CN103570832A - 一种抗副猪嗜血杆菌的猪源嵌合抗体及其构建方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗副猪嗜血杆菌的猪源嵌合抗体及其构建方法和应用，本发明的一种猪源嵌合抗体由一条轻链和一条重链通过二硫键和非共价键联结形成，所述的轻链从N端到C端依次包括鼠源抗副猪嗜血杆菌单抗轻链可变区和猪IgG轻链恒定区，所述的重链依次包括鼠源抗副猪嗜血杆菌单抗重链可变区和猪IgG重链恒定区。实验证明本发明的一种抗副猪嗜血杆菌的猪源嵌合抗体无论在体内还是体外都具有显著地抑菌效果，因此本发明的抗副猪嗜血杆菌的猪源嵌合抗体在检测或预防副猪嗜血杆菌感染方面具有广泛的应用前景。

Description

一种抗副猪嗜血杆菌的猪源嵌合抗体及其构建方法和应用

技术领域

本发明涉及一种猪源嵌合抗体及其构建方法和应用，特别涉及一种能够抗副猪嗜血杆菌的猪源嵌合抗体及其构建方法和应用，属于生物医药技术领域。

背景技术

副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis，HPS）为非溶血、NAD依赖性的革兰氏阴性菌，属于巴斯德杆菌科。副猪嗜血杆菌是猪的一种重要上呼吸道病原菌，是格拉瑟氏病（Gl sser’s Disease）的病原。该病以脑膜炎、关节炎以及纤维素性多发性浆膜炎为主要特征，有时会出现败血症和急性肺炎症状。近年，随着猪群养殖方式的改变，如早期断奶方案和三点养殖***的应用，因副猪嗜血杆菌而引起的猪群的发病率和死亡率逐年增加，并且已成为危害商业化养猪场，特别是SPF猪场最为严重的细菌病之一。虽然用抗生素可以有效治疗因HPS引起的格拉瑟氏病，但关于HPS的耐药性已经有很多报道。疫苗是防治格拉瑟氏病的有效方法，但是由于HPS血清型众多，单一血清型的疫苗只能保护猪群免受同型HPS的攻击，并且关于HPS疫苗交叉保护能力较差已经有很多研究报道。因此，寻找新的防治格拉瑟氏病的方法是非常必要的。

鼠源抗副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis，HPS）单克隆抗体1D8能与15个血清型副猪嗜血杆菌反应，并能部分保护小鼠免受同源及异源副猪嗜血杆菌额攻击，请参见文献：副猪嗜血杆菌具有保护效力单克隆抗体的筛选和免疫原性蛋白的鉴定，田华彬，《中国农业科学院》，2012年。然而，直接在其他种属动物上应用鼠源单克隆抗体可能存在问题。来自不同种属动物的抗体可能不与Fc受体和/或补体反应，这会导致适当的下游功能的缺乏并在体内被快速清除。为了克服鼠源单克隆抗体在猪体内应用的缺陷从而产生了包含猪Fc区域和鼠源可变区的嵌合抗体。利用重组DNA技术产生嵌合抗体用于人类疾病的治疗和预防已被广泛报道。产生鼠-猪嵌合抗体的报道寥寥无几。仅有针对猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒和猪流行性腹泻病毒单克隆抗体构建的鼠-猪嵌合抗体的报道，但两篇文章均未提及嵌合抗体在体内抵抗病毒攻击的能力。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种新的可用于副猪嗜血杆菌感染的检测和预防的方法。为此，本发明提出了一种抗副猪嗜血杆菌的猪源嵌合抗体，实验证明本发明的一种抗副猪嗜血杆菌的猪源嵌合抗体无论在体内还是体外都具有显著地抑菌效果。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：

本发明的一种抗副猪嗜血杆菌的猪源嵌合抗体，其特征在于所述的抗体由一条轻链和一条重链通过二硫键和非共价键联结而成，所述的轻链从N端到C端依次包括鼠源抗副猪嗜血杆菌单抗轻链可变区和猪IgG轻链恒定区，所述的重链依次包括鼠源抗副猪嗜血杆菌单抗重链可变区和猪IgG重链恒定区。

在本发明中，优选的，所述的鼠源抗副猪嗜血杆菌单抗轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的猪IgG轻链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述的鼠源抗副猪嗜血杆菌单抗重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述的猪IgG重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

在本发明中，优选的，所述的轻链和重链的N端还包括信号肽序列，更优选的，所述的轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述的重链的氨基酸序列如SEQ IDNO.6所示。

本发明还提出了编码以上任一项所述猪源嵌合抗体的核苷酸序列。

在本发明中，优选的，编码鼠源抗副猪嗜血杆菌单抗轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，编码猪IgG轻链恒定区的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，编码鼠源抗副猪嗜血杆菌单抗重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，编码猪IgG重链恒定区的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。

在本发明中，优选的，编码轻链和重链的核苷酸序列的5’端还分别连有编码信号肽序列的核苷酸序列，更优选的，编码轻链的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，编码重链的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。

在本发明中，优选的，所述的信号肽序列如SEQ ID NO.13所示，编码该信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示。

更进一步的，本发明还提出了一种表达载体，其特征在于含有以上任一项所述的核苷酸序列。

在本发明中，优选的，所述的表达载体为杆状病毒表达载体，更优选的，所述的表达载体是在双向表达载体pFast-Bac-Dual的基础上构建得到的。

再进一步的，本发明还提出了一种表达所述的抗副猪嗜血杆菌的猪源嵌合抗体的方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）构建用于表达抗副猪嗜血杆菌的猪源嵌合抗体的杆状病毒表达载体，其中编码猪源嵌合抗体轻链的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，编码猪源嵌合抗体重链的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；

（2）将构建得到的杆状病毒表达载体转染昆虫细胞并进行杆状病毒的组装；

（3）获得的杆状病毒接种昆虫细胞，当细胞病变达到80-90%，收获杆状病毒感染的细胞培养物，纯化，即得。

在本发明中，优选的所述的杆状病毒表达载体是在双向表达载体pFast-Bac-Dual的基础上构建得到的，所述的编码猪源嵌合抗体轻链的核苷酸序列以及编码猪源嵌合抗体重链的核苷酸序列分别各自位于pFast-Bac-Dual上的PPH启动子或p10启动子的下游，所述的昆虫细胞为sf-900Ⅱ。

最后，本发明还提出了所述的抗副猪嗜血杆菌的猪源嵌合抗体在制备检测或预防副猪嗜血杆菌感染试剂或药物中的应用。及

所述的表达载体在制备抗副猪嗜血杆菌的猪源嵌合抗体中的应用。

实验证明，采用本发明的方法制备得到的嵌合抗体蛋白，在体外能够抑制副猪嗜血杆菌生长；在小鼠体内能够小鼠免受致死剂量的副猪嗜血杆菌的攻击。因此，说明本发明的嵌合抗体蛋白无论在体内还是体外都具有显著地抑菌效果。

附图说明

图1为单抗轻重链可变区与猪源抗体轻重链恒定区的PCR鉴定结果；

M:DNA Marker DL2000；1：轻链可变区；2：轻链恒定区；3：重链可变区；4：重链恒定区。

图2为重组质粒轻链与重链PCR鉴定结果；

1、3：轻链PCR扩增产物；2、4：重链PCR扩增产物；5：阴性对照；M:DNAMarker DL2000

图3为双向表达载体pFast-Bac-Dual的载体图谱；

图4为轻链连接到pFast-Bac-Dual之后的双酶切鉴定结果；

1：轻链的双酶切鉴定图谱；M:DNA Marker DL2000

图5为连接有轻重链的pFast-Bac-Dual质粒的轻重链的双酶切鉴定结果；

1：重链的双酶切鉴定结果；2：轻链双酶切鉴定结果；M:DNA Marker DL2000

图6为双向表达载体pFast-Bac-Dual-H+L的载体图谱；

图7为P2病毒接毒72h之后的昆虫细胞与对照组昆虫细胞的对比图片；

图8为杆状病毒表达之后的SDS-PAGE结果；

M：蛋白Marker1：纯化后的表达蛋白

图9为杆状病毒表达之后的Western Blot检测图谱；

M：蛋白Marker1：纯化后的蛋白的Western Blot图谱

图10为重组蛋白与单抗1D8的ELISA对比结果；

图11为重组蛋白的体内抑菌试验。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1单抗轻重链可变区序列与猪抗体轻重链恒定区的扩增

1）鼠源抗副猪嗜血杆菌单抗轻链可变区与重链可变区序列的扩增

抗副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis，HPS）单克隆抗体1D8的制备及鉴定请参见文献：副猪嗜血杆菌具有保护效力单克隆抗体的筛选和免疫原性蛋白的鉴定，田华彬，《中国农业科学院》，2012年。由中国农业科学研究哈尔滨兽医研究所猪传染病室猪病分子诊断组分离并保存。

鉴定抗体的亚型之后，将单抗细胞进行总RNA的提取（根据Axygen总RNA小量提取试剂盒），并进行反转录。用设计的引物BacVL-F、BacVL-R与BacVH-F、BacVH-R，各引物序列如下表1所示，分别扩增鼠源抗副猪嗜血杆菌单抗轻链可变区序列与单抗重链可变区序列。

表1

（1）取200μL细胞培养物，加入400μL的Buffer R-Ι，用1ml的注射器反复混匀8～10次，转入1.5ml无RNA酶的离心管中。

（2）加入150μL Buffer R-Ⅱ，漩涡震荡15～30s，12000×g，4℃离心5min。

（3）取上清加入到无RNA酶的1.5ml离心管中，加入250μL异丙醇，混合均匀。

（4）将制备管置于2ml离心管中（试剂盒内提供），转移步骤（3）中的混合液到制备管中，6000×g，4℃离心1min。

（5）弃滤液，将制备管置回到2ml离心管中，制备管中加入500μLBufferW1A，12000×g，4℃离心1min。

（6）弃滤液，将制备管置回到2ml离心管中，制备管中加入700μLBufferW2，12000×g，4℃离心1min。同样的操作应用W2再洗一遍。

（7）弃滤液，将制备管置回到2ml离心管中，12000×g，4℃离心1min。

（8）将制备管放入一个干净的无RNA酶的1.5ml离心管中，值制备管膜中央加70μL的Buffer TE。

（9）室温静置1min，12000×g，4℃离心1min，得RNA。

（10）将洗脱的RNA7μL在冰上与Random引物1μL混合后放入70℃水浴5min后冰上放置2min，然后加入5×M-MLV Buffer5μL、dNTP Mixture(10mM)2μL、Recombinant RNasin Ribonuclease Inhibitor0.5μL、Nuclease-Free Water8μL，37℃水浴50min后70℃15min得cDNA。

扩增轻重链可变区的PCR反应体系为50μL，10×Ex Taq buffer5μL、dNTPMixture4μL，Ex Taq0.5μL、cDNA5μL、BacVL-F与BacVL-R或BacVH-F与BacVH-R各1μL、PCR水33μL。PCR反应条件：94℃5min、94℃1min、53℃30s、72℃1min，共30个循环，72摄氏度10min，4℃终止反应。

2）猪抗体轻链恒定区与重链恒定区的扩增

取新鲜猪的腹股沟***，进行研磨分离淋巴细胞之后提取其总RNA，提取的步骤与提取细胞中的总RNA方法相似，只是提取动物组织总RNA时需要先提取***中的淋巴细胞，提取之后直接加入400μL的Buffer R-Ι，之后的步骤与细胞总RNA提取方法完全相同。用设计的引物BacCL-F与BacCL-R、BacCH-F与BacCH-R，各引物序列如下表2所示，分别扩增猪抗体轻链恒定区与重链恒定区。

表2

（1）在200目的铜网中用5ml的注射器将***碾碎，用1ml的DKW淋巴细胞分离液冲洗铜网几下，转入15ml离心管中。

（2）轻轻沿离心管壁加入1ml的无血清1640，800×g、20℃、30min。（离心机的升降速调低至三档）

（3）吸出淋巴细胞层，加入15ml离心管中，再加入10ml’无血清的1640，250×g、10min。

（4）弃上清，加入完全1640培养液重悬淋巴细胞。

扩增轻重链恒定区的PCR反应体系为50μL，10×Ex Taq buffer5μL、dNTPMixture4μL，Ex Taq0.5μL、cDNA5μL、BacCL-F与BacCL-R或BacCH-F与BacCH-R各1μL、PCR水33μL。PCR反应条件：94℃5min、94℃1min、56℃（轻链）30s/62.5℃（重链）1min、72℃90s，共30个循环，72℃10min，4℃终止反应。

2.2.3琼脂糖凝胶电泳检测

（1）准确称取1.0g琼脂糖加入到100的1×TAE电泳缓冲液中，加热融化后，在室温冷却至一定温度后加入5μL溴化乙锭（EB），混匀后倒入胶槽，待其凝固。

（2）取5μL的PCR产物与1μL6×Loading buffer混匀后加入到胶槽之中，后加入Marker。

（3）接通电源，电压150V，电流200mA，跑大约20min。

（4）将胶取出，放置凝胶成像仪中观察结果。

2.2.4PCR产物胶回收

（1）在紫外割胶仪中分别割下含有Mab1D8轻链可变区、重链可变区以及猪抗体轻链恒定区、重链恒定区的琼脂糖块，将其尽可能切小，分别将其放入到1.5ml的离心管中，称量其重量，减去空管的重量得琼脂糖重量，该重量作为一个凝胶体积（100mg=100μL体积）。

（2）加入三个凝胶体积的Buffer DE-A，混匀后于75℃加热，间断混合（每2-3min）直至凝胶块完全融化（大约6-8min）。

（3）加入0.5个Buffer DE-A体积的Buffer DE-B，混合均匀。

（4）吸取步骤（3）中的混合液，转移到DNA制备管（置于2ml离心管）中，12000×g，1min。

（5）将制备管置回到2ml离心管中，加入500μLBufferW1，12000×g，1min，弃滤液（6）将制备管置回到2ml离心管中，加入700μLBufferW2，12000×g，1min，弃滤液。以同样的方法再用700μLBufferW2洗涤一次。

（7）将制备管置回到2ml离心管中，12000×g，1min。

（8）将制备管置于洁净的1.5ml离心管中，在制备膜中央加25μL Eluent Buffer，室温静置1min，12000×g，1min，洗脱得纯化的DNA。

2.2.5连接转化与测序

1）DH5α感受态细胞的制作

（1）取商品化的DH5α感受态一只，冰上融化，用挑菌环挑取少量菌液，涂布于无抗性的LB培养基上，37℃孵育过夜

（2）挑取单菌落加到1.5ml无菌离心管中，加入1ml的无抗性LB培养液，37摄氏度震荡过夜。

（3）吸取100μL的培养液加入到50ml的新鲜无抗性LB之中，37℃震荡培养。

（4）震荡培养3h之后测定营养液的OD值，当OD₆₀₀=0.4～0.6（每隔15～20min测定OD值）时收集细菌培养物用于制备感受态细胞。

（5）将菌液转移到两个无菌的、用冰水预冷的50ml离心管中，冰上预冷10min。

（6）4600×g，4℃离心10min，轻轻倒掉上清液，将离心管倒置1min，然后向沉淀中加入12.5ml的0.1M的预冷的CaCl₂，冰上放置5min。

（7）4600×g，4℃离心3min，倒掉上清，然后向沉淀中加入12.5ml0.1M的预冷的CaCl₂，冰上放置30min。

（8）3800×g，4℃离心3min，弃上清，然后向沉淀中加入2ml0.1M的预冷的CaCl₂，重悬细胞，分装，每管100μL，-70℃冻存备用或直接用于转化。用于转化的0.1M的CaCl2配方如下表3所示。

