峰面积和样品量,利用公式1进行计算:
(1)
式中:
X—试样中待测组分的含量(mg/g),
C—从标准曲线计算得到待测组分的浓度(mg/mL),
V1—试样溶液定容的体积(mL),
m—称取样品的质量(g)。
因为奶粉,特别是婴幼儿配方奶粉,其成分比较复杂,干扰物多,目标物分离难度大,由图5可以看出,目标物被完全分离,有效的避开了干扰,此方法的分离效果好,分离度高。奶粉中七种糖醇的3种不同浓度回收率结果见表3。由表3可知奶粉中7种糖醇回收率均在74%-110%之间,回收率较好。此发明方法对奶粉的前处理简便快速,液相方法对其中的7种糖及糖醇分离度高,此方法对奶粉的适用性好。
表3不同基质中7种糖及糖醇回收率表
综上所述,此发明方法对牛奶、糕点、糖果、奶粉前处理简单,只要加入沉淀剂,离心,上清液过滤膜,即可满足检测的需要,最大限度的去除了影响回收的步骤。由图2-5可以看出,目标物被完全分离,液相方法的分离效果好,分离度高,回收率在74%-110%之间,回收效果好。本发明对牛奶、糕点、糖果、奶粉的适用性好。
对比例1:采用氨基色谱柱及不同流动相进行比较
步骤(1)、(2)和(3)与实施例1相同;
(4)采用新启用的氨基色谱柱对果糖、葡萄糖、蔗糖和乳糖进行分析,应用乙腈-水(v/v=90:10)为流动相,流速1.0mL/min,柱温30℃,进样量10μL。结果如图6所示。图7和图8分别为100次和300次糖类检测后的色谱图。由图6-8可以看出,新启用的氨基柱,糖类分析分离度较好,目标糖类可以完全分离;随着检测样品数的增多,氨基柱柱效下降很快,当糖类检测100次左右后,果糖与葡萄糖不能完全分离,且乳糖出现肩峰,或是拖尾;当继续增加检测次数,300次左右糖类检测后,柱子填料有塌陷,如图8,综上可以看出,氨基柱柱效下降很快,分离效果不理想。
(5)采用用酰胺柱对果糖、葡萄糖、蔗糖和乳糖进行分析,应用乙腈水为流动相乙腈水(v/v=90:10)为流动相,流速1.0mL/min,柱温70℃,进样量10μL,检测结果如图9。
(6)采用WatersXbridgeAmide酰胺柱对果糖、葡萄糖、蔗糖和乳糖进行分析,丙酮、水和三乙胺的单流动相(丙酮:水=77:23(V/V),每1000mL流动相加入0.230mL三乙胺),等度洗脱;柱温为70℃,流速为0.8mL/min,进样量为10μL。新柱和500次检测后的结果如图10和图11所示。
由图9-11可以看出酰胺柱-乙腈水流动相体系虽然分离度高,但是出峰时间长,对于大批量进样浪费了时间和流动相。酰胺柱-丙酮水流动相体系,对果糖、葡萄糖分离度高,检测时间短,且流动相对柱子填料影响小,多次进样峰形仍然很好,没有出现肩峰及峰明显变宽现象,柱效下降慢。
综上所述:采用的酰胺柱-丙酮水流动相体系对大批量糖醇检测效果好,节约时间和试剂,提高了检测效率。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点,并不以此限制本发明的保护范围。本领域的普通技术人员都会理解,在本发明的保护范围内,对于上述实施例进行修改,添加和替换都是可能的,其都没有超出本发明的保护范围。
Claims (7)
1.一种同时检测含乳制品中多种糖及糖醇的方法,所述方法为HPLC-示差折光检测法,其特征在于所述HPLC的色谱条件为:色谱柱采用酰胺键合柱,流动相为丙酮、水和三乙胺的单流动相,等度洗脱;柱温:70℃;流速:0.8ml/min;进样量:10μL。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于所述酰胺键合柱具体型号为WatersXbridgeAmide。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于所述流动相的体积比组成为:丙酮:水=77:23,每1000ml流动相加入0.115-0.345ml三乙胺。
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于所述的乳制品为牛奶、糕点、糖果、奶粉中的一种。
5.根据权利要求1所述的方法,其特征在于具体的检测步骤如下:
(1)糖单标溶液的配制:分别准确称取山梨糖醇、麦芽糖醇、木糖醇、果糖、葡萄糖、蔗糖、乳糖配制成标准储备液,待用;
(2)标准工作溶液的配制:分别取上述浓度的标准储备液,配制成标准工作溶液;
(3)样品的制备:取样品5.00-20.00g,先加入适量水溶解,再加入沉淀剂混合摇匀,最后加水定容至50ml,混匀后,离心机离心6000r/min,4℃条件下离心5min,取上清液,用0.22μm针头滤膜过滤,滤液供检测;
(4)样品检测:选择液相外标法定量,按照一定浓度配制标准工作溶液,用标准溶液的浓度和相应单体峰面积信号做工作曲线,根据待测样品中单体的响应峰面积和样品量,利用下列公式进行计算:
式中:
X—试样中待测组分的含量(mg/g),
C—从标准曲线计算得到待测组分的浓度(mg/mL),
V1—试样溶液定容的体积(mL),
m—称取样品的质量(g)。
6.根据权利要求5所述的方法,其特征在于步骤(3)中所述的沉淀剂为亚铁***-乙酸锌、0.5%乙酸、氢氧化钠-硫酸铜溶液中的一种或多种。
7.根据权利要求6所述的方法,其特征在于所述的亚铁***-乙酸锌溶液的浓度分别为乙酸锌22wt%,亚铁***10.6wt%。
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