CN105510474A - 一种同时测定果实或果酒中的有机酸和可溶性糖的方法 - Google Patents
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Abstract
一种同时测定果实或果酒中的有机酸和可溶性糖的方法,采用高效液相色谱仪,二极管阵列检测器或DAD甲测器与示差检测器串联使用,紫外波长为190-280nm,分析柱氢离子交换柱,流动相是水相A:0.001mol/L-0.005mol/L的硫酸溶液;有机酸B:乙腈;且A的体积百分比为96%~100%,B的体积百分比为4%-0%,流速为为0.3-0.5mL/min,进样量为5-20μl。检测时间:55min。采用外标法定量分析计算水果中12种有机酸和3种糖的含量。本发明具有组份峰呈现性好,分辨率高,重复性好,可表征各种类型的有机酸和糖的组成,结构特征的优点。
Description
技术领域
本发明属于果实或果酒中的检测领域,具体涉及一种同时测定果实或果酒中的有机酸和可溶性糖的方法。
背景技术
果实中的可溶性糖和有机酸含量是果实品质形成的重要基础,与其风味品质密切相关,在果实的生物发育过程中不断变化,与果实中糖酸及其他物质的代谢、运转、合成及转化等有密切的关系。果实糖酸的种类、含量及其动态变化也是目前高品质生产的研究热点之一。近年来在柑橘、苹果、李、杏等主要果树上的相关研究已有报道。
有机酸的测定方法有离子色谱法、毛细管电泳法、气相色谱法等。离子色谱法一般要用稀强酸做淋洗液,对仪器会造成一定的腐蚀;毛细管电泳法分离度较高,但重复性不好,精密度不高,所测的有机酸含量不准确;气相色谱法需要对难挥发的有机酸进行衍生化处理,步骤繁冗。高效液相色谱是目前普遍采用的测定有机酸的方法,该方法简单、便捷、精密度高,克服了以上的方法的不足。由于糖在紫外和可见光区没有吸收,因此采用高效液相色谱法测定糖时,为了提高分析灵敏度,需经适当方法衍生后用UV或DAD检测。
示差折光检测器(RefractiveIndexDetector,RID)是一种高度稳定和灵敏的液相色谱和凝胶色谱用检测器。其原理是通过比较折光率的变化来检测流动相的样品峰。对于只有紫外末端吸收的物质,用紫外检测灵敏度相对较低,同时易发生基线漂移,而用示差折光检测器可取得较为理想的结果,如聚合物、糖、有机酸等。示差折光检测法(RID)分析糖,样品毋需衍生,方法快速、直接,但RID无法进行梯度洗脱,检测灵敏度低。通用性质量浓度型检测器(ELSD)对没有紫外吸收、荧光或电活性的物质以及产生末端紫外吸收的物质均能产生响应,适于低含量糖类测定。如闫建荣掣采用ELSD2000蒸发光散射检测器-高效液相色谱测定了鱼腥草中的果糖、葡萄糖、甘露糖等八种糖。
现有技术中大多数是利用不同的色谱柱和前处理分别进行糖和酸的测定,还未出现能够采用高效液相色谱DAD检测器串联示差检测器同时测定水果中的12个有机酸(草酸、柠檬酸、酒石酸、奎尼酸、琥珀酸、苹果酸、富马酸、乙酸、丙酸、异丙酸、丁酸、苯甲酸)和3种糖(果糖、蔗糖、葡萄糖)的相关文献或报道。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足,提供一种同时测定果实或果酒中的有机酸和可溶性糖的方法。本发明采用高效液相色谱DAD检测器-串联示差检测器能同时测定水果中12种有机酸(分别为:草酸、柠檬酸、酒石酸、奎尼酸、琥珀酸、苹果酸、富马酸、乙酸、丙酸、异丙酸、丁酸、苯甲酸)和3种糖(果糖、蔗糖、葡萄糖),操作简单快捷。
为实现上述目的,本发明采用如下技术方案:
一种同时测定果实或果酒中的有机酸和可溶性糖的方法,包括如下步骤:
(1)标准样品溶液的制备
分别称取色谱纯的草酸、柠檬酸、酒石酸、琥珀酸、苹果酸、奎尼酸、富马酸、乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、苯甲酸(12种有机酸),葡萄糖、果糖、蔗糖(3种糖),然会用流动相水相制备该12种有机酸标准品不同浓度梯度在0.01-1mg/mL的标准样品溶液、3种糖组分不同浓度梯度在0.1-75mg/mL的标准样品溶液;
(2)待测液的制备
鲜样的制备:称取10g鲜样置于组织捣碎机中,并加入100ml80wt%乙醇溶液匀浆1min,取10ml的匀浆以3000rpm/min离心10min后分出上清液,将上清液转入50mL容量瓶中,且离心的残渣再用80wt%乙醇溶液洗涤两次,每次15ml,离心10min;合并上清液,用80wt%乙醇溶液定容混匀得提取液;取5.00mL提取液于蒸发皿中,且于70℃下恒温水浴蒸发乙醇,蒸发获得的残留物用重蒸水定容到10mL混匀得样液,将该样液过0.45μm滤膜得待测液;
干样的制备:称2~3g干样并研磨过60目,接着以80wt%乙醇溶液为溶剂,于80℃下恒温水浴浸提30min,并离心收集提取液,然后将提取液蒸干,蒸干获得的物质采用2ml超纯水溶解得样液,将该样液过0.45μm滤膜即获待测液;
