CN110376388B

CN110376388B - 一种副猪嗜血杆菌抗体检测方法及其试剂盒

Info

Publication number: CN110376388B
Application number: CN201910756529.9A
Authority: CN
Inventors: 范红结; 张鹏云; 周红; 蔺辉星
Original assignee: Nanjing Changji Biotechnology Co ltd; Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Changji Biotechnology Co ltd; Nanjing Agricultural University
Priority date: 2019-08-16
Filing date: 2019-08-16
Publication date: 2021-10-19
Anticipated expiration: 2039-08-16
Also published as: CN110376388A

Abstract

本发明公开了一种新型副猪嗜血杆菌抗体间接ELISA检测方法，涉及抗体的检测领域，尤其涉及利用一种重组截短蛋白P2检测副猪嗜血杆菌抗体的间接ELISA检测方法及其试剂盒。这种副猪嗜血杆菌间接ELISA检测方法通过截短表达一种重组副猪嗜血杆菌外膜蛋白P2，并以该蛋白作为包被抗原，并通过对ELISA反应条件、检测方式和临界值确定方式的优化；能够实现对副猪嗜血杆菌抗体的准确检测，具有较好的特异性和敏感性；有效解决了在抗体检测过程中本底过高的问题；并较大程度降低了检测成本。

Description

一种副猪嗜血杆菌抗体检测方法及其试剂盒

技术领域

本发明涉及兽医学领域。具体而言，本发明涉及一种快速检测副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS)抗体的ELISA检测方法及其检测试剂盒。

背景技术

副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS)能引起猪的副猪嗜血杆菌病，该病临床症状为多发性关节炎、浆膜炎、脑膜炎，常在仔猪保育阶段发病，死亡率可达50％。随着养猪业规模的迅速扩大和养猪模式的改变，近几年本病流行趋势日趋严重，给我国养猪业带来了巨大的经济损失。对副猪嗜血杆菌血清抗体进行检测，可准确诊断猪是否曾受到该菌感染，并评价相关疫苗的免疫保护效果。

间接ELISA检测方法具有敏感性高，特异性强等特点，是目前血清抗体检测的最主要的方法。目前，国外生产的商品化的检测副猪嗜血杆菌抗体的试剂盒，价格异常昂贵，平均每个样品检测成本接近100元，让养殖企业望而却步。国内尚无商品化的检测副猪嗜血杆菌抗体的试剂盒。同时，文献报道的在研的副猪嗜血杆菌抗体检测方法的检测结果均不甚理想。因此，挖掘新型抗体检测靶点、建立准确性高的抗体检测方法对副猪嗜血杆菌的诊断以及相关疫苗的免疫效果评价具有重要意义。

P2蛋白是副猪嗜血杆菌的外膜蛋白，存在于所有血清型的副猪嗜血杆菌中，在属内的同源性可达到95％以上，属间与其他细菌的同源性菌在50％以下。因此，外膜蛋白P2是检测副猪嗜血杆菌抗体的理想抗原。

基于上述考虑，本发明人通过大量试验，通过截短表达不同片段大小的P2蛋白，作为包被抗原，建立了副猪嗜血杆菌抗体间接ELISA检测方法。通过特异性、敏感性检测及优化，筛选出优选的P2蛋白截短片段。以副猪嗜血杆菌的外膜蛋白P2基因为目标，截短扩增其N端795bp，利用大肠杆菌进行原核表达，经蛋白纯化后，获得重组P2蛋白截短蛋白。并在此基础上对间接ELISA反应条件进行优化，开发出一种副猪嗜血杆菌抗体间接ELISA检测试剂盒。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测副猪嗜血杆菌抗体的间接ELISA检测方法及其试剂盒，能够解决目前国内没有商品化副猪嗜血杆菌抗体检测试剂盒的现状，本发明还能够解决当前副猪嗜血杆菌抗体检测方法特异性不理想的问题。

本发明具体技术方案如下：

本发明的第一个目的是提供一种检测副猪嗜血杆菌抗体的间接ELISA检测试剂盒，所述试剂盒采用截短表达和纯化的副猪嗜血杆菌外膜重组蛋白P2作为包被抗原包被的酶标板，所述副猪嗜血杆菌截短外膜重组蛋白P2的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，截短表达的P2蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

进一步的，所述重组蛋白P2的制备方法为：

(1)以副猪嗜血杆菌血清5型菌株的基因组DNA为模板，设计一对特异性引物P2F/P2R进行扩增：

P2F：5’-CGGGATCCACAGTTTATGAAAATGAAG-3’(SEQ ID NO.3)；

P2R：5’-GCGTCGACTCTTGCGCCAGTTCTTACG-3’(SEQ ID NO.4)；

(2)将PCR产物回收后用BamH I和Sal I进行双酶切，将酶切片段***到质粒pET-28a的BamH I和Sal I酶切位点之间构建原核表达质粒pET-28a-P2；

