CN103555733A - 分子中互补决定区以外的区域中工程改造了的具有结合特性的合成免疫球蛋白结构域 - Google Patents
分子中互补决定区以外的区域中工程改造了的具有结合特性的合成免疫球蛋白结构域 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103555733A CN103555733A CN201310486561.2A CN201310486561A CN103555733A CN 103555733 A CN103555733 A CN 103555733A CN 201310486561 A CN201310486561 A CN 201310486561A CN 103555733 A CN103555733 A CN 103555733A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- immunoglobulin
- modified
- antigen
- amino acids
- molecule
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 title claims abstract description 428
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 title claims abstract description 428
- 230000027455 binding Effects 0.000 title claims abstract description 95
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 title 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 163
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 163
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 163
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 122
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 53
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 53
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 53
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 23
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims abstract description 16
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims abstract description 16
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 claims abstract description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 111
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 80
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 73
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 59
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 claims description 44
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 claims description 34
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 29
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims description 26
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 26
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims description 25
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 23
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 22
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 22
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 22
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 21
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 20
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 19
- 239000013566 allergen Substances 0.000 claims description 15
- -1 autoantigen Proteins 0.000 claims description 15
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 15
- 230000008878 coupling Effects 0.000 claims description 14
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 claims description 14
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 claims description 14
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 14
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 14
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 13
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 claims description 13
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 13
- 108010059108 CD18 Antigens Proteins 0.000 claims description 12
- 108010064696 N,O-diacetylmuramidase Proteins 0.000 claims description 12
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 12
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 claims description 11
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 claims description 11
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 10
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims description 10
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 10
- 241000282836 Camelus dromedarius Species 0.000 claims description 9
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 claims description 9
- 241000725643 Respiratory syncytial virus Species 0.000 claims description 7
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 7
- 230000012010 growth Effects 0.000 claims description 7
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 claims description 7
- 239000002184 metal Substances 0.000 claims description 7
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 claims description 7
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 7
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 claims description 6
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 claims description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 6
- 102100040247 Tumor necrosis factor Human genes 0.000 claims description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 6
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 claims description 6
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 claims description 6
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 6
- OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N potassium;[2-butyl-5-chloro-3-[[4-[2-(1,2,4-triaza-3-azanidacyclopenta-1,4-dien-5-yl)phenyl]phenyl]methyl]imidazol-4-yl]methanol Chemical compound [K+].CCCCC1=NC(Cl)=C(CO)N1CC1=CC=C(C=2C(=CC=CC=2)C2=N[N-]N=N2)C=C1 OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 6
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 claims description 5
- 238000012546 transfer Methods 0.000 claims description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 claims description 4
- 241000193468 Clostridium perfringens Species 0.000 claims description 4
- SHIBSTMRCDJXLN-UHFFFAOYSA-N Digoxigenin Natural products C1CC(C2C(C3(C)CCC(O)CC3CC2)CC2O)(O)C2(C)C1C1=CC(=O)OC1 SHIBSTMRCDJXLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 102100027723 Endogenous retrovirus group K member 6 Rec protein Human genes 0.000 claims description 4
- 101710121417 Envelope glycoprotein Proteins 0.000 claims description 4
- 102000003951 Erythropoietin Human genes 0.000 claims description 4
- 108090000394 Erythropoietin Proteins 0.000 claims description 4
- 101001018097 Homo sapiens L-selectin Proteins 0.000 claims description 4
- 102100032818 Integrin alpha-4 Human genes 0.000 claims description 4
- 108010008212 Integrin alpha4beta1 Proteins 0.000 claims description 4
- 102100025390 Integrin beta-2 Human genes 0.000 claims description 4
- 102100037877 Intercellular adhesion molecule 1 Human genes 0.000 claims description 4
- 102100033467 L-selectin Human genes 0.000 claims description 4
- 102100034256 Mucin-1 Human genes 0.000 claims description 4
- 102100025243 Myeloid cell surface antigen CD33 Human genes 0.000 claims description 4
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 claims description 4
- 108700012411 TNFSF10 Proteins 0.000 claims description 4
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 claims description 4
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 claims description 4
- 229930003756 Vitamin B7 Natural products 0.000 claims description 4
- FRYDSOYOHWGSMD-UHFFFAOYSA-N [C].O Chemical compound [C].O FRYDSOYOHWGSMD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- QONQRTHLHBTMGP-UHFFFAOYSA-N digitoxigenin Natural products CC12CCC(C3(CCC(O)CC3CC3)C)C3C11OC1CC2C1=CC(=O)OC1 QONQRTHLHBTMGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- SHIBSTMRCDJXLN-KCZCNTNESA-N digoxigenin Chemical compound C1([C@@H]2[C@@]3([C@@](CC2)(O)[C@H]2[C@@H]([C@@]4(C)CC[C@H](O)C[C@H]4CC2)C[C@H]3O)C)=CC(=O)OC1 SHIBSTMRCDJXLN-KCZCNTNESA-N 0.000 claims description 4
- 229940105423 erythropoietin Drugs 0.000 claims description 4
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 238000002649 immunization Methods 0.000 claims description 4
- 230000003053 immunization Effects 0.000 claims description 4
- 238000002372 labelling Methods 0.000 claims description 4
- BLFWHYXWBKKRHI-JYBILGDPSA-N plap Chemical compound N([C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O BLFWHYXWBKKRHI-JYBILGDPSA-N 0.000 claims description 4
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 claims description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 4
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims description 4
- 239000011735 vitamin B7 Substances 0.000 claims description 4
- 235000011912 vitamin B7 Nutrition 0.000 claims description 4
- 108010021064 CTLA-4 Antigen Proteins 0.000 claims description 3
- 229940045513 CTLA4 antagonist Drugs 0.000 claims description 3
- 102100039498 Cytotoxic T-lymphocyte protein 4 Human genes 0.000 claims description 3
- 102100024025 Heparanase Human genes 0.000 claims description 3
- 101000878605 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin epsilon Fc receptor Proteins 0.000 claims description 3
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 claims description 3
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 claims description 3
- 102100038007 Low affinity immunoglobulin epsilon Fc receptor Human genes 0.000 claims description 3
- 101800001690 Transmembrane protein gp41 Proteins 0.000 claims description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 3
- 108010037536 heparanase Proteins 0.000 claims description 3
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 claims description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 3
- 239000003053 toxin Substances 0.000 claims description 3
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 claims description 3
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 claims description 3
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 claims description 3
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 claims description 2
- 108010082808 4-1BB Ligand Proteins 0.000 claims description 2
- 102100031585 ADP-ribosyl cyclase/cyclic ADP-ribose hydrolase 1 Human genes 0.000 claims description 2
- 108050000203 Adenosine receptors Proteins 0.000 claims description 2
- 102000009346 Adenosine receptors Human genes 0.000 claims description 2
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 claims description 2
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 claims description 2
- CAVZBWFUMSXZFB-LJWNLINESA-N Amogastrin Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)OC(C)(C)CC)C(N)=O)C1=CC=CC=C1 CAVZBWFUMSXZFB-LJWNLINESA-N 0.000 claims description 2
- 102100038080 B-cell receptor CD22 Human genes 0.000 claims description 2
- 102100024222 B-lymphocyte antigen CD19 Human genes 0.000 claims description 2
- 102100022005 B-lymphocyte antigen CD20 Human genes 0.000 claims description 2
- 102100032412 Basigin Human genes 0.000 claims description 2
- 102000007269 CA-125 Antigen Human genes 0.000 claims description 2
- 108010008629 CA-125 Antigen Proteins 0.000 claims description 2
- 102100024217 CAMPATH-1 antigen Human genes 0.000 claims description 2
- 108010046080 CD27 Ligand Proteins 0.000 claims description 2
- 102000017420 CD3 protein, epsilon/gamma/delta subunit Human genes 0.000 claims description 2
- 108050005493 CD3 protein, epsilon/gamma/delta subunit Proteins 0.000 claims description 2
- 108010029697 CD40 Ligand Proteins 0.000 claims description 2
- 101150013553 CD40 gene Proteins 0.000 claims description 2
