CN102994447B - 一种培养扩增人类毛囊干细胞及重编程为诱导多能干细胞的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种培养扩增人类毛囊干细胞及重编程为诱导多能干细胞的方法，其具体步骤为：将准备拔取毛发的部位贴根部剪去至仅留0.2-0.3cm左右毛发根，75％酒精消毒10min；漂洗；将单根毛发种入培养皿中，采用毛囊干细胞培养基培养；1周后每3-4天换液一次；E、逆转录病毒包装；诱导毛囊干细胞重编程为iPS细胞；毛囊干细胞来源的iPS细胞维持培养及鉴定。本发明过程简单；无需蛋白酶消化成单细胞；扩增的毛囊干细胞中β-整合素和角蛋白-19阳性率达90％以上；为皮肤缺损的快速修复、毛囊干细胞的生长与发生的分子机理研究、表观遗传学研究和重编程为诱导多能干细胞提供充足的种子细胞来源。

Description

一种培养扩增人类毛囊干细胞及重编程为诱导多能干细胞的方法

技术领域

本发明涉及干细胞领域，特别涉及一种培养扩增人类毛囊干细胞及重编程为诱导多能干细胞的方法。

背景技术

根据细胞发育进程可将干细胞分为成体干细胞(adultstemcells)和胚胎干细胞(embryonicstemcells)，根据干细胞的分化潜能等特点，可将干细胞可分为全能干细胞(totipotentstemcells)、多能干细胞(pluripotent/multipotentstemcells)、专能干细胞(unipotentstemcells)和终末分化细胞。全能干细胞可以分化形成人体所具有的全部细胞、或发育形成新的个体，是指在早期胚胎发育过程中的受精卵及受精卵进一步***形成2个、4个或8个卵裂球时期的细胞。多能干细胞(英文表述为：pluripotentstemcells)可以分化形成人体所具有的全部细胞、但不能发育形成新的个体，主要存在于胚胎之中。在早期胚胎发育过程中，受精卵进一步***形成的桑椹胚，桑椹胚再进一步分化形成胚泡；胚泡的成胚体细胞，及在此阶段以前的细胞，只要提取一个细胞，都可以可以分化形成人体所具有的全部细胞。另一概念上的多能干细胞(英文表述为：multipotentstemcells)已经是上述细胞的发育更晚时期了，如各胚层的细胞、及造血干细胞。这些细胞可以分化成很多种细胞，如造血干细胞可以分化成各种白细胞、红细胞、血小板等。单能干细胞或专能干细胞，只能分化成一种细胞，或者是分化成关系比较密切的两种细胞(在特殊条件下也可以发生横向分化)。单能干细胞存在非常广泛，在大部分组织器官都有存在。

胚胎干细胞(embryonicstemcells，EScells)是一种来源于早期胚胎、能在体外长期传代培养、维持正常核型、具有自我更新和分化发育为3个胚层组织细胞潜能的多能性细胞。1981年英国Evans等人建立起第一个小鼠的用生化胚胎干细胞株。此后，科学家又相继建立了猪、牛、绵羊、山羊、兔、水貂、仓鼠、恒河猴、狨等ES细胞系。为研究细胞分化、动物发育、建立相关研究模型、阐明基因功能等开辟了广阔的研究空间。1998年，美国威斯康星大学Thomson教授，在征得胚胎所有者同意后，从做试管婴儿剩余的胚胎中分离出胚胎干细胞，并在体外培养成功。同年，美国约翰-霍普金斯大学的Gearhart教授等人从早期(约6周)流产胚胎的卵巢和睾丸组织中分离出原始生殖干细胞，并建立了胚胎生殖干细胞系。随着同源重组技术在小鼠等哺乳动物遗传修饰动物模型中的广泛应用、哺乳动物体细胞核移植技术的建立和日益完善、ES细胞在体外定向分化手段的日益多样化和成熟，使得ES细胞在多个领域，如细胞治疗、组织工程等方面展示了巨大潜力，被认为是细胞移植替代治疗的未来的希望。