(3)将构建的原核表达质粒pET-28a-P2转化BL21表达菌获得重组表达菌，IPTG诱导其表达目的蛋白；

(4)将菌液离心收集沉淀，将沉淀重溶于PBS中，经超声破菌后离心取沉淀获得重组蛋白P2包涵体；

(5)将得到的重组蛋白P2包涵体采用His标签亲和层析的方法进行纯化，得到重组蛋白P2作为检测抗原。

进一步的，重组蛋白P2的包被浓度为4μg/mL，所述包被液为碳酸盐缓冲液(pH9.6)。

进一步的，所述试剂盒还包含封闭液，所述封闭液为2％的明胶。

进一步的，所述试剂盒还包含待检血清、阳性参照血清(即，标准阳性对照血清)、阴性参照血清(即，标准阴性对照血清)、酶结合物、洗涤液、显色液和终止液。

进一步的，所述样品稀释液为PBST，酶结合物为HRP标记的山羊抗猪IgG，洗涤液为PBST，显色液为TMB显色液，终止液为2mol/L的硫酸溶液。

本发明的第二个目的是提供一种新型副猪嗜血杆菌抗体间接ELISA检测方法，包括以下步骤：

(1)包被：以碳酸盐缓冲液(pH9.6)为包被液将氨基酸序列如SEQ ID NO.2的重组蛋白P2(即含抗原)稀释为4μg/mL，在酶标板奇数列各孔均加入100μL稀释的重组蛋白P2；同时在酶标板偶数列各孔均加入100μL包被液作为空白对照(不含P2蛋白，即不含抗原)，4℃包被过夜，具体的，包被12-16h；

(2)封闭：甩干酶标板中的液体，用PBST洗4遍，每遍每孔均加入300μL，静置5min，最后一遍后甩干孔中液体，向每孔中加入250μL的2％明胶封闭液，37℃封闭2h；

(3)待检血清孵育：甩干酶标板中的液体，用PBST洗4遍，每遍每孔均加入300μL，静置5min，最后一遍后甩干孔中液体，

分别设置标准阳性对照孔(含抗原)、标准阳性对照孔(不含抗原)、标准阴性对照孔(含抗原)、标准阴性对照孔(不含抗原)和待检血清孔(含抗原)、待检血清孔(不含抗原)，

所述标准阳性对照孔为向两组奇数孔和偶数孔(某些特定的实施例中，为向A1(第1行、第1列)、A2(第1行、第2列)和B1(第2行、第1列)、B2(第2行、第2列孔)中分别加入以PBST作100倍稀释的标准阳性对照血清100μL，所述两组奇数孔中得到两组标准阳性对照孔(含抗原)(即某些特定的实施例中的A1、B1)，所述两组偶数孔中得到两组标准阳性对照孔(不含抗原)(即某些特定的实施例中的A2孔、B2孔)；

标准阴性对照孔为向另两组奇数孔和偶数孔(某些特定的实施例中，为向C1(第3行、第1列)、C2(第3行、第2列)和D1(第4行、第1列)、D2(第4行、第2列孔)中分别加入以PBST作100倍稀释的标准阴性对照血清100μL，所述两组奇数孔中得到两组标准阴性对照孔(含抗原)(即某些特定的实施例中的C1、D1)，所述两组偶数孔中得到两组标准阴性对照孔(不含抗原)(即某些特定的实施例中的C2、D2)；

所述待检血清孔为向其余的奇数孔和偶数孔(某些特定的实施例中，为向E1、E2；F1、F2；G1、G2……孔)中分别加入相应的100μL以PBST作100倍稀释的待检血清，得到待检血清孔(含抗原)和待检血清孔(不含抗原)；

上述样品37℃孵育1h；

(4)二抗孵育：甩干酶标板中的液体，用PBST洗4遍，每遍每孔均加入300μL，静置5min，最后一遍后甩干孔中液体，向每孔中加入100μL的以PBST作10000倍稀释的HRP标记的羊抗猪IgG，37℃孵育1h；

(5)显色：甩干酶标板中的液体，用PBST洗4遍，每遍每孔均加入300μL，静置5min，最后一遍后甩干孔中液体，向每孔中加入100μL的TMB显色液，37℃避光显色15min，再向各孔中分别加入50μL的终止液，所述终止液为2mol/L的硫酸溶液，15min以内在酶标仪上读其OD₄₅₀数值；

(6)结果计算：标准阳性对照检测值分别为P[OD₄₅₀(含抗原)]和P[OD₄₅₀(不含抗原)]，待检血清的检测值为S[OD₄₅₀(含抗原)]和S[OD₄₅₀(不含抗原)]，

所述P[OD₄₅₀(含抗原)]为两组标准阳性对照孔(含抗原)的OD₄₅₀平均值，(某些特定的实施例中，为A1孔OD₄₅₀和B1孔OD₄₅₀的平均值)；

所述P[OD₄₅₀(不含抗原)]为两组标准阳性对照孔(不含抗原)的OD₄₅₀平均值；(某些特定的实施例中，为A2孔OD₄₅₀和B2孔的OD₄₅₀平均值)。

所述S[OD₄₅₀(含抗原)]为各奇数待检血清孔的OD₄₅₀，(某些特定的实施例中，为E1、F1、G1……孔各孔的OD₄₅₀值)；

所述S[OD450(不含抗原)]为各偶数待检血清孔的OD₄₅₀；(某些特定的实施例中，为E2、F2、G2……孔各孔的OD₄₅₀)。

通过其计算各自的校正值分别为：

标准阳性血清校正值＝ΔP[OD₄₅₀(含抗原)-OD₄₅₀(不含抗原)]