- 102100032937 CD40 ligand Human genes 0.000 claims description 2
- 108010065524 CD52 Antigen Proteins 0.000 claims description 2
- 108010084313 CD58 Antigens Proteins 0.000 claims description 2
- 102100025475 Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 5 Human genes 0.000 claims description 2
- 102100025473 Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 6 Human genes 0.000 claims description 2
- 102100023126 Cell surface glycoprotein MUC18 Human genes 0.000 claims description 2
- 102000004003 Chemokine CCL11 Human genes 0.000 claims description 2
- 108010082548 Chemokine CCL11 Proteins 0.000 claims description 2
- 108010089448 Cholecystokinin B Receptor Proteins 0.000 claims description 2
- 102100028757 Chondroitin sulfate proteoglycan 4 Human genes 0.000 claims description 2
- 102100023804 Coagulation factor VII Human genes 0.000 claims description 2
- 108010028773 Complement C5 Proteins 0.000 claims description 2
- 102100031506 Complement C5 Human genes 0.000 claims description 2
- 108010076010 Cystathionine beta-lyase Proteins 0.000 claims description 2
- 206010011831 Cytomegalovirus infection Diseases 0.000 claims description 2
- LTMHDMANZUZIPE-AMTYYWEZSA-N Digoxin Natural products O([C@H]1[C@H](C)O[C@H](O[C@@H]2C[C@@H]3[C@@](C)([C@@H]4[C@H]([C@]5(O)[C@](C)([C@H](O)C4)[C@H](C4=CC(=O)OC4)CC5)CC3)CC2)C[C@@H]1O)[C@H]1O[C@H](C)[C@@H](O[C@H]2O[C@@H](C)[C@H](O)[C@@H](O)C2)[C@@H](O)C1 LTMHDMANZUZIPE-AMTYYWEZSA-N 0.000 claims description 2
- 102100035813 E3 ubiquitin-protein ligase CBL Human genes 0.000 claims description 2
- 101150084967 EPCAM gene Proteins 0.000 claims description 2
- 101150029707 ERBB2 gene Proteins 0.000 claims description 2
- 101150039808 Egfr gene Proteins 0.000 claims description 2
- 102000010180 Endothelin receptor Human genes 0.000 claims description 2
- 108050001739 Endothelin receptor Proteins 0.000 claims description 2
- 101710181478 Envelope glycoprotein GP350 Proteins 0.000 claims description 2
- 108010092408 Eosinophil Peroxidase Proteins 0.000 claims description 2
- 108010066687 Epithelial Cell Adhesion Molecule Proteins 0.000 claims description 2
- 102000018651 Epithelial Cell Adhesion Molecule Human genes 0.000 claims description 2
- 102100031939 Erythropoietin Human genes 0.000 claims description 2
- 108010023321 Factor VII Proteins 0.000 claims description 2
- 108010039471 Fas Ligand Protein Proteins 0.000 claims description 2
- 102000003972 Fibroblast growth factor 7 Human genes 0.000 claims description 2
- 108090000385 Fibroblast growth factor 7 Proteins 0.000 claims description 2
- 102100027842 Fibroblast growth factor receptor 3 Human genes 0.000 claims description 2
- 101710182396 Fibroblast growth factor receptor 3 Proteins 0.000 claims description 2
- 102000052874 Gastrin receptors Human genes 0.000 claims description 2
- 102000006354 HLA-DR Antigens Human genes 0.000 claims description 2
- 108010058597 HLA-DR Antigens Proteins 0.000 claims description 2
- 101000691214 Haloarcula marismortui (strain ATCC 43049 / DSM 3752 / JCM 8966 / VKM B-1809) 50S ribosomal protein L44e Proteins 0.000 claims description 2
- 102100026122 High affinity immunoglobulin gamma Fc receptor I Human genes 0.000 claims description 2
- 101000777636 Homo sapiens ADP-ribosyl cyclase/cyclic ADP-ribose hydrolase 1 Proteins 0.000 claims description 2
- 101000884305 Homo sapiens B-cell receptor CD22 Proteins 0.000 claims description 2
- 101000980825 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD19 Proteins 0.000 claims description 2
- 101000897405 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD20 Proteins 0.000 claims description 2
- 101000798441 Homo sapiens Basigin Proteins 0.000 claims description 2
- 101000914324 Homo sapiens Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 5 Proteins 0.000 claims description 2
- 101000914326 Homo sapiens Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 6 Proteins 0.000 claims description 2
- 101000623903 Homo sapiens Cell surface glycoprotein MUC18 Proteins 0.000 claims description 2
- 101000916489 Homo sapiens Chondroitin sulfate proteoglycan 4 Proteins 0.000 claims description 2
- 101000913074 Homo sapiens High affinity immunoglobulin gamma Fc receptor I Proteins 0.000 claims description 2
- 101000935043 Homo sapiens Integrin beta-1 Proteins 0.000 claims description 2
- 101000935040 Homo sapiens Integrin beta-2 Proteins 0.000 claims description 2
- 101000599852 Homo sapiens Intercellular adhesion molecule 1 Proteins 0.000 claims description 2
- 101001057504 Homo sapiens Interferon-stimulated gene 20 kDa protein Proteins 0.000 claims description 2
- 101001055144 Homo sapiens Interleukin-2 receptor subunit alpha Proteins 0.000 claims description 2
- 101001034314 Homo sapiens Lactadherin Proteins 0.000 claims description 2
- 101000946889 Homo sapiens Monocyte differentiation antigen CD14 Proteins 0.000 claims description 2
- 101001133056 Homo sapiens Mucin-1 Proteins 0.000 claims description 2
- 101000934338 Homo sapiens Myeloid cell surface antigen CD33 Proteins 0.000 claims description 2
- 101000581981 Homo sapiens Neural cell adhesion molecule 1 Proteins 0.000 claims description 2
- 101000934346 Homo sapiens T-cell surface antigen CD2 Proteins 0.000 claims description 2
- 101000946860 Homo sapiens T-cell surface glycoprotein CD3 epsilon chain Proteins 0.000 claims description 2
- 101000716102 Homo sapiens T-cell surface glycoprotein CD4 Proteins 0.000 claims description 2
- 101000914514 Homo sapiens T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Proteins 0.000 claims description 2
- 101000914484 Homo sapiens T-lymphocyte activation antigen CD80 Proteins 0.000 claims description 2
- 101100369992 Homo sapiens TNFSF10 gene Proteins 0.000 claims description 2
- 101100207070 Homo sapiens TNFSF8 gene Proteins 0.000 claims description 2
- 101000795167 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 13B Proteins 0.000 claims description 2
- 101000851376 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 8 Proteins 0.000 claims description 2
- 102100025323 Integrin alpha-1 Human genes 0.000 claims description 2
- 102100032817 Integrin alpha-5 Human genes 0.000 claims description 2
- 102100025306 Integrin alpha-IIb Human genes 0.000 claims description 2
- 101710149643 Integrin alpha-IIb Proteins 0.000 claims description 2
- 102100022337 Integrin alpha-V Human genes 0.000 claims description 2
- 108010041341 Integrin alpha1 Proteins 0.000 claims description 2
- 108010055795 Integrin alpha1beta1 Proteins 0.000 claims description 2
- 102000000507 Integrin alpha2 Human genes 0.000 claims description 2
- 102000000510 Integrin alpha3 Human genes 0.000 claims description 2
- 108010041357 Integrin alpha3 Proteins 0.000 claims description 2
- 108010041012 Integrin alpha4 Proteins 0.000 claims description 2
- 102000000426 Integrin alpha6 Human genes 0.000 claims description 2
- 102100025304 Integrin beta-1 Human genes 0.000 claims description 2
- 102100033016 Integrin beta-7 Human genes 0.000 claims description 2
- 102000012355 Integrin beta1 Human genes 0.000 claims description 2
- 108010022222 Integrin beta1 Proteins 0.000 claims description 2
- 108010064593 Intercellular Adhesion Molecule-1 Proteins 0.000 claims description 2
- 108010064600 Intercellular Adhesion Molecule-3 Proteins 0.000 claims description 2
- 102100037871 Intercellular adhesion molecule 3 Human genes 0.000 claims description 2
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 claims description 2
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 claims description 2
- 102000003996 Interferon-beta Human genes 0.000 claims description 2
- 108090000467 Interferon-beta Proteins 0.000 claims description 2
- 102100027268 Interferon-stimulated gene 20 kDa protein Human genes 0.000 claims description 2
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 claims description 2
- 102000000589 Interleukin-1 Human genes 0.000 claims description 2
- 108010065805 Interleukin-12 Proteins 0.000 claims description 2
- 108090000172 Interleukin-15 Proteins 0.000 claims description 2
- 108090000171 Interleukin-18 Proteins 0.000 claims description 2
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 claims description 2
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 claims description 2
- 108010065637 Interleukin-23 Proteins 0.000 claims description 2
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 claims description 2
- 108010002616 Interleukin-5 Proteins 0.000 claims description 2
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 claims description 2
- 102100037792 Interleukin-6 receptor subunit alpha Human genes 0.000 claims description 2
- 108090001007 Interleukin-8 Proteins 0.000 claims description 2
- 102000011782 Keratins Human genes 0.000 claims description 2
- 108010076876 Keratins Proteins 0.000 claims description 2
- 102100039648 Lactadherin Human genes 0.000 claims description 2
- 108010091221 Lymphotoxin beta Receptor Proteins 0.000 claims description 2
- 102000018170 Lymphotoxin beta Receptor Human genes 0.000 claims description 2
- 108090000542 Lymphotoxin-alpha Proteins 0.000 claims description 2
- 102000004083 Lymphotoxin-alpha Human genes 0.000 claims description 2
- 108050008953 Melanoma-associated antigen Proteins 0.000 claims description 2
- 102100035877 Monocyte differentiation antigen CD14 Human genes 0.000 claims description 2
- 108010008707 Mucin-1 Proteins 0.000 claims description 2
- 101100207071 Mus musculus Tnfsf8 gene Proteins 0.000 claims description 2
- 102100027347 Neural cell adhesion molecule 1 Human genes 0.000 claims description 2
- 102000004473 OX40 Ligand Human genes 0.000 claims description 2
- 108010042215 OX40 Ligand Proteins 0.000 claims description 2
- 102000014128 RANK Ligand Human genes 0.000 claims description 2
- 108010025832 RANK Ligand Proteins 0.000 claims description 2
- 102100025237 T-cell surface antigen CD2 Human genes 0.000 claims description 2
- 102100035794 T-cell surface glycoprotein CD3 epsilon chain Human genes 0.000 claims description 2
- 102100036011 T-cell surface glycoprotein CD4 Human genes 0.000 claims description 2
- 102100027213 T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Human genes 0.000 claims description 2
- 102100027222 T-lymphocyte activation antigen CD80 Human genes 0.000 claims description 2
- 102000046283 TNF-Related Apoptosis-Inducing Ligand Human genes 0.000 claims description 2
- 108010000499 Thromboplastin Proteins 0.000 claims description 2
- 102100030859 Tissue factor Human genes 0.000 claims description 2
- 108010060818 Toll-Like Receptor 9 Proteins 0.000 claims description 2
- 102100033117 Toll-like receptor 9 Human genes 0.000 claims description 2
- 108010033576 Transferrin Receptors Proteins 0.000 claims description 2
- 102100026144 Transferrin receptor protein 1 Human genes 0.000 claims description 2
- 102000046299 Transforming Growth Factor beta1 Human genes 0.000 claims description 2
- 101800002279 Transforming growth factor beta-1 Proteins 0.000 claims description 2
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 claims description 2
