CN106520676B - 从人胎盘羊膜制备人羊膜上皮细胞的方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及从人胎盘羊膜制备人羊膜上皮细胞的方法及其应用。具体地说，涉及从胎盘羊膜制备人羊膜上皮细胞的方法，该方法包括以下步骤：将胎盘用基础平衡盐溶液反复冲洗表面，对胎盘进行消毒；用手术镊撕取胎膜外层羊膜置玻璃皿中，用基础平衡盐溶液清洗表面污血，剪碎成，小块；膜小块均匀贴于培养皿，羊膜上皮层朝下，晾干后，添加完全培养基，培养；2天后补液，继续培养；待能看到上皮细胞爬出，去组织，换液继续培养；待出现多处典型的上皮细胞群，局部融合率达90％时，进行传代培养；收获：用胰酶消化后收集细胞，计数，冻存，即得人羊膜上皮细胞。还涉及所制得的人羊膜上皮细胞以及其用途。本发明方法呈现说明书所述优点。

Description

从人胎盘羊膜制备人羊膜上皮细胞的方法及其应用
技术领域
本发明属于干细胞治疗技术领域，涉及从人胎盘羊膜制备上皮细胞的方法，还涉及由该方法制备获得的人羊膜上皮细胞，以及它们的治疗用途。
背景技术
干细胞是再生医学发展的基础，其有效的应用是实现人类健康长寿、防癌抗衰、永保年轻状态、持续提高生活质量等终极梦想的有效方法。近年来，胚胎干细胞与成体干细胞在细胞生物学以及再生医学研究领域倍受重视。然而，尽管胚胎干细胞具有其他细胞无法企及的全能性，但致瘤性、同种异体移植后的免疫排斥性以及无法避免的伦理争议等因素在很大程度上限制了其在临床的应用，而成体干细胞在组织中含量较少，缺乏特异性的表面标志的特点也成为其临床应用的桎梏。相较而言，人羊膜上皮细胞(Human AmnioticEpithelial Cells，hAECs)也具备胚胎干细胞特性，有较强的分化能力及可塑性，又没有风险和伦理问题，且含量丰富，容易获取，拥有诸多胚胎干细胞和成体干细胞不具备的优点，从而成为现在国内外研究和临床应用的热点。
人羊膜上皮细胞因为其无致瘤性、无免疫排斥性、安全性高、含量丰富、容易获取、不引起伦理争议而获得医学界广泛好评。目前为止，人羊膜上皮细胞已经应用在多种疾病中，疗效显著。其中最为被研究者津津乐道的是其在自身免疫性疾病和神经***损伤性疾病方面的疗效。羊膜上皮细胞可以分化成神经细胞，分泌多种神经递质和神经营养因子来修复受损以及退化的神经***疾病，如：老年痴呆、帕金森氏病、多发性硬化、脑出血、脑中风等，这是其他干细胞以及免疫细胞所不具备的。同时，人羊膜上皮细胞通过旁分泌表达广谱抗炎因子，表达多种生长因子，来针对性的抑制自身免疫病的异常炎症。这为自身免疫性疾病开辟了一种新的有针对性的治疗方法。为自身免疫性疾病患者，如***性红斑狼疮、类风湿性关节炎等带来了更好的治疗方法。除此之外，人羊膜上皮细胞对于非神经***的损伤性疾病：如糖尿病、肺和肝的纤维化病变、心肌梗死、急性肝损伤、放射性损伤唾液腺、口腔颌骨缺损等疾病都有一定的疗效。近期，国内外的研究者都把研究目标放在了卵巢早衰和角膜修复方面，所以，人羊膜上皮细胞的前景是不可估量的。
最新研究发现，人羊膜上皮细胞不但具备胚胎干细胞特性，有较强的分化能力及可塑性，同时又没有涉及伦理问题的风险，且含量丰富，容易获取，能完全满足干细胞临床应用安全性、有效性、质量可控性的条件要求，已成为继胚胎干细胞和成体干细胞后又一个独具特点的再生医学和细胞治疗临床应用的理想种子细胞。
羊膜位于胎儿绒毛膜的表面，包裹着羊水和胎儿，提供胚胎生长发育的环境，是胎盘的最内层组织，是与发育中的胎儿联系紧密的胚胎发育早期产物，也是母体与胎儿之间进行物质交换的重要组织。羊膜为半透明的薄膜，有韧性，无神经、血管、***，包裹着羊水和胎儿，提供胚胎生长发育的环境。其厚度仅为0.02～0.5mm，由上皮层、基底层和基质层(***层)组成。
人羊膜上皮细胞是由胎盘靠近胎儿一侧的羊膜组织分离而来的上皮细胞，具有多能干性、有无限增殖性和抗炎特性，无致瘤性和免疫原性，经国内国际众多科学家的多年研究论证，它具备以下特点：
全组织分化能力：羊膜上皮细胞与胚胎干细胞具有同一发育组织来源，具有多能干性，有较强的分化能力及可塑性；可向三胚层中的多种组织类型细胞分化；可分化为外胚层来源的神经元、星形胶质细胞、神经胶质细胞；中胚层来源的骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、心肌细胞、肌细胞；以及内胚层来源的肝细胞、胰腺细胞；羊膜上皮细胞具有向三个胚层分化的潜能，羊膜上皮细胞可表达早期干细胞的一些标记，这说明既然羊膜形成于胚胎内细胞团发育早期，就有可能保留未成熟低分化的干细胞，仍保留多分化潜能；目前，已有越来越多的研究结果表明，人羊膜上皮细胞在体外很容易诱导分化为神经细胞，也可不经体外诱导，直接移植到体内治疗神经损伤及退行性疾病；因此，在治疗神经***疾病和损伤方面，羊膜上皮细胞显然具有更多的向神经细胞分化的潜能；
无致瘤性：与干细胞相比，羊膜上皮细胞缺乏端粒酶，这决定了其在体外扩增不超过6代，具有有限的体外增值能力，而且使其不像胚胎干细胞或其它干细胞那样会在体内产生畸胎瘤或其它肿瘤；正是由于羊膜上皮细胞的这个特点，使其可成功避免干细胞临床应用的致瘤性问题，增殖受限和无致瘤性的特点保证了羊膜上皮细胞治疗的安全性；
无需配型：羊膜上皮细胞不表达MHC-Ⅱ类抗原，具有免疫耐受能力，移植时无需HLA或基因配型；
无排斥性：羊膜上皮细胞缺乏主要组织相容性复合体抗原，同时还表达具有免疫抑制活性的HLA抗原，因此移植后不会产生免疫原性；由于羊膜组织是来源于胎儿的产物，暴露于母体免疫***监视下，使得移植后不会产生免疫原性；此外，人羊膜上皮细胞同时表达具有免疫抑制活性HLA-E、-G抗原；正是由于羊膜上皮细胞这些特点，使其临床治疗时可多次输注而不会引起任何免疫排斥反应；
