CN102876636A

CN102876636A - 抗副猪嗜血杆菌外膜蛋白omp5的单克隆抗体、杂交瘤细胞株hps 1e2及应用

Info

Publication number: CN102876636A
Application number: CN2012103717638A
Authority: CN
Inventors: 李春玲
Original assignee: INSTITUTE OF VETERINARY MEDICINE GUANGDONG ACADEMY OF AGRICULTURAL SCIENCES
Current assignee: INSTITUTE OF VETERINARY MEDICINE GUANGDONG ACADEMY OF AGRICULTURAL SCIENCES
Priority date: 2012-09-28
Filing date: 2012-09-28
Publication date: 2013-01-16
Anticipated expiration: 2032-09-28
Also published as: CN102876636B

Abstract

本发明公开了一种抗副猪嗜血杆菌外膜蛋白OMP5的单克隆抗体、杂交瘤细胞株HPS1E2及应用。所述杂交瘤细胞株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCC2012138。由其制备的单克隆抗体特异性好，与猪大肠杆菌、猪巴氏杆菌、猪胸膜肺炎放线杆菌、猪链球菌和猪波氏杆菌均无交叉反应；效价高，纯化后的ELISA抗体效价可达1：409600；通用性强，对不同血清型副猪嗜血杆菌都能检测；可广泛用于副猪嗜血杆菌病的病原学诊断、血清学检测、免疫学检测及防治等。

Description

抗副猪嗜血杆菌外膜蛋白OMP5的单克隆抗体、杂交瘤细胞株HPS 1E2及应用

技术领域

本发明属于免疫学领域，具体涉及一种抗副猪嗜血杆菌外膜蛋白OMP5的单克隆抗体、杂交瘤细胞株及其应用。

背景技术

副猪嗜血杆菌（Haemophilus Parasuis，HPS）属于巴斯德菌科，嗜血杆菌属，是一种没有运动性、小型、NAD依赖、多形态的革兰氏阴性杆菌。HPS是一种常在菌，通常定植在猪的上呼吸道，并常常可在鼻腔内、扁桃体内和气管前段分离到，而不见其引起任何临床症状。HPS也是猪格拉泽氏病（Glasser’s diseas）的病原。在一定条件下，HPS可造成以纤维素性多发性浆膜炎、关节炎、脑膜炎为特征的全身感染。格拉泽氏病已在全球范围内成为影响猪业的主要细菌性疾病，给养猪业带来巨大损失。迄今已发现的HPS至少有15种不同的血清型，不同血清型菌株之间缺乏有效的交叉免疫保护性，这增加了预防格拉泽氏病的难度。因此，及时、准确、快捷而方便的病原学诊断方法对于猪格拉泽氏病的防治具有重要意义。

目前国内对副猪嗜血杆菌的诊断主要有传统的病原分离，生化鉴定和血清学等方法，以及基于PCR的检测方法等。免疫学方法如ELISA、胶体金试纸条等具有特异性强、灵敏度高、操作简单、快速、对仪器依赖性低等特点，因而常被用于疾病病原检测以及药物痕量分析等领域。目前国内尚未有基于抗体的HPS检测的可商品化诊断方法。

HPS 的外膜蛋白(Outer member protein，OMP)是其主要毒力因子之一，而且免疫原性强。OMP5是其中主要的一种，各血清型HPS菌株都有OMP5。因此OMP5可作为HPS的特异性诊断靶位。

发明内容

本发明的目的在于提供一种分泌抗副猪嗜血杆菌外膜蛋白OMP5单克隆抗体的杂交瘤细胞株HPS 1E2，已于2012年9月25日保藏于中国典型培养物保藏中心（CHINA CENTER FOR TYPE CULTURE COLLECTION），保藏编号为CCTCC C2012138。

本发明还提供了由上述保藏编号为CCTCC C2012138的杂交瘤细胞株制备的单克隆抗体。

本发明还提供了上述单克隆抗体在检测副猪嗜血杆菌上的应用。

本发明所采用的技术方案是：

一种分泌抗副猪嗜血杆菌外膜蛋白OMP5单克隆抗体的杂交瘤细胞株HPS 1E2，于2012年9月25日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC C2012138。

一种抗副猪嗜血杆菌外膜蛋白OMP5的单克隆抗体，保藏编号为CCTCC C2012138的杂交瘤细胞株产生。

所述单克隆抗体为IgG2a亚类。

一种检测副猪嗜血杆菌抗体的试剂盒，含有由保藏编号为CCTCC C2012138的杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体。