- 102100024584 Tumor necrosis factor ligand superfamily member 12 Human genes 0.000 claims description 2
- 101710097155 Tumor necrosis factor ligand superfamily member 12 Proteins 0.000 claims description 2
- 102100032100 Tumor necrosis factor ligand superfamily member 8 Human genes 0.000 claims description 2
- 102100029675 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 13B Human genes 0.000 claims description 2
- 102100029690 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 13C Human genes 0.000 claims description 2
- 101710178300 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 13C Proteins 0.000 claims description 2
- 101710187743 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 1A Proteins 0.000 claims description 2
- 102100033732 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 1A Human genes 0.000 claims description 2
- 102100033733 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 1B Human genes 0.000 claims description 2
- 101710187830 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 1B Proteins 0.000 claims description 2
- 102100040245 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 5 Human genes 0.000 claims description 2
- 102100036857 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 8 Human genes 0.000 claims description 2
- 108091008605 VEGF receptors Proteins 0.000 claims description 2
- 102100033177 Vascular endothelial growth factor receptor 2 Human genes 0.000 claims description 2
- 102100026497 Zinc finger protein 654 Human genes 0.000 claims description 2
- 108700042255 amogastrin Proteins 0.000 claims description 2
- 238000011888 autopsy Methods 0.000 claims description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 2
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 claims description 2
- LTMHDMANZUZIPE-PUGKRICDSA-N digoxin Chemical compound C1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](C)O[C@@H](O[C@@H]2[C@H](O[C@@H](O[C@@H]3C[C@@H]4[C@]([C@@H]5[C@H]([C@]6(CC[C@@H]([C@@]6(C)[C@H](O)C5)C=5COC(=O)C=5)O)CC4)(C)CC3)C[C@@H]2O)C)C[C@@H]1O LTMHDMANZUZIPE-PUGKRICDSA-N 0.000 claims description 2
- 229960005156 digoxin Drugs 0.000 claims description 2
- LTMHDMANZUZIPE-UHFFFAOYSA-N digoxine Natural products C1C(O)C(O)C(C)OC1OC1C(C)OC(OC2C(OC(OC3CC4C(C5C(C6(CCC(C6(C)C(O)C5)C=5COC(=O)C=5)O)CC4)(C)CC3)CC2O)C)CC1O LTMHDMANZUZIPE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 claims description 2
- 102000052116 epidermal growth factor receptor activity proteins Human genes 0.000 claims description 2
- 108700015053 epidermal growth factor receptor activity proteins Proteins 0.000 claims description 2
- 229940012413 factor vii Drugs 0.000 claims description 2
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 claims description 2
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 claims description 2
- 108010021315 integrin beta7 Proteins 0.000 claims description 2
- 229960001388 interferon-beta Drugs 0.000 claims description 2
- 108040006732 interleukin-1 receptor activity proteins Proteins 0.000 claims description 2
- 102000014909 interleukin-1 receptor activity proteins Human genes 0.000 claims description 2
- 108040006849 interleukin-2 receptor activity proteins Proteins 0.000 claims description 2
- 108040006858 interleukin-6 receptor activity proteins Proteins 0.000 claims description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 2
- YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N n-[3-[[6-[3-(trifluoromethyl)anilino]pyrimidin-4-yl]amino]phenyl]cyclopropanecarboxamide Chemical compound FC(F)(F)C1=CC=CC(NC=2N=CN=C(NC=3C=C(NC(=O)C4CC4)C=CC=3)C=2)=C1 YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 claims description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 claims description 2
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 claims description 2
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 claims description 2
- 230000002792 vascular Effects 0.000 claims description 2
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 claims 3
- 102100025221 CD70 antigen Human genes 0.000 claims 1
- 102100031988 Tumor necrosis factor ligand superfamily member 6 Human genes 0.000 claims 1
- 102100032101 Tumor necrosis factor ligand superfamily member 9 Human genes 0.000 claims 1
- 239000002905 metal composite material Substances 0.000 claims 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 75
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 60
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 57
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 51
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 38
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 37
- 108010021083 hen egg lysozyme Proteins 0.000 description 34
- 230000008859 change Effects 0.000 description 28
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 26
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 20
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 20
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 19
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 17
- 238000013461 design Methods 0.000 description 16
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 16
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 16
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 16
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 15
- 241000446313 Lamella Species 0.000 description 14
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 14
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 13
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 12
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 12
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 12
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 11
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 11
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 11
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 11
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 10
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 10
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 10
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 9
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 9
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 9
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 9
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 9
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 9
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 8
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 8
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 8
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 8
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 8
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 8
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 8
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 8
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 7
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 7
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 7
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 7
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 7
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 7
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 7
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 7
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 7
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 6
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 6
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 6
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 6
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 6
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 5
- 102100026120 IgG receptor FcRn large subunit p51 Human genes 0.000 description 5
- 101710177940 IgG receptor FcRn large subunit p51 Proteins 0.000 description 5
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 5
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 5
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 5
- 230000008485 antagonism Effects 0.000 description 5
- 229910021538 borax Inorganic materials 0.000 description 5
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 5
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 5
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 5
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 230000008521 reorganization Effects 0.000 description 5
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 5
- 235000010339 sodium tetraborate Nutrition 0.000 description 5
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 5
- BSVBQGMMJUBVOD-UHFFFAOYSA-N trisodium borate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]B([O-])[O-] BSVBQGMMJUBVOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 5
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 4
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 4
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 4
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 4
- 230000010056 antibody-dependent cellular cytotoxicity Effects 0.000 description 4
- 230000005888 antibody-dependent cellular phagocytosis Effects 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Substances OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 4
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 4
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 4
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 4
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 4
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 4
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 4
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 4
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 241000894007 species Species 0.000 description 4
- 101100136076 Aspergillus oryzae (strain ATCC 42149 / RIB 40) pel1 gene Proteins 0.000 description 3
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 3
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 3
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 3
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 description 3
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 description 3
- SRBFZHDQGSBBOR-HWQSCIPKSA-N L-arabinopyranose Chemical compound O[C@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-HWQSCIPKSA-N 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 3
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 3
- 108010073929 Vascular Endothelial Growth Factor A Proteins 0.000 description 3
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 3
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 3
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 3
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 3
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 3
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 3
- 239000008393 encapsulating agent Substances 0.000 description 3
- 238000002866 fluorescence resonance energy transfer Methods 0.000 description 3
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 3
