CN105200005A - 一种牙鲆肌卫星细胞系的构建方法及其鉴定牙鲆肌卫星细胞标记基因的特异性引物和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及海水鱼类细胞培养技术，具体说是一种牙鲆肌卫星细胞系的构建方法及其鉴定牙鲆肌卫星细胞标记基因的特异性引物和应用。是将牙鲆肌肉组织经原代培养和传代培养，继而构建细胞系；构建后冷冻保存、复苏和鉴定，其中原代培养和传代培养中所采用的细胞培养液为在细胞培养液中添加胎牛血清和人碱性成纤维细胞生长因子。建立的牙鲆肌卫星细胞系形态为梭形或纺锤形单核细胞，该细胞系可以连续传代，能提供大量牙鲆肌卫星细胞。不仅可直接用于牙鲆肌肉发育相关功能基因的研究，为探索鱼类肌肉分化途径的分子机制研究提供丰富的细胞来源，而且可望为牙鲆养殖生产中肌肉性状改良研究及应用提供研究平台。

Description

一种牙鲆肌卫星细胞系的构建方法及其鉴定牙鲆肌卫星细胞标记基因的特异性引物和应用

技术领域

本发明涉及海水鱼类细胞培养技术，具体说是一种牙鲆肌卫星细胞系的构建方法及其鉴定牙鲆肌卫星细胞标记基因的特异性引物和应用。

背景技术

肌卫星细胞是一种起源于胚胎中胚层的肌源性干细胞，它的激活、增殖和分化是骨骼肌细胞增大、数目增多及肌纤维转化的重要基础。骨骼肌是鱼肉组成的主要成分，水产养殖的效益源于鱼类骨骼肌的快速增长，故骨骼肌生长和正常发育对于鱼类养殖发展是很重要的。肌卫星细胞的体外培养是了解骨骼肌细胞增殖、分化和再生机理的重要手段和技术，可以籍此研究和了解鱼类肌纤维发生分化与相关功能基因时空表达的内在联系以及相关调节因子的作用机制，从而促进鱼类肌肉速生快长；鱼类肌卫星的更新和激活分子机理研究，也有助于获得促进鱼类肌肉生长的新的技术方法。但与其他脊椎动物相比，有关鱼类肌肉卫星细胞研究甚少，尤其是经济鱼类的肌肉卫星细胞系及相关研究几乎未见报道。牙鲆(Paralichthysolivaceus)俗称牙片鱼、偏口鱼、比目鱼，隶属于硬骨鱼纲、辐鳍亚纲、鲽形目、鲽亚目、牙鲆科、牙鲆属。其肉质鲜嫩，是一种名贵的海水经济鱼类，也是日本、韩国以及我国的重要海水增养殖鱼类之一。体外分离培养得到的牙鲆肌卫星细胞将成为研究牙鲆肌肉分化途径及性状改良分子机制的重要研究平台。

迄今，见诸报道的仅有大鼠、兔、猪、鸡等非鱼类的肌卫星细胞分离培养方法，其操作繁琐、容易污染，且在保持肌卫星细胞较长时间的生存和增殖能力方面存在不确定性，也不太适合鱼类肌卫星细胞培养。

发明内容

本发明的目的在于提供一种操作简便的牙鲆肌卫星细胞系的构建方法及其鉴定牙鲆肌卫星细胞标记基因的特异性引物和应用。

为实现上述目的，本发明采用技术方案为：

一种牙鲆肌卫星细胞系建立方法，将牙鲆肌肉组织经原代培养和传代培养，继而构建细胞系；

其中，原代培养，将0.5-1g靠近尾部的骨骼肌肉组织块充分剪碎后加入到细胞培养液中悬浮，而后将肌肉组织块悬液于25±0.2℃下正置培养，待组织块完成贴壁后再补加0.5-1mL细胞培养液；

