CN109666650A - 一种细胞重编程方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种细胞重编程方法，属于诱导多能干细胞技术领域。所述方法包括芯片上细胞重编程、芯片上克隆挑取和芯片上微环境的优化的步骤。本发明能够显著提高细胞重编程效率；产生的克隆质量更高，且克隆出现的位置由随机变为可控且更为均一，有利于后续工业化的标准实现。本发明可以方便地对细胞进行追踪，对重编程的动态变化过程进行监测，便于理解重编程的机制；能够高通量对微孔理化环境进行精准控制，高通量的筛选利于重编程的培养微环境。

Description

一种细胞重编程方法
技术领域
本发明属于诱导多能干细胞技术领域，涉及细胞重编程，具体是指一种基于超疏水微孔阵列芯片的高效细胞重编程方法。
背景技术
诱导多能干细胞(iPSCs：induced pluripotent stem cells)在再生医学、药物筛选、疾病模型等方面具有广阔的应用前景，自2006年首次报导以来，受到科学界的广泛关注，参见参考文献[1]：Takahashi K.Yamanaka S.Induction of pluripotent stem cellsfrom mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors[J].Cell,2006,126:663-676。目前诱导多能干细胞技术已经日趋成熟，其临床及产业转化将是未来发展方向，然而目前的重编程方法仍然存在效率较低，参见参考文献[2]：M.Stadtfeld,K.Hochedlinger,“Induced pluripotency:history,mechanisms,andapplications,”vol.5,pp.582–596,2010，随机性强，产生的克隆不均一，参见参考文献[3]：Z.D.Smith,C.Sindhu,and A.Meissner,“Molecular features of cellularreprogramming and development,”Nat.Rev.Mol.Cell Biol.,vol.17,no.3,pp.139–154,2016.，难以实现自动化等问题。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明采用了超疏水微孔阵列芯片实现高效的细胞重编程，相比传统的培养皿，效率提高5倍以上，并且诱导多能干细胞克隆出现的位置由随机变为可控，大大减少了后续克隆挑取等操作的难度。微孔环境促进了细胞聚团和间质-上皮转化，进而提高了重编程效率。本发明的研究有望为iPSCs的临床及产业应用提供新的平台。
本发明提供的一种基于超疏水微孔阵列芯片(全文简称芯片)的细胞重编程方法，所述方法包括如下步骤：
第一步，芯片上细胞重编程。
步骤1.1：超疏水微孔阵列芯片消毒；
步骤1.2：去除微孔中的气体；
步骤1.3：细胞复苏培养；
步骤1.4：细胞重编程，具体步骤包括首先在芯片外利用常规方法(比如病毒转染等)将重编程基因(通常为OCT4，SOX2，Klf4和c-MYC，但不局限于这四个基因)导入细胞内；再将细胞接种到超疏水微孔阵列芯片上，在芯片上完成重编程过程；芯片上重编程采用的培养基与常规6孔板重编程一致，但由于每种细胞的需求不同，应根据细胞类型选取相应的培养基成分；由于芯片上微孔环境能够促进细胞聚团和间质-上皮转化，重编程效率将大大提高，并且iPSCs克隆只能产生在微孔内，便于后续克隆挑取操作。
第二步，芯片上克隆挑取。
第三步，芯片上微环境的优化。
本发明提供一种基于超疏水微孔阵列芯片的细胞重编程方法，优点在于：
(1)微小环境有利于细胞聚团，能够显著提高细胞重编程效率。
(2)产生的克隆质量更高，且克隆出现的位置由随机变为可控且更为均一，有利于后续工业化的标准实现。