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 3
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 3
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 3
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 3
- 101150040383 pel2 gene Proteins 0.000 description 3
- 101150050446 pelB gene Proteins 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 3
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 3
- 230000037432 silent mutation Effects 0.000 description 3
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 3
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 3
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 3
- 108010049777 Ankyrins Proteins 0.000 description 2
- 102000008102 Ankyrins Human genes 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 108010069112 Complement System Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000000989 Complement System Proteins Human genes 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 2
- 102000009465 Growth Factor Receptors Human genes 0.000 description 2
- 108010009202 Growth Factor Receptors Proteins 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 2
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical group SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 2
- 241000186359 Mycobacterium Species 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- YNPNZTXNASCQKK-UHFFFAOYSA-N Phenanthrene Natural products C1=CC=C2C3=CC=CC=C3C=CC2=C1 YNPNZTXNASCQKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090000412 Protein-Tyrosine Kinases Proteins 0.000 description 2
- 102000004022 Protein-Tyrosine Kinases Human genes 0.000 description 2
- 241000125945 Protoparvovirus Species 0.000 description 2
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 2
- 102000013275 Somatomedins Human genes 0.000 description 2
- 230000006044 T cell activation Effects 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- DGEZNRSVGBDHLK-UHFFFAOYSA-N [1,10]phenanthroline Chemical compound C1=CN=C2C3=NC=CC=C3C=CC2=C1 DGEZNRSVGBDHLK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004037 angiogenesis inhibitor Substances 0.000 description 2
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 2
- 230000001772 anti-angiogenic effect Effects 0.000 description 2
- 238000011091 antibody purification Methods 0.000 description 2
- 102000025171 antigen binding proteins Human genes 0.000 description 2
- 108091000831 antigen binding proteins Proteins 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 238000010322 bone marrow transplantation Methods 0.000 description 2
- 125000000837 carbohydrate group Chemical group 0.000 description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 2
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 2
- 230000000155 isotopic effect Effects 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 125000000325 methylidene group Chemical group [H]C([H])=* 0.000 description 2
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 239000002674 ointment Substances 0.000 description 2
- 210000005105 peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000029279 positive regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 2
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 229940043517 specific immunoglobulins Drugs 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 102000002627 4-1BB Ligand Human genes 0.000 description 1
- XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 4-Nitrophenyl Phosphate Chemical compound OP(O)(=O)OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 5,5-dimethyl-2,4-dioxo-1,3-oxazolidine-3-carboxamide Chemical compound CC1(C)OC(=O)N(C(N)=O)C1=O QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 241001661918 Bartonia Species 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000589562 Brucella Species 0.000 description 1
- 102000007499 CD27 Ligand Human genes 0.000 description 1
- 241000589876 Campylobacter Species 0.000 description 1
- 102000011727 Caspases Human genes 0.000 description 1
- 108010076667 Caspases Proteins 0.000 description 1
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 1
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 1
- 241000193403 Clostridium Species 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 description 1
- 241000709687 Coxsackievirus Species 0.000 description 1
- 241001337994 Cryptococcus <scale insect> Species 0.000 description 1
- 241000223935 Cryptosporidium Species 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 101100285408 Danio rerio eng2a gene Proteins 0.000 description 1
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 241000725619 Dengue virus Species 0.000 description 1
- 241001115402 Ebolavirus Species 0.000 description 1
- 241001466953 Echovirus Species 0.000 description 1
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000011510 Elispot assay Methods 0.000 description 1
- 241000709661 Enterovirus Species 0.000 description 1
- 241000991587 Enterovirus C Species 0.000 description 1
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 1
- OTMSDBZUPAUEDD-UHFFFAOYSA-N Ethane Chemical compound CC OTMSDBZUPAUEDD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 1
- 102000015212 Fas Ligand Protein Human genes 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 241000724791 Filamentous phage Species 0.000 description 1
- 241000710831 Flavivirus Species 0.000 description 1
- 241000224467 Giardia intestinalis Species 0.000 description 1
- 241000590002 Helicobacter pylori Species 0.000 description 1
- 241000228404 Histoplasma capsulatum Species 0.000 description 1
- 101000987586 Homo sapiens Eosinophil peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 101000920686 Homo sapiens Erythropoietin Proteins 0.000 description 1
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 description 1
- 206010061217 Infestation Diseases 0.000 description 1
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 241000710842 Japanese encephalitis virus Species 0.000 description 1
- 241000588748 Klebsiella Species 0.000 description 1
- 241001506991 Komagataella phaffii GS115 Species 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 241000713102 La Crosse virus Species 0.000 description 1
- 241000712902 Lassa mammarenavirus Species 0.000 description 1
- 241000589248 Legionella Species 0.000 description 1
- 208000007764 Legionnaires' Disease Diseases 0.000 description 1
- 241000589902 Leptospira Species 0.000 description 1
- 102000019298 Lipocalin Human genes 0.000 description 1
- 108050006654 Lipocalin Proteins 0.000 description 1
- 102000013519 Lipocalin-2 Human genes 0.000 description 1
- 108010051335 Lipocalin-2 Proteins 0.000 description 1
- 241000712079 Measles morbillivirus Species 0.000 description 1
- JHKXZYLNVJRAAJ-WDSKDSINSA-N Met-Ala Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O JHKXZYLNVJRAAJ-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 241000588652 Neisseria gonorrhoeae Species 0.000 description 1
- 241000231286 Neottia Species 0.000 description 1
- 241000187654 Nocardia Species 0.000 description 1
- 241001631646 Papillomaviridae Species 0.000 description 1
- 208000002606 Paramyxoviridae Infections Diseases 0.000 description 1
- 241000009328 Perro Species 0.000 description 1
- 241001505332 Polyomavirus sp. Species 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- 241000711798 Rabies lyssavirus Species 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 1
- PLXBWHJQWKZRKG-UHFFFAOYSA-N Resazurin Chemical compound C1=CC(=O)C=C2OC3=CC(O)=CC=C3[N+]([O-])=C21 PLXBWHJQWKZRKG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000316848 Rhodococcus <scale insect> Species 0.000 description 1
- 238000011579 SCID mouse model Methods 0.000 description 1
- 101710184528 Scaffolding protein Proteins 0.000 description 1
- FFOKMZOAVHEWET-IMJSIDKUSA-N Ser-Cys Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O FFOKMZOAVHEWET-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 1
- 108010003723 Single-Domain Antibodies Proteins 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 108010017622 Somatomedin Receptors Proteins 0.000 description 1
- 241000191940 Staphylococcus Species 0.000 description 1
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 241000710771 Tick-borne encephalitis virus Species 0.000 description 1
- 241000223996 Toxoplasma Species 0.000 description 1
- 241000589886 Treponema Species 0.000 description 1
- 241000243774 Trichinella Species 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 241000700647 Variola virus Species 0.000 description 1
- 241000607598 Vibrio Species 0.000 description 1
- 206010047400 Vibrio infections Diseases 0.000 description 1
- 241000710886 West Nile virus Species 0.000 description 1
- 241000710772 Yellow fever virus Species 0.000 description 1
- 241000607734 Yersinia <bacteria> Species 0.000 description 1
- 108010084455 Zeocin Proteins 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- YAJCHEVQCOHZDC-QMMNLEPNSA-N actrapid Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3N=CNC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@H](C)O)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@H](C)CC)[C@H](C)CC)[C@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C(N)=O)C1=CNC=N1 YAJCHEVQCOHZDC-QMMNLEPNSA-N 0.000 description 1
- 230000033289 adaptive immune response Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000012867 alanine scanning Methods 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-QMKXCQHVSA-N alpha-L-arabinopyranose Chemical compound O[C@H]1CO[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-QMKXCQHVSA-N 0.000 description 1
- 238000003016 alphascreen Methods 0.000 description 1
- 229940124650 anti-cancer therapies Drugs 0.000 description 1
- 230000003388 anti-hormonal effect Effects 0.000 description 1
- 238000011319 anticancer therapy Methods 0.000 description 1
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000002585 base Substances 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000225 bioluminescence resonance energy transfer Methods 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000006790 cellular biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000011098 chromatofocusing Methods 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000007906 compression Methods 0.000 description 1
- 230000006835 compression Effects 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 108010057085 cytokine receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000003675 cytokine receptors Human genes 0.000 description 1
- 230000001461 cytolytic effect Effects 0.000 description 1
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000002254 cytotoxic agent Substances 0.000 description 1
- 231100000599 cytotoxic agent Toxicity 0.000 description 1
- 238000002784 cytotoxicity assay Methods 0.000 description 1
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 229940088679 drug related substance Drugs 0.000 description 1
- 235000014103 egg white Nutrition 0.000 description 1
- 210000000969 egg white Anatomy 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000009881 electrostatic interaction Effects 0.000 description 1