一种检测副猪嗜血杆菌的试剂盒，含有由保藏编号为CCTCC C2012138的杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体。

本发明的有益效果在于：

本发明制备得到的单克隆抗体具有以下优点：

（1）特异性好，与猪大肠杆菌、猪巴氏杆菌、猪胸膜肺炎放线杆菌、猪链球菌和猪波氏杆菌均无交叉反应；

（2）效价高，纯化后的ELISA抗体效价可达1：409600；

（3）通用性强，对不同血清型副猪嗜血杆菌都能检测；

（4）可大量生产；

（5）可广泛用于副猪嗜血杆菌病的病原学诊断、血清学检测、免疫学检测及防治等。

附图说明

图1为本发明的技术流程图；

图2为单克隆抗体的特异性检测结果（M：蛋白Marke；P5：OMP5；1：猪大肠杆菌；2：猪链球菌2型菌株；3：猪多杀性巴氏杆菌菌株A；4：猪多杀性巴氏杆菌菌株B；5：猪胸膜肺炎放线杆菌菌株；6：猪波氏杆菌菌株）；

图3为单克隆抗体的通用性检测结果（M：蛋白Marker；P5：OMP5；1：1型HPS；2：3型HPS；3：4型HPS；4：5型HPS；5：10型HPS；6：11型HPS；7：12型HPS；8：14型HPS；9：15型HPS；10：:未定血清型HPS）；

图4为单克隆抗体用于检测HPS在PK15细胞上的粘附（激光共聚焦显微镜观察）（A：单克隆抗体1E2；B：抗OMP5阳性血清对照； C：抗5型HPS全菌阳性血清对照； D：阴性血清对照）。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

主要实验材料和来源：

猪胸膜肺炎放线杆菌1型（APP259，购自中国兽药监察所）；HPS 3型菌株（SW114，澳大利亚昆士兰州动物健康研究所Pat Blackall博士惠赠）；HPS 11型(H456，澳大利亚昆士兰州动物健康研究所Pat Blackall博士惠赠)；猪大肠杆菌、猪多杀性巴氏杆菌2株菌株、猪链球菌2型菌株、猪波氏杆菌、HPS 1型菌株、HPS 4型菌株、HPS 5型GD H45株、HPS 10型菌株、HPS 12型菌株、HPS 14型菌株、HPS 15型菌株及1株未定型HPS菌株均由本实验室从华南地区病猪中分离、鉴定并保存。

一、免疫原的制备

将HPS 5型GD H45株在TSA平板上培养18～24h后，挑取单菌落接种于5mL TSB培养基中150rpm振荡培养10～12h，然后按照1%～4%（v/v）的比例接种于100mL TSB培养基中培养10h，梯度稀释，细菌计数，同时进行污染检查。6000r/min，离心10min后，用pH7.4的PBS洗涤并制成10⁹ CFU/ml浓度的悬液，加入0.1%～0.4%的甲醛，37℃灭活24h，备用。

二、动物免疫

选取体重在20g左右的雌性Balab/c小鼠。首次免疫，将灭活的HPS 菌液与弗氏完全佐剂按1:1的比例进行混合乳化，剂量为0.1～0.5mL/只，注射方法为背部皮内多点注射。首免后每隔2~3周加强免疫一次，佐剂改用弗氏不完全佐剂。三免后1周左右，剪尾采血，收集血清；用表达纯化的HPS 5型GD H45株外膜蛋白OMP5（制备方法详见文献：陈善真，李春玲等，副猪嗜血杆菌OMP5基因的克隆、表达及间接ELISA检测方法的建立，中国农业科学，2011,44(14):3036-3044）对血清中的抗体进行ELISA检测。免疫进行至抗体效价不再升高。选择抗体效价高的小鼠，在细胞融合前进3天腹腔注射灭活菌液0.1～0.5mL/只行一次加强免疫。

三、杂交瘤细胞的融合、筛选与扩大培养

取效价较高免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤SP2/0细胞，按常规PEG融合法制备杂交瘤细胞；抗体用重组表达的OMP5进行间接ELISA检测，筛选阳性克隆并扩大培养；同时采用有限稀释法对阳性克隆进行亚克隆，至少进行3次，以保证能得到稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。筛选出高分泌特异性的杂交瘤细胞株HPS 1E2保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2012年9月25日，保藏编号为CCTCC C2012138。将其分泌的单克隆抗体命名为HPS 1E2。