(3)可以方便地对细胞进行追踪，对重编程的动态变化过程进行监测，便于理解重编程的机制。
(4)能够高通量对微孔理化环境进行精准控制，高通量的筛选利于重编程的培养微环境。
附图说明
图1A为本发明超疏水微孔阵列芯片上的重编程流程示意图；
图1B为超疏水微孔阵列芯片浸没在培养基中的照片；
图2A为芯片上重编程整体效果图；
图2B为芯片上重编程形成的克隆免疫荧光染色鉴定为Nanog阳性；
图2C为芯片上Nanog阳性克隆统计；
图3A和3B分别为本发明中在芯片上挑取克隆的流程图和芯片上挑取的克隆扩增培养至第二代和第六代的照片；
图4A图4B图4C图4D分别为本发明中在芯片上形成的克隆的免疫荧光染色、核型分析、体外拟胚体分化和体内畸胎瘤鉴定结果；
图5为芯片重编程和常规6孔板重编程的效率比较；
图6为芯片重编程和常规6孔板重编程细胞的流式细胞分析结果；
图7为芯片上重编程过程的追踪图；
图8为定量PCR分析芯片上间质上皮转换相关基因的表达；
图9A为芯片上逆转录病毒诱导重编程产生的克隆的免疫荧光染色鉴定结果；
图9B为芯片上和孔板中逆转录病毒诱导重编程的效率比较；
图10为芯片上慢病毒诱导的人皮肤成纤维细胞重编程产生的克隆的免疫荧光染色结果；
图11A为芯片上不同微孔直径的重编程效率比较；
图11B为在直径800μm的微孔中修饰不同的细胞外基质蛋白，对重编程效率的影响；
图5至图10中chip是指超疏水微孔阵列芯片，plate是常规细胞培养用6孔板(Costa3165，Corning)。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明提供的一种新型的高效细胞重编程方法进行详细说明。
本发明实施例中，通过微孔结构内有限的生长面积增加了细胞间粘附的发生，促进了MET(间质-上皮转化)，最终提高了iPSCs生成的效率。最终本发明在超疏水微孔阵列芯片(后文都简称为芯片，其上具有微孔结构)上得到了90％以上的Nanog阳性细胞团，MET标志基因的表达显著高于传统细胞培养皿，重编程效率获得了5倍的提高。其次，细胞追踪在超疏水微孔阵列芯片的微孔中比在传统细胞培养皿中更方便。在实验中，从诱导后的第1天到第12天持续对超疏水微孔阵列芯片的微孔上细胞的聚集过程进行了定位追踪。而传统的单细胞追踪的方法一般是通过大范围扫描识别单细胞，再追踪其增殖及转化过程，因此能够研究的细胞数目是有限的。超疏水微孔阵列芯片上的实时细胞监测更为简便，从重编程开始到克隆形成的整个过程都可以持续定位观察，以获得更多信息来完善对细胞重编程机制的理解。最后，在高效重编程和克隆定位形成的基础上，可以通过非常简单的步骤完成高质量克隆挑取，更适合于自动化及临床应用研究。
本发明提供的细胞重编程方法，结合如图1A所示流程，分以下步骤：
第一步.芯片上细胞重编程；
步骤1.1：超疏水微孔阵列芯片消毒：
使用75％(体积比)乙醇浸泡的方式对制备好的超疏水微孔阵列芯片进行消毒。向固定了超疏水微孔阵列芯片的培养皿中加入12mL的75％乙醇即可浸没整张芯片，如图1B所示。再用1mL移液枪用力吹打超疏水微孔阵列芯片的微孔，使得微孔内残余的气泡被清除，保证对整个超疏水微孔阵列芯片彻底的消毒灭菌。灭菌15min后，将75％乙醇抽走，放在超净台中风干、紫外灭菌2h以上，同时超疏水微阵列芯片恢复至疏水状态。
所述的超疏水微阵列芯片，参见参考文献[4]：Pengfei Zhang,Jianxiong Zhang,Shengtai Bian,et al.High-throughput superhydrophobic microwell arrays forinvestigating multifactorial stem cell niches[J].Lab on a Chip,2016,16,2996-3006。所述超疏水微孔阵列芯片由具有微孔阵列拓扑结构的PDMS层和超疏水层构成。