- 238000003114 enzyme-linked immunosorbent spot assay Methods 0.000 description 1
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 229940085435 giardia lamblia Drugs 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 239000003966 growth inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229940037467 helicobacter pylori Drugs 0.000 description 1
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- 238000012188 high-throughput screening assay Methods 0.000 description 1
- 102000044890 human EPO Human genes 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 239000012642 immune effector Substances 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000002998 immunogenetic effect Effects 0.000 description 1
- 229940121354 immunomodulator Drugs 0.000 description 1
- 238000005462 in vivo assay Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000001524 infective effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000000111 isothermal titration calorimetry Methods 0.000 description 1
- 229940043355 kinase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 239000006210 lotion Substances 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 238000005374 membrane filtration Methods 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 239000003094 microcapsule Substances 0.000 description 1
- 239000003471 mutagenic agent Substances 0.000 description 1
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 238000011580 nude mouse model Methods 0.000 description 1
- 238000004091 panning Methods 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 1
- 239000002831 pharmacologic agent Substances 0.000 description 1
- CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N phleomycin D1 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC[C@@H](N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCCCNC(N)=N)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N 0.000 description 1
- 239000003757 phosphotransferase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 210000002729 polyribosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000003334 potential effect Effects 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000000651 prodrug Substances 0.000 description 1
- 229940002612 prodrug Drugs 0.000 description 1
- 239000003223 protective agent Substances 0.000 description 1
- 230000012846 protein folding Effects 0.000 description 1
- 230000006916 protein interaction Effects 0.000 description 1
- 230000012743 protein tagging Effects 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 239000002516 radical scavenger Substances 0.000 description 1
- 239000000941 radioactive substance Substances 0.000 description 1
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000002708 random mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 210000000664 rectum Anatomy 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000002821 scintillation proximity assay Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940121358 tyrosine kinase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 239000005483 tyrosine kinase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 150000004917 tyrosine kinase inhibitor derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 210000001215 vagina Anatomy 0.000 description 1
- 230000006459 vascular development Effects 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000001086 yeast two-hybrid system Methods 0.000 description 1
- 229940051021 yellow-fever virus Drugs 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
- C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
- C40B40/00—Libraries per se, e.g. arrays, mixtures
- C40B40/04—Libraries containing only organic compounds
- C40B40/06—Libraries containing nucleotides or polynucleotides, or derivatives thereof
- C40B40/08—Libraries containing RNA or DNA which encodes proteins, e.g. gene libraries
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P33/00—Antiparasitic agents
- A61P33/02—Antiprotozoals, e.g. for leishmaniasis, trichomoniasis, toxoplasmosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/08—Antiallergic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
- C07K2317/522—CH1 domain
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
- C07K2317/526—CH3 domain
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/55—Fab or Fab'
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2318/00—Antibody mimetics or scaffolds
- C07K2318/20—Antigen-binding scaffold molecules wherein the scaffold is not an immunoglobulin variable region or antibody mimetics
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
- C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
- C40B40/00—Libraries per se, e.g. arrays, mixtures
- C40B40/04—Libraries containing only organic compounds
- C40B40/10—Libraries containing peptides or polypeptides, or derivatives thereof
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Cosmetics (AREA)
Abstract
用于工程改造免疫球蛋白从而在所述免疫球蛋白的结构环区域中包含至少一处修饰并测定所述免疫球蛋白对抗原表位的结合的方法,其中未修饰的免疫球蛋白不显著结合所述表位,包括下列步骤:提供编码包含至少一个结构环区域的免疫球蛋白的核酸,修饰至少一个所述结构环区域的至少一个核苷酸残基,将所述经修饰的核酸转移至表达***,表达所述经修饰的免疫球蛋白,使表达的经修饰的免疫球蛋白接触表位,并测定所述经修饰的免疫球蛋白是否结合所述表位,以及经过修饰的免疫球蛋白。
Description
本申请是国际申请日为2006年01月05日的申请号为200680001831.4的中国发明专利申请“分子中互补决定区以外的区域中工程改造了的具有结合特性的合成免疫球蛋白结构域”的分案申请。
本发明涉及用于工程改造(engineer)和制造经修饰的免疫球蛋白的方法。
一般领域是以赋予蛋白质以特异性结合特性为目的的蛋白质工程。更具体的说,本发明中工程改造的实用蛋白质是免疫球蛋白(抗体),甚至更具体的说,是免疫球蛋白的单一结构域或者成对或组合的单一结构域。免疫球蛋白的特异性结合特性是重要特征,因为它们决定了与其它分子诸如抗原的相互作用,并使得免疫球蛋白可用于诊断和治疗应用。
本文将以完整IgG1免疫球蛋白为例解释基本的抗体结构。
两条相同的重链(H)和两条相同的轻链(L)联合,形成Y形抗体分子。每条重链具有四个结构域。氨基末端可变区(VH)位于Y的尖端。接着是三个恒定区:CH1、CH2和羧基末端CH3,位于Y主干的底部。一小段转换区(switch)连接重链可变区和恒定区。铰链连接CH2和CH3(Fc片段)与抗体的剩余部分(Fab片段)。通过蛋白水解切割完整抗体分子中的铰链可生成一个Fc和两个相同的Fab片段。轻链由两个结构域构成,可变区(VL)和恒定区(CL),以转换区分开。
铰链区中的二硫键连接两条重链。轻链通过另外的二硫键与重链偶联。根据免疫球蛋白的类别,Asn连接的碳水化合物部分附着于恒定区中的不同位置。对于IgG1,铰链区中的两个二硫键,在Cys235和Cys238对之间,联合两条重链。轻链通过另外两个二硫键与重链偶联,在CH1结构域的Cys229s和CL结构域的Cys214s之间。碳水化合物部分附着于每个CH2的Asn306,在Y的主干中产生显著的凸出。
这些特征具有深刻的功能后果。重链和轻链二者的可变区(VH和VL) 位于Y的“尖端”,它们在此站位,与抗原起反应。分子的这个尖端是氨基酸序列N末端所在的一侧。Y的主干以有效介导效应物功能的方式凸出,诸如激活补体和与Fc受体的相互作用,或者ADCC和ADCP。其CH2和CH3结构域凸出,便于与效应物蛋白质相互作用。氨基酸序列的C末端位于尖端的对侧,可称为Y的“底部”。完整IgG1的结构见图1a。
在抗体中找到两种类型的轻链,称为拉姆达(λ)和卡帕(κ)。给定免疫球蛋白或具有κ链或具有λ链,从未具有每种各一条。在具有λ或κ链的抗体之间没有发现功能差异。
人免疫球蛋白主要类别单体的结构组织见图1b。各类别的差异在于其各自重链的组成和序列。IgM和IgE都缺乏铰链区,但都包含额外的重链结构域(CH4)。连接各链的二硫键(线)的数目和位置在各同种型之间有不同。它们还在N连接碳水化合物基团的分布中有不同,以圆象征性表示。
抗体分子的每个结构域具有相似的结构,即两组压紧的β片层在压缩的反平行β桶中彼此对立。此保守结构称为免疫球蛋白折叠结构(fold)。恒定区的免疫球蛋白折叠结构包含对立压紧的3链片层和4链片层。折叠结构通过每个片层的β折叠链之间的氢键、内部对立片层的残基之间的疏水键、和片层之间的二硫键得到稳定。3链片层包含C、F和G链,4链片层包含A、B、E和D链。字母A-G表示β折叠链沿免疫球蛋白折叠结构的氨基酸序列的顺序位置。
可变区的折叠结构具有9条β折叠链,排列成4条链和5条链的两组片层。5链片层在结构上与恒定区的3链片层类似,但包含额外的C′和C″链。其余链(A、B、C、D、E、F、G)与它们在恒定区免疫球蛋白折叠结构中的对应物具有相同的拓扑和相似的结构。一个二硫键连接对立片层中的B和F链,与恒定区中的一样。图2图示了免疫球蛋白恒定区和可变区的免疫球蛋白折叠结构。
免疫球蛋白轻链和重链的恒定区都包含三个高变环或互补决定区(CDR)。V结构域的三个CDR(CDR1、CDR2、CDR3)在β折叠桶的一端簇集。CDR是连接免疫球蛋白折叠结构的β折叠链B-C、C′-C″和F-G的环。CDR中的残基在免疫球蛋白分子间有变化,赋予各抗体以抗原特异性。
抗体分子尖端的VL和VH结构域压紧,使得6个CDR(每个结构域3个)协作而构建供抗原特异性结合的表面(或空腔)。如此,抗体的天然抗 原结合位点由连接轻链可变区的B-C、C′-C″和F-G链及重链可变区的B-C、C′-C″和F-G链的环构成。
使用蛋白质的三维结构作为设计的辅助手段,已经使用蛋白质的核心结构作为支架将位于许多蛋白质的表面上的氨基酸残基随机化。此策略的例子的描述或综述见下列参考文献(收入本文作为参考):Nygren PA,Uhlen M.,Curr Opin Struct Biol.(1997)7:463-9;Binz HK,Amstutz P,Kohl A,Stumpp MT,Briand C,Forrer P,Grutter MG,Pluckthun A.Nat Biotechnol.(2004)22:575-82;Vogt M,Skerra A.Chembiochem.(2004)5:191-9;US 6,562,617。
此技术的基本原理基于如下观察结果:许多蛋白质具有稳定的核心,它通过二级结构元件诸如β折叠片层或α螺旋的特定排列形成,所述二级结构元件通过诸如环、转角或随机螺旋的结构相互连接。典型的,这后三种结构元件对蛋白质的整体结构不太重要,这些结构元件中的氨基酸残基常常可交换而不破坏蛋白质的总体折叠结构。此设计原理的一个天然存在例子是抗体的CDR。人工例子包括脂笼蛋白(lipocalin)、锚蛋白(ankyrin)和其它蛋白质支架。
天然免疫球蛋白中CDR环以外的环不具有抗原结合或表位结合特异性,但促成整个免疫球蛋白分子的正确折叠和/或其效应物或其它功能,因此为了本发明的目的称为结构环。
在美国专利第6,294,654号中显示了可生成改变的抗体,其中可将肽抗原在铰链区和可变区之间的CH1区中掺入抗体(Ab)的非CDR环,所得Ab可在APC中摄取,使得该肽抗原在MHC II的背景中呈递在APC的表面,由此产生免疫应答。这些***的肽是表位,而载体分子的整体结构不重要。演示了可将ras肽置于免疫球蛋白的(非CDR)环上,而免疫球蛋白仍然分泌。细胞中有严格的“质量控制”,阻止免疫球蛋白分泌,除非它正确折叠,而改变环的氨基酸序列可能引起蛋白质折叠成细胞将检测为不正确并因此降解它的结构。如此,在所示例子以外,认为进一步修饰结构环而不改变免疫球蛋白的性质是困难的。
美国专利申请2004/0101905记载了包含靶结合位点和Fc效应物肽的结合分子。Fc效应物肽指与效应物分子相互作用的肽。已经显示了将效应物肽***免疫球蛋白片段的CH1结构域的非CDR环。
Fc效应物肽是在抗体的非CDR环中天然存在的结构,因此预期在移植 到免疫球蛋白的不同的相当位置上时不会干扰免疫球蛋白的结构。
无论如何,依照本公开书移植到非CDR环中的每种肽很有可能在它被选择的不同结构环境中是没有活性的。
上文提到的两份现有技术文件中都声明难以将肽***应当保持其结构和功能的环,因为不干扰免疫球蛋白折叠结构是至关重要的,因为这对于功能和分泌是重要的。
美国专利申请2004/0132101和2005/0244403记载了对效应物配体具有改变的结合亲和力的突变型免疫球蛋白,所述效应物配体是该抗体结构环的天然配体。在此文件中,记载了横跨整个免疫球蛋白分子的多个区域中影响完整抗体的效应物功能的许多突变。
其它现有技术文件显示,为了操作现有抗原结合位点的目的,由此引入新的结合特性,至今已经采用免疫球蛋白样支架。然而,至今只有CDR区为抗原结合进行了工程改造,换言之,在免疫球蛋白折叠结构的情况中,只修饰了天然抗原结合位点以改变其结合亲和力或特异性。有极大量的文献记载了不同形式的此类经操作免疫球蛋白,其常常以单链Fv片段(scFv)或Fab片段的形式表达,或是展示在噬菌体颗粒的表面上或是在各种原核或真核表达***中可溶性表达。在本领域领先的作者中有Greg Winter、Andreas Plückthun和Hennie Hoogenboom。
本发明的一个目标是提供引入了新的抗原结合位点的免疫球蛋白,及用于工程改造和制造所述免疫球蛋白的方法。
因此,本发明涉及用于工程改造免疫球蛋白的方法,包含在所述免疫球蛋白的结构环区域中的至少一处修饰,并测定所述免疫球蛋白对抗原表位的结合,其中未修饰的免疫球蛋白不显著结合所述表位,包括下列步骤:
-提供编码包含至少一个结构环区域的免疫球蛋白的核酸,
-修饰至少一个所述结构环区域的至少一个核苷酸残基,
-将所述经修饰的核酸转移入表达***,
-表达所述经修饰的免疫球蛋白,
-使表达的经修饰的免疫球蛋白与表位接触,并
-测定所述经修饰的免疫球蛋白是否结合所述表位。
具体而言,本发明涉及用于工程改造特异性结合选自下组的抗原的表位 的免疫球蛋白的方法:变应原、肿瘤相关抗原、自身抗原、酶、细菌抗原、真菌抗原、原生动物抗原和病毒抗原。通过结构环区域中的修饰,免疫球蛋白可工程改造成结合该表位。在一个优选的实施方案中,免疫球蛋白特异性结合至少两种彼此不同的此类表位,所述表位或是相同抗原的或是不同抗原的。
例如,依照本发明的方法指工程改造特异性结合至少一种第一表位的免疫球蛋白,且在所述免疫球蛋白的至少一个结构环区域中包含至少一个修饰,并测定所述至少一个环区域对至少一种第二表位的特异性结合,所述表位选自上文所述抗原的组,其中未修饰的结构环区域(非CDR区)不特异性结合所述至少一种第二表位,包括下列步骤:
-提供编码特异性结合至少一种第一表位、包含至少一个结构环区域的免疫球蛋白的核酸,
-修饰由所述核酸编码的至少一个所述环区域的至少一个核苷酸残基,
-将所述经修饰的核酸转移入表达***中,
-表达所述经修饰的免疫球蛋白,
-使表达的经修饰的免疫球蛋白与所述至少一种第二表位接触,并
-测定所述经修饰的免疫球蛋白是否特异性结合第二表位。
依照本发明的方法优选指所述免疫球蛋白的至少一个结构环区域中的至少一处修饰并测定所述至少一个环区域对至少一种选自下组的抗原的特异性结合:变应原、肿瘤相关抗原、自身抗原、酶、细菌抗原、真菌抗原、病毒抗原和原生动物抗原,其中包含未修饰的结构环区域的免疫球蛋白不特异性结合所述至少一种抗原。
依照本发明待修饰的术语“免疫球蛋白”(在用于本文时术语免疫球蛋白和抗体可互换)可展现单特异性或多特异性,或者多价结合特性,至少两个、优选至少三个对例如抗原、效应物分子/蛋白质的表位的特异性结合位点。依照本发明的免疫球蛋白还有本领域公认的功能性片段,诸如Fc、Fab、scFv、CH/CL结构域的单链二聚体、Fv、或者免疫球蛋白、完整抗体的重链和轻链可变区(诸如Fd、Vl、Vk、Vh)和恒定区(诸如CH1、CH2、CH3、CH4、Cl和Ck)的结构域的其它衍生物或组合,以及由以结构环相连的免疫球蛋白结构域的两条β折叠链组成的微型结构域(mini-domain)。
应当理解,术语“免疫球蛋白”、“经修饰的免疫球蛋白”或“依照本发明的 免疫球蛋白”同样包括免疫球蛋白的衍生物。衍生物指一种或多种本发明免疫球蛋白的任意组合和/或其中本发明免疫球蛋白的任何结构域或微型结构域可在一种或多种其它蛋白质(诸如其它免疫球蛋白、配体、支架蛋白、酶、毒素等等)的任何位置融合的融合蛋白。本发明免疫球蛋白的衍生物还可通过以各种化学技术诸如共价偶联、静电相互作用、二硫键等结合其它物质来获得。
结合免疫球蛋白的其它物质可以是脂质、碳水化合物、核酸、有机和无机分子、或其任意组合(例如PEG、前药或药物)。衍生物还有具有相同氨基酸序列但完全或部分由非天然或化学修饰氨基酸制备的免疫球蛋白。
依照本发明的工程改造分子作为独立的蛋白质以及融合蛋白或衍生物都是有用的,最典型的是作为更大抗体结构或完整抗体分子或其部分诸如Fab、Fc片段、Fv片段及其它的一部分融合。将有可能使用工程改造的蛋白质来生成单特异性、双特异性、三特异性分子,甚至可能同时携带多种特异性,而且同时将有可能依照此类分子的计划用途的要求同时控制和预先选择结合的效价。
依照本发明,可将所有种类的变应原、肿瘤相关抗原、自身抗原、酶、细菌抗原、真菌抗原、原生动物抗原和病毒抗原的抗原结合区或抗原结合位点引入给定抗体结构的结构环。
依照本发明的术语“抗原”应当指已知与免疫球蛋白的CDR环区域相互作用或能够相互作用的分子或结构。现有技术的结构环区域不与抗原相互作用,但是促成整体结构和/或对效应物分子的结合。
依照本发明的术语“变应原、肿瘤相关抗原、自身抗原、酶、细菌抗原、真菌抗原、原生动物抗原和病毒抗原”应当包括能够为抗体结构所识别的所有变应原和抗原及此类分子的片段(尤其是通常称为“表位”(例如B细胞表位)的子结构(substructure)),只要它们是免疫学相关的,即也受到天然或单克隆抗体的识别。
依照本发明的术语“表位”应当指可完全构成本发明免疫球蛋白的结合结构域的特定结合配偶体或是特定结合配偶体的一部分的分子结构。
在化学上,表位可以由碳水化合物、肽、脂肪酸、无机物质、或其衍生物、及其任意组合构成。若表位是多肽,则它将通常在肽中包含至少3个氨基酸,优选8-50个氨基酸,更优选约10-20个氨基酸。肽的长度没有临界上 限(critical upper limit),它可包含多肽序列的几乎全长。表位可以是线性或构象表位。线性表位由多肽链的一段一级序列构成。线性表位可以是连续的或交叠的。构象表位由通过多肽的折叠而聚到一起,形成三级结构的氨基酸构成,而且所述氨基酸在线性序列中不必彼此相邻。
具体而言,表位是诊断相关分子的至少一部分,即样品中表位的存在与否与疾病或与健康状况或与制造中的进程状态或与环境和食物状况定性或定量相关。表位还可以是治疗相关分子的至少一部分,即可由改变疾病进程的特异性结合结构域靶向的分子。
优选的“变应原、肿瘤相关抗原、自身抗原、酶、细菌抗原、真菌抗原、原生动物抗原和病毒抗原”指那些早已证明就是或者能够成为免疫学或治疗相关的变应原或抗原,尤其是那些已经测试了临床功效的。