待检血清校正值＝ΔS[OD₄₅₀(含抗原)-OD₄₅₀(不含抗原)]

再计算每种待检血清的比率R，具体为：

通过比率R的大小判定样品阴阳性。

所述R为每份待检血清的检测校正值与标准阳性血清校正值的比值，其中S表示待检血清，P表示准阳性血清的平均值。

当待检血清比率R≥0.275时，待检血清中的副猪嗜血杆菌抗体检测结果判定为阳性；当待检血清比率R＜0.275时，待检血清中的副猪嗜血杆菌抗体检测结果判定为阴性。

进一步的，所述步骤(6)的结果计算还包括计算标准阴性血清的比率R，具体为：

标准阴性对照检测值分别为N[OD₄₅₀(含抗原)]和N[OD₄₅₀(不含抗原)]，

所述N[OD₄₅₀(含抗原)]为两组标准阴性对照孔(含抗原)的OD₄₅₀平均值，(某些特定的实施例中，为C1孔OD₄₅₀和D1孔OD₄₅₀的平均值)；

所述N[OD₄₅₀(不含抗原)]为两组标准阴性对照孔(不含抗原)的OD₄₅₀平均值，(某些特定的实施例中，为C2孔OD₄₅₀和D2孔OD₄₅₀的平均值)；

通过其计算各自的校正值分别为：

所述标准阴性校正值＝ΔN[OD₄₅₀(含抗原)-OD₄₅₀(不含抗原)]；

所述标准阳性校正值＝ΔP[OD₄₅₀(含抗原)-OD₄₅₀(不含抗原)]；

再计算标准阴性血清的比率R，具体为：

所述标准阴性血清的比率R应小于0.275，否则试验结果不可靠，需重做。

进一步的，检测时所有标准阴性血清、标准阳性血清和待检血清均做不包被抗原孔的空白对照。

进一步的，步骤(1)所述包被液为0.05mol/L碳酸盐缓冲液(pH＝9.6)，所述包被时间为12-16h。

本发明的有益效果是：

本发明的检测副猪嗜血杆菌抗体的检测方法及其试剂盒，可诊断动物是否受到副猪嗜血杆菌感染，也可以判断副猪嗜血杆菌疫苗的免疫保护效果，该试剂盒具有较高的特异性和重复性，本发明可最大限度降低假阳性出现率，避免肠杆菌科其他细菌抗原给检测带来的干扰。与目前在兽医临床中使用较多的副猪嗜血杆菌抗体玻板凝集检测方法相比，本发明具有更高的灵敏度与准确性，同时极大的降低了检测成本。

附图说明

图1目的基因P2的PCR扩增。

M：DL2000 DNA Maker；1：阴性对照；2，3：目的基因P2的PCR扩增产物。

图2重组P2蛋白原核表达。

M：Protein Maker；1：pET-28a空载对照；2：目的蛋白P2原核表达。

图3重组P2蛋白纯化。

M：蛋白Marker；1：纯化重组P2。

图4ROC曲线。

图5本发明实施例所用酶标板示意图。

具体实施方式

提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，而决不对本发明的内容和保护范围构成任何限制。除另有说明外，本申请中的所有科技术语都具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解相同的含义。本申请中引用的任一专利、专利申请和出版物在此引入作为参考。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常采用常规条件例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的方法。

实施例1：副猪嗜血杆菌截短P2蛋白的原核表达

1.1目的基因P2的扩增

根据副猪嗜血杆菌Nagasaki株(GenBank:CP018034.1)P2基因序列，设计一对针对P2基因的克隆引物P2F/P2R，在引物的5’端分别含有限制性内切酶BamH I和Sal I的酶切位点以及保护性碱基，引物用Primer Premier 5.0软件设计，并由南京金斯瑞生物公司合成，引物序列如下：

P2F：5’-CGGGATCCACAGTTTATGAAAATGAAG-3’(SEQ ID NO.3)；

P2R：5’-GCGTCGACTCTTGCGCCAGTTCTTACG-3’(SEQ ID NO.4)；

以副猪嗜血杆菌血清5型菌株的基因组DNA为模板，副猪嗜血杆菌血清5型菌株可从“中国兽医微生物菌种保藏管理中心”等商业途径购买得到。本实施例以副猪嗜血杆菌临床分离菌株HPS5-SQ株(本实验室从临床发病猪体内分离)基因组为模板，经94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，共进行30个循环；然后72℃延伸10min的PCR循环后，得到大小为795bp的目的基因条带(图1)。

1.2原核表达质粒的构建

将PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后，紫外灯下切割目的条带，用DNA快速纯化试剂盒回收凝胶中的目的片段。将回收的PCR产物用BamH I和Sal I进行双酶切，提取质粒pET-28a，进行双酶切。并将酶切后的产物用T4 DNA连接酶进行连接。将连接产物转化到DH5α大肠杆菌感受态细胞中，通过PCR鉴定和双酶切鉴定，确定了原核表达质粒pET-28a-P2构建成功。

1.3目的蛋白的诱导表达

将pET-28a-P2质粒转化入大肠杆菌BL21，将含有pET-28a-P2质粒的BL21表达菌接种于LB+Kan固体培养基，挑取单菌落接种于2mL LB+Kan液体培养基中，37℃恒温培养过夜，将过夜培养的菌1:100接种于50mL LB+Kan液体培养基中，37℃振荡培养至OD₆₀₀为0.4-0.6，即对数期；加入IPTG(终浓度1mmol/L)诱导表达，在37℃振荡继续培养4h；结束后各取出500μL新鲜菌液于新的2.0mL EP管中，8000r/min离心10min；去上清，加入100μL 1×Proteinloading buffer重悬沉淀，用枪吹打均匀，沸水煮10min，瞬离，最后取10μL进行SDS-PAGE检测(图2)。

确认菌株表达蛋白后，取剩余的经IPTG诱导的菌液，8000r/min离心10min，弃上清，菌体用PBS洗3遍，最后用5mL PBS重悬，并冰浴下进行超声破菌(200W、超声4s停8s，超声40min)。超声破碎完成后12000r/min离心30min，取上清，沉淀用含8M尿素的PBS缓冲液进行溶解，分别取上清和沉淀进行SDS-PAGE检测以确定蛋白的表达形式。

1.4目的蛋白的纯化

在确定了重组蛋白P2以包涵体形式存在后，用包涵体洗涤液将沉淀洗两遍，并用包涵体Binding Buffer于4℃过夜溶解沉淀，离心取上清并用0.45μm滤器过滤。由于重组蛋白P2上有多聚组氨酸(6×His)的标签，故用Ni²⁺柱对重组蛋白接着进行亲和层析纯化。对Ni2+柱先用10倍体积的超纯水进行清洗，再用同体积的Binding Buffer进行平衡，将处理好的蛋白样品加入到平衡过的Ni²⁺柱中，用Binding Buffer处理后再用Elution Buffer将蛋白洗脱下来。通过SDS-PAGE检测确认纯化是否完全。将纯化好的P2蛋白混合在一起，加入20％的甘油，混匀，用BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白浓度的测定，-80℃保存备用(图3)。

实施例2：副猪嗜血杆菌抗体间接ELISA检测方法反应条件的优化

2.1抗原最佳包被浓度和血清最佳稀释度的确定

采用方阵滴定法，用包被液(pH 9.6的0.05mol/L的碳酸盐缓冲液)将纯化的P2蛋白进行2倍比稀释，终浓度分别为1、2、4、8、16μg/mL，每孔加入100μL，每个稀释度重复两排，并加一列不包被抗原的对照，即抗原终浓度为0，置于4℃包被过夜；然后用洗涤液(pH 7.4的PBST溶液)洗涤4次，每次每孔300μL，3min，甩干；每孔加入250μL封闭液(2％明胶)于37℃封闭2h；同上方法进行洗涤；将副猪嗜血杆菌阴性血清和阳性血清用PBST分别作1:50、1:100、1:200、1:400倍比稀释，取100μL分别加入各孔中，于37℃孵育1h；同之前方法洗涤；将PBST稀释的HRP标记山羊抗猪IgG二抗(1:10000稀释)加入到各孔中，每孔100μL，37℃孵育1h；用同之前方法洗涤；最后每孔加入100μL的TMB显色液，于37℃避光显色15min，并向每孔加入50μL的反应终止液(2mol/L的H₂SO₄溶液)，用酶标仪读取在450nm波长处的吸光度值(OD₄₅₀)。

计算相同稀释度的阳性血清和阴性血清校正值之差，根据差值绘制折线图，选择阳性血清测定校正值△P＝P[OD₄₅₀(With Ag)]-P[OD₄₅₀(Without Ag)]值在1.0左右，阴性血清测定校正值△N＝N[OD₄₅₀(With Ag)]-N[OD₄₅₀(Without Ag)]在0.1左右，且阴阳性校正值差值在连续两个稀释度之间变化最大时的上一个稀释度为最佳稀释度，确定为最适抗原包被浓度和血清稀释度。

当重组蛋白P2抗原包被浓度为4μg/mL，血清稀释度为1:100时，符合所述要求。故确定最适抗原包被浓度为4μg/mL，血清最佳稀释度为1:100。

2.2封闭液的确定

按照最佳抗原浓度包被酶标板，4℃过夜且洗涤后，分别加入5组不同的封闭液：组1为1％的BSA、组2为2％的BSA、组3为1％的FBS、组4为5％的脱脂奶粉、组5为2％的明胶。封闭后用最适血清稀释度进行反应，洗涤后再加入HRP标记的山羊抗猪IgG二抗，最后加入TMB显色并加入终止液。读取OD_450nm，比较各组的校正值以及△P/△N值，选择△P/△N值最大时的封闭液最为最适封闭液。

经2％明胶封闭后的ELISA板洗涤后P/N值最大，因此将2％明胶其作为最佳封闭液。

2.3血清最佳反应时间的确定

按照最佳抗原浓度包被酶标板，4℃包被过夜且洗涤后，加入最适封闭液封闭2h，分别加入经过最适稀释倍数稀释的阴性、阳性血清，按照37℃孵育时间不同分成4组：组1为15min、组2为30min、组3为45min、组4为60min。洗涤后再加入HRP标记的山羊抗猪IgG二抗，最后加入TMB显色并加入终止液。读取OD_450nm，比较各组的校正值以及△P/△N值，选择△P/△N值最大时的血清反应时间为最适血清反应时间。

当一抗血清在37℃作用60min时P/N值最高，因此确定待检血清最佳作用时间为60min。

2.4酶标二抗反应浓度及时间的确定

按照最佳抗原浓度包被酶标板，4℃包被过夜且洗涤后，加入最适封闭液封闭2h，分别加入经过最适稀释倍数稀释的阴性、阳性血清作用最佳反应时间，按HRP标记的山羊抗猪IgG二抗的稀释倍数不同分成4组：组1为1:2500、组2为1:5000、组3为1:10000、组4为1:20000。保持其他条件不变，读取并比较各组阴阳性血清的校正值和△P/△N值，选择△P/△N值最大时的稀释倍数作为酶标二抗的最佳反应浓度。

按照最佳抗原浓度包被酶标板，4℃包被过夜且洗涤后，加入最适封闭液封闭2h，分别加入经过最适稀释倍数稀释的阴性、阳性血清作用最佳反应时间，按HRP标记的山羊抗鸡IgG二抗在37℃反应时间不同分为4组：组1为30min、组2为45min、组3为60min、组4为90min。保持其他条件不变，读取并比较各组阴阳性血清的校正值值和△P/△N值，选择△P/△N值最大时的反应时间作为酶标二抗的最佳反应时间。

当HRP标抗的羊抗猪二抗的稀释度为1:1 0000时，其△P/△N值最大，因此确定1:10000为二抗最适稀释度。当HRP标抗的羊抗猪二抗的反应时间为60min时，△P/△N值最大，因此确定当HRP标抗的羊抗猪二抗的最佳反应时间为60min。

2.5底物反应时间的确定

按照最佳抗原浓度包被酶标板，4℃包被过夜且洗涤后，加入最适封闭液封闭2h，分别加入经过最适稀释倍数稀释的阴性、阳性血清作用最佳反应时间，按照确定的二抗最佳稀释倍数和反应时间进行实验，加入TMB显色液后的反应时间分为5组：组1为5min、组2为10min、组3为10min、组4为20min，组5为30min。保持其他条件不变，读取并比较各组阴阳性血清的校正值值和△P/△N值，选择△P/△N值最大时的反应时间作为酶标二抗的最佳反应时间。

当底物反应时间为15min时，其△P/△N值最大，因此确定底物最佳反应时间为15min。

2.6临界值的确定

选择45份副猪嗜血杆菌免疫阳性血清和45份健康猪血清即副猪嗜血杆菌阴性血清，利用建立的ELISA方法检测其比率值，用软件Medcal绘制ROC曲线(接受者操作特征曲线)，确定其临界值为，当比率R≥0.275时判定为阳性，当R＜0.275时判定为阴性。当规定为该临界值时，该检测方法的敏感性为80％，特异性为86.67％，另外该ROC曲线的AUC值为0.923，说明此检测方法效果很好。ROC曲线如图4所示。

2.7根据以上所有优化结果，绘制P2-ELISA方法检测副猪嗜血杆菌抗体的工作表格。

表1 P2-ELISA工作表格

以下实施例具体操作步骤如下：

(1)包被：以0.05mol/L碳酸盐缓冲液(pH9.6)为包被液将重组蛋白P2(即含抗原)稀释为4μg/mL，在酶标板奇数列各孔均加入100μL；同时在酶标板偶数列各孔均加入100μL包被液作为空白对照(不含P2蛋白，即不含抗原)，4℃包被过夜(12-16h)。

(2)封闭：甩干酶标板中的液体，用PBST洗4遍，每遍每孔均加入300μL，静置5min，最后一遍后甩干孔中液体，向每孔中加入250μL的2％明胶封闭液，37℃封闭2h。

(3)待检血清孵育：甩干酶标板中的液体，用PBST洗4遍，每遍每孔均加入300μL，静置5min，最后一遍后甩干孔中液体，向A1、A2孔和B1、B2中分别加入以PBST作100倍稀释的标准阳性对照血清100μL，向C1、C2和D1、D2孔中分别加入以PBST作100倍稀释的标准阴性对照血清100μL，向E1、E2；F1、F2；G1、G2……孔中加入相应的100μL以PBST作100倍稀释的待检血清，37℃孵育1h。

(4)二抗孵育：甩干酶标板中的液体，用PBST洗4遍，每遍每孔均加入300μL，静置5min，最后一遍后甩干孔中液体，向每孔中加入100μL的以PBST作10000倍稀释的HRP标记的羊抗猪IgG，37℃孵育1h。