步骤1.2：去除微孔中的气体：10mL移液管吸取10mL PBS溶液(磷酸盐缓冲溶液)，悬于超疏水微孔阵列芯片的微孔上方10cm处，逐滴滴下，并在超疏水微阵列芯片上逐片砸下，使得所有微孔中均有液体进入，并将整张芯片浸没。
步骤1.3：细胞复苏培养：以小鼠成纤维细胞和人皮肤成纤维细胞为例，从液氮罐中取出成纤维细胞，迅速37℃水浴解冻，加入DMEM完全培养基，转速800rpm离心5min，弃上层清液。再用DMEM完全培养基重悬成纤维细胞并转入6cm培养皿，放入37℃、5％(体积百分比)CO2细胞培养箱中培养，48h后换液。所述DMEM完全培养基中成分包括DMEM，10％(体积百分比)胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)，100U/mL青霉素，100μg/mL链霉素。
步骤1.4：细胞重编程：
1.4.1.Dox诱导的小鼠成纤维细胞重编程，采用携带Dox诱导表达的Oct4，Sox2，Klf4和C-Myc基因的转基因小鼠的胚胎成纤维细胞(简称OSKM-MEF)。
1.4.1.1细胞播种：胰酶消化OSKM-MEF细胞1min，抽走胰酶，加入6-7mL DMEM完全培养基，用移液器多次吹打形成充分打散的成纤维细胞悬液。用血球计数板统计成纤维细胞浓度后，稀释成纤维细胞悬液到3000个成纤维细胞/cm2，再将固定了超疏水微孔阵列芯片的培养皿中的PBS溶液抽走，迅速向超疏水微孔阵列芯片培养皿中加入12mL稀释好的成纤维细胞悬液，在CO2培养箱中过夜培养。
1.4.1.2细胞重编程：如图1A所示流程，细胞播种24h后，消化掉培养皿底部其余细胞，置换为Dox诱导培养基(按照体积比，KnockoutTMDMEM,10％Knockout SerumReplacementTM,10％FBS,1％NEAA,1％Glutamax,1％β-Mercaptoenthanol，1000U/ml LIFand 2mg/ml doxycycline，PD0325901 3μM，CHIR99021 1μM)进行细胞重编程；整个细胞重编程培养过程中前14天用Dox诱导培养基2-3天更换一次，最后6天用KSR培养基(无Dox的诱导培养基)2天更换一次。
1.4.2芯片上逆转录病毒诱导的小鼠成纤维细胞重编程；
1.4.2.1：包装细胞准备和病毒包装：将Plat-E细胞复苏后，传代到直径为10cm的皿中。细胞汇合度到达80％准备转染，转染前1h更换为无血清的DMEM完全培养基(DMEM，100U/mL青霉素，100μg/mL链霉素)。通过脂质体Lipofectamin 2000的转染方法将编码Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc的逆转录病毒质粒转染到Plat-E细胞中。
1.4.2.2：病毒液收集感染：转染48h后，将病毒上清用针筒抽取收集，用0.45μm滤膜过滤到离心管中，在Plat-E细胞中加入10mL DMEM完全培养基，72h后同样方法再次收集病毒液。在收集后的病毒液中按照终浓度4μg/mL比例加入polybrene，混匀。取4种病毒上清液各1ml。
将6孔板中提前复苏好的小鼠成纤维细胞，加入混合好的病毒上清，放入37℃、5％CO2(体积比)细胞培养箱中培养。感染过夜后，将含有病毒的培养基更换为2mL DMEM完全培养基。
1.4.2.3：细胞播种：参考上述步骤1.4.1.1。
1.4.2.4：细胞重编程：细胞播种24h后，消化掉培养皿底部其余细胞，置换为KSR培养基，每两天换液一次，直到第二十天进行克隆挑取。
1.4.3芯片上慢病毒诱导的人皮肤成纤维细胞重编程；