另一方面,依照本发明的另一个方面,还可在结构环区域中引入其它结合性能,例如对小分子诸如药物或酶、酶的催化位点或酶底物,或者对酶底物转变状态类似物的结合性能。
优选的是,结构环中的新的抗原结合位点对未修饰的免疫球蛋白而言是外源的。如此,像效应物分子或Fc受体的靶物优选排除在依照本发明的免疫球蛋白的结合分子和特异性以外。
优选的是,结构环中的新的抗原结合位点是通过由选定核酸编码的免疫球蛋白的替换、缺失和/或***而引入的。
依照本发明的另一个优选实施方案,至少一个核苷酸的修饰导致由所述核酸编码的免疫球蛋白的替换、缺失和/或***。
至少一个环区域的修饰可导致一个或多个氨基酸的替换、缺失和/或***,优选点突变、整个环的交换,更优选至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、多至30个氨基酸的改变。
还优选定点随机突变。通过这种方法,使用随机生成的***物在此类结构环中交换或引入环的一个或多个特定氨基酸残基。或者,优选使用组合方法。
优选通过随机、半随机或特别是通过定点随机诱变方法突变或修饰至少一个环区域。这些方法可用于在本发明免疫球蛋白的期望位置产生氨基酸修饰。在这些情况中,位置是随机选择的,或者氨基酸变化是使用过分简单化原则(simplistic rule)产生的。例如,可将所有残基突变成丙氨酸,称为丙氨 酸扫描。此类方法可偶联更加复杂的工程改造方法,它们采用选择方法来筛选更高水平的序列多样性。
依照本发明的一种优选方法涉及随机修饰的核酸分子,它包含至少一个具有序列5′-NNS-3′、5’-NNN-3’或5’-NNK-3’的核苷酸重复单元。
随机修饰的核酸分子可包含上文鉴定的重复单元,它们编码所有已知的天然存在氨基酸。
正如本领域众所周知的,有多种选择技术可用于鉴定和分离具有某些结合特性和亲和力的蛋白质,包括例如展示技术诸如噬菌体展示、核糖体展示、细胞表面展示、等等,见下文所述。用于生成和筛选抗体变体的方法是本领域众所周知的。用于抗体分子生物学、表达、纯化、和筛选的通用方法记载于《Antibody Engineering》,Duebel & Kontermann编,Springer-Verlag,Heidelberg,2001;及Hayhurst & Georgiou,2001,Curr Opin Chem Biol5:683-689;Maynard&Georgiou,2000,Annu Rev Biomed Eng 2:339-76。
依照本发明的“结构环”或“非CDR环”以如下方式理解:免疫球蛋白由具有所谓的免疫球蛋白折叠结构的结构域构成。本质上,反平行β片层由环相连而形成压缩的反平行β折叠桶。在可变区中,结构域的有些环本质上促成抗体的特异性,即对抗原的结合。这些环称为CDR环。相反,抗体结构域的所有其它环促成分子的结构和/或效应物功能。这些环在本文中定义为结构环或非CDR环。
可将编码经修饰的免疫球蛋白(而且在下文整篇说明书中总是包括免疫球蛋白片段)的核酸分子克隆到宿主细胞中,表达,并测定它们的结合特异性。这些实践使用众所周知的程序进行,可用于本发明的多种方法记载于《Molecular Cloning--A Laboratory Manual》,第3版,Maniatis,Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York,2001及《Current Protocols in Molecular Biology》,John Wiley & Sons。可将编码本发明经修饰的免疫球蛋白的核酸掺入表达载体以表达所述免疫球蛋白。表达载体典型的包含与控制或调节序列、选择标志、任何融合配偶体、和/或另外的元件可操作连接的免疫球蛋白,即置于功能性关系中。为了生成本发明的经修饰的免疫球蛋白,可以在适于诱导或引起经修饰的免疫球蛋白表达的条件下培养经包含编码经修饰的免疫球蛋白的核酸的核酸,优选表达载体转化的宿主细胞。将外源核酸分子导入宿主的方法是本领域众所周知的,而且将随所用宿主而变化。当然, 还可采用非细胞或无细胞表达***来表达经修饰的免疫球蛋白。
在本发明的一个优选实施方案中,在表达后纯化或分离经修饰的免疫球蛋白。经修饰的免疫球蛋白可以以本领域技术人员知道的多种方式分离或纯化。标准纯化方法包括层析技术、电泳、免疫学、沉淀、透析、过滤、浓缩、和层析聚焦技术。特定融合配偶体常常可提供纯化方法。例如,若采用GST融合,则可使用谷胱甘肽树脂来纯化抗体;若采用His标签,则可使用Ni+2亲和层析;若采用flag标签,则可使用固定化抗flag抗体。关于合适纯化技术的一般指导,参阅《Antibody Purification:Principles and Practice》,第3版,Scopes,Springer-Verlag,NY,1994。当然,还有可能在宿主的表面上表达依照本发明的经修饰的免疫球蛋白,特别是在细菌、昆虫或酵母细胞的表面上或者在噬菌体或病毒的表面上。
经修饰的免疫球蛋白可使用多种方法筛选,包括但不限于那些使用体外测定法、体内和基于细胞的测定法、和选择技术的。可在筛选程序中利用自动化和高通量筛选技术。筛选可采用融合配偶体或标记物,例如酶、免疫标记物、同位素标记物、或小分子标记物诸如荧光或比色染料或发光分子。
在一个优选的实施方案中,在体外测定法中筛选免疫球蛋白的功能性和/或生物物理学特性。在一个优选的实施方案中,对抗体筛选功能性,例如它催化反应的能力或它对其靶物的结合亲和力。
测定法可采用多种检测方法,包括但不限于显色、荧光、发光、或同位素标记物。
正如本领域知道的,有些筛选方法选择文库的有利成员。这些方法在本文中称为“选择方法”,而且这些方法可在本发明中用于筛选经修饰的免疫球蛋白。在使用筛选方法筛选免疫球蛋白文库时,只有文库中那些有利的,即达到有些选择标准的成员得到繁殖、分离、和/或观察。应当领会,因为只观察到最合适的变体,所以此类方法能够筛选比那些可通过个别测定文库成员合适性的方法筛选的文库更大的文库。可通过共价或非共价连接免疫球蛋白的表型与其基因型,即抗体的功能与编码它的核酸的任何方法、技术、或融合配偶体来进行选择。例如,通过将文库成员与基因III蛋白融合,从而能够使用噬菌体展示作为选择方法。这样,达到有些标准例如对免疫球蛋白的靶物的结合亲和力的经修饰的免疫球蛋白的选择或分离还选择或分离了编码它的核酸。一旦分离,然后可扩增编码经修饰的免疫球蛋白的一个或多 个基因。可重复称为淘选的这个分离和扩增过程,从而富集文库中有利的抗体变体。所附核酸的核酸测序最终容许基因的鉴定。
本领域知道多种选择方法可在本发明中用于筛选免疫球蛋白文库。这些包括但不限于噬菌体展示(《Phage display of peptides and antibodies:a laboratory manual》,Kay等人,1996,Academic Press,San Diego,Calif.,1996;Lowman et al.,1991,Biochemistry 30:10832-10838;Smith,1985,Science 228:1315-1317)及其衍生物,诸如选择性噬菌体感染(selective phage infection)(Malmborg et al.,1997,J Mol Biol 273:544-551)、选择性感染性噬菌体(selectively infective pahge)(Krebber et al.,1997,J Mol Biol 268:619-630)、和延迟感染性淘选(delayed infectivity panning)(Benhar et al.,2000,J Mol Biol 301:893-904),细胞表面展示(Witrrup,2001,Curr Opin Biotechnol,12:395-399)诸如展示在细菌(Georgiou et al.,1997,Nat Biotechnol 15:29-34;Georgiou et al.,1993,Trends Biotechnol 11:6-10;Lee et al.,2000,Nat Biotechnol 18:645-648;Jun et al.,1998,Nat Biotechnol 16:576-80)、酵母(Boder & Wittrup,2000,Methods Enzymol 328:430-44;Boder & Wittrup,1997,Nat Biotechnol15:553-557)、和哺乳动物细胞(Whitehorn et al.,1995,Bio/technology13:1215-1219)上,以及体外展示技术(Amstutz et al.,2001,Curr Opin Biotechnol 12:400-405),诸如多核糖体展示(Mattheakis et al.,1994,Proc Natl Acad Sci USA 91:9022-9026)、核糖体展示(Hanes et al.,1997,Proc Natl Acad Sci USA 94:4937-4942)、mRNA展示(Roberts & Szostak,1997,Proc Natl Acad Sci USA 94:12297-12302;Nemoto et al.,1997,FEBS Lett 414:405-408)、和核糖体灭活展示***(Zhou et al.,2002,J Am Chem Soc 124,538-543)。
可用于本发明的其它选择方法包括不依赖于展示的方法,诸如体内方法,包括但不限于周质表达和细胞计量筛选(Chen et al.,2001,Nat Biotechnol19:537-542)、抗体片段互补测定法(Johnsson & Varshavsky,1994,Proc NatlAcad Sci USA 91:10340-10344;Pelletier et al.,1998,Proc Natl Acad Sci USA95:12141-12146)、和酵母双杂交体筛选(Fields & Song,1989,Nature340:245-246),以选择模式使用(Visintin et al.,1999,Proc Natl Acad Sci USA96:11723-11728)。在一个备选实施方案中,通过结合表达载体上的特定序列从而将融合配偶体和相关Fc变体文库成员与编码它们的核酸的融合配偶体共价或非共价连接来进行选择。例如,PCT WO 00/22906;PCT WO 01/49058; PCT WO 02/04852;PCT WO 02/04853;PCT WO 02/08023;PCT WO 01/28702;及PCT WO 02/07466记载了这样的融合配偶体和可用于本发明的技术。在一个备选实施方案中,若抗体的表达赋予细胞以有些生长、繁殖、或存活优势,则可发生体内选择。
称为“定向进化”方法的有些选择方法包括在选择过程中交配或繁殖有利序列,有时掺入新的突变。本领域技术人员应当领会,定向进化方法可便于文库中最有利序列的鉴定,而且可提高所筛选序列的多样性。本领域知道多种定向进化方法可在本发明中用于筛选抗体变体,包括但不限于DNA改组(PCT WO 00/42561 A3;PCT WO 01/70947 A3)、外显子改组(美国专利第6,365,377号;Kolkman & Stemmer,2001,Nat Biotechnol 19:423-428)、家族改组(Crameri et al.,1998,Nature 391:288-291;美国专利第6,376,246号)、RACHITTTM(Coco et al.,2001,Nat Biotechnol 19:354-359;PCT WO 02/06469)、STEP和体外重组的随机引发(Zhao et al.,1998,Nat Biotechnol16:258-261;Shao et al.,1998,Nucleic Acids Res 26:681-683)、外切核酸酶介导的基因装配(美国专利第6,352,842号;美国专利第6,361,974号)、基因位点饱和诱变TM(美国专利第6,358,709号)、基因再装配TM(美国专利第6,358,709号)、SCRATCHY(Lutz et al.,2001,Proc Natl Acad Sci USA 98:11248-11253)、DNA片段化法(Kikuchi et al.,Gene 236:159-167)、单链DNA改组(Kikuchi et al.,2000,Gene 243:133-137)、和AMEsystemTM定向进化抗体工程改造技术(Applied Molecular Evolution)(美国专利第5,824,514号;美国专利第5,817,483号;美国专利第5,814,476号;美国专利第5,763,192号;美国专利第5,723,323号)。
在一个优选的实施方案中,使用一种或多种基于细胞的或体内测定法筛选抗体变体。对于此类测定法,典型的是外源添加已纯化或未纯化的经修饰的免疫球蛋白,使得细胞暴露于属于文库的个别免疫球蛋白或免疫球蛋白集合。这些测定法典型的但非总是基于免疫球蛋白的功能;即,抗体结合其靶物和介导有些生物化学事件,例如效应物功能、配体/受体结合抑制、凋亡、等等的能力。此类测定法常常牵涉监测细胞对抗体的应答,例如细胞存活、细胞死亡、细胞形态的改变、或转录激活诸如天然基因或报道基因的细胞表达。例如,此类测定法可测量抗体变体引发ADCC、ADCP或CDC的能力。对于有些测定法,可能需要添加靶细胞以外的额外细胞或成分,例如血清补 体或效应细胞诸如外周血单核细胞(PBMC)、NK细胞、巨噬细胞等等。此类额外细胞可以来自任何生物体,优选人、小鼠、大鼠、兔和猴。免疫球蛋白可引起表达靶物的某些细胞系凋亡,或者它们可介导已经添加到测定法中的免疫细胞对靶细胞的攻击。用于监测细胞死亡或存活力的方法是本领域知道的,包括使用染料、免疫化学、细胞化学和放射性试剂。例如,通过胱天蛋白酶染色测定法可测量凋亡,通过放射性物质或荧光染料诸如alamar blue的摄取或释放可监测细胞生长或激活。在一个优选的实施方案中,可使用DELFIA TM基于EuTDA的细胞毒性测定法(Perkin Elmer, MA)。或者,可通过测量一种或多种天然胞内成分例如乳酸脱氢酶的释放来监测死亡的或损伤的靶细胞。转录激活也可在基于细胞的测定法中充当测定功能的方法。在这种情况中,可通过测定可上调的天然基因或免疫球蛋白来监测应答,例如可测量某些白介素的释放,或者可经由报道构建物读出结果。基于细胞的测定法还可牵涉测量作为对存在经修饰的免疫球蛋白的应答的细胞形态变化。用于测量测定法的细胞类型可以是原核的或真核的,可采用本领域知道的多种细胞系。或者,使用已经用编码变体的核酸转化或转染的细胞进行基于细胞的筛选。即,抗体变体不是外源添加给细胞的。例如,在一个实施方案中,基于细胞的筛选利用细胞表面展示。可采用融合配偶体,从而能够在细胞表面上展示经修饰的免疫球蛋白(Witrrup,2001,Curr Opin Biotechnol,12:395-399)。
在一个优选的实施方案中,可使用一种或多种基于细胞的测定法通过实验测定经修饰的免疫球蛋白的免疫原性。在一个优选的实施方案中,使用先体外后体内(ex vivo)T细胞激活测定法通过实验对免疫原性定量。在这种方法中,用目的肽或完整抗体一次或多次激发(challenge)来自匹配供体的抗原呈递细胞和幼稚T细胞。然后,可使用许多方法检测T细胞激活,例如通过监测细胞因子的生成或测量氚化胸苷的摄取。在最优选的实施方案中,使用Elispot测定法(Schmittel et.al.,2000,J.Immunol.Meth.,24:17-24)监测干扰素γ生成。
可在细胞、组织、和完整生物体实验中表征本发明经修饰的免疫球蛋白的生物学特性。正如本领域知道的,为了测量药物治疗疾病或疾病模型的功效或者测量药物的药动学、毒性和其它特性,常常在动物中测试药物,包括但不限于小鼠、大鼠、兔、犬、猫、猪和猴。这些动物可称为疾病模型。常 常在小鼠中测试治疗剂,包括但不限于裸鼠、SCID小鼠、异种移植物小鼠和转基因小鼠(包括敲入和敲除)。此类实验可为确定抗体用作治疗剂的潜力提供有意义的数据。测试可使用任何生物体,优选哺乳动物。例如,由于猴与人的遗传相似性,猴可以是合适的治疗模型,因而可用于测试本发明经修饰的免疫球蛋白的功效、毒性、药动学或其它特性。批准作为药物最终要求在人体中测试,因此当然设想了这些实验。如此,可以在人体中测试本发明的经修饰的免疫球蛋白以测定它们的治疗功效、毒性、免疫原性、药动学和/或其它临床特性。
本发明的经修饰的免疫球蛋白可用于广泛的抗体产品。在一个实施方案中,本发明的抗体变体用于治疗或预防,用于制备或分析用途,用作诊断剂、工业化合物或研究试剂,优选治疗剂。抗体变体可用于单克隆的或多克隆的抗体组合物。在一个优选的实施方案中,本发明的经修饰的免疫球蛋白用于杀伤携带靶抗原的靶细胞,例如癌细胞。在一个备选实施方案中,本发明的经修饰的免疫球蛋白用于阻断、拮抗或激动(agonize)靶抗原,例如通过拮抗细胞因子或细胞因子受体。在一个备选的优选实施方案中,本发明的经修饰的免疫球蛋白用于阻断、拮抗或激动靶抗原和杀伤携带靶抗原的靶细胞。
在一个备选的优选实施方案中,本发明的经修饰的免疫球蛋白用于阻断、拮抗或激动生长因子或生长因子受体和杀伤携带或需要靶抗原的靶细胞。在一个备选的优选实施方案中,本发明的经修饰的免疫球蛋白用于阻断、拮抗或激动酶和酶的底物。
本发明的经修饰的免疫球蛋白可用于各种治疗目的。在一个优选的实施方案中,将包含经修饰的免疫球蛋白的抗体施用于患者以治疗特定紊乱。为了本发明的目的,“患者”包括人和其它动物,优选哺乳动物,最优选人。“特定紊乱”在本文中指可通过施用包含本发明经修饰的免疫球蛋白的药用组合物而改善的紊乱。
在一个实施方案中,依照本发明的经修饰的免疫球蛋白是施用于患者的唯一治疗活性剂。或者,依照本发明的经修饰的免疫球蛋白联合一种或多种其它治疗剂施用,包括但不限于细胞毒剂、化疗剂、细胞因子、生长抑制剂、抗激素剂、激酶抑制剂、抗血管发生剂、心脏保护剂、或其它治疗剂。经修饰的免疫球蛋白可以与一种或多种其它治疗方案相伴施用。例如,本发明的抗体变体可以与化疗、放疗、或化疗和放疗二者一起施用。在一个实施方案 中,本发明的经修饰的免疫球蛋白可以与一种或多种抗体(可以包含或不包含本发明的抗体变体)联合施用。依照本发明的另一个实施方案,采用本发明的经修饰的免疫球蛋白和一种或多种其它抗癌疗法来先体外后体内处理癌细胞。设想了此类先体外后体内处理在骨髓移植和特别是自体骨髓移植中可能是有用的。当然设想了可以联合其它治疗技术诸如外科手术而采用本发明的抗体。
多种其它治疗剂可用于与本发明的经修饰的免疫球蛋白一起施用。在一个实施方案中,经修饰的免疫球蛋白与抗血管发生剂一起施用,后者是阻断或一定程度干扰血管发育的化合物。抗血管发生因子可以是例如结合牵涉促进血管发生的生长因子或生长因子受体的小分子或蛋白质,例如抗体、Fc融合物、或细胞因子。在本文中优选的抗血管发生因子是结合血管内皮生长因子(VEGF)的抗体。在一个备选的实施方案中,经修饰的免疫球蛋白与诱导或增强适应性免疫应答的治疗剂一起施用,例如靶向CTLA-4的抗体。在一个备选的实施方案中,经修饰的免疫球蛋白与酪氨酸激酶抑制剂一起施用,后者是一定程度抑制酪氨酸激酶的酪氨酸激酶活性的分子。在一个备选的实施方案中,本发明的经修饰的免疫球蛋白与细胞因子一起施用。“细胞因子”在用于本文时指由一种细胞群释放、作为细胞间介质作用于另一细胞的蛋白质的通称,包括趋化因子。
设想了其中配制了本发明的经修饰的免疫球蛋白和一种或多种治疗活性剂的药用组合物。通过将具有期望纯度的所述免疫球蛋白与任选的药学可接受载体、赋形剂或稳定剂(《Remington′s Pharmaceutical Sciences》,第16版,Osol,A.编,1980)混合,制备本发明抗体变体的配制剂供贮存,采取冻干配制剂或水溶液的形式。将用于体内施用的配制剂优选是无菌的。这易于通过无菌滤膜过滤或其它方法来实现。本文中所公开的经修饰的免疫球蛋白和其它治疗活性剂还可配制成免疫脂质体和/或包裹在微胶囊中。
包含本发明经修饰的免疫球蛋白的药用组合物的施用,优选无菌水溶液的形式,可以多种方式进行,包括但不限于口服、皮下、静脉内、鼻内、耳内、经皮、局部(例如凝胶剂、软膏剂、洗剂、乳膏剂等)、腹膜内、肌肉内、肺内(例如AERxTM可吸入技术,可从Aradigm购买;或InhanceTM肺部投递***,可从Inhale Therapeutics购买)、***、肠胃外、直肠、或眼内。
在用于本文时,术语“特异性结合”指异质分子群中目的关联配体决定性 的结合反应。如此,在指定条件(例如在免疫球蛋白的情况中是免疫测定条件)下,指定抗体结合其特定“靶物”且不以显著量结合样品中存在的其它分子。与抗体的CDR相当,经修饰的结构环区域是结合抗原或分子的蛋白质模块,而非抗原。
术语“表达***”指包含可操作连接的期望编码序列和控制序列,使得用这些序列转化的宿主能够生成所编码蛋白质的核酸分子。为了实现转化,表达***可包含在载体上;然而,相关DNA然后还可整合到宿主染色体中。
依照本发明的一个优选实施方案,表达***包含载体。本领域知道的任何表达载体都可在适当时用于此目的。
经修饰的免疫球蛋白优选在宿主中表达,优选在细菌、酵母、植物细胞、动物细胞中或者在植物或动物中表达。
极多种适当的宿主细胞可用于表达经修饰的免疫球蛋白,包括但不限于哺乳动物细胞(动物细胞)、植物细胞、细菌(例如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli))、昆虫细胞、和酵母(例如巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)、啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae))。例如,可从美国典型培养物收藏中心(American Type Culture Collection)获得的ATCC细胞系目录中记载了可用于本发明的多种细胞系。此外,植物和动物也可作为宿主用于表达依照本发明的免疫球蛋白。可根据所用宿主来选择表达以及转染载体或盒。
当然,也可使用非细胞或无细胞蛋白质表达***。生成足够量蛋白质的体外转录/翻译蛋白质表达平台提供了无细胞表达的许多优势,消除了对典型的与基于细胞的表达***有关的费力的上游和下游步骤(例如宿主细胞转化、培养、或溶解)的需要。
本发明的另一个方面涉及用于制造免疫球蛋白或其药用制剂的方法,包含在所述免疫球蛋白的结构环区域中至少一处修饰,并测定所述免疫球蛋白对抗原表位的结合,其中未修饰的免疫球蛋白不显著结合所述表位,包括下列步骤:
-提供编码包含至少一个环区域的免疫球蛋白的核酸,
-修饰至少一个所述环区域的至少一个核苷酸残基,
-将所述经修饰的核酸转移入表达***,
-表达所述经修饰的免疫球蛋白,
-使表达的经修饰的免疫球蛋白与表位接触,
-测定所述经修饰的免疫球蛋白是否结合所述表位,并
-提供结合所述表位的经修饰的免疫球蛋白并任选将其制成药用制剂。
具体而言,本发明涉及用于制造特异性结合至少一种第一分子的多特异性免疫球蛋白或其药用制剂的方法,包含在所述免疫球蛋白的至少一个结构环区域中的至少一处修饰,并测定所述至少一个环区域对至少一种选自下组的第二分子的特异性结合:变应原、肿瘤相关抗原、自身抗原、酶、细菌抗原、真菌抗原、原生动物抗原和病毒抗原,其中包含未修饰结构环区域的免疫球蛋白不特异性结合所述至少一种第二分子,包括下列步骤:
-提供编码特异性结合至少一种第一分子、包含至少一个结构环区域的免疫球蛋白的核酸,
-修饰由所述核酸编码的至少一个所述环区域的至少一个核苷酸残基,
-在表达***中转移所述经修饰的核酸,
-表达所述经修饰的免疫球蛋白,
-使表达的经修饰的免疫球蛋白与所述至少一种第二分子接触,
-测定所述经修饰的免疫球蛋白是否特异性结合第二分子,并
-提供对所述至少一种第二分子特异的经修饰的免疫球蛋白并任选将其制成药用制剂。
将超过一种特异性工程改造到特异性结合对的一个成员中是优选的(Kufer et al.(2004)Trends in Biotechnology vol.22 pages 238-244)。
已经做了许多尝试来生成多特异性,例如双特异性的单克隆抗体或抗体片段。生成由两条不同多肽链(重链和轻链)构成的双特异性抗体中的一个问题是必需在一个细胞中表达四种不同的链(两种重链和两种轻链),产生许多不同的不得不与混合物中的期望双特异性分子分开的分子组合。由于它们的相似性,将这些分子分开是困难且昂贵的。已经采用许多技术使此类不想要的配对的出现最小化(Carter(2001)Journal of Immunological Methods,vol 248,pages 7-15)。
这个问题的一种解决办法是生成一条具有两种特异性的多肽链,像例如彼此相连的两种scFv,或者生成所谓的双抗体。此类分子已经显示出与天然分子的折叠结构相距甚远,而且出了名的难以生成(LeGall et al.(2004)Protein Engineering,Design & Selection vol 17 pages 357-366)。
当前双特异性抗体设计的另一个问题在于即使亲本抗体双价结合其各自结合配偶体(例如IgG),所得双特异性抗体对每一种各自结合配偶体仍是单价的事实。
本发明的优选多特异性分子解决了这些问题:
将双特异性分子表达成一条多肽链是可能的(具有两种结合特异性的经修饰的Ig结构域,见实施例部分),这比表达两条抗体多肽链更加易于实现(Cabilly et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:3273-3277(1984))。
由于第二特异性位于分子的非可变部分,因而不需要两条不同重链或不同轻链的事实,它也可生成为抗体样分子(即由2条多肽链构成)。如此,不可能有两条链的错误配对。
本发明的抗体可以由一条重链和一条轻链组成,它们一起形成结合特定结合配偶体的可变区。第二特异性可以由重链或轻链的任何结构环的经修饰的环形成。结合位点也可以由超过一个非CDR环形成,它们可以是结构上相邻的(或是在重链上或是在轻链上或是在两条链上)。
经修饰的抗体或衍生物可以是完整抗体或抗体片段(例如Fab、CH1-CH2、CH2-CH3)。
根据设计,它可单价或多价结合结合配偶体,甚至对不同结合配偶体具有不同效价。
既然重链和轻链非CDR区有许多不同环可用于选择和设计特异性结合位点,有可能设计具有甚至超过两种特异性的抗体衍生物而没有上文提到的问题。
一条多肽链内的特异性结合位点可以用或不用肽接头相连。
有些抗体类别天生可视为多特异性的,特别是双特异性:它们以可变区结合抗原(典型的是例如外源结构或癌相关结构)并以Fc部分结合Fc效应物分子(例如各种免疫细胞上的Fc受体或补体蛋白),从而能够实现诸如ADCC、ADCP或CDC的效应。
Fc效应物分子通过免疫球蛋白分子Fc部分(对于IgG1,它由CH2和CH3结构域组成)结合,而且已经记载了许多方法通过改进抗体分子的Fc部分的结合来优化效应物功能,或是通过糖工程技术(glycoengineering technique)(US 6,602,684)或是通过蛋白质工程,后者或是直接在Fc处(US2005/0054832)或是间接通过Fc以外的工程改造(US 2005/02444403)。Fc区 与Fc受体的结合和/或与补体蛋白诸如Cq1的结合二者都已经通过此类技术改变。通常试图改进对此类Fc效应物分子的结合亲和力,因为它与改良的效应物功能有关。
通过本发明,有可能设计在天然Fc结合区以外结合Fc效应物分子的抗体。抗体结构域中除牵涉“天然”Fc效应物分子结合的环以外的经修饰的环可从文库中选择或者设计成结合一种或多种Fc效应物分子。具有此类额外Fc效应物分子结合位点的抗体将对某种Fc效应物分子或展示Fc效应物分子的效应细胞具有更强的亲合力,因此可比糖工程抗体或以其它方式改良的Fc区具有甚至更强的效果。然而,对于本发明的某些实施方案,不应直接改变待修饰的给定抗体的效应物特征,而是保持不受依照本发明的结构环中的修饰的影响。
抗体片段与完整抗体相比具有某些优势。片段通常具有较好的生物分布特性,而且可更加容易的生产。然而,大多数抗体片段设计缺乏效应物功能且具有较短的体内半衰期(Holliger P,et al.Nat Biotechnol.(2005)23:1126-36.)。
CH1或者Cκ或Cλ结构域都不介导效应物功能,这就是Fab不显示ADCC、ADCP或CDC的原因。WO 02/44215记载了由抗体的抗原结合位点和结合Fc效应物分子的肽组成的结合分子。以这样一种方式,可构建展示效应物功能的抗体片段。将肽掺入结合分子,位于既不破坏抗原结合也不破坏肽结合Fc效应物分子的能力的位置。
然而,依照本发明,对Fc效应物分子的结合可以用已经从免疫球蛋白结构域的固定支架中随机环序列文库中选择Fc效应物分子结合的经修饰的免疫球蛋白结构域来执行。因此,有可能选择不会在Ig结构域支架以外结合Fc效应物分子的特定环序列。得自本发明的多肽因此优选可以由超过100个氨基酸组成。
为了选择依照本发明的此类结构域的潜在效应物功能,可对突变CH1、Cκ或Cλ结构域的文库选择与Fc受体和/或补体因子诸如C1q的结合。
为了延长由这样的结构域(例如CH1、CH2、CH3、CH4、Cκ或Cλ)组成或包含它们的分子的体内半衰期,可以对突变体例如依照本发明的CH1、CH2、CH3、CH4、Cκ或Cλ结构域的文库选择与FcRn的结合。
供选择的FcRn受体可以在天然表达相应受体的细胞的表面上提供,或 者通过表达并纯化相应受体的胞外部分来提供。为了本发明的目的,对FcRn的第一筛选可以选择这样的突变结构域,它们可以在体外进一步测试和甚至通过与表达FcRn受体的细胞的结合在FACS实验中进一步表征。它可通过与各种重组FcRn、同种型和同种异型的结合的亲和力分级来进一步表征,例如通过表面等离振子共振技术。
依照本发明的一个优选实施方案,免疫球蛋白是人或鼠起源的。
既然经修饰的免疫球蛋白可用于各种目的,特别是药用组合物,那么免疫球蛋白优选是人或鼠起源的。当然,经修饰的免疫球蛋白也可以是人源化的或嵌合的免疫球蛋白。
依照本发明的另一个优选实施方案,人免疫球蛋白选自下组:IgA1、IgA2、IgD、IgE、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4和IgM。
鼠免疫球蛋白优选选自下组:IgA、IgD、IgE、IgG1、IgG2A、IgG2B、IgG2C、IgG3和IgM。
经修饰的免疫球蛋白可衍生自上文鉴定的免疫球蛋白类别之一。
免疫球蛋白优选包含免疫球蛋白的重链和/或轻链或其部分。
经修饰的免疫球蛋白可包含重链和/或轻链,至少一个可变区和/或恒定区。
依照本发明的免疫球蛋白优选包含免疫球蛋白的至少一个恒定区和/或至少一个可变区或其包括微型结构域的部分。
恒定区指免疫球蛋白分子恒定部分的免疫球蛋白折叠结构单元,也称为恒定区结构域(例如CH1、CH2、CH3、CH4、Ck、Cl)。
可变区指免疫球蛋白可变部分的免疫球蛋白折叠结构单元,也称为可变区结构域(例如Vh、Vk、Vl、Vd)。
依照本发明的一种优选免疫球蛋白由选自CH1、CH2、CH3、CH4、Igk-C、Igl-C的恒定区或其包括微型结构域的部分组成,具有至少一个环区域,其中所述至少一个环区域包含至少一处氨基酸修饰,形成至少一个经修饰的环区域,其中所述至少一个经修饰的环区域特异性结合至少一种抗原表位。
依照本发明的另一种优选免疫球蛋白由重链或轻链的可变区或其包括微型结构域的部分组成,具有至少一个环区域,其中所述至少一个环区域包含至少一处氨基酸修饰,形成至少一个经修饰的环区域,其中所述至少一个经修饰的环区域特异性结合至少一种抗原表位。
依照一个优选的实施方案,恒定区选自CH1、CH2、CH3、CH4、Igk-C、Igl-C及其组合。
依照本发明的经修饰的免疫球蛋白可包含一个或多个恒定区(例如至少两个、三个、四个、五个、六个、十个结构域)。如果经修饰的免疫球蛋白中存在超过一个结构域,那么这些结构域可以是相同类型或不同类型的(例如CH1-CH1-CH2、CH3-CH3)。当然,单一结构域的次序也可以是任何种类的(例如CH1-CH3-CH2、CH4-CH1-CH3-CH2)。
免疫球蛋白氨基酸序列的所有编号依照IMGT编号方案(IMGT,the international ImMunoGeneTics information systemimgt.cines.fr;http://imgt.cines.fr;Lefranc et al.,1999,Nucleic Acids Res.27:209-212;Ruiz et al.,2000Nucleic Acids Res.28:219-221;Lefranc et al.,2001,Nucleic Acids Res.29:207-209;Lefranc et al.,2003,Nucleic Acids Res.31:307-310;Lefranc et al.,2005,Dev Comp Immunol 29:185-203)。
依照本发明的另一个优选实施方案,CH1、CH2、CH3和CH4的经修饰的环区域包含第7-21位氨基酸、第25-39位氨基酸、第41-81位氨基酸、第83-85位氨基酸、第89-103位氨基酸和第106-117位氨基酸。
人起源的Igk-C和Igl-C的环区域优选包含第8-18位氨基酸、第27-35位氨基酸、第42-78位氨基酸、第83-85位氨基酸、第92-100位氨基酸、第108-117位氨基酸和第123-126位氨基酸。
鼠起源的Igk-C和Igl-C的环区域优选包含第8-20位氨基酸、第26-36位氨基酸、第43-79位氨基酸、第83-85位氨基酸、第90-101位氨基酸、第108-116位氨基酸和第122-125位氨基酸。
人起源的免疫球蛋白的可变区的结构环区域优选包含第8-20位氨基酸、第44-50位氨基酸、第67-76位氨基酸和第89-101位氨基酸。
依照本发明的一个优选实施方案,鼠起源的免疫球蛋白的可变区的结构环区域包含第6-20位氨基酸、第44-52位氨基酸、第67-76位氨基酸和第92-101位氨基酸。
上文鉴定的各免疫球蛋白的经修饰的氨基酸区域包含待修饰的环区域。
依照本发明的免疫球蛋白优选是骆驼起源的。
骆驼抗体只包含一条抗体,与由轻链和重链组成的正常抗体具有相同的抗原亲和力。因此,骆驼抗体比例如人抗体小得多,容许它们穿透稠密组织 达到抗原,而更大蛋白质则不能。此外,比较简单、亲和力和特异性高、及到达活性位点和与活性位点相互作用的潜力,骆驼的重链抗体在有临床价值的化合物的设计、生产和应用中呈现了优于常见抗体的优点。
骆驼起源的免疫球蛋白优选包含至少一个选自CH1、CH2和CH3的恒定区。
依照本发明的一个优选实施方案,骆驼免疫球蛋白的CH1、CH2和CH3的环区域包含第8-20位氨基酸、第24-39位氨基酸、第42-78位氨基酸、第82-85位氨基酸、第91-103位氨基酸和第108-117位氨基酸。
依照本发明的一个优选实施方案,经修饰的免疫球蛋白对分子的特异性结合通过选自下组的结合测定法测定:免疫学测定法优选优选酶联免疫吸附测定法(ELISA)、表面等离振子共振测定法、饱和转移差异核磁共振光谱法、转移NOE(trNOE)核磁共振光谱法、竞争测定法、组织结合测定法、活细胞结合测定法和细胞提取物测定法。
结合测定法可使用本领域知道的多种技术来进行,包括但不限于基于FRET(荧光共振能量转移)和BRET(生物发光共振能量转移)的测定法、AlphaScreenTM(放大的发光亲近同质测定法)、闪烁亲近测定法、ELISA(酶联免疫吸附测定法)、SPR(表面等离振子共振,也称为BIACORE TM)、等温滴定量热法、差示扫描量热法、凝胶电泳和层析,包括凝胶过滤。这些和其它方法可利用有些融合配偶体或标记物。
经修饰的免疫球蛋白优选偶联选自下组的标记物:有机分子、酶标记物、放射性标记物、有色标记物、荧光标记物、显色标记物、发光标记物、半抗原、洋地黄毒苷、生物素、金属配合物、金属、胶体金及其混合物。
经修饰的免疫球蛋白可偶联容许在例如结合测定法(例如ELISA)和结合研究中简单检测所述偶联物的其它分子。
本发明的另一个方面涉及由选自CH1、CH2、CH3、CH4、Igk-C、Igl-C的恒定区或其包括微型结构域的部分或其组合组成的免疫球蛋白,具有至少一个环区域,其中所述至少一个环区域包含至少一处氨基酸修饰,形成至少一个经修饰的环区域,其中所述至少一个经修饰的环区域特异性结合至少一种抗原表位。
优选在分子上组合至少一种经修饰的抗体结构域(=经非可变序列或结构环结合特定配偶体)与至少一种其它结合分子,后者可以是抗体、抗体片 段、可溶性受体、配体或另一种经修饰的抗体结构域。
所述分子选自蛋白质性质的分子、核酸和碳水化合物。
经修饰的免疫球蛋白的环区域可特异性结合任何种类的结合分子,特别是蛋白质性质的分子、蛋白质、肽、多肽、核酸、聚糖、碳水化合物、脂质、有机小分子、无机分子。当然,经修饰的免疫球蛋白可包含至少两个环区域,由此每个环区域可特异性结合其它分子或表位。
依照本发明的一个优选实施方案,结合经修饰的结构环区域的分子选自下组:肿瘤相关抗原,特别是EpCAM,肿瘤相关糖蛋白-72(TAG-72),肿瘤相关抗原CA125,***特异膜抗原(PSMA),高分子量黑素瘤相关抗原(HMW-MAA),表达Lewis Y相关碳水化合物的肿瘤相关抗原,癌胚抗原(CEA),CEACAM5,HMFG PEM,粘蛋白MUC1,MUC18和细胞角蛋白肿瘤相关抗原,细菌抗原,病毒抗原,变应原,荧光素,溶菌酶,toll样受体9,红细胞生成素,CD2,CD3,CD3E,CD4,CD11,CD11a,CD14,CD18,CD19,CD20,CD22,CD23,CD25,CD28,CD29,CD30,CD33(p67蛋白),CD38,CD40,CD40L,CD52,CD54,CD56,CD80,CD147,GD3,IL-1,IL-1R,IL-2,IL-2R,IL-4,IL-5,IL-6,IL-6R,IL-8,IL-12,IL-15,IL-18,IL-23,干扰素α,干扰素β,干扰素γ;TNF-α,TNF-β2,TNFα,TNFαβ,TNF-R1,TNF-RII,FasL,CD27L,CD30L,4-1BBL,TRAIL,RANKL,TWEAK,APRIL,BAFF,LIGHT,VEG1,OX40L,TRAIL受体-1,A1腺苷受体,淋巴毒素β受体,TACI,BAFF-R,EPO;LFA-3,ICAM-1,ICAM-3,整联蛋白β1,整联蛋白β2,整联蛋白α4/β7,整联蛋白α2,整联蛋白α3,整联蛋白α4,整联蛋白α5,整联蛋白α6,整联蛋白αv,αVβ3整联蛋白,FGFR-3,角质形成细胞生长因子,VLA-1,VLA-4,L-选择蛋白,抗Id,E-选择蛋白,HLA,HLA-DR,CTLA-4,T细胞受体,B7-1,B7-2,VNR整联蛋白,TGFβ1,TGFβ2,eotaxin1,BLyS(B淋巴细胞刺激物),补体C5,IgE,因子VII,CD64,CBL,NCA 90,EGFR(ErbB-1),Her2/neu(ErbB-2),Her3(ErbB-3),Her4(ErbB4),组织因子,VEGF,VEGFR,内皮缩血管肽受体,VLA-4,碳水化合物诸如血型抗原和相关碳水化合物,Galili糖基化,促胃液素,促胃液素受体,肿瘤相关碳水化合物,半抗原NP帽或NIP帽,T细胞受体α/β,E-选择蛋白,地高辛,胎盘碱性磷酸酶(PLAP)和睾丸PLAP样碱性磷酸酶,运铁蛋白受体,类肝素酶(Heparanase)I,人心肌球蛋白,糖 蛋白IIb/IIIa(GPIIb/IIIa),人巨细胞病毒(HCMV)gH包膜糖蛋白,HIV gp120,HCMV,呼吸道合胞病毒RSV F,RSVF Fgp,VNR整联蛋白,Hep B gp120,CMV,gpIIbIIIa,HIV IIIB gp120 V3环,呼吸道合胞病毒(RSV)Fgp,单纯疱疹病毒(HSV)gD糖蛋白,HSV gB糖蛋白,HCMV gB包膜糖蛋白,产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)毒素及其片段。
依照本发明的经修饰的免疫球蛋白可优选结合上文所公开的分子之一。这些分子还包括变应原。
依照本发明的另一个优选实施方案,修饰了CH3第15-17位、第29-34位、第85.4-85.3位、第92-94位、第97-98位和/或第108-110位的氨基酸残基。
依照本发明的免疫球蛋白的修饰优选是缺失、替换或***。
依照本发明,至少1个,优选至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个和15个氨基酸遭到缺失,用其它氨基酸(也用经修饰的氨基酸)替换,或***免疫球蛋白的环区域。然而,***免疫球蛋白环区域的氨基酸的最大数目不能超过30个,优选不超过25个,更优选不超过20个氨基酸。氨基酸替换和***优选通过本领域知道的、本专利申请中公开的方法随机发生。
依照一个具体实施方案,依照本发明的免疫球蛋白的特征在于当EpCam结合所述免疫球蛋白时CH3区包含SEQ ID No.16或SEQ ID No.18,当荧光素结合所述免疫球蛋白时CH3区包含SEQ ID No.20,当溶菌酶结合所述免疫球蛋白时CH3区包含SEQ ID No.22,24,26,28,30或32,当TLR9结合所述免疫球蛋白时CH3区包含SEQ ID No.34,36,38或40,而当溶菌酶和/或红细胞生成素结合所述免疫球蛋白时CH3区包含SEQ ID No.42。
依照本发明的一个具体实施方案,免疫球蛋白的特征在于在溶菌酶和gp41结合所述免疫球蛋白时它包含SEQ ID No.44或SEQ ID No.46。
经修饰的免疫球蛋白优选偶联选自下组的标记物或受体分子:有机分子、酶标记物、放射性标记物、有色标记物、荧光标记物、显色标记物、发光标记物、半抗原、洋地黄毒苷、生物素、金属配合物、金属、胶体金及其混合物。
偶联有上文指定的标记物的经修饰的免疫球蛋白可用于例如诊断方法。
本发明的另一个方面涉及依照本发明的或可通过依照本发明的方法获 得的免疫球蛋白用于制备供自动免疫接种(active immunization)的疫苗的用途。据此,免疫球蛋白或是作为抗原性药物物质用于配制疫苗或者用于钓取或捕获抗原性结构供疫苗配制剂之用。
本发明的另一个方面涉及依照本发明的或可通过依照本发明的方法获得的免疫球蛋白用于制备免疫球蛋白的蛋白质文库的用途。
本发明的还有一个方面涉及用于特异性结合和/或检测分子的方法,包括下列步骤:
(a)使依照本发明的经修饰的免疫球蛋白或可通过依照本发明的方法获得的经修饰的免疫球蛋白接触怀疑含有所述分子的测试样品,并
(b)检测特异性免疫球蛋白/分子复合物的潜在形成。
本发明的另一个方面涉及用于特异性分离某种分子的方法,包括下列步骤:
(a)使依照本发明的经修饰的免疫球蛋白或可通过依照本发明的方法获得的经修饰的免疫球蛋白接触含有所述分子的样品,
(b)分离形成的特异性免疫球蛋白/分子复合物,并
(c)任选从所述复合物分离该分子。
依照本发明的免疫球蛋白可用于从样品中特异性分离分子。如果使用多特异性免疫球蛋白,那么可以从样品中分离超过一种分子。在此类方法中使用经修饰的免疫球蛋白是尤其有利的,因为它容许例如生成具有同质表面且限定量的能够结合待分离分子的结合配偶体(即经修饰的免疫球蛋白)固定其上的基质。与之相反,如果使用单特异性结合配偶体,那么无法生成同质基质,因为单一结合配偶体并非以相同效率结合基质。
本发明的另一个方面涉及用于将化合物靶向靶物的方法,包括下列步骤:
(a)将能够特异性结合所述化合物的依照本发明的经修饰的免疫球蛋白或可通过依照本发明的方法获得的经修饰的免疫球蛋白与所述化合物接触,
(b)将特异性免疫球蛋白/化合物复合物投递至靶物。
依照本发明的经修饰的免疫球蛋白可用于将至少一种结合CDR和/或经修饰的环区域的化合物投递至靶物。此类免疫球蛋白可用于在疾病的治疗过程中将治疗性物质靶向优选作用部位。
本发明的另一个方面涉及包含依照本发明的或者可通过依照本发明的 方法获得的免疫球蛋白的蛋白质文库。
用于构建所述文库的优选方法可在上文和实施例中找到。依照本发明的文库可用于鉴定结合独特分子的免疫球蛋白。
具体而言,本发明涉及包含依照本发明的或者可通过依照本发明的方法获得的免疫球蛋白的蛋白质文库用于设计免疫球蛋白衍生物的用途。可改变现有的免疫球蛋白,通过使用各结构域的至少10种,优选100种,更优选1000种,更优选10000种,更优选100000种,最优选超过1000000种具有至少一个经修饰的环的变异结构域的蛋白质文库,将抗原结合位点引入任何结构域或微型结构域。然后对文库筛选对特定抗原的结合。在对期望特性进行分子表征后,通过遗传工程技术将选择的结构域或微型结构域克隆到最初的免疫球蛋白中,使得它替换野生型区域。或者,可以只交换编码环或编码突变氨基酸的DNA以获得具有对特定抗原的额外结合位点的免疫球蛋白。
突变的、抗原特异性的结构环的位点的选择取决于最初免疫球蛋白的结构和额外结合位点的目的。如果例如最初的分子是需要***额外抗原结合位点且不干扰效应物功能的完整免疫球蛋白,那么待修饰的环将从远离CH2和CH3的结构域中选择,CH2和CH3是Fc效应物分子的天然结合配偶体。如果最初的免疫球蛋白是Fab,那么有可能修饰轻链或重链的恒定区或可变区中的环。为了生成文库,可制备突变的最初分子的文库,它们在一个或多个结构域的一个或多个结构环中具有突变。对完整的、突变的最初分子的选择可具有一些优势,在于对经修饰的结构环选择抗原结合将瞄准空间有利的修饰,如果还测试突变型免疫球蛋白应当显示的其它特性的话。
突变的结构域或微型结构域或结构域融合分子的蛋白质文库的库容量要求(即变异蛋白质数目)取决于目标。一般而言,用于从头生成抗原结合位点的文库需要比用于进一步修饰早就存在的由经修饰的结构环构成的工程改造的抗原结合位点的文库(例如用于提高亲和力或改变对抗原的精细特异性)更大。
本发明还涉及包含多种免疫球蛋白的免疫球蛋白文库或核酸文库,例如恒定区或可变区、微型结构域和/或微型结构域中所包含的至少一个结构环区域、或者编码它们的核酸分子。文库包含具有不同修饰的成员,其中多数由至少一个结构环区域中的修饰限定。核酸文库优选包含至少10个不同成员(导致一处氨基酸交换),更优选包含至少100个,更优选1000个或10000 个不同成员(例如通过随机化策略或组合技术设计)。甚至更多多样化个体成员数,诸如至少1000000个或至少10000000个也是优选的。
本发明的另一个方面是选自至少两个依照本发明的文库的两种不同结构域或微型结构域的组合,以生成多特异性免疫球蛋白。这些选择的特定免疫球蛋白可相互组合,与其它分子组合,类似于积木(building block),以设计结构域或微型结构域的最佳排列以得到期望特性。
此外,可以将依照本发明的一种或多种经修饰的免疫球蛋白引入蛋白质的多个或所有可能的不同位点而不破坏蛋白质的结构。通过这样一种“结构域改组”技术,产生了可再次选择期望特性的新文库。
优选的文库包含依照本发明的,选自免疫球蛋白的结构域、微型结构域或其衍生物的免疫球蛋白。
本发明的一个优选实施方案是抗原的结合分子(抗原结合分子),所述抗原的结合分子包含至少一个免疫球蛋白结构域和结构环区域,所述结构环区域为结合抗原而依照本发明修饰的,其中所述结合分子不包含抗体的可变区。它可包含可用于抗体活性的其它部分(例如诸如天然的或经修饰的效应物区域(序列));然而,它在抗体的“天然”结合区即可变区的天然存在位置缺乏可变区。依照本发明的这些抗原结合分子具有上文关于现有分子描述的优势,但没有抗体的特异性结合活性;然而,具有在结构环区域中新引入的特异性结合活性。
优选的是,依照本发明的这些抗原结合分子包含CH1、CH2、CH3、CH4、Igk-C、Igl-C及其组合;所述组合包含至少两个,优选至少四个,尤其是至少六个恒定区且至少一个结构环区域依照本发明修饰。优选的是,这些结构环区域或是经依照本发明的结构环区域连接,或是经天然存在于两个此类恒定区之间的结构环连接。依照本发明的这些抗原结合分子的一个实施方案由在结构环中具有至少一处依照本发明的修饰的,抗体的Fc区组成。同样,对于依照本发明的抗原结合分子,优选结构环中新的抗原结合位点是通过随机化技术引入的,即通过随机化技术交换环的一个或多个氨基酸残基,或者通过将随机生成的***物引入此类结构环。或者,优选使用组合方法。
依照另一个方面,本发明涉及在一个或多个结构环中掺入了对未修饰免疫球蛋白而言外源的抗原结合位点的经修饰的免疫球蛋白。术语“外源的”意味着抗原结合位点不是由免疫球蛋白的特定区域天然形成的,而且外源的结 合配偶体而非免疫球蛋白的天然结合配偶体得到抗原结合位点的结合。这意味着结合配偶体,诸如Fc受体或免疫***的效应物,不认为受到对未修饰免疫球蛋白而言外源的抗原结合位点的结合。
优选的是,抗原选自:病原体抗原、肿瘤相关抗原、酶、底物、自身抗原、有机分子或变应原。更优选的抗原选自:病毒抗原、细菌抗原、或来自真核生物或噬菌体的抗原。优选的病毒抗原包括HAV、HBV、HCV、HIV I、HIV II、细小病毒、流感病毒、HSV、肝炎病毒、黄病毒、西尼罗河病毒、埃博拉病毒、痘病毒、天花病毒、麻疹病毒、疱疹病毒、腺病毒、***瘤病毒、多瘤病毒、细小病毒、鼻病毒、柯萨奇病毒、脊髓灰质炎病毒、艾柯病毒、日本脑炎病毒、登革病毒、蜱媒脑炎病毒、黄热病毒、冠状病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒、拉克罗斯病毒、拉沙病毒、狂犬病病毒、轮状病毒抗原;优选的细菌抗原包括假单胞菌、分枝杆菌、葡萄球菌、沙门氏菌、脑膜炎球菌、疏螺旋体、利斯特氏菌、奈瑟氏球菌、梭菌、埃希氏菌、军团菌、芽孢杆菌、乳杆菌、链球菌、肠球菌、棒杆菌、诺卡氏菌、红球菌、莫拉氏菌、布鲁氏菌、弯曲杆菌、肉杆菌、弗朗西丝氏菌、螺杆菌、嗜血菌、克雷伯氏菌、志贺氏菌、耶尔森氏菌、弧菌、衣原体、钩端螺旋体、立克次氏体、分枝杆菌、密螺旋体、巴尔通氏体抗原。病原性真核生物的优选真核生物抗原包括来自贾第鞭毛虫、弓形体、环孢菌、隐孢子虫、毛线虫、酵母、假丝酵母、曲霉、隐球酵母、芽生菌、组织胞浆菌、球孢菌的抗原。
依照本发明的优选免疫球蛋白包含至少两个抗原结合位点,第一位点结合第一表位而第二位点结合第二表位。
依照一个优选的实施方案,本发明的免疫球蛋白包含至少两个环区域,第一环区域结合第一表位而第二环区域结合第二表位。或是至少第一或至少第二环区域或者二者可包含结构环。依照本发明的免疫球蛋白包括其本领域知道有功能的、包含依照本发明的本质元件——依照本发明修饰的结构环区域的片段。
优选的是,依照本发明的免疫球蛋白由至少两个免疫球蛋白结构域或其包括微型结构域的部分构成,且每个结构域包含至少一个抗原结合位点。
还优选这样的依照本发明的免疫球蛋白,它包含免疫球蛋白的至少一个恒定区的结构域和/或可变区的至少一个结构域,或其包括微型结构域的部分。如此,例如C末端区域有修饰的可变区,或与经修饰的CH1区例如经 修饰的CH1微型结构域连接的可变区是优选实施方案之一。
依照本发明的优选免疫球蛋白包含与未修饰结构域具有至少50%同源性的结构域。
术语“同源性”表示多肽在一级、二级或三级结构的对应位置具有相同或保守的残基。该术语还延伸至编码同源多肽的两种或多种核苷酸序列。
“同源免疫球蛋白结构域”意味着依照本发明的免疫球蛋白结构域相对于本文中所公开的全长天然序列免疫球蛋白结构域序列或全长免疫球蛋白结构域序列的任何其它片段具有至少约50%的氨基酸序列同一性。优选的是,同源免疫球蛋白结构域将与本文中所公开的天然免疫球蛋白结构域序列或全长免疫球蛋白结构域序列的任何其它明确限定片段具有至少约50%的氨基酸序列同一性,优选至少约55%的氨基酸序列同一性,更优选至少约60%的氨基酸序列同一性,更优选至少约65%的氨基酸序列同一性,更优选至少约70%的氨基酸序列同一性,更优选至少约75%的氨基酸序列同一性,更优选至少约80%的氨基酸序列同一性,更优选至少约85%的氨基酸序列同一性,更优选至少约90%的氨基酸序列同一性,更优选至少约95%的氨基酸序列同一性。