超强的神经修复能力：羊膜上皮细胞具有干细胞旁分泌功能，能够分泌多种神经营养因子(NGF、BDNF、NT3等)、神经递质和生长因子，能促使宿主自身神经干细胞功能的活跃及自身修复，可促进神经细胞生长，修复神经损伤；神经发育生物学研究认为神经发生早期，羊膜组织直接与神经上皮联系，向羊水中释放神经递质及神经营养因子，在神经***发育过程中起着重要作用；羊膜上皮细胞具有神经细胞生物化学方面的特性，能合成和分泌多巴胺(DA)，细胞膜上表达多巴胺受体D1和D2，质膜上也有多巴胺转运蛋白表达；此外，羊膜上皮细胞能分泌神经营养因子(如BDNF、NT-3、NGF等)和其他神经递质与调质(如儿茶酚胺、乙酰胆碱、去甲肾上腺素、组胺、五羟色胺、尿紧张素、神经紧张素和生长激素抑制素等)；羊膜上皮细胞不仅能自身分化神经组织，而且也能分泌多种神经递质和神经营养因子，促使宿主自身干细胞功能的活跃及自身修复；
独特的免疫调节能力：羊膜上皮细胞能分泌表达多种抗炎症因子和相关蛋白，能抑制淋巴细胞的增殖，可用于炎症性、成纤维性和自身免疫性疾病的细胞治疗；其分泌的免疫抑制因子则对自身免疫性疾病及亚健康人群的免疫调节具有较好的效果；
加快组织修复能力：羊膜上皮细胞分泌的生长因子(EGF、TGF、IGF等)，不但可促进血管上皮细胞修复，促进损伤区的毛细血管的生成，增加胶原蛋白合成能力，而且能激活体内休眠状态的自体干细胞向体内损伤部位迁移、聚集及转化，从而加速血管生长，加快组织修复；
伦理认同、来源广泛：羊膜上皮细胞来源于新生儿产后废弃物羊膜，为胎盘表面一层可剥离的生物膜，没有胚胎干细胞应用带来的伦理学问题；此外，容易大量获得细胞，易于质量控制，一张羊膜至少可获1×108个羊膜上皮细胞，而一个病人单次治疗仅需1×107个，也就是说一张羊膜满足多个病人使用。
已经有诸多关于羊膜上取细胞的制备方法的报道。例如
CN104818244A(中国专利申请号201510263291.8，天晴)公开了一种羊膜上皮细胞分离、培养的方法，其特征在于该方法是按以下步骤完成的：一、羊膜组织分离和消毒：将羊膜自胎盘上剥离，然后用生理盐水冲洗2～3遍，再在含有1％～3％头孢哌酮的生理盐水中浸泡3～10min；二、羊膜上皮细胞分离：将羊膜裁剪成50～150cm2的块状，然后将裁剪后羊膜的上皮面朝上贴敷于无菌硝酸纤维膜上，向培养皿A中加入3～10mL生理盐水，再将羊膜的上皮面朝下贴置在培养皿A中，静置2～3min，获得羊膜贴片；将羊膜贴片置于培养皿B中，加入10～30ml质量浓度为0.25％的胰酶-EDTA消化15～20min，然后封口膜封口后将培养皿放入恒温摇床中消化，得到消化液，再加入2～5ml胎牛血清终止酶反应，然后去除羊膜贴片上团聚、黏连的羊膜上皮细胞，再将羊膜贴片转移至装有生理盐水的培养皿C中，清洗贴壁的羊膜上皮细胞，得到清洗液，收集消化液和清洗液，经100目细胞筛过滤，获得羊膜上皮细胞单细胞悬液；三、羊膜上皮细胞纯化培养：将步骤二获得的羊膜上皮细胞单细胞悬液在4℃、1500rpm的条件离心5～15min，弃上清，然后加入含有表皮生长因子的低糖DMEM/F12培养基重悬细胞，混匀后按0.9～1.1×105/cm2的接种量接种于培养瓶中，再置于37℃、CO2体积浓度为5％的培养箱中培养，细胞融合率达到85％后，弃除非贴壁细胞，并用生理盐水冲洗2次，然后加入质量浓度为0.05％的胰酶-EDTA消化，37℃消化2～5min，弃除消化液，再用生理盐水冲洗1～2次，然后加入质量浓度为0.25％的胰酶-EDTA，在37℃条件下消化3～6min，再加入FBS终止酶反应，收集消化液，将消化液在4℃、1500rpm旋转震荡的条件下离心5～15min，弃上清，然后加入DMEM/F12培养基重悬细胞，得到高纯度P0代羊膜上皮细胞单细胞悬液，即完成。据信该发明羊膜组织制成羊膜贴片后可以保证羊膜上皮面平整，同时羊膜背面粘液与***与硝酸纤维膜紧密贴合，促进胰酶消化效率和细胞与组织的分离，短时间消化即可收集全部羊膜上皮细胞，避免了细胞贴壁率的降低，短时间培养后进行两次胰酶消化，获得了高纯度羊膜上皮细胞。据信该发明可应用于基础研究和临床移植领域。
CN104371971A(中国专利申请号201310357351.3，协和)公开了一种分离获得羊膜上皮细胞的方法，该方法包括：将羊膜组织加入胶原酶溶液孵育；然后将羊膜组织加入胰蛋白酶溶液进行消化；终止消化并过滤；将上清液离心后获得羊膜上皮细胞。本发明操作简单，且能保持细胞原有活性及生长状态，提高羊膜上皮细胞的得率。
CN104974980A(中国专利申请号201510261707.2，重庆)公开了一种人类羊膜上皮细胞的分离方法，包括以下步骤：第一步，采集运输胎盘，先将采集到的新鲜胎盘放入盛有0.9％质量浓度生理盐水的无菌塑料袋中，密封后放入保护盒中；再将保护盒放入温度为2℃～8℃的运输箱中，并在12小时内运输到细胞分离室；此过程保证了胎盘组织的新鲜及羊膜上皮细胞的活性，为接下来的分离培养分离提供质量保证；第二步，撕取羊膜，细胞分离人员将接收到的新鲜胎盘放置在圆盘中，先用生理盐水冲洗新鲜胎盘表面，再从新鲜胎盘上完整的撕下羊膜；第三步，冲洗羊膜，先将撕下的羊膜放入肾形盘中展开冲洗，并用止血钳去除羊膜上的血丝，再用生理盐水反复冲洗至少5次，直至羊膜干净；第四步，剪裁羊膜，先将冲洗干净的羊膜剪裁成圆形，圆形直径大小较相应培养皿直径大3～4cm，将圆形的羊膜上皮面朝上覆盖于培养皿上，并且圆形的羊膜边缘必须在培养皿边缘之上；这样操作为了确保在接下来的消化过程中胰蛋白酶只单独接触羊膜上皮面；第五步，消化羊膜上皮面，将0.25％质量浓度的胰蛋白酶液加入到覆盖有羊膜的培养皿中，直至胰蛋白酶液接近装满培养皿，在使羊膜上皮面充分接触胰蛋白酶同时，羊膜的其他部位接触不到胰蛋白酶；在37℃恒温静止消化40～80分钟；消化时间的长短因不同个体羊膜的厚度、面积等不同而有所变化；第六步，终止消化，消化结束后，先用移液管将培养皿中的胰蛋白酶液吸出并弃之，再用移液枪加入含10％体积浓度胎牛血清的EMDM-F12培养液，并用移液枪吹打培养皿中的羊膜上皮面，使上面的经过消化的羊膜上皮细胞脱离羊膜进入到细胞培养液中，经过反复吹打直至细胞培养液变的浑浊，然后，收集细胞培养液置于50ml离心管中；此步骤重复3～5次，以便分离下更多的羊膜上皮细胞；第七步，离心收集细胞，将收集到的细胞培养液在离心机上，以300～500g离心力离心5～10分钟；第八步，羊膜上皮细胞重悬并接种培养，离心后弃去上清液，离心管底部的羊膜上皮细胞沉淀用10mlEMDM-F12培养液重悬，取少量悬液用于细胞计数、活率检测以及流式检测，以1.0～1.3×105/cm2的密度接种细胞。据信该发明能分离得到高纯度的羊膜上皮细胞，且细胞数量多、活性高，为羊膜上皮细胞的研究和临床应用奠定基础。