1.4.3.1：病毒包装：将293T细胞复苏后，传代到直径为10cm的培养皿中。细胞汇合度到达80-90％准备转染，转染前1h更换为无血清的DMEM培养基。通过脂质体Lipofectamin-2000的转染方法将载体质粒psPAX2和pMD2.G和基因质粒FUW-TetO、FUW-TeTO-hOCT4、FUW-TeTO-hSOX2、FUW-TeTO-hKLF4、FUW-TeTO-hMYC、按psPAX2：pMD2.G:基因质粒＝3:1:4(质量比)的比例转染293T细胞。
1.4.3.2：病毒液收集感染：转染48h后，将病毒上清用针筒抽取收集，用0.45μm滤膜过滤到离心管中，在293T细胞中加入10mL DMEM完全培养基，72h后同样方法再次收集病毒液。在收集后的病毒液中按照终浓度4μg/mL比例加入polybrene，混匀。取4种病毒上清液各1ml。
将6孔板中提前复苏好的人的皮肤成纤维细胞(HSF)中的培养基替换为新鲜DMEM完全培养基后，加入各对应病毒上清，放入37℃、5％CO2(体积比)细胞培养箱中培养。感染过夜后的HSF细胞换液，每孔各加入2ml hESC培养基(DMEM/F-12,5％(体积比)KnockoutSerum ReplacementTM,15％(体积比)FBS,1％(体积比)NEAA,1％(体积比)Glutamax,1％(体积比)β-Mercaptoethanol，4ng/ml FGF2)。
1.4.3.3：细胞播种：参考上述步骤1.4.1.1。感染后第5天，将HSF细胞用胰酶消化下来，重新播种到芯片上用hESC培养基进行重编程，方法参考Dox诱导的小鼠成纤维细胞重编程步骤1.4.1.1
1.4.3.4：细胞重编程：细胞播种24h后，消化掉培养皿底部其余细胞，置换为添加2mg/ml doxycycline的hESC培养基，每两天换液一次，直到第二十天更换为hESC培养基，第28天进行克隆挑取。
第二步：克隆挑取
2.1：克隆挑取及扩大培养：在显微镜下扫描整张超疏水微孔阵列芯片，选择边界清晰生长状态良好的克隆团，标记其在超疏水微阵列芯片微孔中的行列数。在生物安全柜中用Eppendorf 吸头轻轻***待挑取克隆的微孔中，沿微孔孔壁搅动使其不再贴壁于微孔中，然后缓慢吸出。置于0.25％(质量百分比)Trypsin(胰蛋白酶)中进行消化，再用移液枪吹散细胞，加入到铺好饲养层细胞的孔板中，小鼠细胞用KSR培养基，人细胞用hESC培养基培养，每2-3天换液一次，约两次换液后克隆长出，再进行传代及扩大培养。
2.2对芯片上的iPSCs克隆多能性鉴定：
2.2.1.免疫荧光染色：将待染色细胞用PBS润洗一遍，用***溶液固定10min后吸去，再用PBS润洗三次。室温下用通透液(PBS，3％(体积比)山羊血清，0.1％Triton X-100)处理15min，再用封闭液(PBS，3％(体积比)山羊血清，0.05％Triton X-100)封闭2小时。去除封闭液，用封闭液将一抗稀释适当倍数(Oct4 1:200(体积比)；SSEA11:400(体积比)；Nanog 1:200(体积比)；α-Actin 1:200(体积比)；α-fetoprotein 1:200(体积比)；βIII-tubulin 1:200(体积比))，充分覆盖样品，4℃孵育过夜(10～16小时)。第二天，去除封闭液，用清洗液(PBS，0.05％(体积比)Triton X-100)清洗三次(每次5min，缓慢震荡)。再用封闭液将二抗稀释适当倍数(1：500)(体积比)，室温避光孵育2h。用清洗液清洗三次(每次5min，缓慢震荡)。用PBS缓冲液将4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI：4',6-diamidino-2-phenylindole)照1：1000(体积比)稀释，避光孵育3min后用PBS缓冲液洗三遍，于荧光显微镜下观察染色结果。