(3)使用包括四元泵、柱温箱、DAD检测器/示差检测器以及工作站所组成的HPLC仪器,在氢离子交换柱上,以乙腈-硫酸溶液为流动相等度洗脱分离各种有机酸,色谱条件如下:
分析柱:氢离子交换柱;
流动相:水相A:0.001mol/L-0.005mol/L的硫酸溶液;有机相B:乙腈;且A的体积百分比为100-96%,B的体积百分比为为0-4%;
流速:0.3-0.5mL/min;
洗脱方式:等度洗脱;
检测波长:190nm-280nm;
温度:25-50℃;
进样体积:5-20μL;
检测时间:55min;
(4)测定:分别取步骤(1)制备的标准样品溶液及步骤(2)制备的待测液,采用步骤(3)的色谱条件进行进样检测,之后采用外标法定量分析计算水果中10种有机酸及3种糖的含量。
步骤(3)中所述的氢离子交换柱为RezexROA-OrganicAcidH+NewColumn250×4.6mm。
所述的果实包括枇杷、葡萄、香蜜果、五味子、柑橘中的一种;所述的果酒为葡萄酒。
本发明的有益效果在于:
本发明提供了一种同时测定果实或果酒中12种有机酸和3种糖组份含量的高效液相色谱法,具有操作简单快捷的特点。
附图说明
图1是本发明标准样品溶液的高效液相色谱图;1-草酸,2-柠檬酸,3-酒石酸,4-苹果酸,5-琥珀酸,6-富马酸,7-乙酸,8-奎尼酸,9-丙酸,10-异丁酸,11-丁酸;
图2是本发明的示差检测器糖组份标准品图;13-葡萄糖,14-蔗糖,15-果糖;
图3是茂谷橘橙幼果果肉的高效液相色谱图。
具体实施方式
本发明用下列实施例来进一步说明本发明,但本发明的保护范围并不限于下列实施例。
表112种有机酸、可溶性糖的标准曲线回归方程、相关系数、线性下限
实施例1
1.葡萄果酒和柑橘、枇杷果肉中的有机酸和可溶性糖测定
1材料与方法
1.1材料与试剂
草酸、柠檬酸、酒石酸、苹果酸、琥珀酸、富马酸、乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸等有机酸购自Sigma公司。
1.2仪器与设备
L-2000型高效液相色谱仪(日本日立公司),配有二极管阵列检测器(DAD)、四元泵、柱温箱、自动进样器等;SartoriusBS224S分析天平(德国赛多利斯);FW100高速万能粉碎机(天津泰斯特仪器有限公司);ALLEGRATM64R高速冷冻离心机(美国BECKMAN公司)。
1.3试验方法
1.3.1标准曲线的绘制
准确称取标准样品用80wt%乙醇配制成1mg/mL的标准液,用逐级稀释法配成不同浓度的混合标样,-20℃保存备用;
1.3.2样品前处理
2g冻干果实样品→20mL80wt%乙醇研磨→80℃水浴30min浸提→3000rpm/min离心10min分出上清液→重复四次→收集提取液→蒸干→2mL超纯水溶解,将样液过0.45μm滤膜,供液相色谱分析使用;
100mL果酒样品(酒)减压浓缩→冻干→10mL80wt%乙醇溶解→定容→将样液过0.45μm滤膜,供液相色谱分析使用;
1.3.3色谱条件
分析柱:RezexROA-OrganicAcidH+NewColumn(300×7.8mm,8μm),流动相:A:0.002mol/L硫酸;B:乙腈;A:B:96:4;流速:0.4mL/min;洗脱方式:等度洗脱;检测:210nm-280nm;温度:25℃;进样体积:10μL;检测时间:30min;
2结果与分析
2.1色谱条件的选择
经实验筛选,得出果实中常见的10种有机酸在RezexROA-OrganicAcidH+NewColumn柱上的最佳分离条件为:0.002mol/L硫酸-乙腈,96:4为流动相,流速0.4mL·min-1,进样量为10μL。在确定的色谱条件下进10种有机酸的混合标准溶液,得出各峰的保留时间;然后分别取10个有机酸单标溶液,在同样条件下进样,得出各种有机酸的保留时间,从而确定混合标准色谱图中各峰相对应的有机酸。混合标准色谱图中依次为草酸(10.17min)、柠檬酸(12.43min)、酒石酸(13.00min)、苹果酸(14.77min)、琥珀酸(18.45min)、富马酸(20.77min)、乙酸(22.91min)、丙酸(26.31min)、异丁酸(29.09min)、丁酸(31.37min)等。
2.2果实和果酒中有机酸的测定
分别取不同的果实样品,按照1.3.2处理样品,进样10μL,完成HPLC测定。各样品所含有机酸的结果见表2。葡萄果酒中主要的有机酸是琥珀酸、果皮中主要的酸是异丁酸。茂谷橘橙幼果果肉主要的酸是柠檬酸、苹果酸和琥珀酸。枇杷果肉中主要是苹果酸。不同种类的葡萄酒的有机酸含量不同,如桂浦一号中主要的有机酸是琥珀酸、酒石酸、苹果酸,刺葡萄酒中主要的有机酸是酒石酸和苹果酸。