CN104371970A(中国专利申请号201310355824.6，协和)公开了一种用于培养人羊膜上皮细胞的培养基，其特征在于该培养基由DMEM、胎牛血清、丙酮酸钠、L-谷氨酰胺、EGF、β-巯基乙醇和非必需氨基酸组成；其中DMEM的含量为10g/1000ml；其中胎牛血清的体积含量为5～15％；其中丙酮酸钠的含量为0.0550～0.2200g/1000ml；其中L-谷氨酰胺的含量为0.0731～0.2193g/1000ml；其中β-巯基乙醇的含量为1.9287～5.7861g/1000ml；其中EGF的含量为5～15ng/ml；其中非必需氨基酸为L-丙氨酸、L-天门冬酰胺、L-天冬氨酸L、L-谷氨酸、甘氨酸L、L-脯氨酸和L--丝氨酸中组成；非必需氨基酸的含量为0.5～2mM。据信该发明的培养基适用于人羊膜上皮细胞的培养，尤其适用于原代人羊膜上皮细胞的分离和纯化过程中的培养，同时可以降低移植人体过程中引发免疫反应的几率。
CN103642751A(中国专利申请号201310650384.7，同泽)公开了一种从人羊膜中制取干细胞的方法，具体指一种羊膜中分离上皮细胞和间充质干细胞方法，涉及细胞分离技术领域。通过自制的无菌、高效、稳定的胎盘保护液对胎盘进行采集，利用消化法和爬片法的组合，将羊膜上皮细胞与羊膜间充质干细胞分离开来，分别得到高纯度的羊膜上皮细胞和羊膜间充质干细胞。本发明解决了现有技术中存在人羊膜采集污染率高、采集后的细胞活性差，直接影响了后续的细胞分离及培养的问题。是对从人羊膜中分离干细胞的方法进行改良和创新，形成了一套标准化的分离方案，能够更稳定，充分利用羊膜的干细胞资源，无污染，纯度高，细胞数量更多，在保持细胞活性的同时，保证了干细胞的原始特性。
CN105420179A(中国专利申请号201510963676.5，斯坦姆)公开了一种从脐带和胎盘羊膜组织同时提取上皮细胞和间充质干细胞的方法，其特征在于：步骤如下：⑴脐带和胎盘羊膜取材和接种：①高温消毒手术器械和大玻璃皿，同时紫外线消毒超净工作台；②配制培养基：完全培养基的组成是：DMEM/F12加完全培养基总体积5％的胎牛血清、完全培养基总体积1％的胰岛素、铁传递蛋白和硒的混合添加物，完全培养基中终浓度为20毫微克/毫升的表皮生长因子和完全培养基中终浓度为20毫微克/毫升的碱性纤维母细胞生长因子，无菌过滤，4℃保存；所述DMEM/F12中DMEM：F12的体积比为1:1；所述混合添加物及在混合添加物中的终浓度为胰岛素5微克/毫升、铁传递蛋白10微克/毫升和***钠5毫微克/毫升；③严格筛选供者，血液化验排除传染病；④低温冰盒中运送脐带和胎盘：机械剥离胎盘羊膜之后，将脐带和胎盘羊膜分别置于大玻璃皿中，以下步骤都在无菌条件下进行，将脐带剪成1cm长的小段，将胎盘羊膜剪成约5X5cm长的方块，用磷酸缓冲盐水+总体积1％的青霉素+总体积1％的链霉素清洗组织两次，洗干净脐带的血液；⑤将脐带和胎盘羊膜组织放在4℃的磷酸缓冲盐水中，以防止组织在机械剪碎时过热而影响到细胞存活，使用组织剪碎机来分别破碎成1-3mm的碎块，使用低速破碎组织，同时保持细胞活性，得到破碎的脐带和羊膜组织；⑥将破碎的脐带和羊膜组织分别转移到T175细胞培养瓶中，并用组织刮取器将其平铺于培养瓶底，小心加入少量完全培养基，使培养液既能覆盖破碎的脐带和羊膜组织块，又不至于使其漂浮起来，置于37℃、饱和湿度5％CO2培养箱中培养；⑵间充质干细胞和羊膜上皮细胞在培养瓶中扩增和传代：①培养过程中观察可见细胞从组织块逐渐游移出来，并进一步实现贴壁生长和增殖，在培养的第3-4天、当细胞生长融合成片时，用无菌磷酸缓冲盐水洗去残存的组织，全部换为新鲜完全培养基继续培养；②此后每4天换一次培养液直到细胞长满90-100％培养瓶底面积，便进行胰酶消化传代；③胰酶消化传代：倒弃培养液，用PBS洗细胞2次，每T175用10毫升质量百分数为0.25％的胰酶-EDTA在37℃消化10分钟，待细胞悬浮后每个T175加入1毫升胎牛血清以中和胰酶反应，1000转/分离心10分钟，再悬浮于完全培养基中，按1：4细胞数比例传代到新T175培养瓶中；⑶间充质干细胞和羊膜上皮细胞的鉴定：①胰酶消化传到第三代时，用流式细胞仪鉴定培养细胞的纯度：羊膜上皮细胞的标记物包括：角蛋白CK19，CD29，和CD34；胎盘和脐带间充质干细胞的标记物包括：CD73，CD90，和CD105；②流式细胞仪验证细胞纯度达到90％以上，化验排除常见的传染病，并排除细菌，支原体污染，即是符合标准，即得上皮细胞和间充质干细胞的混合物。据信该发明的方法成本低、简单快速，使用组织剪碎机来将脐带和胎盘羊膜剪碎成极小的碎块，极为利于直接接种到培养瓶之后细胞向组织外游移；不使用任何蛋白酶试剂，从而大幅度地降低成本，减少制备时间，使得短时间大规模细胞制备成为现实；该方法使用添加生长因子及其它营养物的细胞培养基，节省了血清。
然而，本领域仍然期待有新的方法来制备人羊膜上皮细胞，并且期待这种方法呈现出一种或者多种有益的技术效果。
发明内容
本发明的目的在于提供一种从胎盘羊膜制备人羊膜上皮细胞的方法，期待该方法呈现出一种或者多种有益的技术效果。
本发明第一方面提供了一种从胎盘羊膜制备人羊膜上皮细胞的方法，该方法包括以下步骤：
(1)从胎盘样品采集盒中取出胎盘，置于白瓷盘中，使用基础平衡盐溶液反复冲洗表面，对胎盘进行消毒处理；
