CN102191251A

CN102191251A - 一种在昆虫细胞sf9中表达抗菌肽的方法

Info

Publication number: CN102191251A
Application number: CN 201110073088
Authority: CN
Inventors: 康春涛; 张双全
Original assignee: YANCHENG XINGHAI FEED CO Ltd
Current assignee: YANCHENG XINGHAI FEED CO Ltd
Priority date: 2011-03-25
Filing date: 2011-03-25
Publication date: 2011-09-21

Abstract

本发明涉及生物基因工程领域，公开了一种在昆虫细胞sf9中表达抗菌肽的方法。本发明方法包括如下步骤：(1)将抗菌肽CM4基因克隆入pFastBacHT B载体得到重组质粒pFastBacHTB-ABP；(2)将重组质粒pFastBac HTB-ABP转化DH10Bac大肠杆菌感受态细胞，获得重组杆状病毒穿梭载体Bacmid-ABP；(3)Bacmid-ABP转染Sf9昆虫细胞，获表达抗菌肽的重组病毒。经Western blotting检测，结果表明目的基因在昆虫细胞中获得融合表达。本实验建立的昆虫/杆状病毒表达***为抗菌肽的大量获得提供一条新途径，为进一步的抗菌机理的研究及新药的开发打下工作基础。

Description

一种在昆虫细胞sf9中表达抗菌肽的方法

技术领域

本发明涉及生物基因工程领域，涉及一种在昆虫细胞sf9中表达抗菌肽的方法。

背景技术

抗菌肽是动植物体内分泌的一类小分子活性多肽，一般由15-45个氨基酸组成，在动植物的免疫***中发挥着重要作用。目前，由于抗生素的滥用导致耐药菌株不断增多，人们对抗菌肽的研究投入极大热情。

家蚕抗菌肽属于Cecropin家族中的一个成员，为线性、d-螺旋肽，含有35个氨基酸；抗菌肽具两亲性：N端具有亲水性、C端具有疏水性，同时抗细菌、抗真菌及抗肿瘤作用，且对正常真核细胞无明显毒副作用。

抗菌肽CM4是张双全等从中国家蚕(Bombyx mori)(浙农1号×苏12号)中分离得到的。它是线性的、具有α螺旋两亲的阳离子肽，由35个氨基酸组成，分子量约为3.8KD，有很强的杀菌能力，对细菌，真菌等都有作用且不含甲硫氨酸。从蚕蛹中提取的执菌肽CM4具有较广泛的抗菌和杀伤某些肿瘤细胞的能力，并且不破坏正常细胞。目前已有在大肠杆菌表达***、毕赤酵母表达***中表达抗菌肽CM4的报道，但至今尚未有在昆虫细胞中表达抗菌肽CM4的相关报道。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种在昆虫细胞sf9中表达抗菌肽的方法。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

在昆虫细胞sf9中表达抗菌肽的方法，包括如下步骤：

1)将两端分别包含BamHI和HindIII酶切位点的抗菌肽CM4基因克隆入pFastBacHT B载体的BamHI/HindIII位点间得到重组质粒pFastBac HTB-ABP；

2)将重组质粒pFastBac HTB-ABP转化DH10Bac大肠杆菌感受态细胞，与其中的杆状病毒穿梭载体Bacmid重组，获得***ABP基因的重组杆状病毒穿梭载体Bacmid-ABP；

3)脂质体介导重组杆状病毒穿梭载体Bacmid-ABP转染Sf9昆虫细胞，获表达抗菌肽的重组病毒；

4)培养所述的重组病毒，表达抗菌肽CM4。

其中，步骤1)所述的两端分别包含BamHI和HindIII酶切位点的抗菌肽CM4基因通过如下方法获得：以中国家蚕(Bombyx mori)(浙农1号×苏12号)的总RNA为模板，利用上游引物sABP-F：SEQ ID NO.1，下游引物sABP-R：SEQ ID NO.2通过rPCR扩增得到所述的抗菌肽CM4基因；然后以所述的抗菌肽CM4基因为模板，利用上游引物pFastBacHTB-F：SEQID NO.3，下游引物pFastBacHTB-R：SEQ ID NO.4通过PCR扩增得到两端分别包含BamHI和HindIII酶切位点的抗菌肽CM4基因。