ELISA所用溶液的配制

包被缓冲液：（0.05mol/L 碳酸盐缓冲液pH9.6）：1.59g Na₂CO₃，2.93g Na₂HCO₃溶于800mL双蒸水中，调节pH值至9.6，并定容至1000mL。

封闭液：牛血清白蛋白（BSA）1g加入100mL的包被液中，混匀，现配现用。

洗涤缓冲液（pH7.4 PBST）：0.2g KH₂PO₄，2.9g Na₂HPO₄·12H₂O，8.0g NaCl，0.2g KCl，0.5mL Tween-20（0.05% V/V）以上各物质准确称量后，加双蒸水完全溶解后，调pH值至7.4，定容至1000mL。

抗体稀释液：0.5g BSA溶于100mL PBST中。

底物缓冲液：Na₂HPO₄·12H₂O 3.8g；柠檬酸0.98g，准确称量后，溶于80mL双蒸水，调pH值至5.0，用蒸馏水定容到100mL。

TMB底物显色液：A液：TMB 50mg 溶于10mL DMSO中4℃避光保存。 B液：（pH5.0）：0.2 mol/L Na₂HPO₄.12H₂O 51.4mL，0.1 mol/L柠檬酸48.6mL，100mL超纯水，再加入30% H₂O₂ 112μL于棕色瓶中 4℃避光保存。用前A液和B液按1﹕50比例混合。

终止液：（2 mol/L H₂SO₄）：双蒸水178.3mL，逐滴加入浓硫酸（98%）21.7mL。

间接ELISA具体操作如下：

1) 包被：用包被液稀释重组HPS外膜蛋白OMP5至浓度为3.475μg /mL，100μL/孔，加入96孔聚苯乙烯酶联反应板，4℃包被过夜；弃去包被液，每孔加250μL PBST洗涤液，静置3min，弃洗涤液，将ELISA板在吸水纸上用力拍干，重复三次。

2) 封闭：加封闭液，100μL/孔，37℃条件下封闭2h，弃去封闭液，在每孔加250mL PBST，静置3min，在吸水纸上用力拍干，重复三次。

3) 加样：每孔加入100μL细胞培养上清\腹水\纯化后的抗体，用PBST按1:1000稀释抗HPS阳性小鼠血清，作为阳性对照，取SP2/0培养上清为阴性对照，37℃作用1h，作用完毕后弃去样品。每孔加250μL PBST 静置3min，在吸水纸上用力拍干，重复三次。

4) 加酶标二抗：每孔加50μL用PBST 1:4000稀释的辣根过氧化物标记山羊抗小鼠抗体，37℃作用30min，作用完毕后弃去二抗，每孔加250μL PBST 静置3min，在吸水纸上用力拍干，重复三次。

5) 加显色液：每孔加入100μL显色液，显色液要用新鲜配制的，室温条件下避光显色10min。

6) 加入终止液：显色完毕后，立即加入终止液终止反应，每孔100μL。

7) 测OD值：用酶标仪测定OD450nm处吸光值。

四、杂交瘤细胞株上清与腹水单抗（HPS 1E2）效价的测定

将杂交瘤细胞培养上清和制备的腹水，连续倍比稀释，然后用间接ELISA（操作方法同三）测定其效价，并设阳性、阴性血清以及SP2/0细胞培养上清作阴性对照。结果显示，杂交瘤细胞培养上清的效价为1:2560，腹水效价为1：51200，纯化后的抗体效价为1: 409600。

五、单克隆抗体HPS 1E2腹水的大量制备

取10周龄雌性健康Balb/c小鼠，0.5ml/只腹腔注射降植烷；1周后，0.2～0.5 ml/只腹腔注射浓度为5×10⁷/ml的杂交瘤细胞；待小鼠腹部明显胀大，用手触摸皮肤时有紧致感时，收集腹水并以2000rpm离心5min，上清液即为含单克隆抗体的腹水。将腹水从 1:100进行倍比稀释，然后用间接ELISA（操作方法同四）测定其效价，结果显示，腹水的效价为1:51200。所获得的腹水可于－80℃或液氮中保存。

六、单克隆抗体HPS 1E2的纯化

用Roche公司的蛋白A亲和层析试剂盒将单克隆抗体从筛选到的杂交瘤细胞培养液或腹水中纯化出来，具体步骤按试剂盒的说明书操作。

纯化后的效价为1：409600。

七、单克隆抗体IgG亚类鉴定

参照Sigma公司的Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Reagents使用说明，运用捕捉ELISA法测定HPS 1E2杂交瘤细胞分泌的免疫球蛋白的亚类类型，结果表明1E2为IgG2a亚类。