2006年，Yamanaka等***研究小鼠和人ESCs多潜能性相关因子时发现4个转录因子：Oct4，Sox2，Klf4，c-Myc，将这四个因子导入鼠成纤维细胞后，成纤维细胞重编程形成ESCs类似的多能干细胞，被称为诱导多能干细胞(mouseinducedPluripotentStemcells，miPSCs)。2007年Yamanaka和Yu等分别独立建立了人iPS细胞系(humaniPSCs，hiPSCs)。这一研究成果被誉为生命科学新的里程碑，它不仅为研究多能性的调控机制带来了观念上的创新和提供了新的研究模型，更为解决目前干细胞移植治疗中最大难点之-移植后的免疫排异问题-开辟了新的途径。iPSCs细胞在形态、多能性维持和分化潜能上与ESCs一致，且克服了ESCs不可避免的伦理学争议和异体细胞移植排斥等问题。因此，hiPSCs已逐渐代替hESCs成为未来临床转化医学重要的细胞来源。

近几年来，研究者们陆续从多种细胞类型中重编程获得hiPSCs细，如皮肤成纤维细胞、骨髓间充质干细胞、肝脏细胞和胃上皮细胞、神经前体细胞、胰岛细胞、人皮肤和毛囊角质形成细胞、脂肪干细胞、羊水来源细胞、血液前体细胞、神经干细胞、脐带血干细胞、脐带华通胶和羊膜来源细胞、外周血T淋巴细胞等。这种通过活检或其他借助外科手段获取种子细胞制备患者特异性的iPS有望克服胚胎干细胞治疗中所带来的免疫排斥和深层的伦理学问题。上述不同的体细胞在hiPSCs重编程过程中有着不同的特点，并且上述方法在获取所需要的种子细胞过程当中，因为要借助于活检或抽血等手段，将会对患者造成一定程度上的损伤，所以需要一种新的微创或无创的方法获取种子细胞，并且这种种子细胞能高效率地被再程序化为iPS细胞。

发明内容

针对背景技术中的问题，本发明提供以下技术方案：

一种培养扩增人类毛囊干细胞及重编程为诱导多能干细胞的方法，其具体步骤为：

A、将准备拔取毛发的部位贴根部剪去至仅留0.2-0.3cm左右毛发根，75％酒精消毒10min；

B、用清洁眉镊快速将发根拔出，并快速置入无菌的PBS中漂洗；

C、将单根毛发种入培养皿中，采用毛囊干细胞培养基培养；

D、每天观察毛发的生长情况，1周后每3-4天换液一次；

E、逆转录病毒包装：采用试剂Fugene6和PLATA细胞进行逆转录病毒的包装，分别利用pMX-hOct4、pMX-hSox2、pMX-hKlf4和pMX-hc-Myc包装出四种逆转录病毒；

F、通过逆转录病毒感染毛囊干细胞，促使其表达外源的人类Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc基因，诱导毛囊干细胞重编程为iPS细胞；

G、毛囊干细胞来源的iPS细胞维持培养及鉴定。

作为本发明的优选技术方案，，所述步骤A中：小剪刀、镊子及棉球临用前灭菌，最好准备一间无菌间，或经紫外灭菌的房间，或病人家中(临时用70％的乙醇喷洒整个房间)；如采集头发者，剪去耳后2cmx2cm大小面积的长发，仅留2-3毫米长的毛发，用70％的乙醇棉球擦除被剪毛发部分及周边部分10X10cm大小面积，五min后再用70％的乙醇棉球擦一次。

作为本发明的优选技术方案，，培养所述步骤C中的毛囊干细胞培养基为：含1％B27、10ng/mLbFGF和50ng/mLEGF的DMEM/F12。

作为本发明的优选技术方案，，所述步骤E中：转染前2天，准备4个100mm培养皿，各接种2×106个PLATA细胞；转染当天，4个100mm培养皿的PLAT-A细胞汇合度达到70％，符合转染所需细胞数量要求；取4个EP管，每个加300ulOPTI-MEM和27ulFugene6，轻轻弹匀，室温孵育5min；pMX-hOct4、pMX-hSox2、pMX-hKlf4和pMX-hc-Myc各9μg分别加至上述4个EP管内，充分混匀后，室温孵育15min；将上述4个EP管内混合液分别加至4个100mm培养皿，轻轻摇匀培养皿后，放置在37℃，5％CO2的温箱进行培养；转染24h后，4个培养皿进行换液，各加10mL不含双抗的PLATA基本培养基；转染48h后，收集4个含转录因子病毒上清至一个50mL离心管，混匀，约36mL；收集上述病毒后用于感染毛囊干细胞。