(2)用手术镊慢慢撕取胎膜外层羊膜置于150mm玻璃皿中，使用基础平衡盐溶液反复清洗表面污血，剪碎成直径为5mm的羊膜组织小块；
(3)羊膜小块均匀贴于100mm培养皿，羊膜上皮层朝下，晾干30-60min后，缓慢添加完全培养基，没过组织；在37℃、5％CO2培养箱中培养；
(4)2天后补液(即补充上述完全培养基)，继续培养；待能够看到明显的卵圆形上皮细胞爬出(通常约6天左右，还可见部分间充质干细胞、成纤维细胞等杂细胞)，去组织，换液(即上述完全培养基)继续培养；
(5)待出现多处典型的上皮细胞群(10d左右)，呈铺路石样紧密排列，局部融合率达90％时，进行传代培养(体视显微镜镜下挑取羊膜上皮细胞于离心管中，吹散，细胞计数仪计数，按3000/cm2接种至培养瓶中，使用完全培养基继续培养)；
(6)收获：用胰酶消化液消化后收集细胞，计数，冻存，即得P1代的人羊膜上皮细胞，必要时对其进行传代培养。
根据本发明第一方面任一实施方案的方法，其中所述基础平衡盐溶液中包括链霉素和青霉素两种抗生素。
根据本发明第一方面任一实施方案的方法，其中所述基础平衡盐溶液是通过如下方式配制得到的：将0.4g的KCl、0.06g的KH2PO4、0.132g的Na2HPO4.12H2O、8g的NaCl、0.35g的NaHCO3、1.0g的D-葡萄糖、0.10g的链霉素、0.06g的青霉素用水溶解并定容成1L的溶液。
根据本发明第一方面任一实施方案的方法，其中步骤(3)中所述完全培养基包括：DMEM基础培养基、10％FBS、10mg/L表皮生长因子(EGF)。在一个实施方案中，所述的完全培养基中还添加了0.01～0.05％(例如0.01～0.04％、例如0.01～0.03％)硝酸硫胺和0.05～0.1％(例如0.06～0.1％、例如0.07～0.1％)麦芽糖。已经出人意料地发现，向培养基中添加微量的硝酸硫胺和麦芽糖两者后，可以显示地提高人羊膜上皮细胞的产量，而不使用它们二者或者仅增添其中之一时无法获得这种效果。
根据本发明第一方面任一实施方案的方法，其中步骤(4)中，继续培养至能够看到明显的卵圆形上皮细胞爬出，此时培养约5～7天，通常约6天，并且此时还可见部分间充质干细胞、成纤维细胞等杂细胞。
根据本发明第一方面任一实施方案的方法，其中步骤(5)中，出现多处典型的上皮细胞群时为培养约8～12天，通常约10天左右。
根据本发明第一方面任一实施方案的方法，其中步骤(5)中，传代培养是照如下操作进行的：体视显微镜镜下挑取羊膜上皮细胞于离心管中，吹散，细胞计数仪计数，按3000/cm2接种至培养瓶中，继续培养)；
根据本发明第一方面任一实施方案的方法，其中步骤(5)中，胰酶消化液是包括0.25％的胰蛋白酶和0.02％的EDTA的消化液。
进一步的，本发明第二方面提供了一种人羊膜上皮细胞，其是通过本发明第一方面所述方法制备得到的。
根据本发明第二方面的人羊膜上皮细胞，其是通过包括如下步骤的方法制备得到的：
(1)从胎盘样品采集盒中取出胎盘，置于白瓷盘中，使用基础平衡盐溶液反复冲洗表面，对胎盘进行消毒处理；
(2)用手术镊慢慢撕取胎膜外层羊膜置于150mm玻璃皿中，使用基础平衡盐溶液反复清洗表面污血，剪碎成直径为5mm的羊膜组织小块；
(3)羊膜小块均匀贴于100mm培养皿，羊膜上皮层朝下，晾干30-60min后，缓慢添加完全培养基，没过组织；在37℃、5％CO2培养箱中培养；
(4)2天后补液(即补充上述完全培养基)，继续培养；待能够看到明显的卵圆形上皮细胞爬出(通常约6天左右，还可见部分间充质干细胞、成纤维细胞等杂细胞)，去组织，换液(即上述完全培养基)继续培养；
(5)待出现多处典型的上皮细胞群(10d左右)，呈铺路石样紧密排列，局部融合率达90％时，进行传代培养(体视显微镜镜下挑取羊膜上皮细胞于离心管中，吹散，细胞计数仪计数，按3000/cm2接种至培养瓶中，使用完全培养基继续培养)；
(6)收获：用胰酶消化液消化后收集细胞，计数，冻存，即得P1代的人羊膜上皮细胞，必要时对其进行传代培养。
根据本发明第二方面任一实施方案的人羊膜上皮细胞，其中所述基础平衡盐溶液中包括链霉素和青霉素两种抗生素。
根据本发明第二方面任一实施方案的人羊膜上皮细胞，其中所述基础平衡盐溶液是通过如下方式配制得到的：将0.4g的KCl、0.06g的KH2PO4、0.132g的Na2HPO4.12H2O、8g的NaCl、0.35g的NaHCO3、1.0g的D-葡萄糖、0.10g的链霉素、0.06g的青霉素用水溶解并定容成1L的溶液。
根据本发明第二方面任一实施方案的人羊膜上皮细胞，其中步骤(3)中所述完全培养基包括：DMEM基础培养基、10％FBS、10mg/L表皮生长因子(EGF)。在一个实施方案中，所述的完全培养基中还添加了0.01～0.05％(例如0.01～0.04％、例如0.01～0.03％)硝酸硫胺和0.05～0.1％(例如0.06～0.1％、例如0.07～0.1％)麦芽糖。
根据本发明第二方面任一实施方案的人羊膜上皮细胞，其中步骤(4)中，继续培养至能够看到明显的卵圆形上皮细胞爬出，此时培养约5～7天，通常约6天，并且此时还可见部分间充质干细胞、成纤维细胞等杂细胞。
根据本发明第二方面任一实施方案的人羊膜上皮细胞，其中步骤(5)中，出现多处典型的上皮细胞群时为培养约8～12天，通常约10天左右。
根据本发明第二方面任一实施方案的人羊膜上皮细胞，其中步骤(5)中，传代培养是照如下操作进行的：体视显微镜镜下挑取羊膜上皮细胞于离心管中，吹散，细胞计数仪计数，按3000/cm2接种至培养瓶中，继续培养)；
根据本发明第二方面任一实施方案的人羊膜上皮细胞，其中步骤(5)中，胰酶消化液是包括0.25％的胰蛋白酶和0.02％的EDTA的消化液。
进一步的，本发明第三方面提供了本发明第二方面任一实施方案所述人羊膜上皮细胞在制备作为细胞治疗剂的药物中的用途。
根据本发明第三方面任一实施方案的用途，其中所述人羊膜上皮细胞是通过包括如下步骤的方法制备得到的：