八、杂交瘤细胞分泌抗体HPS 1E2的稳定性分析

将杂交瘤细胞在液氮中冻存1个月后复苏，以OMP5为抗原用间接ELISA法测定细胞培养上清液中的抗体效价，然后再次放入液氮中冻存；1个月后再次取出复苏，如此连续重复冻融三次。比较分析几次杂交瘤细胞培养上清的抗体效价的测定值。结果表明，杂交瘤细胞经过三次反复冻融，其细胞培养上清液抗体效价恒定，说明分泌的单抗具有良好的稳定性。

九、单克隆抗体HPS1E2的特异性检测

将不同的细菌，包括猪大肠杆菌、猪多杀性巴氏杆菌、猪胸膜肺炎放线杆菌1型、猪链球菌2型和猪波氏杆菌培养后收集菌体；用4℃灭菌蒸馏水洗涤菌体3次，4℃超声波破碎，以8000rpm离心10min，取上清液进行SDS-PAGE电泳，转移到硝酸纤维素膜（NC）上，同时以重组HSP OMP5为阳性对照；以单克隆抗体HPS1E2为一抗，以辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠抗体为二抗进行Western-blotting检测。

Western Blot检测按以下步骤进行：

(1)样品制备：将蛋白样品与上样缓冲液体积按1:1的比例混合均匀后，煮沸10min。

(2)SDS-PAGE 电泳：制胶，加样进行SDS-PAGE电泳，当预染蛋白Marker跑到预定位置后，断开电源。

(3)电泳完毕后，卸下凝胶，并用电转移缓冲液平衡3次，每次5min。

(4)PVDF膜处理：预先裁好与胶条同样大小的PVDF膜和滤纸，将PVDF膜用甲醇处理5s，然后平铺于双蒸水面，侵入水中10min使其靠毛细作用吸水后排干净气泡，随后放入电转缓冲液中平衡。

(5)取胶：胶在转移缓冲液中平衡后，置于洁净玻璃板上，依次铺上NC膜、三层滤纸（两侧都铺）。

(6)转膜：往电转槽加入适量电转液，将胶平铺于用电转缓冲液润湿过的海绵上进行固定（固定时注意膜对着正极一侧）；固定后放入电转移槽，恒流100mA转移（将电转槽放在冰水混合物中，防止电转过程中温度过高）3h后，断开电源取膜做免疫印迹。

(7)洗膜：将膜放入TBST中，静置5min，重复三次。

(8)包被：将膜加入包被液中，室温条件下平稳摇动包被2h。

(9)洗膜：弃去包被液，将膜放入TBST中，静置5min，重复三次。

(10)加一抗：一抗即单克隆抗体HPS 1E2，用TBST按1:500比例稀释，室温下平稳摇动1h。

(11)洗膜：弃去一抗，将膜放入TBST中，静置5min，重复四次。

(12)加二抗：将辣根过氧化物标记的山羊抗小鼠抗体，按1:5000比例用TBST稀释，室温平稳摇动感作1h。

(13)洗膜：反应完毕后，弃去酶标二抗，用TBST先后洗膜3次，每次5min；然后将膜转入TBS中静置10min，重复两次。

(14)显色：加入DAB显色液，室温条件下避光显色，当出现条带时，显色结束；立即将膜放入超纯水中终止反应。

结果见图2。从图中可以看出，本发明所获得的单克隆抗体与猪大肠杆菌、猪多杀性巴氏杆菌、猪胸膜肺炎放线杆菌、猪链球菌2型菌株和猪波氏杆菌的菌体蛋白均无反应，在HPS的OMP5蛋白（约57KD）处可见到特异性反应条带，说明所获得的单抗可与HPS OMP5特异性结合。

十、单克隆抗体HPS1E2的通用性检测

将HPS 1型菌株、3型菌株、4型菌株、5型菌株、10型、11型菌株、12型菌株、14型菌株、15型菌株等9个不同血清型的副猪嗜血杆菌菌株及1株未定型菌株培养后收集菌体；用4℃灭菌蒸馏水洗涤菌体3次，4℃超声波破碎，以8000rpm离心10min，取上清液进行SDS-PAGE电泳，转移到硝酸纤维素膜（NC）上，同时做重组HSP OMP5阳性对照；以获得的单抗HPS1E2为一抗，以辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠抗体为二抗进行Western-blotting检测。