2.2.2.流式细胞分析：用Accutase消化整张超疏水微阵列芯片上的克隆，浸没放置在培养箱中半小时。取出后用移液枪反复吹打超疏水微孔阵列芯片，至克隆完全被吹散至单细胞，并将单细胞悬液收集至15mL离心管，离心900rpm/5min。吸走上清，加入PBS溶液，吹打，再次离心去除上清液。加入***溶液将细胞吹散，固定10min，加入PBS缓冲液润洗一遍。再依次加入2mL通透液处理15min，加入2mL封闭液室温封闭2小时。每加入一种溶液都要进行离心和吸去上清。最后用封闭液1:400(体积比)稀释一抗Nanog，将离心管中细胞悬浮起来加入3.5cm皿中，封好封口膜，4℃孵育过夜。第二天，用Washing buffer将皿中细胞冲洗下来，离心900rpm/5min，吸走上清，用同样方法再次清洗一遍。封闭液1:500(体积比)稀释二抗，将细胞悬液加入3.5cm皿中，室温避光孵育2小时。最后用Washing buffer清洗三遍，最后一遍每管用500μLPBS溶液将细胞悬浮起来，进行流式细胞仪检测。
2.2.3.实时荧光定量PCR：
2.2.3.1.用Accutase消化整张超疏水微孔阵列芯片上的克隆，浸没放置在培养箱中半小时。取出后用移液枪反复吹打芯片，至克隆完全被吹散至单细胞，用血球计数板统计并记录细胞数。将单细胞悬液收集至15mL离心管，离心900rpm/5min，吸走上清，加入1mLPBS清洗一遍，再转移至1.5mL离心管中。
2.2.3.2. mRNA DIRECTTMKit提取mRNA提取：a.离心后吸走上清，加入与细胞数目对应体积的Lysis/Binding Buffer，用移液枪反复吹吸使细胞充***解。b.用振荡仪将磁珠充分混匀，加入与细胞数目对应体积的磁珠悬液到RNase-free的1.5mL管中并放在磁力架上，30秒后吸走上清，再加入适量Lysis/Binding Buffer清洗磁珠。c.将清洗好的磁珠放在磁力架上，并吸去上清，再将裂解产物转移进来，反复吹吸混匀磁珠与裂解产物。室温孵育3-5min(可放在旋转仪上)，若细胞数目较多裂解产物较黏，可适当增加时间。d.将磁珠/mRNA混合溶液放在磁力架上，待上清析出可进行清洗，先用Washing BufferA清洗两遍，再用Washing Buffer B清洗一遍。e.加入适量Elution Buffer洗脱mRNA，混匀后在65℃保温2min，再迅速放到磁力架上吸出上清，转移至200μL管中放在冰上。
2.2.3.3.使用NanoDropTM3300荧光分光光度计测定mRNA浓度，记录对应值。
2.2.3.4.ReverTra qPCR RT Kit反转录：根据NanoDrop测定的mRNA浓度进行相应稀释，保证所有样品的mRNA初始量相同。按照表1体系配制反转录反应液，先37℃进行15min反转录，再98℃进行5min的酶失活反应。反应结束后样品保存在-20℃的条件下。
表1反转录反应体系
2.2.3.5.使用PowerUpTM Green Master Mix进行qPCR反应液配制，具体配比见表2。在重编程第3,6,9天，对间质-上皮转化(mesenchymal–epithelialtransition，MET)相关基因E-cadherin及上皮-间质转化(epithelial–mesenchymaltransition，EMT)相关基因N-cadherin和Thy1的基因表达水平进行检测；在12天后细胞重编程完成时，对多能性标志基因Nanog和Rex1的基因表达水平进行检测，比较实验组之间多能性表达情况。每组qPCR反应都以GAPDH作为内参基因，通过ΔΔCt法进行数据处理。
表2实时荧光定量PCR反应体系
表3实时荧光定量PCR引物设计
第三步.芯片上微环境的优化；