(1)从胎盘样品采集盒中取出胎盘，置于白瓷盘中，使用基础平衡盐溶液反复冲洗表面，对胎盘进行消毒处理；
(2)用手术镊慢慢撕取胎膜外层羊膜置于150mm玻璃皿中，使用基础平衡盐溶液反复清洗表面污血，剪碎成直径为5mm的羊膜组织小块；
(3)羊膜小块均匀贴于100mm培养皿，羊膜上皮层朝下，晾干30-60min后，缓慢添加完全培养基，没过组织；在37℃、5％CO2培养箱中培养；
(4)2天后补液(即补充上述完全培养基)，继续培养；待能够看到明显的卵圆形上皮细胞爬出(通常约6天左右，还可见部分间充质干细胞、成纤维细胞等杂细胞)，去组织，换液(即上述完全培养基)继续培养；
(5)待出现多处典型的上皮细胞群(10d左右)，呈铺路石样紧密排列，局部融合率达90％时，进行传代培养(体视显微镜镜下挑取羊膜上皮细胞于离心管中，吹散，细胞计数仪计数，按3000/cm2接种至培养瓶中，使用完全培养基继续培养)；
(6)收获：用胰酶消化液消化后收集细胞，计数，冻存，即得P1代的人羊膜上皮细胞，必要时对其进行传代培养。
根据本发明第三方面任一实施方案的用途，其中所述基础平衡盐溶液中包括链霉素和青霉素两种抗生素。
根据本发明第三方面任一实施方案的用途，其中所述基础平衡盐溶液是通过如下方式配制得到的：将0.4g的KCl、0.06g的KH2PO4、0.132g的Na2HPO4.12H2O、8g的NaCl、0.35g的NaHCO3、1.0g的D-葡萄糖、0.10g的链霉素、0.06g的青霉素用水溶解并定容成1L的溶液。
根据本发明第三方面任一实施方案的用途，其中步骤(3)中所述完全培养基包括：DMEM基础培养基、10％FBS、10mg/L表皮生长因子(EGF)。在一个实施方案中，所述的完全培养基中还添加了0.01～0.05％(例如0.01～0.04％、例如0.01～0.03％)硝酸硫胺和0.05～0.1％(例如0.06～0.1％、例如0.07～0.1％)麦芽糖。
根据本发明第三方面任一实施方案的用途，其中步骤(4)中，继续培养至能够看到明显的卵圆形上皮细胞爬出，此时培养约5～7天，通常约6天，并且此时还可见部分间充质干细胞、成纤维细胞等杂细胞。
根据本发明第三方面任一实施方案的用途，其中步骤(5)中，出现多处典型的上皮细胞群时为培养约8～12天，通常约10天左右。
根据本发明第三方面任一实施方案的用途，其中步骤(5)中，传代培养是照如下操作进行的：体视显微镜镜下挑取羊膜上皮细胞于离心管中，吹散，细胞计数仪计数，按3000/cm2接种至培养瓶中，继续培养)；
根据本发明第三方面任一实施方案的用途，其中步骤(5)中，胰酶消化液是包括0.25％的胰蛋白酶和0.02％的EDTA的消化液。
本发明任一方面或该任一方面的任一实施方案所具有的任一技术特征同样适用其它任一实施方案或其它任一方面的任一实施方案，只要它们不会相互矛盾，当然在相互之间适用时，必要的话可对相应特征作适当修饰。下面对本发明的各个方面和特点作进一步的描述。
本发明所引述的所有文献，它们的全部内容通过引用并入本文，并且如果这些文献所表达的含义与本发明不一致时，以本发明的表述为准。此外，本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义，即便如此，本发明仍然希望在此对这些术语和短语作更详尽的说明和解释，提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本发明所表述的含义为准。
通常地讲，一个胎盘羊膜的面积约600平方厘米，本发明羊膜干细胞即取材于胎盘上的羊膜。
本发明完全培养基中添加了EGF(表皮生长因子)，能够更有效促进了羊膜上皮细胞的增殖。在贴壁培养过程中，不可避免会长出成纤维细胞或间充质干细胞，本发明采取挑克隆的方法高效提高了羊膜上皮细胞的纯度，且更利于羊膜上皮细胞的传代生长。本发明方法的整个流程操作简单，可控，P1代即可收获大量细胞，为临床应用和研究提供了可能。
CK19是上皮细胞标志物的典型特征性生物标志物。已以发现，本发明所得人羊膜上皮细胞经免疫细胞化学和免疫荧光染色检测，结果均显示，原代和1-3代培养细胞均高表达上皮标志CK19，但不表达波形蛋白，证明本发明所分离的细胞为hAECs。此外，针对本发明获得的流式检测显示：CD9、CD73、CD90、Nanog为阳性，CD34、CD45、HLA-DR阴性；诱导分化结果显示其：成软骨、成脂、成骨为阳性。此外，已经发现，通过使用本发明方法，每400平方厘米羊膜可以得到108个以上的人羊膜上皮细胞。
附图说明
图1显示了本发明所得人羊膜上皮细胞显微图(200X)。
具体实施方式
通过下面的实施例可以对本发明进行进一步的描述，然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细的描述。
本发明下文试验中所使用的材料例如其中所使用的试剂是本领域已知的，其可以采用公知方法配制或者直接从市场购得。
实施例1：从胎盘羊膜制备人羊膜上皮细胞
(1)从胎盘样品采集盒中取出胎盘，置于白瓷盘中，使用基础平衡盐溶液(将0.4g的KCl、0.06g的KH2PO4、0.132g的Na2HPO4.12H2O、8g的NaCl、0.35g的NaHCO3、1.0g的D-葡萄糖、0.10g的链霉素、0.06g的青霉素用水溶解并定容成1L的溶液，即得)反复冲洗表面，对胎盘进行消毒处理；
(2)用手术镊慢慢撕取胎膜外层羊膜置于150mm玻璃皿中，使用基础平衡盐溶液反复清洗表面污血，剪碎成直径为5mm的羊膜组织小块；
(3)羊膜小块均匀贴于100mm培养皿，羊膜上皮层朝下，晾干30-60min(本试验45min)后，缓慢添加完全培养基(DMEM基础培养基、10％FBS、10mg/L表皮生长因子)，没过组织；在37℃、5％CO2培养箱中培养；
(4)2天后补液(即补充上述完全培养基)，继续培养；待能够看到明显的卵圆形上皮细胞爬出(通常约5～7天，本实验6天，还可见部分间充质干细胞、成纤维细胞等杂细胞)，去组织，换液(即上述完全培养基)继续培养；
(5)待出现多处典型的上皮细胞群(通常约8～12天，本实验10d)，呈铺路石样紧密排列，局部融合率达90％时，进行传代培养(体视显微镜镜下挑取羊膜上皮细胞于离心管中，吹散，细胞计数仪计数，按3000/cm2接种至培养瓶中，使用完全培养基继续培养)；
(6)收获：用胰酶消化液(包含0.25％的胰蛋白酶和0.02％的EDTA的消化液)消化后收集细胞，计数，冻存，即得P1代的人羊膜上皮细胞，必要时对其进行传代培养。
实施例2：从胎盘羊膜制备人羊膜上皮细胞
(1)从胎盘样品采集盒中取出胎盘，置于白瓷盘中，使用基础平衡盐溶液(将0.4g的KCl、0.06g的KH2PO4、0.132g的Na2HPO4.12H2O、8g的NaCl、0.35g的NaHCO3、1.0g的D-葡萄糖、0.10g的链霉素、0.06g的青霉素用水溶解并定容成1L的溶液，即得)反复冲洗表面，对胎盘进行消毒处理；
(2)用手术镊慢慢撕取胎膜外层羊膜置于150mm玻璃皿中，使用基础平衡盐溶液反复清洗表面污血，剪碎成直径为5mm的羊膜组织小块；
(3)羊膜小块均匀贴于100mm培养皿，羊膜上皮层朝下，晾干30-60min(本试验30min)后，缓慢添加完全培养基(DMEM基础培养基、10％FBS、10mg/L表皮生长因子)，没过组织；在37℃、5％CO2培养箱中培养；
(4)2天后补液(即补充上述完全培养基)，继续培养；待能够看到明显的卵圆形上皮细胞爬出(通常约5～7天，本实验7天，还可见部分间充质干细胞、成纤维细胞等杂细胞)，去组织，换液(即上述完全培养基)继续培养；
(5)待出现多处典型的上皮细胞群(通常约8～12天，本实验8d)，呈铺路石样紧密排列，局部融合率达90％时，进行传代培养(体视显微镜镜下挑取羊膜上皮细胞于离心管中，吹散，细胞计数仪计数，按3000/cm2接种至培养瓶中，使用完全培养基继续培养)；
(6)收获：用胰酶消化液(包含0.25％的胰蛋白酶和0.02％的EDTA的消化液)消化后收集细胞，计数，冻存，即得P1代的人羊膜上皮细胞，必要时对其进行传代培养。
实施例3：从胎盘羊膜制备人羊膜上皮细胞
(1)从胎盘样品采集盒中取出胎盘，置于白瓷盘中，使用基础平衡盐溶液(将0.4g的KCl、0.06g的KH2PO4、0.132g的Na2HPO4.12H2O、8g的NaCl、0.35g的NaHCO3、1.0g的D-葡萄糖、0.10g的链霉素、0.06g的青霉素用水溶解并定容成1L的溶液，即得)反复冲洗表面，对胎盘进行消毒处理；
(2)用手术镊慢慢撕取胎膜外层羊膜置于150mm玻璃皿中，使用基础平衡盐溶液反复清洗表面污血，剪碎成直径为5mm的羊膜组织小块；
(3)羊膜小块均匀贴于100mm培养皿，羊膜上皮层朝下，晾干30-60min(本试验60min)后，缓慢添加完全培养基(DMEM基础培养基、10％FBS、10mg/L表皮生长因子)，没过组织；在37℃、5％CO2培养箱中培养；
(4)2天后补液(即补充上述完全培养基)，继续培养；待能够看到明显的卵圆形上皮细胞爬出(通常约5～7天，本实验5天，还可见部分间充质干细胞、成纤维细胞等杂细胞)，去组织，换液(即上述完全培养基)继续培养；
(5)待出现多处典型的上皮细胞群(通常约8～12天，本实验12d)，呈铺路石样紧密排列，局部融合率达90％时，进行传代培养(体视显微镜镜下挑取羊膜上皮细胞于离心管中，吹散，细胞计数仪计数，按3000/cm2接种至培养瓶中，使用完全培养基继续培养)；
(6)收获：用胰酶消化液(包含0.25％的胰蛋白酶和0.02％的EDTA的消化液)消化后收集细胞，计数，冻存，即得P1代的人羊膜上皮细胞，必要时对其进行传代培养。
经本发明实施例1～3的方法制备P1代的人羊膜上皮细胞，针对不同胎盘样本，平均地讲，每400平方厘米羊膜可以得到(1.73～2.21)×108个人羊膜上皮细胞。但是经本发明实施例4～6的方法制备P1代的人羊膜上皮细胞，针对不同胎盘样本，平均地讲，每400平方厘米羊膜可以得到(7.46～9.38)×108个人羊膜上皮细胞，显著地高于实施例1～3方法。本发明在参照实施例4～6的补充试验中，发现如果在完全培养基中硝酸硫胺和麦芽糖二者只添加其中的一种，则此时制备P1代的人羊膜上皮细胞，针对不同胎盘样本，平均地讲，每400平方厘米羊膜可以得到(1.32～1.97)×108个人羊膜上皮细胞，这表明将硝酸硫胺和麦芽糖之一增补到完全培养基中无法有效地提高人羊膜上皮细胞的产量。此外，本发明人参考其它现有技术文献，例如本发明已经引用的专利文献中的方法制备P1代(以P1代为比较参数，更具可比性)的人羊膜上皮细胞时，其平均每400平方厘米羊膜可以得到的人羊膜上皮细胞小于1.6×108个。
实施例4：从胎盘羊膜制备人羊膜上皮细胞
(1)从胎盘样品采集盒中取出胎盘，置于白瓷盘中，使用基础平衡盐溶液(将0.4g的KCl、0.06g的KH2PO4、0.132g的Na2HPO4.12H2O、8g的NaCl、0.35g的NaHCO3、1.0g的D-葡萄糖、0.10g的链霉素、0.06g的青霉素用水溶解并定容成1L的溶液，即得)反复冲洗表面，对胎盘进行消毒处理；
(2)用手术镊慢慢撕取胎膜外层羊膜置于150mm玻璃皿中，使用基础平衡盐溶液反复清洗表面污血，剪碎成直径为5mm的羊膜组织小块；
(3)羊膜小块均匀贴于100mm培养皿，羊膜上皮层朝下，晾干30-60min(本试验45min)后，缓慢添加完全培养基(DMEM基础培养基、10％FBS、10mg/L表皮生长因子、0.02％硝酸硫胺、0.085％麦芽糖)，没过组织；在37℃、5％CO2培养箱中培养；
(4)2天后补液(即补充上述完全培养基)，继续培养；待能够看到明显的卵圆形上皮细胞爬出(通常约5～7天，本实验6天，还可见部分间充质干细胞、成纤维细胞等杂细胞)，去组织，换液(即上述完全培养基)继续培养；