结果见图3。从图中可以看出，本发明所获得的单克隆抗体HPS1E2与所有9个血清型的副猪嗜血杆菌菌体蛋白及未定型菌株均发生反应。在OMP5蛋白（约57KD）处可见到特异性反应条带，说明所获得的单抗HPS1E2通用性良好。

十一、单克隆抗体HPS1E2用于HPS的免疫荧光检测---激光共聚焦免疫荧光检测

1．激光共聚焦专用细胞培养皿的处理：

(1)预平衡：吸取3mL细胞培养液到培养皿中，然后在细胞培养箱中孵育15min。

(2)倒掉细胞培养液，加入500μL细胞悬液，在细胞培养箱中放置2h，让细胞沉降贴壁。

(3)小心补加3mL细胞培养液。

2．PK-15细胞的传代培养：用含10%胎牛血清的MEM培养液培养PK-15细胞，等细胞长到对数生长期后开始传代。具体操作如下：倒去培养液，用灭菌PBS洗去残留培养液；加入1mL胰酶，轻轻摇晃作用2min，看到瓶底细胞呈雾状时倒掉胰酶，用灭菌PBS洗去残留胰酶；用含10%胎牛血清的MEM培养液将细胞悬浮起来，然后将细胞悬液一分为二，分装到两个细胞培养瓶中，放入培养箱中培养，传代后1h换液将聚集成团的细胞倒掉，以免影响实验效果。

3．待细胞长至80%满度后，给细胞换液，加入血清5型HPS菌液，使其终浓度为1×10⁶cfu/mL，置37℃，2h进行共培养；弃去培养液，用PBS充分洗涤，加入2ml含15μL/mL正常山羊血清的PBS，37℃放置15min；用PBS洗涤。加入2mL含2%戊二醛和1.5%甲醛的PBS 4℃固定2h。

4．每孔加入含10%胎牛血清和1%BSA的PBS，每孔500μL，37℃封闭1h；封闭完毕后，弃去封闭液，加入PBS充分洗涤；将用抗OMP5的单克隆抗体HPS1E2制作的腹水做1:100稀释（用含5%胎牛血清和0.05%Tween-20的PBS为稀释液，以下同），分别加入各培养皿，每个500μL，37℃ 作用2h，同时设抗5型HPS全菌多抗、抗OMP5多抗和HPS阴性血清对照；作用完毕后，弃去腹水，用PBS洗涤。

抗5型HPS全菌多抗和抗OMP5多抗的制备方法为：将经甲醛灭活的5型HPS或将纯化的重组外膜蛋白P5分别与弗氏完全或不完全佐剂制备的油乳剂亚单位疫苗，分别皮下多点注射免疫Balb/c小鼠，共免疫三次，中间间隔14天，于第三次免疫后14天进行采血，分离血清。

5．以FITC-羊抗鼠抗体为二抗，用PBST按1:1000的比例进行稀释，加入各培养皿，每个500μL，37℃作用 2h；作用完毕后弃去二抗，用PBS洗涤；最后加入少许PBS，以防止细胞失水。

6．激光共聚焦显微观察:将培养皿置激光共聚焦显微镜（laser confocal scanning light microscope，Leica TCS SP），调Ar Ion Laser波长至488nm，调焦收集聚焦信息。

结果见图 4。图中结果显示，单抗HPS1E2与抗5型HPS全菌阳性血清和抗OMP5阳性血清对照一样，能引起吸附有HPS的PK-15细胞周围发出绿色荧光，说明单抗HPS1E2与天然抗原能发生反应，可用于HPS的临床检测。

Claims

1.一种分泌抗副猪嗜血杆菌外膜蛋白OMP5单克隆抗体的杂交瘤细胞株HPS 1E2，于2012年9月25日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC C2012138。

2.一种抗副猪嗜血杆菌外膜蛋白OMP5的单克隆抗体，由权利要求1所述的杂交瘤细胞株产生。

3.根据权利要求2所述的抗副猪嗜血杆菌外膜蛋白OMP5的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体为IgG2a亚类。

4.一种检测副猪嗜血杆菌抗体的试剂盒，含有权利要求2或3所述的单克隆抗体。

5.一种检测副猪嗜血杆菌的试剂盒，含有权利要求2或3所述的单克隆抗体。