表2果酒和果实中有机酸和可溶性糖含量(mg/g.DW)
实施例2
五味子、香蜜果、金柑果肉中的有机酸和可溶性糖的测定
1材料与试剂
草酸、柠檬酸、酒石酸、苹果酸、琥珀酸、富马酸、乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸等有机酸购自Sigma公司;
2仪器与设备
L-2000型高效液相色谱仪(日本日立公司),配有二极管阵列检测器(DAD)、四元泵、柱温箱、自动进样器等;SartoriusBS224S分析天平(德国赛多利斯);FW100高速万能粉碎机(天津泰斯特仪器有限公司);ALLEGRATM64R高速冷冻离心机(美国BECKMAN公司);
3试验方法
3.1标准曲线的绘制
准确称取标准样品用10wt%乙醇配制成1mg/mL的标准液,用逐级稀释法配成不同浓度的混合标样,-20℃保存备用;
3.2样品前处理
3g果实样品→20mL80wt%乙醇研磨→80℃水浴30min浸提→3000rpm/min离心10min分出上清液→重复三次→收集提取液→蒸干→2ml超纯水溶解,取部分样液过0.45μm滤膜,供液相色谱分析使用;
3.3色谱条件
分析柱:RezexROA-OrganicAcidH+NewColumn(300×7.8mm,8μm),流动相:A:0.005mol/L硫酸;B:乙腈;A:B96:4;流速:0.33mL/min;洗脱方式:等度洗脱;检测:210nm-280nm,示差检测器;温度:30℃;进样体积:10μL;检测时间:55min;
4.结果
表3果酒和果实中有机酸含量(mg/g.DW)
以上所述仅为本发明的较佳实施例,凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰,皆应属本发明的涵盖范围。
Claims (3)
1.一种同时测定果实或果酒中的有机酸和可溶性糖的方法,其特征在于:包括如下步骤:
(1)标准样品溶液的制备
分别称取色谱纯的草酸、柠檬酸、酒石酸、琥珀酸、苹果酸、奎尼酸、富马酸、乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、苯甲酸这12种有机酸,以及葡萄糖、果糖、蔗糖这3种糖,然后用流动相水相制备该12种有机酸标准品不同浓度梯度在0.01-1mg/mL的标准样品溶液,以及3种糖组分不同浓度梯度在0.1-75mg/mL的标准样品溶液;
(2)待测液的制备
鲜样:称取10g鲜样置于组织捣碎机中,并加入100ml80wt%乙醇溶液匀浆1min,取10ml的匀浆以3000rpm/min离心10min后分出上清液,将上清液转入50mL容量瓶中,且离心的残渣再用80wt%乙醇溶液洗涤两次,每次15ml,离心10min;合并上清液,用80wt%乙醇溶液定容混匀得提取液;取5.00mL提取液于蒸发皿中,且于70℃下恒温水浴蒸发乙醇,蒸发获得的残留物用重蒸水定容到10mL混匀得样液,将该样液过0.45μm滤膜得待测液;
干样:称2~3g干样并研磨过60目,接着以80wt%乙醇溶液为溶剂,于80℃下恒温水浴浸提30min,并离心收集提取液,然后将提取液蒸干,蒸干获得的物质采用2ml超纯水溶解得样液,将该样液过0.45μm滤膜即获待测液;
(3)使用包括四元泵、柱温箱、DAD检测器/示差检测器以及工作站所组成的HPLC仪器,在氢离子交换柱上,以乙腈-硫酸溶液为流动相等度洗脱分离各种有机酸,色谱条件如下:
分析柱:氢离子交换柱;
流动相:水相A:0.001mol/L-0.005mol/L的硫酸溶液;有机相B:乙腈;且A的体积百分比为100-96%,B的体积百分比为为0-4%;
流速:0.3-0.5mL/min;
洗脱方式:等度洗脱;
检测波长:190nm-280nm;
温度:25-50℃;
进样体积:5-20μL;
检测时间:55min;
(4)测定:分别取步骤(1)制备的标准样品溶液及步骤(2)制备的待测液,采用步骤(3)的色谱条件进行进样检测,之后采用外标法定量分析计算果实或果酒中12种有机酸及3种糖的含量。
2.根据权利要求1所述的同时测定果实或果酒中的有机酸和可溶性糖的方法,其特征在于:步骤(3)中所述的氢离子交换柱为RezexROA-OrganicAcidH+NewColumn250×4.6mm。
3.根据权利要求1所述的同时测定果实或果酒中的有机酸和可溶性糖的方法,其特征在于:所述的果实包括枇杷、葡萄、香蜜果、五味子、柑橘中的一种;所述的果酒为葡萄酒。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20160420 |
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RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |