CN103436583B

CN103436583B - 一种生产治疗性犬瘟热病毒单克隆抗体的方法、其制品及杂交瘤细胞

Info

Publication number: CN103436583B
Application number: CN201310397952.7A
Authority: CN
Inventors: 孙明; 陈西钊; 田克恭; 曹振; 张丽
Original assignee: Beijing Shiji Yuanheng Animal Epidemic Prevention Technology Co Ltd
Current assignee: Beijing Shiji Yuanheng Animal Epidemic Prevention Technology Co Ltd
Priority date: 2013-09-04
Filing date: 2013-09-04
Publication date: 2015-06-03
Anticipated expiration: 2033-09-04
Also published as: CN103436583A

Abstract

本发明提供一种生产治疗性犬瘟热病毒单克隆抗体的方法、其制品及杂交瘤细胞。本发明生产治疗性犬瘟热病毒单克隆抗体的方法，包括如下步骤：(1)将分泌生产治疗性犬瘟热病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞于细胞培养液中进行扩大培养；(2)再接种到生物反应器内的细胞培养液中进行培养；(3)收获杂交瘤细胞所生成的治疗性犬瘟热病毒单克隆抗体。本发明方法生产的治疗性犬瘟热病毒单克隆抗体纯度高，批间差异小，质量易控，可显著提高治疗性单克隆抗体质量。

Description

一种生产治疗性犬瘟热病毒单克隆抗体的方法、其制品及杂交瘤细胞

技术领域

本发明涉及单克隆抗体生产的技术领域，具体涉及一种生产治疗性犬瘟热病毒单克隆抗体的方法、其制品及杂交瘤细胞。

背景技术

1975年Koehler和Milstein（Nature Vol.256，pp495-497），采用细胞杂交技术，将绵羊红细胞（SRBC）免疫的小鼠脾细胞，与小鼠骨髓瘤细胞融合，成功获得了抗SRBC的单克隆抗体。创建了具有划时代意义的杂交瘤单克隆抗体技术，为生物技术打开了一个全新的领域。目前，该技术的应用已涉及医学、农业、食品、环境等众多领域，广泛应用于基础研究、疾病诊断、环境与食品检测、治疗、预防、蛋白提纯等方面。随着单克隆抗体在体内诊断和治疗中的应用，对单克隆抗体产品也提出了更高的要求，从而促进了体外大规模培养杂交瘤细胞生产单克隆抗体的技术发展。该技术也随着机械化工、计算机学科的发展而日益完善，为生物医学（包括人类和兽医）的各个领域，尤其在病毒感染的预防和治疗的基础研究和临床应用领域，发挥其重要的作用。

犬瘟热（Canine Distemper,CD）是由犬瘟热病毒（Canine Distemper virus,CDV）引起的，感染肉食兽中的犬科（尤其是幼犬）、鼬科及一部分浣熊科动物的高度接触传染性、致死性传染病。以早期表现双相热型、急性鼻卡他，及随后的以支气管炎、卡他性肺炎、严重的胃肠炎和神经症状为特征。少数病例出现鼻部和脚垫的高度角化。该病传染性强、发病率高，经常引起大批犬、貂、狐等动物发病，致死率30%～80%，雪豹高达100%。另外，该病毒感染还威胁到实验用犬。目前临床上对该病毒感染的治疗主要是对症治疗，配合高免血清和单克隆抗体治疗。制备治疗性犬瘟热病毒单克隆抗体的传统方法是体内生产法。此方法将融合产生的犬瘟热病毒单克隆杂交瘤细胞接种于小鼠（非同系动物）腹腔中，在小鼠腹腔内生长杂交瘤，诱导产生大量腹水，同时，犬瘟热病毒单克隆杂交瘤细胞分泌抗体于腹水中，而得到大量的腹水单抗。一般而言，该类腹水中常混有小鼠的各种杂蛋白（包括Ig），因此要提纯后才能使用；另外，这种方法的产量低，生产周期长、批间差异大，不适合进行批量化的治疗性单抗的生产。

目前，亟需能生产出具有纯度高，批间差异小，质量易控，可显著提高治疗性单克隆抗体质量的治疗性犬瘟热病毒单克隆抗体的方法。

发明内容

根据上述领域的需求和不足，本发明提供一种生产治疗性犬瘟热病毒单克隆抗体的方法，本发明还提供由该方法直接获得的治疗性犬瘟热病毒单克隆抗体。本发明方法生产的治疗性犬瘟热病毒单克隆抗体纯度高，批间差异小，质量易控，可显著提高治疗性单克隆抗体质量。另外，本发明还提供分泌抗犬瘟热病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞。

本发明的技术方案如下：

一种生产治疗性犬瘟热病毒单克隆抗体的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将分泌生产治疗性犬瘟热病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞于细胞培养液中进行扩大培养；

(2)再接种到生物反应器内的细胞培养液中进行培养；

(3)收获杂交瘤细胞所生成的治疗性犬瘟热病毒单克隆抗体。

所述细胞培养液的配方是：85%DMEM液、15%犊牛血清、添加200单位/ml青霉素钠和200单位/ml硫酸链霉素；或无血清杂交瘤细胞培养基，添加200单位/ml青霉素钠和200单位/ml硫酸链霉素。

接种密度是1×105～1×106/ml。

接种密度是2×105～8×105/ml，其中步骤（2）中采用批式、连续灌流或换液收取方式在生物反应器中培养所述杂交瘤细胞。

接种密度是4×105～5×105/ml，培养所述杂交瘤细胞的培养温度在36～37℃之间，所述细胞培养液的pH值为7.0～7.2，所述生物反应器的溶氧范围设为50%～90%。

当采用连续灌流方式培养杂交瘤细胞时，流加体积为每天1～5罐体积。

上述方法的特征在于，所述杂交瘤细胞的保藏号为：CGMCC No.7613。

还包括如下步骤：将步骤（3）收获的生产治疗性犬瘟热病毒单克隆抗体进行浓缩与纯化，再无菌、定量分装到灭菌的容器中。

上述方法生产的治疗性犬瘟热病毒单克隆抗体。

一种杂交瘤细胞株，其保藏号为CGMCC No.7613。

在本发明中，“生物反应器”是指为培养生长的和非固定化的细胞提供良好封闭环境的生物反应装置，通常又称为细胞发酵罐。有多种生物反应器可以适用于本发明中，包括例如搅拌式生物反应器、气升式生物反应器、中空纤维生物反应器和流化床生物反应器等。

生物反应器培养细胞主要有批式（Batch）、流加式（Fed-batch）和灌流式（Perfusion）三种。在简单的批式培养中，随着营养物的消耗和副产物的积累，细胞停止生长并开始死亡，产物也停止产生，生产效率很低。流加式培养，即在培养过程中，根据细胞代谢需求，连续或间隔地向反应器内加入特定的流加培养基，补充新的营养物质，减少副产物。整个培养过程没有流出或回收，通常在细胞进入衰亡期或衰亡期后进行终止，回收整个反应体系，分离细胞和细胞碎片，浓缩、纯化目标蛋白。灌流式培养是指把细胞和培养基一起加入反应器后，在细胞生长和产物形成过程中，不断地将消耗过的培养基排出，同时又连续不断地灌注新的培养基的方法。

本发明用生物反应器生产治疗性犬瘟热病毒单克隆抗体的方法中，细胞的培养方式可以是批式、流加式或灌流式中的任意一种，这三种细胞培养方式均能满足本发明的要求，实现本发明的发明目的，考虑到实验条件等其他方面的问题，本发明实施例中使用的是灌流式的细胞培养方式，这并不代表另外两种方式就不能实现本发明的发明目的。

具体而言，使用生物反应器培养的步骤可以是：

从工作细胞库中取出杂交瘤细胞，采用快速融化法将种子细胞由液氮迅速转入到37℃水浴复苏，以85%DMEM液、15%犊牛血清培养液，添加200单位/ml青霉素钠和200单位/ml硫酸链霉素；或无血清杂交瘤细胞培养液，添加200单位/ml青霉素钠和200单位/ml硫酸链霉素进行细胞扩大培养。

同时，将生物反应器彻底清洗、消毒后开启空气、氧气、氮气和二氧化碳四气体供气装置，设定生物反应器培养条件：温度，pH值，溶氧，搅拌速度等备用。

当生产细胞种子增殖达到合适总量，按细胞终浓度的合理范围接种到生物反应器中进行培养，其中接种浓度范围为1×10⁵～1×10⁶/ml能满足本发明基本的接种要求，而接种浓度范围为2×10⁵～8×10⁵/ml，该范围的接种浓度效果较佳，而接种浓度范围为4×10⁵～5×10⁵/ml效果最好，该范围的接种浓度即可保证细胞充分适应从静态培养到动态培养，又能缩短从接种到收获的时间。当细胞密度达到1×10⁶/ml以上时，即可设定并开启蠕动泵开始以灌注的方式收获培养上清液。根据细胞密度和效价，调整蠕动泵转速，改变灌注体积。优选在细胞密度达到2×10⁶/ml以上时，尤其是当细胞密度达到5×10⁶/ml以上时，则检测的效价所对应的细胞浓度在该密度达到合格要求，逐步提升设定转速，然后以连续灌流或换液收取方式获得细胞培养上清即为治疗性犬瘟热病毒单克隆抗体。本发明可以以任何合适的浓度将杂交瘤种子细胞接种到生物反应器中。在本发明中，接种到生物反应器中的种子细胞的浓度只要在10⁵/ml以上即可。在本发明的一个实施例中，接种到生物反应器中的种子细胞的浓度优选为2×10⁵/ml以上。在另两个实施例中，接种到生物反应器中的种子细胞的浓度分别优选为5×10⁵/ml或8×10⁵/ml以上。当然，普通技术人员可以容易地确定种子细胞接种浓度的合理范围如上述范围。

在上述方法中可以采用任何合适的分泌治疗性单克隆抗体的杂交瘤细胞。该杂交瘤细胞可以来源于已有的保藏物例如来源于保藏机构的保藏物，或者从商业途径购得，或者自行制备。普通技术人员知晓构建分泌治疗性单克隆抗体杂交瘤细胞的方法，例如可以用犬瘟热病毒CDV MD-77株免疫小鼠，应用SPA-HRP免疫组织化学技术检测免疫小鼠血清效价，当其达到1:640后，取血清效价最高的小鼠脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞相融合，在96孔细胞板上培养10天后，吸取细胞上清液做ELISA筛选阳性融合株，1次或数次（例如3次）克隆后获得杂交瘤细胞株。另外，所述杂交瘤细胞分泌治疗性单克隆抗体的免疫组化效价在1:32～1:128范围内。优选抗体效价1:64以上的杂交瘤细胞作为生产用治疗性单克隆抗体杂交瘤细胞株。本发明的具体实施方式中，采用自行制备的于2013年5月17日以保藏号为CGMCC No.7613保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）的小鼠杂交瘤细胞系。

在本发明中，可以采用任何适合于杂交瘤细胞生长的液体培养基。本发明实施例中优选的培养液配方是：85%DMEM液、15%犊牛血清，添加200单位/ml青霉素钠和200单位/ml硫酸链霉素。在另一个实施方式中，所用的培养基是无血清杂交瘤细胞培养基，添加200单位/ml青霉素钠和200单位/ml硫酸链霉素。

本发明可以在任何合适的温度下培养种子细胞，温度在20～38℃能满足基本培养要求，优选30～37℃，更优选是33～37℃。在一个具体的实施方式中，培养种子细胞的温度为36～37℃之间效果最佳。优选所用生物培养器的溶氧范围设在50%～90%之间。本发明中，在生物反应器培养过程中，培养种子细胞的培养液的pH值控制在7.0～7.2之间。可以通过在培养过程中添加合适酸或碱而将培养液pH控制在合适的范围内，例如二氧化碳和碳酸氢钠等。

优选的，生物反应器培养温度设在36～37℃之间，生物反应器培养时的流加体积在每天1～5罐体积之间。

当生物反应器中的细胞生长至合适的密度后，收获培养上清液本发明中优选，当细胞密度达到10⁶/ml以上时，即可收获培养上清液。更优选在细胞密度达到2×10⁶/ml以上时，尤其是达到5×10⁶/ml以上时，该点值的细胞浓度是产品效价评价的一个基础标准，收获培养上清液。可以通过多种合适的方法收获上清液，例如离心、过滤、沉淀等方法，这是本领域普通技术人员所熟知的。

本发明的方法进一步包括将收获的治疗性单克隆抗体进行过滤和浓缩的步骤。具体采用如下方法：取无菌检验呈阴性，效价检测合格的单克隆抗体上清液，将蠕动泵连接到单克隆抗体收集瓶，利用0.45μm预滤***过滤除去细胞碎片等杂质，然后连接平板膜包超滤***（截留分子量为30kDa），开启蠕动泵进行单克隆抗体的超滤浓缩，调节进料口和出料口压力在20～30psig，当达到超滤浓缩的倍数时停止超滤浓缩***。

本发明的方法还包括将浓缩的单克隆抗体无菌、定量分装到灭菌的容器中。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1、本发明中用生物反应器替代了利用小鼠制造治疗性犬瘟热病毒单克隆抗体注射液，可解决鼠源外源病源污染的问题，通过原材料和培养条件的严格控制，保证生产出来的治疗性犬瘟热病毒单克隆抗体注射液纯粹，确保治疗性犬瘟热病毒单克隆抗体注射液的安全性；

2、采用本发明方法生产治疗性犬瘟热病毒单克隆抗体产量高，成本低，可显著提高该产品经济效益；

3、本发明生产工艺简单且稳定、易操作，抗体纯度高，批间差异小，质量易控，可显著提高治疗性单克隆抗体质量；

4、本发明方法生产的治疗性犬瘟热病毒单克隆抗体对治疗犬瘟热病毒病有很好的疗效。

杂交瘤细胞保藏信息：

杂交瘤细胞株名称：治疗性犬瘟热病毒单克隆抗体杂交瘤细胞CDV1H2

菌株分类：小鼠杂交瘤细胞系

保藏编号为：CGMCC No.7613

保藏日期：2013年5月17日

保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC）

保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

附图说明

图1为本发明的工艺流程图。

具体实施方式

提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。

实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。

生物材料：

犬瘟热病毒CDV：CDV MD-77株，由农业部兽医诊断中心提供；

犬瘟热病毒98017株，由农业部兽医诊断中心提供；

犬细小病毒AMS-1株，由农业部兽医诊断中心提供；

犬传染性肝炎病毒（ICHV），由农业部兽医诊断中心提供；

呼肠病毒3型（Reo-3），由农业部兽医诊断中心提供；

SP2/0细胞由军事医学科学院惠赠；

Balb/c小鼠购自北京维通利华公司；

申请人声明，以上生物材料均在申请人实验室有保存，自申请日起二十年内可向公众发放用于验证试验。

实施例1分泌抗CDV单克隆抗体的杂交瘤细胞系的获得

1.1使用犬瘟热病毒CDV（CDV MD-77株，HA效价为1：5120，来源于农业部兽医诊断中心）免疫Balb/c小鼠。病毒液与弗氏完全佐剂（CFA）等体积混合乳化，经四肢肌肉多点注射，每只每次注射300ul。首次免疫后15d和30d，分别用同样剂量的病毒液加弗氏不完全佐剂（IFA）进行加强免疫。第二次加强后采血，对血清同时进行ELISA效价检测和免疫酶效价检测。

1.2杂交瘤的制备：

当ELISA效价达到1:20000，同时免疫酶效价达到1：640后，取小鼠脾脏做融合。融合前72h再次加强免疫，经尾静脉注射病毒液1次，50ul/只。制备10块融合板。

融合：取血清免疫组化检测效价最高的小鼠脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞相融合，先把脾脏研磨得到脾细胞悬液，然后与细胞数低十倍的处于对数生长期的SP2/0小鼠骨髓瘤细胞混合，经PEG1500作用1min将两种细胞融合一起，然后把融合细胞液100ml分装到10块96孔板中培养。融合培养基为含HAT和20％FBS的RPMI1640完全筛选培养基。抗原特异性克隆通过ELISA实验筛选，经3次克隆化后，得到稳定的单克隆抗体细胞株。

杂交瘤的筛选：融合后细胞在96孔细胞板上培养10天后，吸取细胞上清做ELISA和免疫酶检测，阳性孔继续克隆化，直至分泌抗体的细胞株能够稳定为止。分泌抗体的细胞株能够稳定的判定为单抗细胞融合后，能保持染色体条数不变，分泌能力不变。

筛选结果：获得1株杂交瘤细胞株，将其命名为CDV1H2，于2013年5月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），其保藏号为CGMCC No.7613。

杂交瘤细胞株的鉴定：符合治疗性犬瘟热病毒单克隆抗体杂交瘤细胞标准，细胞形态呈圆形，染色体平均数在96～103之间，核型应相同。按现行《中华人民共和国兽药典》进行支原体检验，应无支原体生长。按现行《中华人民共和国兽药典》进行无菌检验，应无菌生长。当细胞数达到5×10⁵个/ml以上时，上清液犬瘟热病毒98017株、犬细小病毒AMS-1株、犬传染性肝炎病毒（ICHV）、呼肠病毒3型（Reo-3）的细胞培养飞片，进行免疫酶试验。犬瘟热病毒单克隆抗体与犬瘟热病毒细胞培养飞片为阳性，与其它病毒飞片为阴性。

实施例210L（贝朗）生物反应器培养

（1）将实施例1中的CDV1H2细胞系用细胞培养液吹打、分散传代，在细胞培养液中于37℃继续培养，形成良好单层时，用于继续传代；使细胞总数达到10⁹/500ml以上。

种子细胞的鉴定：当细胞数达到5×10⁵个/ml以上时，上清液犬瘟热病毒98017株、犬细小病毒AMS-1株、犬传染性肝炎病毒（ICHV）、呼肠病毒3型（Reo-3）的细胞培养飞片，进行免疫酶试验。犬瘟热病毒单克隆抗体与犬瘟热病毒细胞培养飞片为阳性，与其它病毒飞片为阴性；分泌单克隆抗体为IgG1类型；

（2）治疗性单克隆抗体的培养生产制备：从工作细胞库中取出分泌治疗性单克隆抗体杂交瘤细胞，采用快速融化法将种子细胞由液氮迅速转入到37℃水浴复苏，以85%DMEM液、15%犊牛血清，再添加200单位/ml青霉素钠和200单位/ml硫酸链霉素的培养液进行细胞扩大培养。

同时，将生物反应器彻底清洗、消毒后开启空气、氧气、氮气和二氧化碳四气体供气装置，设定生物反应器培养条件：温度37℃，pH值7.2，溶氧60%，搅拌速度80rpm/min等备用。

当生产细胞种子增殖达到10⁹/500ml以上，按细胞终浓度值大于2×10⁵/ml接种到生物反应器内的细胞培养液中进行培养，所用培养液是：85%DMEM液、15%犊牛血清，再添加200单位/ml青霉素钠和200单位/ml硫酸链霉素，该细胞培养液的pH值调整为7.0～7.2，培养该杂交瘤细胞的温度在36～37℃之间。

当细胞密度达到1×10⁶/ml以上时，即可设定并开启蠕动泵开始以灌注的方式培养所述杂交瘤细胞。根据细胞密度和效价，调整蠕动泵设定转速，改变灌注体积。本实施例中选用的是当细胞密度达到5×10⁶/ml以上时，逐步提升设定转速，以连续灌流方式培养、获得细胞培养上清液，生物反应器连续灌流培养收集时流加体积每天在1～5罐体积之间。

对收获的细胞培养上清液按现行《中华人民共和国兽药典》附录进行检验，应无细菌、霉菌、支原体生长。培养液对犬安全无副作用，收获培养液犬瘟热中和效价≥1：128。

（3）治疗性单克隆抗体培养液的浓缩与纯化：收获上清培养液用超滤***滤过，根据治疗性单克隆抗体培养液效价确定浓缩倍数。用过滤***去除细胞碎片，收获的液体置-15℃以下保存；

浓缩液的检验：按现行《中华人民共和国兽药典》附录进行检验，应无细菌、霉菌、支原体生长。培养液对犬安全无副作用，收获培养液犬瘟热病毒中和效价≥1：1024。

（4）分装：将浓缩、纯化的治疗性单克隆抗体，无菌、定量分装到灭菌的容器中。分装后迅速加灭菌塞、压盖后即得成品，-15℃以下保存。

成品检验：按现行《中华人民共和国兽药典》附录进行检验，应无细菌、霉菌、支原体生长。对犬安全无副作用，犬瘟热病毒中和效价≥1：1024。

实施例330L（贝朗）生物反应器培养

（1）将实施例1中的CDV1H2细胞系用细胞培养液吹打、分散传代，在细胞培养液中于37℃继续培养，形成良好单层时，用于继续传代；使细胞总数达到3×10⁹/500ml以上。

（2）治疗性单克隆抗体的培养生产制备：从工作细胞库中取出分泌治疗性单克隆抗体杂交瘤细胞，采用快速融化法将种子细胞由液氮迅速转入到37℃水浴复苏，以无血清杂交瘤细胞培养基，再添加200单位/ml青霉素钠和200单位/ml硫酸链霉素作为培养液进行细胞扩大培养。

同时，将生物反应器彻底清洗、消毒后开启空气、氧气、氮气和二氧化碳四气体供气装置，设定生物反应器培养条件：温度37℃，pH值7.2，溶氧80%，搅拌速度80rpm/min等备用。

当生产细胞种子增殖达到3×10⁹/500ml以上，按细胞终浓度的合理范围大于5×10⁵/ml接种到生物反应器中进行细胞培养，所用培养液的配方是：无血清杂交瘤细胞培养基，再添加200单位/ml青霉素钠和200单位/ml硫酸链霉素，pH值调整为7.0～7.2，培养该杂交瘤细胞的温度在36～37℃之间。

当细胞密度达到1×10⁶/ml以上时，即可设定并开启蠕动泵开始以灌注的方式收获培养上清液。根据细胞密度和效价，调整蠕动泵设定转速，改变灌注体积。本实施例中优选在细胞密度达到2×10⁶/ml以上时，逐步提升设定转速，以连续灌流或换液收取方式获得细胞培养上清液，生物反应器连续灌流培养收集时流加体积每天在1～4罐体积之间。

对收获的细胞培养上清液按现行《中华人民共和国兽药典》附录进行检验，应无细菌、霉菌、支原体生长。培养液对犬安全无副作用，收获培养液犬瘟热病毒中和效价≥128。

（3）治疗性单克隆抗体培养液的浓缩与纯化：收获细胞培养上清液用超滤***滤过，根据治疗性单克隆抗体培养液效价确定浓缩倍数。用过滤***去除细胞碎片，收获的液体置-15℃以下保存；

浓缩液的检验：按现行《中华人民共和国兽药典》附录进行检验，应无细菌、霉菌、支原体生长。细胞培养上清液对犬安全无副作用，收获培养液犬瘟热病毒中和效价≥1024

成品检验：按现行《中华人民共和国兽药典》附录进行检验，应无细菌、霉菌、支原体生长。对犬安全无副作用，犬瘟热病毒中和效价≥1024。

实施例4100L（贝朗）生物反应器培养

（1）将实施例1中的CDV1H2细胞系用细胞培养液吹打、分散传代，在细胞培养液中于37℃继续培养，形成良好单层时，用于继续传代；使细胞总数达到10¹⁰/500ml以上。

（2）治疗性单克隆抗体的培养生产制备：从工作细胞库中取出分泌治疗性单克隆抗体杂交瘤细胞，采用快速融化法将种子细胞由液氮迅速转入到37℃水浴复苏，以85%DMEM液、15%犊牛血清、200单位/ml青霉素钠和200单位/ml硫酸链霉素的培养液进行细胞扩大培养。

同时，将生物反应器彻底清洗、消毒后开启空气、氧气、氮气和二氧化碳四气体供气装置，设定生物反应器培养条件：温度37℃，pH值7.2，溶氧90%，搅拌速度80rpm/min等备用。

当生产细胞种子增殖达到10¹⁰/500ml以上，按细胞终浓度值大于8×10⁵/ml接种到生物反应器内的细胞培养液中进行培养，所用培养液的配方是：85%DMEM液、15%犊牛血清、200单位/ml青霉素钠和200单位/ml硫酸链霉素，该细胞培养液的pH值调整为7.0～7.2，培养该杂交瘤细胞的温度在36～37℃之间。

当细胞密度达到1×10⁶/ml以上时，即可设定并开启蠕动泵开始以灌注的方式培养所述杂交瘤细胞。根据细胞密度和效价，调整蠕动泵设定转速，改变灌注体积。本实施例中选用的是当细胞密度达到1×10⁶/ml以上时，逐步提升设定转速，以连续灌流或换液收取方式培养、获得细胞培养上清液，生物反应器连续灌流培养收集时流加体积每天在1～3罐体积之间。

对收获的细胞培养上清液按现行《中华人民共和国兽药典》附录进行检验，应无细菌、霉菌、支原体生长。培养液对犬安全无副作用，收获培养液犬瘟热病毒中和效价≥128

浓缩液的检验：按现行《中华人民共和国兽药典》附录页进行检验，应无细菌、霉菌、支原体生长。培养液对犬安全无副作用，收获培养液犬瘟热病毒中和效价≥1024

成品检验：按现行《中华人民共和国兽药典》附录进行检验，应无细菌、霉菌、支原体生长。对犬安全无副作用，犬瘟热病毒中和效价≥128。

实施例5本发明制备得到的犬瘟热病毒单克隆抗体注射液中和试验

本试验采用固定病毒—稀释血清法中和试验，用于犬瘟热病毒单克隆抗体中和效价的检测。

1材料和方法

1.1新生牛血清

1.2DMEM

1.2.1DMEM母液：1L量DMEM粉末溶于100ml高压灭菌无离子水中，G6滤器过滤。

1.2.2无血清DMEM液：

1.2.3Vero细胞营养液：含10%牛血清的无血清DMEM液；

1.2.4Vero细胞维持液：含2%牛血清的无血清DMEM液；

1.3犬瘟热病毒：CDV MD-77株；

1.4Vero细胞；

1.5细胞培养板。

2试验方法

2.1将Vero细胞培养于25cm2细胞瓶中，待细胞长成单层后按每瓶0.1ml量接种CDV，33℃培养5天后，将对照细胞和接毒细胞分别用胰酶消化，收毒和细胞悬液，测定TCID₅₀；

2.2稀释病毒：将病毒悬液稀释至100TCID₅₀/0.1ml；

2.3稀释单克隆抗体：将待测犬瘟热病毒单克隆抗体注射液作2倍倍比稀释；实施例2制备的3批犬瘟热病毒单克隆抗体；实施例3制备的3批犬瘟热病毒单克隆抗体；实施例4制备的3批犬瘟热病毒单克隆抗体。

2.4体外中和：0.25ml各稀释度犬瘟热病毒单克隆抗体注射液与0.25ml病毒液混合，37℃作用1小时；

2.5在96孔细胞培养板上每孔加40μl Vero细胞悬液；

2.6每孔加入100μl单抗-病毒混合液，每个稀释度加6孔。5%CO2培养箱，37℃培养；

2.7试验同时设0.1、1、100TCID50病毒对照、Vero细胞对照、犬瘟热病毒单克隆抗体注射液原液对照，各4孔；

2.8待细胞长成单层，换无血清DMEM培养液，每日观察细胞病变，按Reed和Muench氏法计算结果。

3结果：

9批犬瘟热单克隆抗体中和效价

	批次	中和效价
			实例1	20120301	1﹕2048
实例1	20120302	1﹕1024
			实例1	20120303	1﹕1024
实例2	20120401	1﹕1024
			实例2	20120402	1﹕2048
实例2	20120403	1﹕1024
			实例3	20120501	1﹕1024
实例3	20120502	1﹕1024
			实例3	20120503	1﹕1024

经过固定病毒—稀释血清法对实例2、3、4生产的各3批犬瘟热病毒单克隆抗体进行了中和效价的检测，结果表明实施例2，3，4制备的犬瘟热病毒单克隆抗体中和效价均达到1:1024，效价合格。

实施例6本发明制备得到的犬瘟热病毒单克隆抗体注射液对瘟热病毒强毒人工感染犬的疗效研究

1实验材料

1.1犬瘟热病毒种毒：CDV98017病毒培养液，病毒效价为10⁶TCID₅₀/ml。

1.2实验动物

8周龄断奶比格犬90只，精神状态和饮食欲正常。

1.3受试药物及其他试剂

1.3.1实施例2中制备的3批犬瘟热病毒单克隆抗体注射液，批号分别为：20120301（中和效价1﹕2048）、20120302(中和效价1﹕1024)、20120303(中和效价1﹕1024)。经过物理性状、pH值、活性、无菌、支原体、外源病毒、安全等检验合格后用于试。由北京世纪元亨动物防疫技术有限公司提供。

1.3.2实施例3中制备的3批犬瘟热病毒单克隆抗体注射液，批号分别为：20120401（中和效价1﹕1024）、20120402(中和效价1﹕2048)、20120403(中和效价1﹕1024)。经过物理性状、pH值、活性、无菌、支原体、外源病毒、安全等检验合格后用于试。由北京世纪元亨动物防疫技术有限公司提供。

1.3.3实施例4中制备的3批犬瘟热病毒单克隆抗体注射液，批号分别为：20120501（中和效价1﹕1024）、20120502(中和效价1﹕1024)、20120503(中和效价1﹕1024)。经过物理性状、pH值、活性、无菌、支原体、外源病毒、安全等检验合格后用于试。由北京世纪元亨动物防疫技术有限公司提供。

1.3.4犬瘟热病毒抗体ELISA检测试剂盒，由北京世纪元亨动物防疫技术有限公司提供。

1.3.5生理盐水，由医用药店购买。

2实验方法

2.1接种：90只8周龄健康合格断奶比格犬，实验前采集犬的血清样品进行犬瘟热病毒抗体ELISA试验，检测结果为阴性。以CDV98017病毒培养液按5ml/只的剂量腹腔注射、0.5ml/只的剂量滴鼻，接种8周龄断奶比格犬，接种后连续观察临床症状，早、中、晚各测量一次体温，并观察临床症状，包括精神状态、食欲等，作好记录。待感染犬出现间歇性或持续性发热，体温达39.5℃以上，精神不振，饮食欲减退，眼鼻有浆液性或脓性分泌物，咳嗽、喘等呼吸道症状，或出现抽搐、震颤、麻痹等神经症状，并经犬瘟热病毒抗体ELISA检测试剂盒确认检测阳性。

2.2分组：将接种后第3日至9日之间的发病犬选出60只随机分为12组，每组各5只。再将每日发病犬随机编号，随机抽取发病犬编号进行随机分组，其中第4组发病犬作为对照，不予治疗。

2.3治疗

2.3.1.实施例2制备的单抗注射液

2.3.1.1第1组直接注射犬瘟热病毒单克隆抗体注射液，按1ml/kg剂量肌肉注射20120301批（中和效价为1﹕2048），每日1次，连用3日。

2.3.1.2第2组直接注射犬瘟热病毒单克隆抗体注射液，按0.5ml/kg剂量肌肉注射20120302批（中和效价为1﹕1024），每日1次，连用3日。

2.3.1.3第3组将犬瘟热病毒单克隆抗体注射液与生理盐水按1﹕1体积混合，按0.5ml/kg剂量肌肉注射20120303批（中和效价为1﹕1024），每日1次，连用3日。

2.3.1.4第4组发病犬作为对照，不予治疗。

2.3.2实施例3制备的单抗注射液

2.3.2.1第5组直接注射犬瘟热病毒单克隆抗体注射液，按1ml/kg剂量肌肉注射20120401批（中和效价为1﹕1024），每日1次，连用3日。

2.3.2.2第6组直接注射犬瘟热病毒单克隆抗体注射液，按0.5ml/kg剂量肌肉注射20120402批（中和效价为1﹕2048），每日1次，连用3日。

2.3.2.3第7组将犬瘟热病毒单克隆抗体注射液与生理盐水按1﹕1体积混合，按0.5ml/kg剂量肌肉注射20120403批（中和效价为1﹕1024），每日1次，连用3日。

2.3.2.4对照同2.3.1.4

2.3.3实施例4制备的单抗注射液

2.3.3.1第8组直接注射犬瘟热病毒单克隆抗体注射液，按1ml/kg剂量肌肉注射20120501批（中和效价为1﹕1024），每日1次，连用3日。

2.3.3.2第9组直接注射犬瘟热病毒单克隆抗体注射液，按0.5ml/kg剂量肌肉注射20120502批（中和效价为1﹕1024），每日1次，连用3日。

2.3.3.3第10组将犬瘟热病毒单克隆抗体注射液与生理盐水按1﹕1体积混合，按0.5ml/kg剂量肌肉注射20120503批（中和效价为1﹕1024），每日1次，连用3日。

2.3.3.4对照同2.3.1.4

观察10日。计算发病犬康复比率。以实验犬精神、食欲、体温恢复正常为康复标准。

3结果

人工感染后三个四组试验犬全部发病，通过3批犬瘟热病毒单克隆抗体注射液的治疗，其治愈率达到100%。治疗后第5天的结果见表4，5，6。

表4实施例2制备的犬瘟热病毒单克隆抗体注射液治疗效果测定结果

组别	试验犬条数	感染剂量	治疗单抗批号	治愈
					第1组	5	10⁶TCID₅₀/1.0ml	20120301	5/5
第2组	5	10⁶TCID₅₀/1.0ml	20120302	5/5

第3组	5	10⁶TCID₅₀/1.0ml	20120303	5/5
					第4组	5	10⁶TCID₅₀/1.0ml	生理盐水	0/5

第1组、第2组和第3组犬治愈达100%，第4组空白对照犬症状逐渐加剧，其中1只犬于感染后7日死亡，1只于感染后10日死亡。

表5实施例3制备的犬瘟热病毒单克隆抗体注射液治疗效果测定结果

第1组、第2组和第3组犬治愈达100%，第4组空白对照犬症状逐渐加剧，其中2只犬于感染后7日死亡，1只于感染后10日死亡。

表6实施例4制备的犬瘟热病毒单克隆抗体注射液治疗效果测定结果

本发明实施例2，3，4制备的犬瘟热病毒单克隆抗体注射液治疗实验犬中的3组犬治愈均达100%，第4组空白对照犬症状逐渐加剧，其中1只犬于感染后7日死亡，3只于感染后10日死亡。

4分析与讨论

试验结果表明，三个实施例方法分别制备的3批犬瘟热病毒单克隆抗体注射液对发生瘟热病毒病的犬治疗3天后临床症状明显缓解，治愈达到100%。

以上通过具体实施例解释了本发明，但本发明不限于此。凡根据本发明的精神实质所做的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种生产治疗性犬瘟热病毒单克隆抗体的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(2)再接种到生物反应器内的细胞培养液中进行培养；

(3)收获杂交瘤细胞所生成的治疗性犬瘟热病毒单克隆抗体；

所述杂交瘤细胞的保藏号为：CGMCC No.7613。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞培养液的配方是：85％DMEM液、15％犊牛血清、添加200单位/ml青霉素钠和200单位/ml硫酸链霉素；或无血清杂交瘤细胞培养基，添加200单位/ml青霉素钠和200单位/ml硫酸链霉素。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，接种密度是1×10⁵～1×10⁶/ml。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，接种密度是2×10⁵～8×10⁵/ml，其中步骤(2)中采用批式、连续灌流或换液收取方式在生物反应器中培养所述杂交瘤细胞。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，接种密度是4×10⁵～5×10⁵/ml，培养所述杂交瘤细胞的培养温度在36～37℃之间，所述细胞培养液的pH值为7.0～7.2，所述生物反应器的溶氧范围设为50％～90％。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，当采用连续灌流方式培养杂交瘤细胞时，流加体积为每天1～5罐体积。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，还包括如下步骤：将步骤(3)收获的生产治疗性犬瘟热病毒单克隆抗体进行浓缩与纯化，再无菌、定量分装到灭菌的容器中。

8.权利要求1-7任一所述的方法生产的治疗性犬瘟热病毒单克隆抗体。

9.一种杂交瘤细胞株，其保藏号为CGMCC No.7613。