(5)待出现多处典型的上皮细胞群(通常约8～12天，本实验10d)，呈铺路石样紧密排列，局部融合率达90％时，进行传代培养(体视显微镜镜下挑取羊膜上皮细胞于离心管中，吹散，细胞计数仪计数，按3000/cm2接种至培养瓶中，使用完全培养基继续培养)；
(6)收获：用胰酶消化液(包含0.25％的胰蛋白酶和0.02％的EDTA的消化液)消化后收集细胞，计数，冻存，即得P1代的人羊膜上皮细胞，必要时对其进行传代培养。图1显示了本实施例所得人羊膜上皮细胞显微图。
实施例5：从胎盘羊膜制备人羊膜上皮细胞
(1)从胎盘样品采集盒中取出胎盘，置于白瓷盘中，使用基础平衡盐溶液(将0.4g的KCl、0.06g的KH2PO4、0.132g的Na2HPO4.12H2O、8g的NaCl、0.35g的NaHCO3、1.0g的D-葡萄糖、0.10g的链霉素、0.06g的青霉素用水溶解并定容成1L的溶液，即得)反复冲洗表面，对胎盘进行消毒处理；
(2)用手术镊慢慢撕取胎膜外层羊膜置于150mm玻璃皿中，使用基础平衡盐溶液反复清洗表面污血，剪碎成直径为5mm的羊膜组织小块；
(3)羊膜小块均匀贴于100mm培养皿，羊膜上皮层朝下，晾干30-60min(本试验30min)后，缓慢添加完全培养基(DMEM基础培养基、10％FBS、10mg/L表皮生长因子、0.01％硝酸硫胺、0.1％麦芽糖)，没过组织；在37℃、5％CO2培养箱中培养；
(4)2天后补液(即补充上述完全培养基)，继续培养；待能够看到明显的卵圆形上皮细胞爬出(通常约5～7天，本实验7天，还可见部分间充质干细胞、成纤维细胞等杂细胞)，去组织，换液(即上述完全培养基)继续培养；
(5)待出现多处典型的上皮细胞群(通常约8～12天，本实验8d)，呈铺路石样紧密排列，局部融合率达90％时，进行传代培养(体视显微镜镜下挑取羊膜上皮细胞于离心管中，吹散，细胞计数仪计数，按3000/cm2接种至培养瓶中，使用完全培养基继续培养)；
(6)收获：用胰酶消化液(包含0.25％的胰蛋白酶和0.02％的EDTA的消化液)消化后收集细胞，计数，冻存，即得P1代的人羊膜上皮细胞，必要时对其进行传代培养。
实施例6：从胎盘羊膜制备人羊膜上皮细胞
(1)从胎盘样品采集盒中取出胎盘，置于白瓷盘中，使用基础平衡盐溶液(将0.4g的KCl、0.06g的KH2PO4、0.132g的Na2HPO4.12H2O、8g的NaCl、0.35g的NaHCO3、1.0g的D-葡萄糖、0.10g的链霉素、0.06g的青霉素用水溶解并定容成1L的溶液，即得)反复冲洗表面，对胎盘进行消毒处理；
(2)用手术镊慢慢撕取胎膜外层羊膜置于150mm玻璃皿中，使用基础平衡盐溶液反复清洗表面污血，剪碎成直径为5mm的羊膜组织小块；
(3)羊膜小块均匀贴于100mm培养皿，羊膜上皮层朝下，晾干30-60min(本试验60min)后，缓慢添加完全培养基(DMEM基础培养基、10％FBS、10mg/L表皮生长因子、0.03％硝酸硫胺、0.07％麦芽糖)，没过组织；在37℃、5％CO2培养箱中培养；
(4)2天后补液(即补充上述完全培养基)，继续培养；待能够看到明显的卵圆形上皮细胞爬出(通常约5～7天，本实验5天，还可见部分间充质干细胞、成纤维细胞等杂细胞)，去组织，换液(即上述完全培养基)继续培养；
(5)待出现多处典型的上皮细胞群(通常约8～12天，本实验12d)，呈铺路石样紧密排列，局部融合率达90％时，进行传代培养(体视显微镜镜下挑取羊膜上皮细胞于离心管中，吹散，细胞计数仪计数，按3000/cm2接种至培养瓶中，使用完全培养基继续培养)；
(6)收获：用胰酶消化液(包含0.25％的胰蛋白酶和0.02％的EDTA的消化液)消化后收集细胞，计数，冻存，即得P1代的人羊膜上皮细胞，必要时对其进行传代培养。
试验例1：羊膜上皮细胞的验证：
(一)、流式细胞仪
CD45检测：准备两支流式管，编号，其中一支为质控管一支为样品管，将CD45的control试剂摇匀，向质控管中加入20ul，再将CD45试剂摇匀，向样品管中加入20ul的CD45试剂，然后将样品震荡摇匀，向两支流式管中各加入600ul样品，然后混匀，置于4℃左右避光孵育30分钟，然后向质控管和样品管中分别加入1毫升PBS，混匀后1500转/分钟离心5分钟，后弃去上清，加入240ul的PBS后混匀上机，检测阳性结果≦2％则为合格，出具细胞表面标记物检测合格报告。
HLA-DR检测：准备两支流式管，编号，其中一支为质控管一支为样品管，将HLA-DR的control试剂摇匀，向质控管中加入20ul，再将HLA-DR试剂摇匀，向样品管中加入20ulHLA-DR试剂，然后将样品震荡摇匀向两支流式管中各加入600ul样品，然后混匀，置于4℃左右避光孵育30分钟，然后质控管和样品管中分别加入1毫升PBS，混匀后1500转/分钟离心5分钟，后弃去上清，加入240ul的PBS后混匀上机，检测阳性结果≦2％则为合格，出具细胞表面标记物检测合格报告。
SSEA-4检测：准备两支流式管，编号，其中一支为质控管一支为样品管，将SSEA-4的control试剂摇匀，向质控管中加入20ul，再将SSEA-4试剂摇匀，向样品管中加入20ulSSEA-4试剂，然后将样品震荡摇匀向两支流式管中各加入600ul样品，然后混匀，置于4℃左右避光孵育30分钟，然后质控管和样品管中分别加入1毫升PBS，混匀后1500转/分钟离心5分钟，后弃去上清，加入240ul的PBS后混匀上机，检测阳性结果≧80％则为合格，出具细胞表面标记物检测合格报告。
(二)、荧光定量PCR(检测Nanog、Oct4、Kcf4和SOX2基因的表达量，引物由专业基因公司合成)以下为操作步骤：
1.样品RNA的抽提
①从-70℃冰箱取出细胞样品后，放于冰上，后转移至操净台，在细胞样品管中迅速加入1毫升Trizol试剂。将此样品管标为1号管。待1号管中细胞融化后，用1毫升移液枪反复吹打直至看不见任何不溶物，吸取1毫升细胞样品转移至2号干净无RNA酶的EP离心管中，写好与样品对应的编号。