本方法还包含所述的重组杆状病毒穿梭载体Bacmid-ABP的鉴定。

所述的重组杆状病毒穿梭载体Bacmid-ABP的鉴定方法优选PCR鉴定：分别以M13-F：SEQ ID NO.5、M13-R：SEQ ID NO.6和M13-F：SEQ ID NO.5、pFastBacHTB-R：SEQ ID NO.4以及pFastBacHTB-F：SEQ ID NO.3、M13-R：SEQ ID NO.6为引物对重组杆状病毒穿梭载体Bacmid-ABP进行PCR扩增，能够扩增出对应的2471bp、1876bp、740bp目标片段的即为真正含有整合了目的基因的重组杆状病毒穿梭载体Bacmid-ABP。

所述的重组病毒培养基为无血清无抗生素的Sf-900II SFM。

有益效果：

发明人参照CM4序列合成了昆虫细胞偏爱密码子的引物，进而将CM4克隆入pFastBacHTB载体，并进一步获得含ABP基因的重组杆状病毒穿梭载体Bacmid-ABP，通过脂质体介导转染Sf9昆虫细胞，成功实现了抗菌肽CM4基因在昆虫细胞中的表达，为抗菌肽CM4的大量获得提供一条新途径，为进一步的抗菌机理的研究及新药的开发打下工作基础。

本发明首次实现了在昆虫细胞中表达抗菌肽CM4基因，与在毕赤酵母中表达CM4比较的积极作用：

1.在昆虫中表达家蚕抗菌肽CM4，由于与家蚕的种属相近，有望得到后加工完整、生物活性高的CM4；

2.只要获得高滴度的重组CM4的杆状病毒，可直接感染昆虫细胞，易于纯化，易于大规模生产外源蛋白。

附图说明

图1、CM4基因PCR扩增产物；

1：CM4 gene(105bp)，M：Marker 2000。

图2、BamHI/HindIII双酶切鉴定重组表达载体pFastBac HTB-ABP；

1：pFastBac HTB-ABP BamHI/HindIII酶切产物，M：Marker 2000。

图3、Sal I单酶切鉴定重组表达载体pFastBac HTB-ABP；

1：pFastBac HTB；2：Sal I单酶切pFastBac HTB产物；3：Sal I单酶切pFastBac HTB-ABP产物；M：Marker 2000。

图4、PCR鉴定Bacmid-ABP；

1：以M13-F、M13-R为引物扩增Bacmid，2：以M13-F、M13-R为引物扩增Bacmid-ABP，3：以M13-F、pFastBacHTB-R为引物扩增Bacmid，4：以M13-F、pFastBacHTB-R为引物扩增Bacmid-ABP，5：以pFastBacHTB-F、M13-R为引物扩增Bacmid，6以pFastBacHTB-F、M13-R为引物扩增Bacmid-ABP，LaneM：Marker 2000。

图5、正常Sf9细胞。

图6、Bacmid/ABP转染的Sf9细胞。

图7是.重组融合抗菌肽CM4的SDS-PAGE和Western blotting分析；

M泳道：分子量标记；1泳道：未感染的培养液；2泳道：感染的细胞培养液；3泳道：未感染的细胞裂解液；4泳道：感染的细胞裂解液；5泳道：融合抗菌肽的Western blotting结果。

具体实施方式

在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

下面结合具体的制备实施例和应用实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。所用到的引物，均在首次出现时标明，其后所用相同引物，均以首次标明的内容相同。

实施例1pFastBac HT B/ABP表达载体的构建

(1)获得两端分别包含BamH I和HindIII酶切位点的抗菌肽CM4基因：

sABP-F：

5’-CGTTGGAAGATCTTCAAGAAGATCGAGAAGGTGGGTCAGAACATCC

-3’(SEQ ID NO.1)

sABP-R：

5’-GATGGTAGCAGCCTGACCCACCACAGCCACAGCGGGACCAGCCTTC

-3’(SEQ ID NO.2)

斜黑体为互补部分。

以中国家蚕(Bombyx mori)(浙农1号×苏12号)的总RNA为模板，利用上游引物sABP-F：SEQ ID NO.1，下游引物sABP-R：SEQ ID NO.2通过rPCR扩增得到所述的抗菌肽CM4基因(图1)。

以上一步扩增的的抗菌肽CM4基因为模板，利用上游引物pFastBacHTB-F：SEQ ID NO.3，下游引物pFastBacHTB-R：SEQ ID NO.4通过PCR扩增得到两端分别包含BamHI和HindIII酶切位点的抗菌肽CM4基因。

PCR扩增(引入酶切位点和肠激酶切割位点)，引物设计如下：

pFastBacHTB-F：5′-ATCT GACGACGACGACAAGCGTTGGAAGATCTTC-3′

(SEQ ID NO.3) ↑ ↑

BamHI 肠激酶切割位点

pFastBacHTB-R：5′-GCTCGA

TCATTAGTTGATGGTAGCAGCCTG-3’

(SEQ ID NO.4) ↑

HindIII

(2)抗菌肽CM4基因克隆入pFastBacHT B载体

利用BamHI和hindIII分别对步骤(1)扩增得到的两端分别包含BamHI和HindIII酶切位点的抗菌肽CM4基因和pFastBacHT B载体(金思瑞生物科技有限公司)进行双酶切，获得抗菌肽CM4基因目的片段和pFastBacHT B载体线性片段，连接两片段，得到连接产物。

(3)连接产物转化和重组质粒鉴定

将甘油冻存保存的DH5α(北京百亿新创科技有限公司)接种划平板，37℃倒置培养过夜；挑取单克隆至装有3ml LB的试管中，37℃220rpm振摇12h；吸取1ml菌液至1.5ml离心管中，4℃ 12000g离心3min，弃上清；用400μl 0.1mol/l预冷的CaCl₂重悬菌体沉淀，12000g离心3min，弃上清；用200μl 0.1mol/l预冷的CaCl₂再次重悬菌体沉淀，置冰上过夜；将连接液20μl全部加入200μl感受态细菌中，置冰上1h；42℃热休克90sec，迅速置冰中5min；加入800μl 37℃预热的LB培养液；37℃，220rpm振摇1h，离心后全部涂布于含100μg/mlAmp的LB平板，37℃倒置培养过夜。挑取单菌落接种含100μg/ml Amp的LB培养基37℃过夜振荡培养，提取重组质粒进行BamHI/HindIII双酶切鉴定和Sal I单酶切鉴定，结果见图2和图3。酶切验证正确的质粒命名为重组表达载体pFastBac HTB-ABP。

实施例2重组杆状病毒的获得

将pFastBac HTB-ABP转化DH10Bac大肠杆菌感受态细胞(金思瑞生物科技有限公司，其中含有一个杆状病毒穿梭载体简称Bacmid，还有一个辅助质粒)，以获得***ABP基因的重组杆状病毒穿梭载体Bacmid-ABP。

(1)重组pFastBac HT B-ABP转化进入感受态大肠杆菌DH10Bac(转座)

1)取5μl重组表达载体pFastBacHT B-ABP加入100ul感受态大肠杆菌DH10Bac中，轻轻混匀，将离心管放入冰水浴30min。再置于42℃热休克45s，然后迅速移至冰水中放置2min；