作为本发明的优选技术方案，，所述步骤F中：用1∶1∶1∶1的上述四种混合逆转录病毒感染提前24h准备的细胞总数为0.5-1x105的成纤维细胞，并选用10ng/mLPolybrene增加感染效率；8小时后换成新鲜培养液，24小时后重复一次。最后一次重复24小时后转移感染后细胞到MEFs，24小时后换成iPS培养液，之后每天更换培液，观察细胞形态变化并记录第一个克隆出现时间，直到第二十天克隆足够大时挑克隆扩大培养。

作为本发明的优选技术方案，所述步骤G中：在原代iPS克隆足够大或iPS克隆生长接近汇合之前传代，一般5～7天传代一次；可采用两种传代方法：机械法，主要用于早期iPS克隆挑选及传代：在体视显微镜下，用注射器针头将iPS克隆与饲养层细胞剥离，并切割为数块；用200uL枪头轻轻将其逆向铲离饲养层和培养皿底，并转种到新的饲养层上，移入培养箱内培养；次日大部分iPS克隆贴壁，随后每日换液并观察；消化法：加入含1mg/mLCollageIV和1mg/mLDispase的培养液置于培养箱中消化10-15min；收集iPS克隆并离心，沉淀用iPS培养液重悬后再次离心；iPS克隆的沉淀用iPS培养液重悬，并轻轻吹吸成50～100个细胞的小团块，按1∶3～1∶5分种至新的饲养层上，培养箱中继续培养；定时观察和换液。

本发明所述检测方法及检测试剂盒所带来的有益效果是：

1、提供了一种人头发、胡髭、腋毛及***来源的毛囊干细胞扩增制备方法。

2、提供了头发、胡髭、腋毛及***来源的毛囊干细胞培养基；

3、提供了毛囊干细胞重编程为诱导多能干细胞的方法；

4、本发明提供的方法仅需要采集低至单根毛发，无需对个体进行组织活检或抽取血液，极大的减少了人的痛苦；

5、采集毛囊时仅需用消毒剂处理五min后直接拔取，过程简单；

6、单根毛囊经二周的培养可得到0.5-1x10⁵毛囊干细胞数，细胞量足够为重编程为诱导全能干细胞提供充足的细胞来源，同时为皮肤缺损的快速修复、毛囊干细胞的生长与发生的分子机理研究、表观遗传学研究和诱导多能干细胞提供充足的种子细胞来源。

附图简述

图1显示悬浮培养的从一根人毛发上生长出来的毛囊干细胞球(放大倍数20x)。

图2显示一个从毛囊干细胞再程序化而来的诱导多能干细胞克隆(放大倍数10x)。

具体实施方式

下面对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。

实施例中，下述缩略语表示如下的意义，未加定义的缩略语使用其通常可接受的定义：

PBS＝磷酸缓冲液；DMEM/F12＝DMEM与F12为1∶1混合细胞培养基；cm＝厘米；bFGF＝碱性成纤维细胞生长因子；EGF＝表皮细胞生长因子；HBSS＝Hank’s平衡盐溶液；℃＝摄氏度；min＝min；mL＝毫升；μL＝微升。