(5)显色：甩干酶标板中的液体，用PBST洗4遍，每遍每孔均加入300μL，静置5min，最后一遍后甩干孔中液体，向每孔中加入100μL的TMB显色液，37℃避光显色15min，再向各孔中分别加入50μL的终止液(2mol/L的硫酸)，15min以内在酶标仪上读其OD₄₅₀数值。

(6)结果计算：

标准阳性对照检测值为P[OD₄₅₀(含抗原)](A1孔OD₄₅₀和B1孔OD₄₅₀的平均值)和P[OD₄₅₀(不含抗原)](A2孔OD₄₅₀和B2孔OD₄₅₀的平均值)，

待检血清的检测值为S[OD₄₅₀(含抗原)](E1、F1、G1……孔OD₄₅₀值)和P[OD₄₅₀(不含抗原)](E2、F2、G2……孔OD₄₅₀值)，

通过其计算各自的校正值分别为：

阳性校正值＝△P[OD₄₅₀(含抗原)-OD₄₅₀(不含抗原)]

待检血清校正值＝△S[OD₄₅₀(含抗原)-OD₄₅₀(不含抗原)]

再计算每种待检血清的比率R，具体为：

此外，还需计算标准阴性血清的比率R以确定试验结果是否可靠，具体为：

所述N[OD₄₅₀(含抗原)]为C1孔OD₄₅₀和D1孔OD₄₅₀的平均值；

所述N[OD₄₅₀(不含抗原)]C2孔OD₄₅₀和D2孔OD₄₅₀的平均值；

通过其计算各自的校正值分别为：

再计算标准阴性血清的比率R：

实施例3：副猪嗜血杆菌抗体间接ELISA检测试剂盒的敏感性试验

用商业化副猪嗜血杆菌灭活疫苗免疫3周龄断奶仔猪65头，一免后21天进行二免，二免后14天，所有免疫仔猪前腔静脉采血，分离血清，用本发明建立的ELISA方法进行副猪嗜血杆菌抗体检测。同时，将分离到的血清做20、40、80、160、320、640倍稀释，用本发明建立的ELISA方法检测不同稀释度的副猪嗜血杆菌阳性血清，以确认该检测试剂盒的敏感性。

结果显示：65份副猪嗜血杆菌阳性血清结果有63份结果显示为阳性，阳性率达96.9％，结果与商业化抗体检测试剂盒检测结果一致。将副猪嗜血杆菌阳性血清稀释不同倍数后，用本发明建立的ELISA方法进行抗体检测，在稀释倍数为320时依然为阳性。上述结果表明，本发明建立的副猪嗜血杆菌抗体ELISA检测试剂盒具有良好的敏感性。

实施例4：副猪嗜血杆菌抗体间接ELISA检测试剂盒的特异性试验

随机检测40份健康猪血清，用建立好的方法进行ELISA检测，结果显示：40份健康猪血清结果全部为阴性；同时用建立好的方法分别检测猪瘟病毒(HCV)阳性血清、猪伪狂犬病毒(PRV)阳性血清、猪蓝耳病毒(PRRSV)阳性血清、猪***病毒(FMDV)阳性血清、猪圆环病毒2型(PCV2)阳性血清等5种种常见病毒病阳性血清，和猪大肠杆菌(E.coli)阳性血清、猪链球菌(SS)阳性血清、猪沙门氏菌(SM)阳性血清、猪肺炎支原体(MHP)阳性血清、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(APP)阳性血清等5种常见猪细菌病阳性血清，确定是否存在交叉反应，以检验本检测试剂盒的特异性。结果10种血清结果均判定为阴性。

表2特异性试验结果

由此可知：该试剂盒具有较高的特异性。

实施例5：副猪嗜血杆菌抗体间接ELISA检测试剂盒的重复性试验

5.1批内重复性试验

取同一批次制备的副猪嗜血杆菌抗体间接ELISA检测试剂盒分别检测相同的5份副猪嗜血杆菌阳性血清和5份猪阴性血清，进行批内重复性检验。结果表明，不同血清检测结果的变异系数在1％-13％之间，该试剂盒批内重复性良好。

表3批内重复性试验结果

5.2批间重复性试验

取不同批次制备的副猪嗜血杆菌抗体间接ELISA检测试剂盒(批号分别为190427，190501和190504)，在相同条件下检测5份副猪嗜血杆菌阳性血清、5份猪阴性血清，进行批间重复性检验。结果表明，不同批次试剂盒的检测结果的变异系数在3％-11％之间，该试剂盒批间重复性良好。

表4批间重复性试验结果

上述研究结果表明：本试剂盒具有良好的重复性。

实施例6：副猪嗜血杆菌抗体间接ELISA检测试剂盒与商品化进口试剂盒比较试验

用本发明制备的试剂盒检测115份临床猪血清，检测结果为阳性血清51份、阴性血清64份。同时用加拿大Biovet公司生产的副猪嗜血杆菌抗体检测试剂盒对这115份血清进行检测，检测结果为阳性血清49份、阴性血清66份。比较两种检测方法可知，本发明制备的副猪嗜血杆菌抗体ELISA检测试剂盒与进口试剂盒的符合率约为96.5％。