传代培养，待上述经原代培养的组织块周围细胞迁出并增殖至形成巢式细胞晕时，加入0.25％胰蛋白酶消化液使细胞悬起得细胞悬液，而后利用细胞培养液进行原瓶传代培养,待原瓶传代细胞长满瓶底后，将其用0.25％胰蛋白酶消化液消化悬起后细胞悬液与新鲜细胞培养液按1：1-1：2(v/v)的比例分瓶传代，以后7天传代一次，15代后每3-5天传代一次，进而细胞系建立成功。

所述细胞培养液为在MEM培养液中加入占细胞培养液总体积20％的胎牛血清，10ng/mL人碱性成纤维生长因子，100U/mL青霉素，100μg/mL链霉素，pH值为7.0-7.4，于4℃下保存，备用。

所述牙鲆可以由其它海水或淡水鱼类所替换。进一步的说是半滑舌鳎、大菱鲆或圆斑星鲽。

所述骨骼肌肉组织块为将牙鲆骨骼肌组织置于细胞培养液中3-5min后，吸出培养液，用1.0-1.2mLPBS(pH7.2)反复冲洗骨骼肌组织，再吸出PBS，将肌肉组织剪成小块，待用。所述肌肉组织为约1mm³大小的小块。

所述原代培养组织块周围细胞迁出并增殖至形成巢式细胞晕时，吸出培养液，用PBS(pH7.2)冲洗，吸出PBS，加入0.25％胰蛋白酶液消化，而后显微镜下观察到细胞收缩即吸弃胰蛋白酶液，继续在显微镜下观察，待细胞变圆，在原瓶中加入细胞培养液使细胞悬浮，而后将悬液进行传代。

一种用于鉴定牙鲆肌卫星细胞标记基因的特异性引物，用于鉴定鱼类肌卫星细胞标记基因的特异性引物为，正向引物(F)TACTAGTGCTCGCCTGACATG；反向引物(R)TCAATCCTTAAACAATGCTGG。所述鱼类为牙鲆。

一种用于鉴定牙鲆肌卫星细胞标记基因的特异性引物的应用，所述特异性引物用于制备定性和/定量检测牙鲆肌卫星细胞标记基因的试剂盒。

本发明所具有的优点和积极效果如下：

1.本发明构建方式所涉及组织块培养法不仅能克服因两步酶消化法引起的细胞完整性破坏而导致的细胞功能紊乱和大量成肌细胞被消化的弊端，且其操作简便，更适宜鲆鲽类甚至于其他海水、淡水鱼类的肌卫星细胞培养。

2.本发明通过易于操作、简便的方式将骨骼肌组织经原代培养和传代培养的方式，获得可以连续传代且细胞能维持良好生长状态的肌卫星细胞。具体是指本发明中的牙鲆肌卫星细胞系的构建方法操作简单，重复性强，因此该构建方法更适用于构建其他海水和淡水鱼类肌卫星细胞系，应用价值极大。

3.通过采用本发明方法构建的牙鲆肌卫星细胞系可以进行连续传代，目前已传46代，能提供大量的牙鲆肌卫星细胞，细胞生长温度为25±0.2℃，细胞形态为梭形或纺锤形，生长曲线正常，染色体为正常的48条端部着丝点染色体。并通过肌卫星细胞标记基因检测确定其为牙鲆肌卫星细胞。以pEGFP-N3进行基因转染实验，可以观察到较强的绿色荧光，证实牙鲆肌卫星细胞系可以直接应用于鱼类肌纤维发生分化相关功能基因的作用机制等方面的研究。

附图说明

图1A、图1B为本发明实施例提供的相差显微镜下传代培养的牙鲆肌卫星细胞系图，其中A为牙鲆肌卫星细胞1代图(100×)，B为牙鲆肌卫星细胞22代图(100×)。

图2为本发明实施例提供的牙鲆肌卫星细胞系的生长曲线图。

图3为本发明实施例提供的牙鲆肌卫星细胞系的染色体中期***相。

图4为本发明实施例提供的牙鲆肌卫星细胞系细胞核DAPI染色图片(200×)。

图5为本发明实施例提供的牙鲆肌卫星细胞分子鉴定图片。

图6为本发明实施例提供的牙鲆肌卫星细胞系转染pEGFP-N3后的荧光显微图片(100×)。

具体实施方式：

本发明建立了鱼类肌卫星细胞的分离及离体培养体系，操作方法简单，重复性强，较之前报道的其他脊椎动物肌卫星细胞的分离及培养方法更容易掌握和操作，应用价值极大，为进一步的实验研究提供了材料和技术支持。