②两相分离：将已混合均匀的样品放在掌上离心机离心3s,使管盖的Trizol试剂进入管内。每1毫升的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2毫升的氯仿，盖紧管盖。将已盖紧的2号EP管手动剧烈震荡15s，在15到30℃静置5分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60％。
③RNA沉淀：小心地从离心机中拿出已离心好的样品，放在超净台上。将2号管倾斜45°角，将水相上层转移到3号干净无RNA酶的离心管中，切勿碰到管壁和吸到中间层。加入等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，盖紧管盖，写好与之对应的编号。轻轻颠倒5次，使之混匀。混匀后在15到30℃静置10分钟后，于4℃下12000rpm离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。
④RNA清洗：移去3号管中的上清液，每1毫升TRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1毫升的75％乙醇(75％乙醇用DEPC水配制)，清洗RNA沉淀。盖紧管盖，反复颠倒数次，使沉淀漂浮起来。室温静置5分钟。然后将3号管4℃下7500rpm离心5分钟。
⑤RNA干燥：尽可能的小心吸去3号管中所有乙醇溶液，切勿吸走沉淀。开风机，风干5-10分钟左右。然后使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。
⑥溶解RNA沉淀：加入适量的无RNase水，静置5分钟。在58℃的的水浴锅中水浴8分钟。从水浴锅中取出溶解好的RNA，在漩涡振荡器上震荡10秒。获得的3号管的RNA溶液保存于-80℃待用。
2.RNA质量检测(紫外吸收法测定)
先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA溶液用TE稀释(1:100)后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定RNA溶液的浓度和纯度。
①浓度测定
A260下读值为1表示40ug RNA/毫升。样品RNA浓度(ug/毫升)计算公式为：A260×稀释倍数×40ug/毫升。具体计算如下：
RNA溶于40ul DEPC水中，取5ul，1:100稀释至495ul的TE中，测得A260＝0.21
RNA浓度＝0.21×100×40ug/毫升＝840ug/毫升或0.84ug/微升
取5ul用来测量以后，剩余样品RNA为35ul，剩余RNA总量为：
35ul×0.84ug/ul＝29.4ug
②纯度检测
RNA溶液A260和A280两数值的比值即为RNA纯度，质量合格的RNA溶液的A260/A280比值范围应为1.8到2.1。
通过本试验例1的测试方法测试本发明实施例1～6所得人羊膜上皮细胞，结果显示上述测试的各参数均与人羊膜上皮细胞典型特征相符。例如，经流式检测，实施例1～6所得人羊膜上皮细胞表面标识物SSEA-4百分率均在94％以上。另外，采用本领域公知的方法测试本发明实施例1～6所得人羊膜上皮细胞的CK19、CD9、CD73、CD90、Nanog、CD34、CD45、HLA-DR，结果显示这些标志物均与人羊膜上皮细胞符合。特别是，例如，CK19、CD9、CD73、CD90、Nanog均呈阳性，而CD34、CD45、HLA-DR均呈阴性。另外，本发明实施例1～6所得人羊膜上皮细胞诱导分化结果显示其成软骨、成脂、成骨均为阳性。

Claims (8)

1.从胎盘羊膜制备人羊膜上皮细胞的方法，该方法包括以下步骤：
(1)从胎盘样品采集盒中取出胎盘，置于白瓷盘中，使用基础平衡盐溶液反复冲洗表面，对胎盘进行消毒处理；
(2)用手术镊慢慢撕取胎膜外层羊膜置于150mm玻璃皿中，使用基础平衡盐溶液反复清洗表面污血，剪碎成直径为5mm的羊膜组织小块；
(3)羊膜小块均匀贴于100mm培养皿，羊膜上皮层朝下，晾干30-60min后，缓慢添加完全培养基，没过组织；在37℃、5%CO2培养箱中培养；所述完全培养基包括：DMEM基础培养基、10%FBS、10mg/L表皮生长因子、0.01~0.05%硝酸硫胺和0.05~0.1%麦芽糖；
(4)2天后补液，继续培养；待能够看到明显的卵圆形上皮细胞爬出，去组织，换液继续培养；
(5)待出现多处典型的上皮细胞群，呈铺路石样紧密排列，局部融合率达90%时，进行传代培养；
(6)收获：用胰酶消化液消化后收集细胞，计数，冻存，即得P1代的人羊膜上皮细胞，必要时对其进行传代培养。
2.根据权利要求1的方法，所述基础平衡盐溶液中包括链霉素和青霉素两种抗生素。
3.根据权利要求1的方法，所述基础平衡盐溶液是通过如下方式配制得到的：将0.4g的KCl、0.06g的KH2PO4、0.132g的Na2HPO4.12H2O、8g的NaCl、0.35g的NaHCO3、1.0g的D-葡萄糖、0.10g的链霉素、0.06g的青霉素用水溶解并定容成1L的溶液。
4.根据权利要求1的方法，步骤(4)中，继续培养至能够看到明显的卵圆形上皮细胞爬出，此时培养5~7天，并且此时还可见部分间充质干细胞、成纤维细胞。
5.根据权利要求1的方法，步骤(5)中，出现多处典型的上皮细胞群时为培养8~12天。
6.根据权利要求1的方法，步骤(5)中，传代培养是照如下操作进行的：体视显微镜镜下挑取羊膜上皮细胞于离心管中，吹散，细胞计数仪计数，按3000/cm2接种至培养瓶中，继续培养。
7.根据权利要求1的方法，步骤(5)中，胰酶消化液是包括0.25%的胰蛋白酶和0.02%的EDTA的消化液。
8.权利要求1~7任一项所述方法制备的人羊膜上皮细胞在制备作为细胞治疗剂的药物中的用途。
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