2)在该管中加入灭菌的LB液体培养基900ul，37℃摇床220r/min振荡培养4h，使之发生转座；

3)用LB培养液制备10倍系列的细胞稀释液，以10^-1、10^-2，和10^-3，不同的稀释度稀释，各取100μl分别涂布于含50μg/ml卡那霉素、7μg/ml庆大霉素、10μg/ml四环霉素、100μg/ml X-gal，and 40μg/ml IPTG的LB平板；

4)将平皿于37℃倒置培养48h，观察蓝白斑的生长情况。发生转座后的DH10Bac细菌因其LacZ基因被***失活，而使含有重组Bacmid的大肠杆菌菌落成为白色。

(2)重组杆状病毒穿梭载体Bacmid-ABP的提取

阳性表形的确定：

1)用10μl的枪头轻轻挑取10个分隔较大的白色菌落，划线于同样含有卡那霉素、庆大霉素、四环霉素、X-gal、IPTG的LB平板上，37℃培养过夜；

2)如果所得菌落仍然均为白斑，说明所挑菌落均为真正含有整合了目的基因的阳性克隆Bac-ABP；

3)从再划线平板上挑取阳性白色单克隆进含卡那霉素、庆大霉素、四环霉素的液体培养液中，37℃摇床225rpm振荡培养24h。

重组杆状病毒的提取：

1)将此培养液分装至1.5ml的Eppendorf管中，14000g离心1min沉淀菌体；

2)弃净上清，加入300μl溶液I(15mM Tris-HCl，pH 8.0，10mM EDTA，100μg/ml RNaseA，过滤除菌)，重悬沉淀；

3)加入300μl溶液II(0.2N NaOH，1％SDS，过滤除菌)，温和颠倒混匀，室温放置5min，使细菌裂解；

4)缓慢逐滴加入300μl 3M(pH5.5)的乙酸钾溶液，加入过程中轻微摇动，一层厚厚的白色菌体蛋白和基因组DNA慢慢出现，将样品置于冰上5-10min，14000g离心10min；

5)同时标好另一干净的Eppendorf管，加入800μl异丙醇，轻轻将4)中所得上清转移至已加好异丙醇的新管中，注意不要混有任何白色沉淀，将离心管颠倒数次混匀，置于冰上5-10min，14000g离心15min，弃上清；

6)分别用75％和100％的乙醇各洗涤一次，14000g离心5min；

7)弃上清，室温风干(在细胞室内无菌条件下)5-10min，得表达抗菌肽的重组杆状穿梭载体病毒Bacmid-ABP；

8)溶于40μl 1×TE缓冲液(10mmol Tris-HCI，lmmol EDTA，pH8.0)，4℃保存。

(3)重组杆状穿梭载体病毒Bacmid-ABP的PCR鉴定

Bacmid中的M13引物配对位点位于mini-attTn7两侧，以M13上游引物和M13下游引物扩增重组杆状穿梭载体病毒Bacmid-ABP，以野生的杆状病毒(金思瑞生物科技有限公司)为对照。

M13-F：5′-GTTTTCCCAGTCACGAC-3′(SEQ ID NO.5)；

M13-R：5′-CAGGAAACAGCTATGAC-3′(SEQ ID NO.6)；

pFastBacHTB-F：5′-ATCT

GACGACGACGACAAGCGTTGGAAGATCTTC-3’；

(SEQ ID NO.3)。

pFastBacHTB-R：5′-GCTCGAAAGCTTTCATTAGTTGATGGTAGCAGCCTG-3’(SEQ IDNO.4)。

分别以M13-F、M13-R和M13-F、pFastBacHTB-R以及pFastBacHTB-F、M13-R为引物，对重组杆状穿梭载体病毒Bacmid-ABP进行PCR鉴定，结果见图4。由图4可见对于重组杆状穿梭载体病毒Bacmid-ABP，以M13-F、M13-R为引物，可扩增出2471bp的条带，以M13-F、pFastBacHTB-R为引物，可扩增出1876bp的条带，以pFastBacHTB-F、M13-R为引物，可扩增出740bp的条带。

实施例3重组杆状穿梭载体病毒Bacmid-ABP转染Sf9细胞

(1)转染sf9单层细胞

在35mm的六孔板中每孔以2ml的无血清无抗生素的Sf-900 II SFM培养液接种9×10⁵个Sf9细胞(南京金思瑞生物科技有限公司)，培养过夜，待细胞密度长至60％-70％时进行转染。在无菌的Eppendorf管中配制以下溶液，

A液：5μl重组Bacmid-ABP加100μl无血清无抗生素的Sf-900 II SFM；

B液：6μl脂质体转染试剂Cellfectin加100μl无血清无抗生素的Sf-900 II SFM；然后将A液和B液轻轻混合均匀，室温放置15-45min。同时去除六孔板中每个孔中的培养液，以无血清无抗生素的Sf-900II SFM洗涤一遍，弃净培养液。在上述混合液中补加800μl无血清无抗生素的Sf-900II SFM，至总体积约1ml，再吸入每个孔中，置于27℃孵育5h。5h后去除DNA混合液，每孔加入2ml Sf-900II SFM，在27℃培养箱中培养72h之后观察细胞病变状况，细胞病变前后对比见图5和图6。

(2)重组杆状病毒的获得与扩大

待被转染的细胞出现明显病变状况后，在每个孔中收集含有重组杆状病毒颗粒的培养上清液，500g离心5min去除细胞和大碎片，将上清分成小份避光4℃保存，此为P1代病毒，可用于再次感染Sf9单层细胞以获。

为获高滴度病毒，可用以下公式计算获某一特定MOI时所需接种的P1代病毒：

P(k)＝1-P(0)

MOI＝-InP(0)

P(k)为被感染细胞的百分率，P(0)为未被感染细胞的百分率，

MOI(multiplicity ofinfection)称感染复数，是感染时病毒与细胞数量的比的值。

以MOI为0.1进行病毒扩增，在六孔板中种2×10⁶细胞/孔，27℃培养，1h后镜检细胞贴壁情况，加入适量P1于每孔，在27℃培养箱中培养48h，48h后镜检细胞病变状况，从每孔中收集2ml含病毒颗粒的培养基，500g离心5min取上清，4℃避光保存，此即为P2代病毒。可以同样方法扩增获P3代病毒。

实施例4目的蛋白的表达及其鉴定

(1)目的蛋白的表达

1)以6×10⁵/ml的Sf9细胞转接培养，细胞贴壁30min以上；

2)去除无血清无抗生素的Sf-900 II SFM培养液，加入新鲜培养液，以MOI为10进行蛋白表达，向每孔中加入P3代重组病毒100μl，在27℃中培养；

3)在细胞出现明显病变后(图6)收细胞分析蛋白表达情况。

(2)表达产物分布的确定

收细胞和培养液上清，其中培养液上清10000g离心10min，收上清，细胞以PBS洗两遍，再以细胞裂解液(RIPA buffer)冰上裂解0.5小时，用细胞刮子将细胞刮下，4℃10000g离心取上清。取10μl上清液加入等量的2×上样缓冲液，沉淀用500μl 1×上样缓冲液重悬后取10μl，恒压100V进行12％SDS-PAGE，考马斯亮蓝R250染色显带，结果见图7(泳道1～4)。2×上样缓冲液配方：1.0M Tris(pH＝6.8)0.48ml，100％甘油2ml，10％SDS 1.6ml，β-巯基乙醇0.4ml，溴酚蓝0.02g，水15.52ml。

(3)重组抗菌肽的鉴定

取样品10μl，加入等量含β-巯基乙醇的2×上样缓冲液，恒压100V进行12％SDS-PAGE，转膜，利用His抗体进行检测。

Western blotting的操作流程如下：

1)准备：取出电泳结束的PAGE胶(图7，泳道4)，切去浓缩胶及下面多余的部分，置于1XTransfer buffer中平衡5分钟；同时，膜，滤纸及海绵均浸泡于1XTransfer buffer中，5分钟；