下面结合实施例详述本发明的构建、鉴定和应用方法。

实施例1

牙鲆肌卫星细胞系的建立方法，步骤如下：

1)配制细胞培养液：取Hyclone公司MEM培养液，向培养液中加入占总体积20％的胎牛血清，10ng/mL人碱性成纤维细胞生长因子，100U/mL青霉素，100μg/mL链霉素，pH值为7.0-7.4，4℃存放，备用。

2)原代培养：无菌取体重120g牙鲆的靠近尾部的骨骼肌肉组织，置于添加了400U/mL青霉素、400μg/mL链霉素的4mLHyclone公司MEM培养液的无菌玻璃平皿中3-5min后，吸出培养液，用1.0-1.2mLPBS(pH7.2)冲洗肌肉组织两次，吸出PBS，而后将肌肉组织剪成大约1mm³的小块，加入至1mL的上述步骤1)配制细胞培养液中，使肌肉组织小块悬浮，而后转至25cm²培养瓶中，于25±0.2℃培养箱正置培养。第二天向培养瓶中补充上述步骤1)配制细胞培养液0.5-1.0mL，然后每隔7天更换培养瓶中半量细胞培养液一次。

3)传代培养：待步骤2)原代培养细胞不断从组织块周围迁出并迅速增殖，当组织块周围细胞晕停止生长后，吸出培养液，用PBS(pH7.2)冲洗，吸出PBS后加入1mL的0.25％胰蛋白酶液消化。显微镜下观察到细胞收缩即吸弃胰蛋白酶液，继续在显微镜下观察，待细胞变圆，在原瓶中加入新鲜细胞培养液使细胞悬浮，而后将悬液进行传代。第一次传代后，当细胞长满瓶底时，将其用0.25％胰蛋白酶消化液消化悬起后细胞悬液与新鲜细胞培养液按1：1-1：2(v/v)的比例，至使培养液中细胞浓度在2×10⁴-2×10⁵细胞/mL进行分瓶传代；以后7天传代一次；传至15代后，进行1：2-1：3分瓶传代,每3-5天传代一次，进而细胞系建立成功。目前，该肌卫星细胞已经传至46代。细胞已能稳定增值，可定为细胞系，该细胞系主要细胞类型为体积小的单核梭形细胞(如图1A、B所示)。

实施例2

牙鲆肌卫星细胞系的鉴定和应用

1)细胞的冻存与复苏

细胞的冻存：

选取上述处于指数生长期、细胞密度达到90％以上的传代培养肌细胞，按常规方法消化，消化后显微镜下观察到细胞收缩即吸弃胰蛋白酶消化液，继续在显微镜下观察，待细胞变圆，在原瓶中加入2mL新鲜的上述实施例步骤1)配制细胞培养液制备细胞悬液。将细胞悬液转移至15mL离心管中，以2200rpm离心2min，去上清。用2mL预冷的冻存液(即含10％二甲基亚砜的Hyclone公司MEM细胞培养液)悬浮细胞，并移至2mL冻存管中，将冻存管放入程序降温盒中后依次于4℃放置30min，-20℃放置2h，-80℃放置过夜，然后移至液氮中保存，并做好记录。

所述消化方式为，将上述处于指数生长期的肌卫星细胞吸出培养液，而后用PBS(pH7.2)冲洗，吸出PBS后再加入1mL的0.25％胰蛋白酶液消化。

细胞的复苏：

自液氮中取出保存的冻存管，迅速置于42℃水浴中融化，2200rpm离心5min，弃上清，沉淀加入2mL上述实施例步骤1)配制的细胞培养液悬浮上述冻存细胞，转移至25cm²培养瓶中，放置于培养箱中25±0.2℃培养，次日待细胞贴壁后弃上清，沉淀中再加入2mL新的上述实施例步骤1)配制的细胞培养液。复苏后细胞存活率为88-90％，复苏细胞形态、生长速度无明显差异。