步骤3.1：孔径优化：采用现有的超疏水微孔阵列芯片，设计加工包含不同孔径的芯片，设计方法参考文献：P.Zhang et al.,“High-throughput superhydrophobicmicrowell arrays for investigating multifactorial stem cell niches,”Lab Chip,vol.16,no.16,pp.2996–3006,2016，包括孔径1500μm孔间距为2500μm的6*7的微孔阵列，孔径为800μm孔间距为1500μm的6*7的微孔阵列，孔径为500μm孔间距为1200μm的6*7的微孔阵列，孔径为300μm孔间距为1100μm的3*14的微孔阵列。
步骤3.2：蛋白修饰：用PBS稀释配置不同蛋白溶液，配置为50μg/ml的Laminin，1.25μg/ml的vitronectin，0.25％(体积比)的gelatin。在已经形成液滴阵列的芯片上，用10ul的移液器逐孔加样的方式点入不同的蛋白溶液，用封口膜封好好放入培养箱中，37℃孵育1h，为之后的重编程做准备。
结果表示：
超疏水微孔阵列芯片(简称芯片)上单个微孔直径为300-1500μm，芯片上表面还粘有一层约100μm厚的超疏水材料，超疏水材料具有抑制细胞黏附的特性，较厚的超疏水层还具有很好的稳定性，因此能够在后续长时间培养中将细胞限制在微孔中生长，形成了一种利于重编程发生的微小培养环境。从图2A～2C中可以看出，芯片上大部分孔中能够形成形状清晰的克隆，免疫荧光染色表明90％以上的微孔中形成了Nanog阳性克隆；且芯片上的微孔位置确定，可以直接将其中的细胞取出。相比昂贵的一体化机器人装置，成本将大大降低。
图3A和图3B为本发明中采用的简便的克隆挑取方法示意图，仅需几步操作即可完成克隆的挑取。相对于目前常规的挑克隆方式，本发明不需要在显微镜下边观察边操作，对操作者的技术要求显著降低，并且挑出的克隆能够长期传代。
对芯片上产生的iPSCs细胞进行多能性验证，从图4A～4D，可以看出，本发明产生的克隆具有多能性。免疫荧光染色证明了本发明的克隆能够明显表达Nanog，Oct4，SSEA-1等多能性标志物。核型鉴定，证明本发明产生的iPSCs具有正常的核型。体外拟胚体分化实验证明，三胚层标志蛋白均呈强阳性。由iPSCs形成的畸胎瘤可以清晰的辨别出神经上皮组织(外胚层)、肌肉组织(中胚层)和腺体组织(内胚层)。这些结果证明了本发明在超疏水微孔阵列芯片上进行的重编程及开发的克隆挑取方法可形成高质量、稳定的iPSCs。
对芯片重编程和常规6孔板上的重编程进行比较，可以看出芯片能够显著提高重编程效率，图5表明相对于常规培养方式，本发明产生Nanog阳性克隆的效率提高了5倍以上。对重编程得到的细胞进行流式细胞分析，图6表明，芯片重编程得到的Nanog阳性细胞的占比显著高于常规6孔板。
本发明能够方便地对微孔中细胞重编程的动态过程进行追踪，结果如图7所示，观察到芯片上的细胞在诱导后第3天开始发生聚集，聚集的细胞群大小随时间推移显著增加，表现出活跃的细胞增殖，最终形成了一个边界清晰的致密三维克隆。可以从一定程度说明，微孔结构将细胞限制在一个微小环境内，大大增加了邻近细胞的聚集和三维克隆团形成的效率。细胞重编程的重要特征之一是早期发生的间质-上皮转化(mesenchymal epithelialtransition，MET)，参见参考文献[5]David L,Polo J M.Phases of reprogramming[J].Stem Cell Research,2014,12(3):754-761。在这个过程中细胞失去间质表型特征，转化为上皮细胞，伴随发生的是E-cadherin高表达和细胞间粘附的增强。因此，本发明在诱导第6天时，对MET相关基因E-cadherin，N-cadherin和Thy1的基因表达水平进行检测，以MEF细胞作为阴性对照，图8中实时荧光定量PCR结果显示重编程细胞发生了E-cadherin上调，N-cadherin和Thy1下调，证明MET过程的发生。而芯片上的三种基因的表达变化均显著高于6孔板(P<0.05)，表明超疏水微阵列芯片促进了MET过程。综上，超疏水微阵列芯片促进了细胞间发生聚集，增强了MET过程，最终大大提高了重编程效率。