表5符合性比较试验

序列表

<110> 南京农业大学

南京昌吉生物科技有限公司

<120> 一种副猪嗜血杆菌抗体检测方法及其试剂盒

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 795

<212> DNA

<213> 副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis)

<400> 1

acagtttatg aaaatgaagg tacaaaagtt gattttgatg gtcaattgcg tcttctttta 60

gaagaacaag ccacaaaaga gaaaggtcaa tcttcaacac gtggtcacac taacttaaag 120

aataatggtt ctcgtttcgg tatttctatc aaacataata tcaatgagaa tctctacggt 180

tttggtcgtt atgagactcg ccttggccgt aattctgaaa atgctgcagg atggggcgat 240

gttacaacag aatacgctta cgtcggttta ggtggctatg gtcatgaaat ttcttttggt 300

aaacaagctg taatcggtga tagcattggt caagctggtt ttgataaagt atacggtgtt 360

ggtactggtg gaattaaata ttcagcaaac aacacaaaca aaaaaggttt tgatatcctt 420

acttcagatt ctgattcagc aattaactat acctatacag gcattgaagg tttgacgtta 480

ggtgctaact ataatgttgc aaatgagcgt gataagaaga cgggagaagt aaatgtaggt 540

tctactaaat ctggctttgg tttaggtgct aaatacacag ctaagattgc ggaaagtcaa 600

tctgtaactg tggcagcagg ttatactcat gatgactata aatctggagc tgttaataag 660

aaagacaaag atggtgtata ctttggtctt aaatatgtca actctccatt tactgtagct 720

gttgatggtg gtcatggtgt tgtaaaaaca ggtaatgtta aagagaaaat tgacttcgta 780

agaactggcg caaga 795

<210> 2

<211> 265

<212> PRT

<213> 副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis)

<400> 2

Thr Val Tyr Glu Asn Glu Gly Thr Lys Val Asp Phe Asp Gly Gln Leu

1 5 10 15

Arg Leu Leu Leu Glu Glu Gln Ala Thr Lys Glu Lys Gly Gln Ser Ser

20 25 30

Thr Arg Gly His Thr Asn Leu Lys Asn Asn Gly Ser Arg Phe Gly Ile

35 40 45

Ser Ile Lys His Asn Ile Asn Glu Asn Leu Tyr Gly Phe Gly Arg Tyr

50 55 60

Glu Thr Arg Leu Gly Arg Asn Ser Glu Asn Ala Ala Gly Trp Gly Asp

65 70 75 80

Val Thr Thr Glu Tyr Ala Tyr Val Gly Leu Gly Gly Tyr Gly His Glu

85 90 95

Ile Ser Phe Gly Lys Gln Ala Val Ile Gly Asp Ser Ile Gly Gln Ala

100 105 110

Gly Phe Asp Lys Val Tyr Gly Val Gly Thr Gly Gly Ile Lys Tyr Ser

115 120 125

Ala Asn Asn Thr Asn Lys Lys Gly Phe Asp Ile Leu Thr Ser Asp Ser

130 135 140

Asp Ser Ala Ile Asn Tyr Thr Tyr Thr Gly Ile Glu Gly Leu Thr Leu

145 150 155 160

Gly Ala Asn Tyr Asn Val Ala Asn Glu Arg Asp Lys Lys Thr Gly Glu

165 170 175

Val Asn Val Gly Ser Thr Lys Ser Gly Phe Gly Leu Gly Ala Lys Tyr

180 185 190

Thr Ala Lys Ile Ala Glu Ser Gln Ser Val Thr Val Ala Ala Gly Tyr

195 200 205

Thr His Asp Asp Tyr Lys Ser Gly Ala Val Asn Lys Lys Asp Lys Asp

210 215 220

Gly Val Tyr Phe Gly Leu Lys Tyr Val Asn Ser Pro Phe Thr Val Ala

225 230 235 240

Val Asp Gly Gly His Gly Val Val Lys Thr Gly Asn Val Lys Glu Lys

245 250 255

Ile Asp Phe Val Arg Thr Gly Ala Arg

260 265

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cgggatccac agtttatgaa aatgaag 27

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gcgtcgactc ttgcgccagt tcttacg 27

Claims

1.一种检测副猪嗜血杆菌抗体的间接ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒采用截短表达和纯化的副猪嗜血杆菌血清5型临床分离菌株HPS5-SQ株外膜重组蛋白P2作为包被抗原包被的酶标板，

所述副猪嗜血杆菌截短外膜重组蛋白P2的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，截短表达的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.根据权利要求1所述的检测副猪嗜血杆菌抗体的间接ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述重组蛋白P2的制备方法为：