表3用于转化的0.1M的CaCl2配方

2）将胶回收得到得纯化DNA与pMD18-T载体相连接、转化、测序

（1）在0.5ml离心管中加入pMD18-T载体1μL，纯化DNA3μL，ddH₂O1μL，混合均匀。

（2）加入5μL的SolutionΙ，混匀后16℃连接过夜。

（3）取出DH5α感受态细胞四只，冰上融化。

（4）将2.2.4节获得的连接产物分别加入到四管感受态细胞之中，冰上放置30min。

（5）42℃水浴静置90s，然后冰上放置2min。

（6）将感受态细胞转移到800μL的SOC培养基中，37℃震荡培养45min。

（7）取100μL均匀涂布于含氨苄抗性的LB固体培养皿中，37℃孵育过夜。

（8）挑取菌落进行PCR鉴定，将阳性菌落送去华大基因测序。

（9）测序序列即为本发明所克隆的阳性序列。

2.2.6克隆轻链全长与重链全长

重新用BacVL-F与BacVL-R、BacVH-F与BacVH-R、BacCL-F与BacCL-R或BacCH-F与BacCH-R克隆本发明所得到的阳性序列，然后通过融合PCR的方法扩增轻链全长与重链全长，分别用BacVL-F与BacCL-R扩增轻链全长序列，用BacVH-F与BacCH-R扩增重链全长序列。应用KOD高保真酶进行PCR。PCR反应体系如下表4所示。

表4PCR反应体系

PCR结果应用DNA凝胶电泳鉴定为阳性之后需要连接转化后送出去测序，以确定所获得的轻重链为本发明所需要的序列。因为KOD酶是一个高保真的平末端PCR酶，所以在连接的时候需要先进行加A，之后再进行连接转化。

PCR产物加A是应用加A试剂盒进行的，PCR产物加A反应体系如下表3所示。

（1）在微量离心管中加入以下的加“A”反应液，总体积为20μL

表5PCR产物加A反应体系

（2）72℃反应20min。

（3）72℃反应20min。

（4）冰上放置1～2min。

（5）将加A完成的DNA片段与pMD18-T载体相连接，16℃，连接过夜。

（6）将连接产物转化到DH5α感受态细胞中，挑取单菌落PCR鉴定。

（7）将阳性克隆送去测序。

PCR反应条件：94℃5min、94℃1min、56℃（轻链）30s或56℃（重链）1min、72℃（轻链）1min/72℃（重链）100s，共30个循环，72℃10min，4℃终止反应。

测序回来之后通过DNASTAR等软件分析序列，挑选其中正确的序列，将正确序列的阳性克隆进行扩大培养，提取其质粒，用BamHΙ与EcoRΙ、XhoΙ与NheΙ分别进行双酶切，之后用DNA胶凝胶电泳鉴定酶切结果。

（1）取2ml在LB培养基中培养过夜的菌液，12000×g离心1min，弃尽上清。

（2）加入250μL Buffer S1悬浮细菌沉淀，悬浮需均匀，不应该留有小的菌块。

（3）加入250μL Buffer S2，温和并充分地上下翻转4～6次混合均匀使菌体充***解，直至形成透亮的溶液，此步骤应该避免剧烈摇晃，否则会造成基因组DNA的污染，且此步骤不宜超过五分钟。

（4）加入350μL Buffer S3，温和并充分地上下翻转混合6～8次，12000×g离心10min。

吸取上一步骤中的离心上清液并转移到制备管中（制备管置于2ml的离心管中），12000×g离心1min，弃滤液。

（5）将制备管置回到离心管中，加入500μL的BufferW1，12000×g离心1min，弃滤液。

（6）将制备管置回到离心管中，加入700μL的BufferW2，12000×g离心1min，弃滤液；以同样的方法再用700μL的BufferW2再洗一次，弃滤液。

（7）将制备管置回到2ml离心管中，12000×g离心1min。

（8）将制备管转移到新的1.5ml离心管中中，在制备膜的中央加60μL的EluentBuffer，室温静置1min，12000×g离心1min，此处的Eluent Buffer应先加热至65℃左右，这样可以提到洗脱效率。将得到的质粒DNA按照下面表6（轻链）和表7（重链）的体系加入到1.5ml离心管中。

将体系放入到37℃水浴锅之中酶切过夜。

将体系放入到37℃水浴锅中酶切过夜。

将酶切产物进行DNA凝胶电泳鉴定，鉴定结果为阳性之后对酶切产物进行胶回收，直接用于连接表达载体。

2.2.7表达质粒的构建与测序

首先，将双向表达载体pFast-Bac-Dual，其载体图谱如图3所示，进行单向的双酶切，首先将连接重链的一侧进行双酶切，双酶切体系如下表8所示：

将酶切体系放入到37℃水浴锅中酶切过夜。

将酶切过夜的产物进行DNA凝胶电泳分析，条带正确之后，用内切酶XhoΙ与NheΙ进行双酶切，回收酶切产物，将胶回收的产物与轻链双酶切胶回收之后的产物进行连接。连接体系如下表9所示。

16℃连接反应过夜。

将连接产物进行转化，转化到DH5α感受态细胞中，此处转化时在37℃震荡培养时震荡培养3h左右，然后取100μL菌液均匀涂布于氨苄抗性的LB培养皿中，37℃孵育过夜，第二天挑取单克隆进行PCR检测，将PCR检测阳性的单克隆扩大培养，提取质粒进行双酶切鉴定，鉴定结果阳性的克隆送测序。

PCR反应体系：94℃5min、94℃1min、56℃1min、72℃1min共30个循环，72℃10min，4℃终止反应。

测序结果反馈回来之后根据DNASTAR等软件分析序列，找到其中与本发明的轻链模版相同的序列，将正确序列的克隆扩大培养，提取其质粒，然后进行重链方向的双酶切，酶切反应体系如下表10所示：

37℃水浴锅酶切过夜。

将酶切产物进行DNA凝胶电泳鉴定，然后与先前的重链双酶切产物进行连接，连接的反应体系如下表11所示：

16℃连接反应过夜。

将连接产物转化DH5α感受态细胞，此处转化的37℃摇床的震荡培养时间也为3h左右，之后取100μL的菌液均匀涂布于含有氨苄抗性的LB固体培养基上。37℃孵育过夜，第二天挑取单克隆进行扩大培养之后分别进行轻链与重链的PCR鉴定与轻链与重链的双酶切鉴定。将鉴定反应为阳性的单克隆菌液送往华大基因测序。测序结果反馈之后，应用生物学软件进行序列比对分析，找出本发明所需要的阳性克隆，提取其质粒，即为我们所构建的用于表达的双向表达质粒pFast-Bac-Dual-H+L，载体构建图如图6所示。

2.2.8重组质粒的转化与提取

1）重组质粒的转化

将测序正确的单克隆进行扩大培养之后，提取其质粒，转化DH10Bac感受态细胞。DH10Bac感受态细胞的制备：

（1）在含有50μg/ml卡那抗性和7μg/ml庆大霉素抗性的双抗性LB平板上使用DH10Bac菌液画板，37℃孵育过夜。

（2）从平板上挑取一个单菌落，接种到一个含有50μg/ml卡那抗性和7μg/ml庆大霉素抗性的双抗性液体LB培养基中，于37℃，250rpm培养3～6h，至OD₆₀₀为0.4～0.6左右。

（3）将DH10Bac细菌培养液于冰上孵育10min，使培养物冷却至0℃，转入无菌的事先预冷的50ml离心管中，然后于4℃，5000rpm离心8分钟收集细胞。

（4）倒出培养液，尽量将上清弃尽，然后按照每50ml初始培养物加入30ml预先用冰预冷的0.1CaCl₂溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置30min。

（5）于4℃5000rpm离心8min收集细胞，弃尽上清。加入4ml预先用冰预冷的0.1M CaCl₂。轻轻悬浮细胞，加入1ml经过高压灭菌的事先预冷的80%甘油，吹打混匀。

（6）将DH10Bac感受态细胞按照每管100μL分装。可以直接用新鲜制备的DH10Bac感受态细胞进行质粒转化，也可以放在-70℃冰箱保存备用。

（7）取测序正确的质粒2μL加入到100μL的DH10Bac感受态细胞之中，冰上放置30min。

（8）将感受态细胞放入到42℃水浴锅中孵育90s，期间不要晃动感受态细胞。

（9）将感受态细胞取出，冰上放置2min，然后无菌加入800μL的SOC培养液，37℃，250rpm震荡培养3h。

（10）取100μL菌液均匀涂布于含有50μg/ml卡那抗性、7μg/ml庆大霉素抗性和10μg/ml四环霉素的三抗LB固体培养基上，涂菌之前30min先在三抗培养基上40μL100μg/ml的X-gal和16μL40μg/ml的IPTG，用于进行蓝白斑筛选（由于重组效率很低，所以必须应用蓝白斑帅选）。

（11）挑取白色单克隆，继续接种于另一个新的蓝白斑帅选的三抗培养基上，观察第二个培养基上的菌落颜色，若绝大部分或者全部是白色的则为阳性，若含有大部分的蓝色菌落则为假阳性则需重新鉴定。

（12）挑取第二次筛选的培养基上的白色单克隆进行扩大培养，提取质粒。同时也挑取一个蓝色的阴性克隆子进行扩大培养，用于以后的蛋白表达的阴性对照。

2）重组质粒的提取

DH10Bac感受态细胞质粒的提取不能用普通的质粒提取试剂盒，量非常之少，要根据Invitrogen公司提供的Bac-to-Bac Baculovirus Expression System手册上提供的质粒提取方法提取。

（1）用一个无菌的10μL枪头挑取在第二个三抗培养基上划线的阳性单克隆菌落，加入到一个含有5ml三抗液体培养基的无菌试管中。

（2）37℃震荡培养24h。

（3）将菌液转移到1.5ml的无菌离心管中，配平离心，14000g×，1min，弃尽上清。

（4）用0.3ml的SolutionΙ重悬菌体，轻轻的用枪头上下吹西菌体，避免剧烈吹打。

（5）加入0.3ml的SolutionΙΙ并轻轻混匀，室温孵育5min。

（6）缓慢加入0.3ml3M醋酸钾，在滴加的同时轻轻混匀，这时就会有白色的浑浊物出现，这是一线蛋白质和大肠杆菌的基因组DNA，冰上放置5～10min。

（7）14000g×，10min。

（8）轻轻的将上清液转移到一个含有0.8ml异丙醇的离心管中，注意不要吸起任何白色沉淀物，混合均匀，冰上放置5～10min。

（9）在室温条件下14000g×，15min.。

（10）轻轻的弃掉上清液，注意不要吸起下面的白色沉淀物，加入0.5ml70%的乙醇，反复清洗白色沉淀物几次。此步骤需要无菌操作。

（11）14000g×，5min，根据需要重复步骤10、11。

（12）尽可能干净的去掉上清，小心不要去掉下面的白色固体，室温条件下无菌干燥5～10min，但是不要过于干燥。

（13）用40μL的TE Buffer溶解固体，避免剧烈吹洗，

（14）4℃保存。

提取DH10Bac细胞中的质粒DNA所需要的溶液如下表12所示：

2.2.9昆虫细胞的转染与杆状病毒的组装

昆虫细胞在转染之前，必须要确保细胞处于健康状态，且处于对数生长期，细胞的数量要求在1.5×10⁶～2.5×10⁶个左右。

（1）向六孔板中加入2ml的sf-900Ⅱ，然后向其中加入8×10⁵个cell/板，然后将培养板放在室温条件下静置15min，使细胞贴壁。

计数方法：总体积中的细胞数=4个大格/4×16×10⁴×稀释倍数

（2）混合Cell fectionⅡ：将8μL的Cell fectionⅡ加入到100μL的无血清无抗生素的培养基中，漩涡震荡1～3s，这个混合液在使用之前要放置30min以上。