2)细胞生长曲线绘制

为了分析牙鲆肌卫星细胞系的生长情况，取40代肌卫星细胞，按照1.2×10⁵个细胞/孔的密度在24孔板中接种18孔，将细胞培养板置于25℃培养箱中培养。分别在接种后的第1，3，5，7，9，11天按照常规胰蛋白酶液消化法消化，收集3孔细胞，用细胞计数板计数。以培养时间为横坐标，以每毫升培养液中的细胞数量为纵坐标，绘制生长曲线，如图2所示。

3)染色体分析

取35代牙鲆肌卫星细胞，用按照上述实施例步骤1)配制的2mL细胞培养液悬浮，接种于25cm²的培养瓶中，接种密度为1×10⁶个细胞/瓶。25±0.2℃下培养24h，加入终浓度1μg/mL的秋水仙素3h后，按照常规胰蛋白酶液消化法消化，消化后以2200rpm离心2min收集细胞，细胞沉淀中加入10mL0.075mol/LKCl溶液37℃水浴低渗处理20min后，加入1mL预冷的卡诺固定液(甲醇：乙酸＝3：1(v/v))预固定2min，固定后以1000rpm离心5min后弃上清，细胞沉淀用5mL预冷卡诺固定液固定15min后以1000rpm离心5min收集细胞，重复操作两次。然后将细胞重悬于0.5mL预冷卡诺固定液中，将细胞悬液以冷滴法滴片，风干，10％吉姆萨染色10min，用Nikon显微镜观察。结果显示牙鲆肌卫星细胞的染色体众数为48条(图3)，均为端部着丝粒染色体，染色体核型为2n＝48t。

4)细胞核DAPI染色分析

DAPI(4，6-二甲脒基-2-苯基)能与双链DNA结合，结合后荧光强度增强20倍，可较好地标记细胞核。取28代肌卫星细胞，用PBS冲洗3遍后滴加DAPI工作液，避光置5min，PBS漂洗3遍后在倒置荧光显微镜下观察到细胞核显示蓝色强荧光，且大多数为单核细胞(图4)。

5)肌卫星细胞的分子鉴定

为了验证所得到的细胞系是肌卫星细胞，进行了肌卫星细胞标记基因pax7b的RT-PCR检测：用Trizol法提取肌卫星总RNA。应用Promega的M1701cDNA第一链合成试剂盒得到模板cDNA。pax7b的引物序列分别为：TACTAGTGCTCGCCTGACATG，正向引物(F)；TCAATCCTTAAACAATGCTGG,反向引物(R)，PCR反应体系：2×EsTaqMasterMix12.5μL,正向引物(F)和反向引物(R)引物各1μL(10μmol),cDNA模板1μL(380ng/μL)，RNase-FreeWater9.5μL总体积为25.0μL。PCR反应条件为95℃5min，然后95℃30s,55℃30s，72℃7min,35个循环。通过PCR结果显示出的pax7b条带证明培养肌细胞为肌卫星细胞(图5)。

由上述可见构建所得细胞系源于牙鲆的靠近尾部的骨骼肌肉组织，同时本领域人员所熟知肌卫星细胞是一种起源于胚胎中胚层的肌源性干细胞，并且本发明构建过程没有突变可能，因此所得细胞系为肌卫星细胞系；

另外，由本领域人员所熟知通过分子技术进行肌卫星细胞鉴定时，通过检测肌卫星细胞标记基因pax7b即可，标记基因pax7b的cDNA序列为1545bp，用于标记的片段大小为198bp。