2)转膜：在转移盒上依次铺上在transfer buffer中浸湿的海绵和滤纸后，平铺SDS-PAGE的分离胶部分，上面再依次放上NC膜，两层滤纸和海绵，赶去气泡；然后恒流250mA，冰浴转膜90分钟；转膜结束后取出NC膜，将之于TBST中摇洗10min；

3)封闭：将NC膜于20ml blocking buffer中涤荡1h后，15ml TBST中摇洗3次，每次5min；

4)孵一抗：弃TBST，加入封闭液稀释的一抗鼠抗His抗体4℃孵育过夜，TBST摇洗三次，每次5min；

5)孵二抗：再与HRP标记的羊抗鼠IgG室温孵育1h，TBST摇洗三次，每次5min；

6)显色：在目的条带附近用TMB显色，结果见图7，泳道5。由图7可见，在7.4kD处有一条特异蛋白带，说明目标蛋白抗菌肽CM4得到表达，并且表达蛋白大部分都存在细胞裂解液上清中。

Claims

1.在昆虫细胞sf9中表达抗菌肽的方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)将两端分别包含BamHI和HindIII酶切位点的抗菌肽CM4基因克隆入pFastBacHTB载体的BamHI/HindIII位点间得到重组质粒pFastBac HTB-ABP；

(2)将重组质粒pFastBac HTB-ABP转化DH10Bac大肠杆菌感受态细胞，与其中的杆状病毒穿梭载体Bacmid重组，获得***ABP基因的重组杆状病毒穿梭载体Bacmid-ABP；

(3)脂质体介导重组杆状病毒穿梭载体Bacmid-ABP转染Sf9昆虫细胞，获表达抗菌肽的重组病毒；

(4)培养所述的重组病毒，表达抗菌肽CM4。

2.根据权利要求1所述的在昆虫细胞sf9中表达抗菌肽的方法，其特征在于步骤1)所述的两端分别包含BamHI和HindIII酶切位点的抗菌肽CM4基因通过如下方法获得：以中国家蚕浙农1号×苏12号的总RNA为模板，利用上游引物sABP-F：SEQ ID NO.1，下游引物sABP-R：SEQ ID NO.2通过rPCR扩增得到所述的抗菌肽CM4基因；然后以所述的抗菌肽CM4基因为模板，利用上游引物pFastBacHTB-F：SEQ ID NO.3，下游引物pFastBacHTB-R：SEQ ID NO.4通过PCR扩增得到两端分别包含BamHI和HindIII酶切位点的抗菌肽CM4基因。

3.根据权利要求1所述的在昆虫细胞sf9中表达抗菌肽的方法，其特征在于本方法还包含所述的重组杆状病毒穿梭载体Bacmid-ABP的鉴定。

4.根据权利要求3所述的在昆虫细胞sf9中表达抗菌肽的方法，其特征在于所述的重组杆状病毒穿梭载体Bacmid-ABP的鉴定方法为PCR鉴定：分别以M13-F：SEQ ID NO.5、M13-R：SEQ ID NO.6和M13-F：SEQ ID NO.5、pFastBacHTB-R：SEQ ID NO.4以及pFastBacHTB-F：SEQ ID NO.3、M13-R：SEQ ID NO.6为引物对重组杆状病毒穿梭载体Bacmid-ABP进行PCR扩增，能够扩增出对应的2471bp、1876bp、740bp目标片段的即为真正含有整合了目的基因的重组杆状病毒穿梭载体Bacmid-ABP。

5.根据权利要求1所述的在昆虫细胞sf9中表达抗菌肽的方法，其特征在于所述的重组病毒培养基为无血清无抗生素的Sf-900 II SFM。