P2F：5’-CGGGATCCACAGTTTATGAAAATGAAG-3’，SEQ ID NO.3；

P2R：5’-GCGTCGACTCTTGCGCCAGTTCTTACG-3’，SEQ ID NO.4；

(5)将得到的重组蛋白P2包涵体采用His标签亲和层析的方法进行纯化，得到重组蛋白P2，作为检测抗原。

3.根据权利要求1所述的检测副猪嗜血杆菌抗体的间接ELISA检测试剂盒，其特征在于，重组蛋白P2的包被浓度为4μg/mL，所述包被液为pH 9.6的碳酸盐缓冲液。

4.根据权利要求1所述的检测副猪嗜血杆菌抗体的间接ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述包被液为pH 9.6的0.05mol/L的碳酸盐缓冲液。

5.根据权利要求1所述的检测副猪嗜血杆菌抗体的间接ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含封闭液，所述封闭液为2％的明胶。

6.根据权利要求1～4任一项所述的检测副猪嗜血杆菌抗体的间接ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含待检血清、阳性参照血清、阴性参照血清、样品稀释液、酶结合物、洗涤液、显色液和终止液。

7.根据权利要求6所述的检测副猪嗜血杆菌抗体的间接ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述样品稀释液为PBST，酶结合物为HRP标记的山羊抗猪IgG，洗涤液为PBST，显色液为TMB显色液，终止液为2mol/L的硫酸溶液。

8.一种基于权利要求1所述间接ELISA检测试剂盒的副猪嗜血杆菌抗体间接ELISA检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)包被：以pH 9.6的碳酸盐缓冲液为包被液将氨基酸序列如SEQ ID NO.2的重组蛋白P2稀释为4μg/mL，在酶标板奇数列各孔均加入100μL；同时在酶标板偶数列各孔均只加入100μL包被液作为空白对照，4℃包被过夜；所述包被时间为12-16h；

分别设置含抗原的标准阳性对照孔、不含抗原的标准阳性对照孔、含抗原的标准阴性对照孔、不含抗原的标准阴性对照孔和含抗原的待检血清孔、不含抗原的待检血清孔，

所述标准阳性对照孔为向两组奇数孔和偶数孔中分别加入以PBST作100倍稀释的标准阳性对照血清100μL，所述两组奇数孔中得到两组含抗原的标准阳性对照孔，所述两组偶数孔中得到两组不含抗原的标准阳性对照孔；

所述标准阴性对照孔为向另两组奇数孔和偶数孔中分别加入以PBST作100倍稀释的标准阴性对照血清100μL，所述两组奇数孔中得到两组含抗原的标准阴性对照孔，所述两组偶数孔中得到两组不含抗原的标准阴性对照孔；

所述待检血清孔为向其余的奇数孔和偶数孔中分别加入相应的100μL以PBST作100倍稀释的待检血清，得到含抗原的待检血清孔和不含抗原的待检血清孔；

上述样品37℃孵育1h；

所述P[OD₄₅₀(含抗原)]为两组含抗原的标准阳性对照孔的OD₄₅₀平均值，

所述P[OD₄₅₀(不含抗原)]为两组不含抗原的标准阳性对照孔的OD₄₅₀平均值；

所述S[OD₄₅₀(含抗原)]为各奇数待检血清孔的OD₄₅₀，

所述S[OD₄₅₀(不含抗原)]为各偶数待检血清孔的OD₄₅₀；

通过其计算各自的校正值分别为：

标准阳性校正值＝△P[OD₄₅₀(含抗原)-OD₄₅₀(不含抗原)]

待检血清校正值＝△S[OD₄₅₀(含抗原)-OD₄₅₀(不含抗原)]

再计算每种待检血清的比率R，具体为：

通过比率R的大小判定样品阴阳性。

9.根据权利要求8所述的副猪嗜血杆菌抗体间接ELISA检测方法，其特征在于，所述包被液为pH 9.6的0.05mol/L的碳酸盐缓冲液。

10.根据权利要求8所述的副猪嗜血杆菌抗体间接ELISA检测方法，其特征在于，检测时所有标准阴性血清、标准阳性血清和待检血清均做不包被抗原孔的空白对照。

11.根据权利要求8所述的副猪嗜血杆菌抗体间接ELISA检测方法，其特征在于，当待检血清比率R≥0.275时，待检血清中的副猪嗜血杆菌抗体检测结果判定为阳性；当待检血清比率R＜0.275时，待检血清中的副猪嗜血杆菌抗体检测结果判定为阴性。

12.根据权利要求8所述的副猪嗜血杆菌抗体间接ELISA检测方法，其特征在于，所述步骤(6)的结果计算还包括计算标准阴性血清的比率R，

所述N[OD₄₅₀(含抗原)]为两组含抗原的标准阴性对照孔的OD₄₅₀平均值，

所述N[OD₄₅₀(不含抗原)]为两组不含抗原的标准阴性对照孔的OD₄₅₀平均值，

通过其计算各自的校正值分别为：

所述标准阴性校正值＝△N[OD₄₅₀(含抗原)-OD₄₅₀(不含抗原)]；

所述标准阳性校正值＝△P[OD₄₅₀(含抗原)-OD₄₅₀(不含抗原)]；

再计算标准阴性血清的比率R：

具体为：

所述标准阴性血清R应小于0.275。