（3）将1μg的重组质粒加到100μL的无血清无抗生素的培养基中，混合均匀。

（4）将步骤2和3得到的混合液混合均匀，室温放置30min。

（5）将步骤4中的混合液滴加到步骤1中铺好的细胞培养板上，27℃培养3～5h。移除转染混合液，用2ml的含有1%双抗的sf-900Ⅱ培养液进行培养。

（6）27℃培养箱中培养直至发生病变。若第一代病毒的细胞病变不明显，则可以在细胞培养96h之后，收集含有病毒的培养液，转移到15ml的无菌离心管中，离心，500×g、5min。

（7）将上清液转移到新的15ml离心管中，这就是P1代病毒，4℃避光保存。

（8）用P1代病毒接种昆虫细胞后重复第9步操作，产生P2代病毒。

（9）然后用P2代病毒接昆虫细胞后重复第9步操作，产生P3代病毒。P3代病毒就是本发明所需要的重组的杆状病毒，可以用于接种sf9细胞产生蛋白，且可以产生明显的细胞病变。

2.2.10蛋白质的纯化

（1）取小量的细胞培养物和细胞上清，进行SDS配置验证是否表达蛋白，蛋白质存在于哪里，属于可溶性蛋白还是以包涵体形式存在。

（2）确定蛋白存以包涵体的形式存在。

（3）收获杆状病毒感染的细胞培养物，10000rpm离心10min，弃尽上清，用PBS洗三次，10000rpm离心10min，弃尽上清，称重：试管净重M1，试管湿重M2，则细胞沉淀物m=M2-M1。

（4）向离心管中加入事先预冷的NP-40裂解液（加入裂解液的体积是以细胞泥体积的10倍比例计算）悬浮细胞沉淀物，冰上放置10min，然后4℃，10000rpm离心10min，弃尽上清。

（5）重复向离心管中加入事先预冷的NP40裂解液（体积仍为细胞泥体积的10倍）悬浮细胞沉淀物，并且超声处理两次，超声条件：振幅28%，超声5s，间隔10s，超声时间10min，取10μL的超声产物用于SDS分析，然后4℃，10000rpm离心10min，弃尽上清。

（6）向离心管中加入事先预冷的PBS缓冲液（加入体积为细胞体积的10倍比例计算）悬浮细胞沉淀物，并超声处理两次：振幅28%，超声5s，间隔10s，超声时间10min，取10μL的超声产物用于SDS分析，然后4℃，10000rpm离心10min，弃尽上清。

（7）向试管中加入2M尿素（pH8.0）洗沉淀，超声处理：振幅28%，超声5s，间隔10s，超声时间10min，取10μL的超声产物用于SDS分析，然后4℃，10000rpm离心10min，弃尽上清。

（8）向离心管中加入事先预冷的8M尿素溶解沉淀物。然后按照Protein G蛋白纯化柱的步骤进行纯化。

（9）首先用5～10ml的Binding Buffer过0.45μm滤膜后处理纯化柱（纯化柱内不可以有空气）。

（10）然后将2ml的样品过0.45μm滤膜过滤到10ml的无菌青霉素瓶中，然后取8ml过完0.45μm滤膜的Binding Buffer也加入到青霉素瓶中，用1ml的移液器反复抽吸几次混匀。

（11）用1ml的注射器对样品进行过柱，过到一个新的青霉素瓶中，将样品反复过柱3～5次，过柱的时候尽量缓慢过柱，1ml的过柱时间大约在2min左右。

（12）用5～10ml的Binding Buffer过0.45μm滤膜洗涤纯化柱（纯化柱内不可以有空气）。

（13）取5ml Elution Buffer过0.45μm滤膜，然后用1ml注射器吸取0.8ml的Elution Buffer快速打进纯化柱中（使纯化柱内的pH迅速从7.0降到2.7），因为此时的液体不纯，所以舍弃。

（14）吸取1ml Elution Buffer以相同的方法过柱，收集此次的液体，然后重复此次操作3～4次。

（15）用pH缓冲液对收集到的蛋白洗脱液进行pH调节，将pH调节到7.0左右。

（16）直接使用蛋白或者4℃保存。

（17）用5～10ml的Elution Buffer洗涤纯化柱。

（18）再用5～10ml的Binding Buffer洗涤纯化柱。

（19）最后再用5～10ml的20%的乙醇洗涤，然后将柱子放入4℃保存备用。

包涵体纯化所需的各种溶液如下表13所示、

2.2.11ELISA检测蛋白活性

（1）用副猪嗜血杆菌分离株HLJ-018包被ELISA板（包被量2μg/孔），37℃孵育1h，4℃包被过夜。

（2）用PBST反复洗涤ELISA板三次，每次3min。

（3）用5%的脱脂奶粉封闭，37℃封闭2h。

（4）倒掉封闭液，用PBST洗涤ELISA板，反复洗涤三次，每次3min。

（5）将ELISA板晾干备用。

（6）向晾干的的ELISA板中加入已纯化好的蛋白，100μl/孔，37℃孵育1h。

（7）倒掉上清液，PBST洗涤三次，加入羊抗猪二抗，37℃孵育1h。

（8）倒掉上清液，PBST洗涤三次，加入显色液，显色10min。

（9）酶标检测仪测量OD₄₅₀值。

2.2.12SDS-PAGE与Western blot分析蛋白

1）SDS-PAGE分析

（1）SDS-PAGE溶液配方，如下表14所示：

表14

将配好的溶液加入到凝胶板中分别配制上层胶与下层胶。

（2）当上层胶与下层胶凝固之后转移到垂直电泳槽中，加入预先处理的样品（事先将10μl的样品与8μl2×的Loading Buffer和2μl的DTT混匀煮沸5min，后离心）与蛋白质Marker。

（3）80V电压跑完积层胶，使蛋白在下层较开始处处于同一位置。

（4）120V电压跑完分离胶。

（5）将跑完的一块蛋白胶进行考马斯亮蓝染色，室温摇床2h，另一块蛋白胶用于Western Blot分析.

（6）将染色的蛋白胶放入脱色盒内加入一定量的蒸馏水，微波炉煮5min，然后倒掉蒸馏水，换新的蒸馏水，重复操作3～4次，至出现明显条带为止。

2）Western Blot分析

（1）在蛋白胶将要跑完的时候将滤纸与硝酸纤维素薄膜（NC膜）分别用转膜液和蒸馏水完全印湿。

（2）将胶与滤纸和NC膜按照自上而下滤纸、NC膜、蛋白质胶、滤纸的顺序依次放置，然后用剪刀根据蛋白胶的大小修剪滤纸和膜的大小，滤纸与膜的边缘必须整齐，修剪完成之后放入半干转膜仪中进行转膜。

（3）转膜的时间、电压：15V/30min。

（4）将转膜完成的NC膜取出后，放入玻璃平皿中，5%脱脂乳4℃封闭过夜。

（5）倒掉脱脂乳，加入PBST洗涤NC膜，洗涤三次，每次3min。

（6）向玻璃瓶平皿中加入纯化好的蛋白作为一抗，室温摇床孵育2h。

（7）倒掉蛋白溶液，加入PBST洗涤NC膜，洗涤三次，每次3min。

（8）加入羊抗猪二抗稀释液，室温摇床孵育1h。

（9）倒掉羊抗猪二抗稀释液，加入PBST洗涤NC膜，洗涤三次，每次3min。

（10）加入HRP-DAB显色液显色，观察实验结果。

2.2.13蛋白的体外中和试验

（1）取冻存的副猪嗜血杆菌HLJ-018，用挑菌环蘸取菌液，在TSA培养基上划线培养细菌，37℃培养过夜。

（2）挑取单克隆菌落，接种于完全TSB液体培养基中，37℃摇床震荡培养，当其处于对数生长期时，吸取1ml用作倍比稀释使其OD值大约为0.634左右，其内还有的细菌数量大约为0.24×10³CFU/ml。

（3）分别将PBS、Mab1D8和纯化的蛋白与稀释好的菌液混合后放入到37℃水浴锅中孵育1h。

（4）取出混合物，瞬离去除管壁上的水珠，每管取出100μl均匀涂布于TSA培养基上，37℃培养过夜。

（5）对培养基上的菌落数进行计数，对比效果。

2.2.14蛋白的体内中和试验

（1）取18只6周龄的Balb/c雌鼠，随机分成三组，每组六只，分别作为阴性对照组，阳性对照组与实验组。

（2）在攻菌前1h，腹腔被动免疫PBS、Mab1D8和纯化的蛋白，然后腹腔注射处于对数生长期的致死剂量的副猪嗜血杆菌（10¹⁰CFU/ml）。

（3）观察小鼠的死亡情况，记录实验结果。

2.3试验结果

2.3.1单克隆抗体1D8轻重链可变区的扩增与猪源抗体轻重链可变区的克隆

通过对单克隆抗体1D8和猪淋巴细胞的基因组总RNA的提取，并将其反转录为cDNA，应用本发明合成的引物，进行PCR扩增，1%琼脂糖凝胶电泳，得到大小约为336bp、330bp、345bp和987bp的目的条带，相对应的是鼠源单抗轻链可变区、猪轻链恒定区、鼠源单抗重链可变区和猪重链恒定区，结果如图1所示。编码鼠源单抗轻链可变区、猪轻链恒定区、鼠源单抗重链可变区和猪重链恒定区的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.7-10所示，其中鼠源单抗轻链可变区以及鼠源单抗重链可变区的N端连接有信号肽序列，如SEQ ID NO.13所示。

2.3.2重组质粒轻链与重链的克隆

在扩增出鼠源单抗轻链可变区（LV）、猪轻链恒定区（LC）、鼠源单抗重链可变区（HV）和猪重链恒定区（HC）之后，通过融合PCR的方法扩增重组蛋白的轻链与重链，经过PCR扩增，1%琼脂糖凝胶电泳，得到大小约为750bp和1300bp的两条DNA条带，分别为重组蛋白的轻链和重链，如图2，编码轻链和重链的的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.11和12所示。

2.3.3酶切鉴定重组质粒

轻链连接完pFast-Bac-Dual质粒之后，用XhoΙ和NheΙ进行双酶切鉴定，得到一条大约750bp的目的条带和一条穿梭质粒载体DNA，如图4。

2.3.4重链的双酶切鉴定结果

在连接有轻链的pFast-Bac-Dual质粒上通过BamHΙ和EcoRΙ双酶切之后连上重链DNA序列，然后通过双酶切鉴定重链连接结果，通过BamHΙ和EcoRΙ双酶切之后，得到一条约1500bp左右的目的条带和一条质粒DNA条带，结果如图5。双向表达载体pFast-Bac-Dual-H+L的载体图谱如图6所示。