为了验证本发明中芯片环境对重编程的普遍促进作用，采用了不同重编程体系，包括逆转录病毒和慢病毒诱导的重编程。从图9A～9B中可以看出芯片上逆转录病毒诱导的重编程比普通培养皿具有更高的效率，图10可以看出芯片上利用慢病毒能够成功诱导人皮肤成纤维细胞重编程，且从免疫荧光染色的结果上看,得到的克隆能够表达多能性基因。
本发明能够对芯片微孔环境进行高通量筛选，从图11A和11B看出，微孔直径越小，对重编程的促进效果越显著，当孔径为300μm时对重编程的促进效果最显著，而蛋白修饰对重编程也有一定的促进作用。
iPSCs的一大问题就是效率低下，本发明通过在超疏水微孔阵列芯片上进行重编程，能够有效地提高重编程效率，降低操作难度，促进iPSCs临床应用。

Claims (8)

1.一种细胞重编程方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤，
第一步，超疏水微孔阵列芯片上细胞重编程；
步骤1.1：超疏水微孔阵列芯片消毒；
步骤1.2：去除微孔中的气体；
步骤1.3：细胞复苏培养；
步骤1.4：细胞重编程，具体步骤包括：
首先在超疏水微孔阵列芯片外，将重编程基因导入细胞内；再将所述细胞接种到超疏水微孔阵列芯片上，在超疏水微孔阵列芯片上完成重编程过程；超疏水微孔阵列芯片上重编程采用的培养基与常规6孔板重编程一致，并根据细胞类型选取相应的培养基成分；
第二步，超疏水微孔阵列芯片上克隆挑取；
第三步，超疏水微孔阵列芯片上微环境的优化。
2.根据权利要求1所述的一种细胞重编程方法，其特征在于：步骤1.1所述的超疏水微孔阵列芯片消毒，具体为，
向固定了超疏水微孔阵列芯片的培养皿中加入12mL的75％乙醇，浸没整张疏水微孔阵列芯片，再用1mL移液枪用力吹打超疏水微孔阵列芯片的微孔，使得微孔内残余的气泡被清除，保证对整个超疏水微孔阵列芯片彻底的消毒灭菌；灭菌15min后，将75％乙醇抽走，放在超净台中风干、紫外灭菌2h以上，同时超疏水微阵列芯片恢复至疏水状态。
3.根据权利要求1所述的一种细胞重编程方法，其特征在于：步骤1.2具体为，
10mL移液管吸取10mL PBS溶液，悬于超疏水微孔阵列芯片的微孔上方10cm处，逐滴滴下，并在超疏水微阵列芯片上逐片砸下，使得所有微孔中均有液体进入，并将整张超疏水微孔阵列芯片浸没。
4.根据权利要求1所述的一种细胞重编程方法，其特征在于：当步骤1.4所述的细胞重编程为Dox诱导的小鼠成纤维细胞重编程，采用携带Dox诱导表达的Oct4，Sox2，Klf4和C-Myc基因的转基因小鼠的胚胎成纤维细胞，简称OSKM-MEF，重编程步骤为：
1.4.1.1细胞播种：胰酶消化OSKM-MEF细胞1min，抽走胰酶，加入6-7mL DMEM完全培养基，用移液器多次吹打形成充分打散的成纤维细胞悬液；用血球计数板统计成纤维细胞浓度后，稀释成纤维细胞悬液到3000个成纤维细胞/cm2，再将固定了超疏水微孔阵列芯片的培养皿中的PBS溶液抽走，迅速向超疏水微孔阵列芯片培养皿中加入12mL稀释好的成纤维细胞悬液，在CO2培养箱中过夜培养；
1.4.1.2细胞重编程：细胞播种24h后，消化掉培养皿底部其余细胞，置换为Dox诱导培养基进行细胞重编程；整个细胞重编程培养过程中前14天用Dox诱导培养基2-3天更换一次，最后6天用KSR培养基，2天更换一次。
5.根据权利要求1所述的一种细胞重编程方法，其特征在于：当步骤1.4所述的细胞重编程为芯片上逆转录病毒诱导的小鼠成纤维细胞重编程，具体步骤为：
1.4.2.1：包装细胞准备和病毒包装：将Plat-E细胞复苏后，传代到直径为10cm的皿中；细胞汇合度到达80％准备转染，转染前1h更换为无血清的DMEM完全培养基；通过化学转染方法将编码Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc的逆转录病毒质粒转染到Plat-E细胞中；