6)GFP报告基因在肌卫星中的表达

转染前一天，取第25代肌卫星细胞，用按照步骤1)配制的2mL细胞培养液悬浮，以2×10⁵个细胞/孔的密度接种于24孔板中，25±0.2℃培养。转染时，细胞密度超过80％，以Invitrogen公司的Lipofectamine2000转染pEGFP-N3。具体步骤为将1μLLipofectamine2000加入到包含49μLHyclone公司的MEM细胞培养液的1.5mL离心管中，另一个离心管中加入1μLpEGFP-N3(400ng/μL)和49μLHyclone公司的MEM细胞培养液。5min后，将上述两管溶液混合，室温放置25min。将上述100μL混合液加入到包含500μL不含血清的上述实施例步骤1)配制细胞培养液的24孔板的一孔中，25±0.2℃培养4.5h后，吸出培养液，加500μL按照上述实施例步骤1)配制的细胞培养液，72h后，用NikonECLIPSETE2000-U荧光显微镜观察绿色荧光的表达，发现约有15％以上的细胞表达较强荧光(具体参见图6)。

上述实施例表明，用本发明方法建立的牙鲆肌卫星细胞系，生长曲线正常，染色体为正常的48条，可以进行连续传代，也可以对其进行冷冻保存。以pEGFP-N3进行基因转染实验，也观察到较强的绿色荧光，证实牙鲆肌卫星细胞系可以直接应用于外源基因功能研究。

本发明牙鲆肌卫星细胞系的建立方法重复性强，经染色体鉴定结果可信，取材的牙鲆体重恰当，操作方法简便，也可以适用于构建其他鱼类肌卫星细胞系。

Claims (7)

1.一种牙鲆肌卫星细胞系，其特征在于：

将牙鲆肌肉组织经原代培养和传代培养，继而构建细胞系；

其中，原代培养，将骨骼肌肉组织块加入到细胞培养液中悬浮，而后将肌肉组织块悬液于25±0.2℃下正置培养，待组织块完成贴壁后补加细胞培养液；

传代培养，待上述经原代培养的组织块周围细胞迁出并增殖至形成巢式细胞晕时，加入0.25％胰蛋白酶消化液使细胞悬起得细胞悬液，而后利用细胞培养液进行原瓶传代培养，待原瓶传代细胞长满瓶底后，将上述细胞悬液与细胞培养液按1：1-1：2(v/v)的比例分瓶传代，以后7天传代一次，15代后每3-5天传代一次，进而细胞系建立成功。

2.按权利要求1所述的牙鲆肌卫星细胞系，其特征在于：所述细胞培养液为在MEM培养液中加入占细胞培养液总体积20％的胎牛血清，10ng/mL人碱性成纤维生长因子，100U/mL青霉素，100μg/mL链霉素，pH值为7.0-7.4,于4℃下保存，备用。

3.按权利要求1所述的牙鲆肌卫星细胞系，其特征在于：所述骨骼肌肉组织块为将牙鲆骨骼肌组织置于细胞培养液中3-5min后，吸出培养液，用1.0-1.2mLPBS(pH7.2)反复冲洗骨骼肌组织，再吸出PBS，将肌肉组织剪成小块，待用。

4.按权利要求1或3所述的牙鲆肌卫星细胞系，其特征在于：所述肌肉组织为约1mm³大小的小块。

5.按权利要求1所述的牙鲆肌卫星细胞系，其特征在于：所述原代培养组织块周围细胞迁出并增殖至形成巢式细胞晕时，吸出培养液，用PBS(pH7.2)冲洗，吸出PBS，加入0.25％胰蛋白酶液消化，而后显微镜下观察到细胞收缩即吸弃胰蛋白酶液，继续在显微镜下观察，待细胞变圆，在原瓶中加入细胞培养液使细胞悬浮，而后将悬液进行传代。

6.一种用于鉴定牙鲆肌卫星细胞标记基因的特异性引物，其特征在于：用于鉴定牙鲆肌卫星细胞标记基因的特异性引物为，正向引物(F)TACTAGTGCTCGCCTGACATG；反向引物(R)TCAATCCTTAAACAATGCTGG。

7.一种用于鉴定牙鲆肌卫星细胞标记基因的特异性引物的应用，其特征在于：所述特异性引物用于制备定性和/定量检测牙鲆肌卫星细胞标记基因的试剂盒。