第一部分：毛囊干细胞采集

1、试剂及仪器

①70％乙醇；

②PBS；

③DMEM/F12；

④100x青/链霉素储备液；

⑤棉球；

⑥带喷嘴的500毫升塑料瓶；

⑦24孔培养板；

⑧小剪刀一把；

⑨眉毛镊子一把。

2、头发毛囊的采集：

①小剪刀、眉毛镊子及棉球临用前灭菌，无菌条件下24孔培养板每孔加200uLDMEM/F12及2uL100x青/链霉素储备液；

②准备一间无菌间，或经紫外灭菌的房间，或病人家中(临时用70％的乙醇喷洒整个房间)；

③被采集毛囊者换无菌衣服或衣服喷70％的乙醇进入无菌间和经紫外灭菌的房间；

④采集头发者：剪去耳后2cmx2cm大小面积的长发，仅留2-3毫米长的毛发；

⑤用70％的乙醇棉球擦除被剪毛发部分及周边部分10X10cm大小面积；

⑥五min后再用70％的乙醇棉球擦一次；

⑦十min后手术者无菌条件下持眉毛镊子采集毛根5至10根，无菌条件下放入24孔培养板中；

⑧一小时内送回实验室中，无条件者可在24小时内4度冷藏保存送回实验室。

第二部分：毛囊干细胞培养及传代

1、毛囊干细胞的培养

试剂及仪器

①DMEM/F12液体培养基(Invitrogen，Cat.no.11330-32)；

②B27添加剂；

③bFGF细胞因子；

④EGF表皮生长因子；

⑤100X双抗；

⑥PBS；

⑦HBSS(Invitrogen，Cat.no.14170-088)；

⑧Dispase酶(bectonDickinson，S.A.，cat.no.354235)；

⑨TrypLEExpressStableTrypsinReplacement(Invitrogen，Cat.no.12604-039)；

⑩CO2培养箱；

超净工作台；

培养瓶。

2、毛囊干细胞培养

①毛囊干细胞培养基的配置：DMEM/F12，2％B27，20ng/mlbFGF，20ng/mlEGF，1％双抗；

②每孔加入1mlPBS漂洗毛发一次；

③每孔加入2ml毛囊干细胞培养基；

④置37℃、5％CO2培养箱中培养，每3天换液一次，共二周。

3、毛囊干细胞消化与传代

①将毛囊干细胞用PBS漂洗一次，加0.5mlHBSS配置的Dispase消化液(500U/ml)，视毛囊干细胞团大小，4度消化1--5小时；

②将Dispase消化液吸净，加入0.5ml的TrypLEExpressStableTrypsinReplacement，37度消化20min；

③用10％的血清中和，再用200ul的枪头吹打至单细胞；

④转移至1.5ml灭菌的Ep管中，300xg离心5min；

⑤单个的毛囊干细胞重新种植在有或无MEF的6孔培养皿(先用Matrigel包埋皿底)中传代。

第三部分：毛囊干细胞重编程为诱导全能干细胞(iPS)

1、试剂准备

①pMSCV逆转录病毒质粒(含Oct-4、Sox-2、Klf4、c-Myc和GFP表达序列，Addgene)；

②FuGENE6转染试剂(RocheAppliedScience，cat.no.1181509001)；

③EpiLife。

2、pMSCV逆转录病毒的扩增

①解冻一管293细胞，扩增培养至10cm直径的培养皿中至80％的融合，加入27ul的FuGENE6/9ug的pMSCV逆转录病毒质粒DNA于培养液中(极慢的加入)；

②置37℃、5％CO2培养箱中培养24小时；

③加新鲜的培养基10ml，置32℃、5％CO2培养箱中再培养24小时；

④采集病毒上清液，并加人新的DMEM培养基；

⑤病毒上清液用0.45ulPVDF滤膜过滤，并加入1ulpolybrene(10mg/ml)/ml作助转剂。

3、pMSCV逆转录病毒的转染

①当种植在有或无MEF培养皿(先用Matrigel包埋皿底)中毛囊干细胞当达到30％的融合时，加入新鲜的病毒上清液(已用0.45ulPVDF滤膜过滤，并加入1ulpolybrene(10mg/ml)/ml作助转剂)1ml(6孔皿)，32℃10min；

②将6孔皿离心，650xg，32℃45min；

③离心后将6孔皿置32℃、5％CO2培养箱中培养20min；

④移除含病毒质粒的液体，用PBS洗二次，加入新的EpiLif；e

⑤24小时后，按上述①～④方法重复感染病毒一次；

⑥再培养24～48小时后，将被感染的细胞转移到新的MEF培养皿中；

⑦以后每二天换液一次，4-5天后应该可以可见小克隆团，14～28天后应该可以可见大克隆团；

⑧挑出5-7个典型的克隆团进行鉴定并传代。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本领域的技术人员在本发明所揭露的技术范围内，可不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。

Claims (1)

1.一种培养扩增人类毛囊干细胞及重编程为诱导多能干细胞的方法，其特征在于，其具体步骤为：

A、将准备拔取毛发的部位贴根部剪去至仅留0.2-0.3cm左右毛发根，75％酒精消毒10min；

B、用清洁眉镊快速将发根拔出，并快速置于无菌的PBS中漂洗；

C、将单根毛发种入培养皿中，采用毛囊干细胞培养基培养，以获得毛囊干细胞，所述毛囊干细胞培养基为含1％B27、10ng/mlbFGF和50ng/mlEGF的DMEM/F12；

D、每天观察毛发的生长情况，1周后每3-4天换液一次；

E、逆转录病毒包装：采用试剂Fugene6和PLATA细胞进行逆转录病毒的包装，分别利用pMX-hOct4、pMX-hSox2、pMX-hKlf4和pMX-hc-Myc包装出四种逆转录病毒；

F、通过逆转录病毒感染毛囊干细胞，促使其表达外源的人类Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc基因，诱导毛囊干细胞重编程为iPS细胞。