1.4.2.2：病毒液收集感染：转染48h后，将病毒上清用针筒抽取收集，用0.45μm滤膜过滤到离心管中，在Plat-E细胞中加入10mL DMEM完全培养基，72h后同样方法再次收集病毒液；在收集后的病毒液中按照终浓度4μg/mL比例加入polybrene，混匀；取4种病毒上清液各1ml；
将6孔板中提前复苏好的小鼠成纤维细胞，加入混合好的病毒上清，放入37℃、5％CO2细胞培养箱中培养；感染过夜后，将含有病毒的培养基更换为2mL DMEM完全培养基；
1.4.2.3：细胞播种；
1.4.2.4：细胞重编程：细胞播种24h后，消化掉培养皿底部其余细胞，置换为KSR培养基，每两天换液一次，直到第二十天进行克隆挑取。
6.根据权利要求1所述的一种细胞重编程方法，其特征在于：当步骤1.4所述的细胞重编程为芯片上慢病毒诱导的人皮肤成纤维细胞重编程，具体步骤如下：
1.4.3.1：病毒包装：将293T细胞复苏后，传代到直径为10cm的培养皿中；细胞汇合度到达80-90％准备转染，转染前1h更换为无血清的DMEM完全培养基；通过化学转染方法将载体质粒psPAX2和pMD2.G和含有人Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc基因的质粒按psPAX2：pMD2.G:基因质粒＝3:1:4的比例转染293T细胞；
1.4.3.2：病毒液收集感染：转染48h后，将病毒上清用针筒抽取收集，用0.45μm滤膜过滤到离心管中，在293T细胞中加入10mL DMEM完全培养基，72h后同样方法再次收集病毒液；在收集后的病毒液中按照终浓度4μg/mL比例加入polybrene，混匀；取4种病毒上清液各1ml；
将6孔板中提前复苏好的人的皮肤成纤维细胞HSF中的培养基替换为新鲜DMEM完全培养基后，加入各对应病毒上清，放入37℃、5％CO2细胞培养箱中培养；感染过夜后的HSF细胞换液，每孔各加入2ml hESC培养基；
1.4.3.3：细胞播种：感染后第5天，将HSF细胞用胰酶消化下来，重新播种到芯片上用hESC培养基进行重编程；
1.4.3.4：细胞重编程：细胞播种24h后，消化掉培养皿底部其余细胞，置换为添加2mg/ml doxycycline的hESC培养基，每两天换液一次，直到第二十天更换为hESC培养基，第28天进行克隆挑取。
7.根据权利要求1所述的一种细胞重编程方法，其特征在于：第二步所述的克隆挑取具体为，
2.1：克隆挑取及扩大培养：在显微镜下扫描整张超疏水微孔阵列芯片，选择边界清晰生长状态良好的克隆团，标记其在超疏水微阵列芯片上微孔的行列数；在生物安全柜中用Eppendorf 吸头轻轻***待挑取克隆的微孔中，沿微孔孔壁搅动使其不再贴壁于微孔中，然后缓慢吸出；置于0.25％Trypsin中进行消化，再用移液枪吹散细胞，加入到铺好饲养层细胞的孔板中，小鼠细胞用KSR培养基，人细胞用hESC培养基培养，每2-3天换液一次，约两次换液后克隆长出，再进行传代及扩大培养；
2.2：对芯片上的iPSCs克隆多能性鉴定：
2.2.1.免疫荧光染色；
2.2.2.流式细胞分析；
2.2.3.实时荧光定量PCR。
8.根据权利要求1所述的一种细胞重编程方法，其特征在于：第三步所述的芯片上微环境的优化，具体为，
步骤3.1：芯片孔径优化：芯片为孔径300～1500μm的微孔阵列；
步骤3.2：蛋白修饰：用PBS稀释配置不同蛋白溶液，配置为50μg/ml的Laminin，1.25μg/ml的vitronectin，0.25％的gelatin；在已经用PBS砸好的芯片上，用10ul的移液器逐孔加样的方式点入不同的蛋白溶液，用封口膜放好放入培养箱中，37℃孵育1h，为之后的重编程做准备。
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