2.3.5杆状病毒转染昆虫细胞

用转染试剂将重组的质粒DNA转染Sf9细胞，27℃培养五天之后，没有细胞病变，然后500×g室温离心5min，用上清液继续接种昆虫细胞，27℃培养三天之后发现了轻微的细胞病变，然后收取病毒，500×g室温离心5min，用上清液继续接种昆虫细胞，27℃培养三天之后发现了明显的细胞病变。结果如图7。

2.3.6蛋白表达之后的SDS-PAGE与Western Bolt检测

在获得杆状病毒的高效价的P3代病毒之后，用其接种昆虫细胞，在接种后的第三天当细胞病变达到80-90%之后，收集细胞，500×g室温离心5min，收集上清液作为病毒保存，沉淀则通过包涵体纯化方法进行纯化，通过SDS-PAGE和WesternBolt检测蛋白的表达情况。如图8与9：

2.3.7杆状病毒表达的蛋白的ELISA检测结果

重组蛋白在经过蛋白质纯化之后所得到的的蛋白，用ELISA检测方法检测其蛋白质的活性，结果如图10所示。

2.3.8杆状病毒表达的重组蛋白的体外抑菌试验

将纯化好的蛋白与分离培养的处于生长期的副猪嗜血杆菌HLJ-01837℃水浴30min之后，取100μl菌液均匀涂布于TSA培养基上37℃孵育过夜，然后对培养基上的细菌进行计数，结果如表15所示：

2.3.9杆状病毒表达的重组蛋白的体内抑菌试验

在Balb/c小鼠被动接种致死剂量的副猪嗜血杆菌HLF-018前1h，在小鼠的腹腔中分别注射0.5mg的纯化后的Mab1D8、纯化后的重组蛋白和等体积的PBS，观察小鼠的存活情况，结果如图11。

由图可以看出，阴性对照组的小鼠在注射致死剂量的副猪嗜血杆菌之后在18h时就已经死亡四只，而在32h时阴性对照组的小鼠已经完全死亡，而本发明的重组蛋白组与单抗1D8的两组中小鼠虽有死亡，但是对比于阴性对照组说明本发明的蛋白具有很好的体内抑菌作用。

Claims (12)

1.一种抗副猪嗜血杆菌的猪源嵌合抗体，其特征在于所述的抗体由一条轻链和一条重链通过二硫键和非共价键联结而成，所述的轻链从N端到C端依次包括鼠源抗副猪嗜血杆菌单抗轻链可变区和猪IgG轻链恒定区，所述的重链依次包括鼠源抗副猪嗜血杆菌单抗重链可变区和猪IgG重链恒定区。 

2.如权利要求1所述的猪源嵌合抗体，其特征在于所述的鼠源抗副猪嗜血杆菌单抗轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的猪IgG轻链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述的鼠源抗副猪嗜血杆菌单抗重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述的猪IgG重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。 

3.如权利要求1或2所述的猪源嵌合抗体，其特征在于在所述的轻链和重链的N端还包括信号肽序列，优选的，所述的轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述的重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。 

4.编码权利要求1-3任一项所述猪源嵌合抗体的核苷酸序列。 

5.如权利要求4所述的核苷酸序列，其特征在于编码鼠源抗副猪嗜血杆菌单抗轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，编码猪IgG轻链恒定区的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，编码鼠源抗副猪嗜血杆菌单抗重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，编码猪IgG重链恒定区的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。 

6.如权利要求4所述的核苷酸序列，其特征在于在编码轻链和重链的核苷酸序列的5’端还分别连有编码信号肽序列的核苷酸序列，优选的，编码轻链的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，编码重链的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。 

7.一种表达载体，其特征在于含有权利要求4-6任一项所述的核苷酸序列。 

8.如权利要求7所述的表达载体，其特征在于所述的表达载体为杆状病毒表达载体，优选的，所述的表达载体是在双向表达载体pFast-Bac-Dual的基础上构建得到的。 

9.一种表达权利要求1所述的抗副猪嗜血杆菌的猪源嵌合抗体的方法，其特征在于包括以下步骤： 

（1）构建用于表达抗副猪嗜血杆菌的猪源嵌合抗体的杆状病毒表达载体，其中编码猪源嵌合抗体轻链的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，编码猪源嵌合抗体重链的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示； 

（2）将构建得到的杆状病毒表达载体转染昆虫细胞并进行杆状病毒的组装； 

（3）获得的杆状病毒接种昆虫细胞，当细胞病变达到80-90%，收获杆状病毒感染的细胞培养物，纯化，即得。 

10.如权利要求7所述的方法，其特征在于所述的杆状病毒表达载体是在双向表达载体pFast-Bac-Dual的基础上构建得到的，所述的编码猪源嵌合抗体轻链的核苷酸序列以及编码猪源嵌合抗体重链的核苷酸序列分别各自位于pFast-Bac-Dual上的PPH启动子或p10启动子的下游，所述的昆虫细胞为sf-900Ⅱ。 

11.权利要求1-3任一项所述的抗副猪嗜血杆菌的猪源嵌合抗体在制备检测或预防副猪嗜血杆菌感染试剂或药物中的应用。 

12.权利要求5或6所述的表达载体在制备抗副猪嗜血杆菌的猪源嵌合抗体中的应用。 

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