关于本文中所鉴定的免疫球蛋白结构域序列的“百分比(%)氨基酸序列同一性”定义为对比序列并在必要时引入缺口以获取最大百分比序列同一性后,且不将任何保守替代视为序列同一性的一部分时,候选序列中与特定免疫球蛋白结构域序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分率。为测定百分比氨基酸序列同一性目的的对比可以本领域技术范围内的多种方式进行,例如使用公众可得到的计算机软件,诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可决定用于测量对比的适宜参数,包括对所比较序列全长获得最大对比所需的任何算法。
%氨基酸序列同一性值可使用WU-BLAST-2计算机程序(Altschul et al.,Methods in Enzymology 266:460-480(1996))如下所述获得。大多数WU-BLAST-2搜索参数设成缺省值。不设成缺省值的参数,即可调整参数设成如下值:交叠跨度=1,交叠分数=0.125,词阈值(T)=11,和评分矩阵=BLOSUM62。在采用WU-BLAST-2时,%氨基酸序列同一性值是通过将(a)通过WU-BLAST-2确定的具有衍生自天然免疫球蛋白结构域的序列的目的免疫球蛋白结构域氨基酸序列和目的比较氨基酸序列(即目的免疫球蛋白结 构域针对其进行比较的序列,它可以是未修饰的免疫球蛋白结构域)之间的匹配相同氨基酸残基数除以(b)目的免疫球蛋白结构域的未随机化部分的氨基酸残基总数确定的。例如,在叙述“包含与氨基酸序列B具有至少80%氨基酸序列同一性的氨基酸序列A的多肽”中,氨基酸序列A是目的比较氨基酸序列,氨基酸序列B是目的免疫球蛋白结构域的氨基酸序列。
在一个优选的实施方案中,依照本发明的免疫球蛋白是双特异性抗体或双特异性单链抗体。进一步优选的是免疫球蛋白包含双特异性结构域或其包括微型结构域的部分。
依照本发明的免疫球蛋白可用于本领域知道的关于免疫球蛋白的任何目的,但还使得依赖于通过本发明引入的特异性组合的应用成为可能。因此,依照本发明的免疫球蛋白优选用于治疗和预防用途(例如作为自动或被动免疫疗法);用于制备和分析用途;及用于诊断用途。
本发明的另一个方面涉及结合配偶体的试剂盒,包括:
(a)在一个或多个结构环中掺入对免疫球蛋白而言外源的抗原结合位点的经修饰的免疫球蛋白,和
(b)包含所述抗原表位的结合分子。
依照本发明的这种试剂盒的这样一种结合分子可用于鉴定依照本发明的经修饰的免疫球蛋白的结合特异性。通过使用依照本发明的这种试剂盒的,可测定依照本发明的经修饰的免疫球蛋白的效力(potency)。
效力在本文中定义为经修饰的分子对其抗原的结合特性。结合可以在特异性和/或亲和力和/或亲合力方面定量和/或定性测定,用于质量控制目的。
此外,依照本发明的试剂盒的结合分子可用于从由至少10种、优选至少100种、更优选至少1000种、更优选至少10000种、尤其至少100000种在结构环中具有不同修饰的免疫球蛋白组成的文库中选择依照本发明的经修饰的免疫球蛋白。
依照本发明,本发明的主要特色之一在于免疫球蛋白结构域的工程改造发生在正常情况下不牵涉抗原结合的区域中,换言之,在抗体的CDR以外的区域中。观察到免疫球蛋白结构域的特定折叠结构容许在结构与CDR类似但序列中位置不同的区域中引入随机突变。通过本发明鉴定的区域是像CDR一样连接免疫球蛋白折叠结构的β折叠链的环区域。
更具体的说,本文中描述了通过在连接人IgG1 CH3结构域的β折叠链 A-B和E-F的环中引入随机突变,选择了特异性结合Toll样受体9肽(TLR-9)或鸡卵溶菌酶的突变型CH3结构域,Toll样受体9肽(TLR-9)和鸡卵溶菌酶分别是在正常情况下不受人IgG1的CH3结构域识别和结合的肽和蛋白质。由我们引入的突变包括其中在野生型序列中选择的氨基酸残基用随机选择的残基替换的突变,它们还包括在上文所述环中***额外氨基酸残基。
通过类推,来自任何类别的免疫球蛋白和来自任何物种的免疫球蛋白的免疫球蛋白结构域都适用于这种类型的工程改造。此外,不仅可操作本发明所瞄准的特定环,而且可以相同方式操作免疫球蛋白中连接β折叠链的任何环。
来自任何生物体和来自任何类别免疫球蛋白的工程改造的免疫球蛋白结构域可依照本发明使用,或是就这样(作为单一结构域)或者作为更大分子的一部分。例如,它们可以是完整免疫球蛋白的一部分,该完整免疫球蛋白因此将具有其由6个CDR形成的“正常”抗原结合区和新的工程改造的抗原结合区。像这样,可生成多特异性,例如双特异性免疫球蛋白。工程改造的免疫球蛋白结构域还可以是任何融合蛋白的一部分。这些工程改造的免疫球蛋白结构域的用途在免疫球蛋白的一般用途领域中。
本文中将下列免疫球蛋白的结构域理解为免疫球蛋白结构域:
对IgG、IgD和IgA:VL、CL、VH、CH1、CH2、CH3;
对IgM和IgE:VL、CL、VH、CH1、CH2、CH3、CH4。
1.单一免疫球蛋白结构域,一侧随机化,即连接β折叠链B-C、D-E或F-G(“尖端”,除了被许多专利覆盖的可变区)或者β折叠链A-B、C-D(在可变区的情况中是C-C′和C″-D)或E-F(“底部”)的环中。可随机化单一环或任何环组合。可改变、缺失残基,或者可***额外残基。
2.单一免疫球蛋白结构域,在尖端和底部两侧都随机化。
3.包含单一随机化结构域之一的任何蛋白质,诸如:
a)“单链CH3”二聚体(scCH3)、scCH2、scCH1/CL,一侧或两侧随机化
b)单链Fv,“底部”随机化,即CDR的对侧
c)Fab片段,“底部”随机化,即CH1和CL结构域的C末端
d)Fc片段(即由CH2-CH3组成的蛋白质),一侧或两侧随机化
e)完整免疫球蛋白,Fc底物随机化
f)其它合适的结构域
单一结构域的主要优势与用于倡仪骆驼VH分子(“nanobodies”(纳米抗体),参阅www.ablynx.com)的所有论点非常相似。随机化免疫球蛋白结构域是非常小的蛋白质(分子量约12-15kDa,取决于***的氨基酸残基数),因此与常规抗体或抗体片段诸如scFv和Fab相比将具有下列优势:识别不常见的或隐藏的表位,结合到蛋白质靶物的空腔或活性位点中,易于制造,及许多其它的。在两侧都随机化的免疫球蛋白结构域的情况中,可生成二价或双特异性分子。作为融合蛋白一部分的单一结构域的主要优势在于可在任何其它蛋白质上工程改造额外结合特性。
设想了任何表达***都可用于制备蛋白质。本文中所描述的单一结构域的类似物可在来自骆驼的抗体中找到,它只具有VH但没有VL。在这些蛋白质,只有3个CDR(而非“正常”抗体中的6个)负责抗原结合。
将下列专利参考文献收入本文作为参考,就像完整列出它们一样:
US 6,294,654 Modified immunoglobulin molecule incorporating an antigen in a non-CDR loop region(在非CDR环区中掺入抗原的改良免疫球蛋白分子)
US 5,844,094 Target binding polypeptide(靶结合多肽)
US 5,395,750 Methods for producing proteins which bind to predetermined antigens(用于生成结合预定抗原的蛋白质的方法)
US 2004/0071690 High avidity polyvalent and polyspecific reagents(高亲合力、多价和多特异性试剂)
US 2004/0018508 Surrogate antibodies and methods of preparation and use thereof(代用抗体及其制备和使用方法)
US 2003/0157091 Multi-functional proteins(多功能蛋白质)
US 2003/0148372 Method to screen phage display libraries with different ligands(用不同配体筛选噬菌体展示文库的方法)
US 2002/0103345 Bispecific immunoglobulin-like antigen binding proteins and method of production(双特异性免疫球蛋白样抗原结合蛋白质及生产方法)
US 2004/0097711 Immunoglobulin superfamily proteins(免疫球蛋白超家族蛋白质)
US 2004/0082508 Secreted proteins(分泌型蛋白质)
US 2004/0063924 Secreted proteins(分泌型蛋白质)
US 2004/0043424 Immunoglobulin superfamily proteins(免疫球蛋白超家族蛋白质)
US 5,892,019 Production of a single-gene-encoded immunoglobulin(单基因编码的免疫球蛋白的生成)
US 5,844,094Target binding polypeptide(靶结合多肽)
下面的附图和实施例进一步例示而非限制本发明。
图1a显示了完整IgG1的结构。箭头标示各结构域。
图1b图示了人免疫球蛋白主要同种型单体的结构组织。二硫键以线表示,N连接碳水化合物基团以圆表示。
图2显示了免疫球蛋白恒定区(左图)和可变区(右图)的免疫球蛋白折叠结构。箭头标示β折叠链。
图3显示了依照本发明的工程改造的CH3结构域的分子模型,随机化部分以溶剂可到达表面标示。所述表面以圈围绕。
图4显示了用于生成装配突变型CH3结构域所用片段的PCR的示意图。箭头标示PCR引物,它们各自采取5’-3’取向,而垂直线标示为了装配突变型基因而引入的限制性位点的大致位置。引物上包含下列限制性位点供PCR片段的连接之用:CH3LNCO:NcoI;CH3LSAC和CH3CSAC:SacI;CH3CHIN和CH3RHIN:HindIII;CH3RNOT:NotI。
图5显示了如何使用本申请的免疫球蛋白结构域的一些例子。以星形符号表示随机化区域。一个分子中的随机化区域的特异性可以是相同的或者是不同的。
图6显示了双特异性工程改造的CH3结构域的设计示意图。框中给出了引物的名称,箭头标示引物的延伸方向。带倾斜线的框标示此构建物中随机化的区域的相对位置,带垂直线的框标示为了生成克隆C24而引入的区域的相对位置,而且给出了用于克隆程序的限制性位点。
图7显示了双特异性工程改造的CH3结构域的设计示意图。显示了双特异性工程改造的CH3结构域的基本设计的核苷酸序列及其翻译结果。红色序列标示为了生成双特异性构建物而随机化的区域,而绿色框标示其中序列为了生成克隆C24而随机化的区域。
图8显示了本文中所公开的序列的序列表。
具体实施例的描述
实施例1:CH3文库的构建和噬菌体表面展示
使用Brookhaven数据库中条目1OQO.pdb公开的IgG1 Fc片段的晶体结构来辅助设计突变型CH3结构域。
作为CH3文库构建的基础使用的序列见SEQ ID No.1。在此序列中,第一个氨基酸对应于Brookhaven数据库条目1OQO.pdb的A链的脯氨酸343。1OQO.pdb中所含最后一个残基是SEQ ID No.1的丝氨酸102。在详细分析1OQO.pdb的结构并直观检查形成连接β链的环的残基后,决定将残基17、18和19(它们是连接β链A-B的环的一部分)以及残基71、72、73、76和77(它们是连接SEQ ID No.1的β链E-F的环的一部分)随机化。工程改造CH3结构域的分子模型见图3,以溶剂可到达表面标示随机化部分。通过一系列PCR反应,接着连接所得PCR产物,生成工程改造基因。为了便于连接,修饰编码SEQ ID No.1的核苷酸序列的有些密码子以生成限制性位点但不改变氨基酸序列(沉默突变)。为了***克隆载体pHEN1(Nucleic Acids Res.1991 Aug 11;19(15):4133-7.Multi-subunit proteins on surface of filamentous phage:methodologies for displaying antibody(Fab)heavy and light chains.Hoogenboom HR,Griffiths AD,Johnson KS,Chiswell DJ,Hudson P,Winter G.),与pelB分泌信号处于同一读码框,在序列的5’末端附着编码Met-Ala的额外核苷酸残基以生成NcoI限制性位点。对于随机化残基,选择编码所有20种天然存在氨基酸但避免3种终止密码子中2种的密码子NNS(IUPAC代码,其中S指C或G)。工程改造序列的核苷酸序列见SEQ ID No.2,氨基酸序列见SEQ ID No.3。SEQ ID No.3中的字母X表示随机化氨基酸残基。用于装配突变型CH3结构域的PCR引物的序列见SEQ ID No.4-9。图4显示了为了装配突变基因而生成的PCR片段及所用引物的示意图。
使用人单克隆抗体3D6的重链的cDNA(Felgenhauer M,Kohl J,Rüker F.Nucleotide sequences of the cDNAs encoding the V-regions of H-and L-chains of a human monoclonal antibody specific to HIV-1-gp41.Nucleic Acids Res.1990 Aug 25;18(16):4927)作为PCR反应的模板。将3种PCR产物分别用SacI和/或HindIII消化并连接到一起。将连接产物进一步用NcoI和NotI消 化并连接到已经用NcoI和NotI消化过的表面展示噬菌粒载体pHEN1中。选择许多克隆通过限制性分析和DNA测序进行检验,发现它们包含计划的***物,包括正确***的随机化序列。制备噬菌体的后续步骤遵循标准方案。简而言之,将连接混合液通过电穿孔转化到大肠杆菌TG1细胞中。随后用辅助噬菌体M13-KO7从大肠杆菌TG1细胞回收(rescue)噬菌体颗粒。然后以2步用PEG/NaCl从培养物上清液沉淀噬菌体颗粒,溶于水,并用于通过淘选进行的选择,或者保存于-80℃。
实施例2:CH3+3文库的构建
此文库以与CH3文库相同的方式构建和克隆。构建物的氨基酸序列见SEQ ID No.10,对应的核苷酸序列见SEQ ID No.11,而构建所用引物见SEQ ID No.4-7、SEQ ID No.9和SEQ ID No.12。
实施例3:CH3+5文库的构建
此文库以与CH3文库相同的方式构建和克隆。构建物的氨基酸序列见SEQ ID No.13,对应的核苷酸序列见SEQ ID No.14,而构建所用引物见SEQ ID No.4-7、SEQ ID No.9和SEQ ID No.15。
实施例4:CH3噬菌体文库对TLR-9肽的淘选
依照标准方案进行3轮淘选。简而言之,应用如下方法。用代表Toll样受体9(TLR-9)的部分序列的合成肽包被Maxisorp 96孔板(Nunc)。向每个孔中加入200μl下列溶液:0.1M碳酸钠缓冲液,pH 9.6,含下列浓度的溶解的肽:
第1轮淘选:1mg/ml TLR-9肽
第2轮淘选:500μg/ml TLR-9肽
第3轮淘选:100μg/ml TLR-9肽
于37℃温育1小时,接着每个孔用200μl2%奶粉(M-PBS)于室温封闭1小时。
然后通过添加100μl噬菌体悬浮液和100μl4%奶粉(M-PBS),接着于室温振摇温育45分钟、静置温育90分钟,容许表面展示噬菌体文库与所结合的肽反应。
如下洗去未结合的噬菌体颗粒。在第1轮淘选后:10x300μl T-PBS,5x300μl PBS;在第2轮淘选后:15x300μl T-PBS,10x300μl PBS;在第3轮淘选后:20x300μl T-PBS,20x300μl PBS。
通过向每个孔中添加200μl0.1M甘氨酸pH 2.2并于室温振摇温育30分钟,进行所结合噬菌体颗粒的洗脱。随后,通过添加60μl2M Tris-碱中和噬菌体悬浮液,接着通过混合10ml指数式生长的培养物与0.5ml洗脱的噬菌体并于37℃温育30分钟,感染到大肠杆菌TG1细胞中。最后,将受感染的细菌涂布在含1%葡萄糖和100μg/ml氨苄青霉素的TYE培养基上,并于30℃温育过夜。
表1:CH3-噬菌体文库对TLR-9肽的淘选结果(噬菌体滴度)
淘选轮次 淘选时TLR-9的浓度 输入(噬菌体/ml) 输出(噬菌体/ml)
第1轮 1mg/ml 6x1018 2x1010
第2轮 0.5mg/ml 4x1018 2x1010
第3轮 0.1mg/ml 4x1022 6x1010
实施例5:克隆针对TLR-9选择的CH3突变体的选定克隆供可溶性表达
用微量制备试剂盒(midi-prep)分离来自通过3轮淘选选择的噬菌体的噬菌粒DNA。通过PCR分批扩增编码突变的CH3区的DNA,并以NcoI-NotI克隆到载体pNOTBAD/Myc-His中,该载体是***了NotI限制性位点以便于克隆的大肠杆菌表达载体pBAD/Myc-His(Invitrogen)。通过电穿孔将连接构建物转化到大肠杆菌LMG194细胞(Invitrogen)中,并于30℃在含1%葡萄糖和氨苄青霉素的TYE培养基上培养过夜。将选择的克隆接种到200μl含氨苄青霉素的2xYT培养基中,于30℃培养过夜,并通过添加L-***糖至终浓度0.1%而诱导。于16℃表达过夜后,通过离心收获细胞,并用100μl硼酸钠缓冲液pH 8.0于4℃处理过夜以制备周质提取物。取50μl周质提取物用于ELISA(见下文)。
实施例6:针对TLR-9选择的CH3突变体的ELISA
通过ELISA对选择的克隆测定对TLR-9肽的特异性结合。
包被:微量滴定板(NUNC,Maxisorp),100μl/孔,20μg TLR-9肽/ml0.1M 碳酸钠缓冲液pH 9.6,37℃,1小时
清洗:3x200μl PBS
封闭:1%BSA-PBS,室温,1小时
清洗:3x200μl PBS
周质提取物结合:50μl周质提取物,50μl2%BSA-PBS,室温,过夜
清洗:3x200μl PBS
一抗:抗His4(Qiagen),1:1000在1%BSA-PBS中稀释,室温,90分钟,100μl/孔
清洗:3x200μl PBS
二抗:山羊抗小鼠*HRP(SIGMA),1:1000在1%BSA-PBS中稀释,室温,90分钟,100μl/孔
清洗:3x200μl PBS
检测:3mg/ml OPD溶于Na-柠檬酸/磷酸缓冲液pH 4.5,0.4μl30%H2O2
停止:100ml3M H2SO4
吸光度读数:492/620nm
将在此第一次、初步ELISA中给出高信号的克隆如上所述以相同条件在20ml体积中培养。如上所述在1/20培养物体积中分离它们的周质提取物并通过ELISA(如上所述)测试供确认。
表2:确认ELISA的结果
背景(只有抗原)(12个平行读数):0.0115
实施例7:CH3和CH3+5噬菌体文库对鸡卵溶菌酶的淘选
进行3轮淘选。通过向每个孔中添加200μl下列溶液,用鸡卵溶菌酶包被Maxisorp 96孔板(Nunc):
PBS,含下列浓度溶解的鸡卵溶菌酶:
第1轮淘选:2mg/ml HEL
第2轮淘选:1mg/ml HEL
第3轮淘选:1mg/ml HEL
于37℃温育1小时,接着每个孔用200μl2%奶粉(M-PBS)于室温封闭1小时。
然后通过添加100μl噬菌体悬浮液和100μl4%奶粉(M-PBS),接着于室温振摇温育45分钟、静置温育90分钟,容许表面展示噬菌体文库与所结合的鸡卵溶菌酶反应。
如下洗去未结合的噬菌体颗粒:
第1轮淘选:10x300μl T-PBS,5x300μl PBS
第2轮淘选:15x300μl T-PBS,10x300μl PBS
第3轮淘选:20x300μl T-PBS,20x300μl PBS。
通过向每个孔中添加200μl0.1M甘氨酸pH2.2并于室温振摇温育30分钟,进行所结合噬菌体颗粒的洗脱。随后,通过添加60μl2M Tris-碱中和噬菌体悬浮液,接着通过混合10ml指数式生长的培养物与0.5ml洗脱的噬菌体并于37℃温育30分钟,感染到大肠杆菌TG1细胞中。最后,将受感染的细菌涂布在含1%葡萄糖和100μg/ml氨苄青霉素的TYE培养基上,并于30℃温育过夜。
表3:噬菌体文库CH3对鸡卵溶菌酶的淘选结果(噬菌体滴度)
淘选轮次 淘选时HEL的浓度 输入(噬菌体/ml) 输出(噬菌体/ml)
第1轮 2mg/ml 4.7x1010
第2轮 1mg/ml 1.29x1022 8.0x109
第3轮 1mg/ml 5.71x1020 4.8x1010
表4:噬菌体文库CH3+5对鸡卵溶菌酶(HEL)的淘选结果(噬菌体滴度)
淘选轮次 淘选时HEL的浓度 输入(噬菌体/ml) 输出(噬菌体/ml)
第1轮 2mg/ml 8.3x1016 2.9x109
第2轮 1mg/ml 2.1x1019 2.6x109
第3轮 1mg/ml 5.4x1019 1.2x1010
实施例8:克隆实施例7的选定克隆供可溶性表达
如上文关于针对TLR-9选择的CH3突变体所述,进行选定克隆的克隆供可溶性表达。
实施例9:实施例7的选定克隆的可溶性表达
如上文关于针对TLR-9选择的CH3突变体所述,进行选定克隆的可溶性表达。在初步ELISA(方案见实施例10)中测试周质提取物。
将在此第一次、初步ELISA中给出高信号的克隆如上所述以相同条件在20ml体积中培养。如上所述在1/20培养物体积中分离它们的周质提取物并通过ELISA(如实施例10所述)测试供确认。
实施例10:针对鸡卵溶菌酶选择的CH3突变体的ELISA
包被:微量滴定板(NUNC,Maxisorp),100μl/孔,100μg鸡卵溶菌酶/mlPBS,37℃,1小时
清洗:3x200μl PBS
封闭:1%BSA-PBS,室温,1小时
清洗:3x200μl PBS
周质提取物结合:50μl周质提取物,50μl2%BSA-PBS,室温,过夜
清洗:3x200μl PBS
一抗:抗His4(Qiagen),1:1000在1%BSA-PBS中稀释,室温,90分钟,100μl/孔
清洗:3x200μl PBS
二抗:山羊抗小鼠*HRP(SIGMA),1:1000在1%BSA-PBS中稀释,室温,90分钟,100μl/孔
清洗:3x200μl PBS
检测:3mg/ml OPD溶于Na-柠檬酸/磷酸缓冲液pH 4.5,0.4μl30%H2O2
停止:100ml 3M H2SO4
吸光度读数:492/620nm
表5:针对鸡卵溶菌酶选择的CH3突变体的确认ELISA的结果
背景(只有抗原)(12个平行读数):0.1763
表6:针对鸡卵溶菌酶选择的CH3突变体的抗原稀释的确认ELISA的结果
nc:未添加周质提取物
注意到鸡卵溶菌酶与抗his4抗体起反应,因此观察到相对较高的背景。
表7:针对鸡卵溶菌酶选择的CH3+5突变体的确认ELISA的结果
背景(只有抗原)(12个平行读数):0.1334
注意:鸡卵溶菌酶与抗his4抗体起反应,因此观察到相对较高的背景。
实施例11:CL文库
对Fab片段晶体结构的直观检查(使用人单克隆抗体3D6的Fab的结构:RSCB蛋白质数据库(http://www.rcsb.org/pdb/)条目1DFB.PDB(He XM,et al.Proc Natl Acad Sci U S A.1992 Aug 1;89(15):7154-8)及此蛋白质的二级和三级结构的计算机辅助分析(例如Protein Explorer用于此目的(http://molvis.sdsc.edu/protexpl/frntdoor.htm)))容许鉴定位于连接CL结构域支架的β链的环区中的残基。这些残基包括第8-18位氨基酸、第27-35位氨基酸、第42-78位氨基酸、第83-85位氨基酸、第92-100位氨基酸、第108-117位氨基酸和第123-126位氨基酸(编号依照IMGT编号***(Lefranc MP,et al.Nucleic Acids Res.2005 Jan 1;33(Database issue):D593-7;Lefranc MP,et al.Dev Comp Immunol.2005;29(3):185-203))。
更具体的说,将人CL结构域内的残基11、12、14-18及92-95随机化(SEQ ID No.48)。随机化是通过用其中相关密码子的位置以核苷酸序列5’-NNS-3’编码的PCR引物PCR扩增编码序列实现的,5’-NNS-3’潜在编码所有20种氨基酸,同时避免3种终止密码子中的2种。通过两个分开的PCR反应扩增文库***物,并将两个PCR片段经通过PCR引物作为沉默突变引入的HpyCH4IV限制性位点连接到一起。引物还分别提供了限制性内切核酸酶位点NcoI和NotI供克隆到噬菌体展示载体pHEN中(Hoogenboom HR,et al.Nucleic Acids Res.1991 Aug 11;19(15):4133-7)。噬菌体展示不包含CL结构域的C末端半胱氨酸,但是可以稍后在使用改良CL克隆时添加,例如用于构建Fab片段。
使用包含人单克隆抗体的完整轻链作为***物的质粒,诸如pRcCMV-3D6LC(Rüker F,et al.Ann N Y Acad Sci.1991 Dec 27;646:212-9),作 为PCR扩增的模板。
对于在CL结构域的第92和95位之间包含***的额外残基的CL+3(SEQ ID No.50,51)和CL+5(SEQ ID No.52,53)文库,分别使用引物CLRHPY3和CLRHPY5代替引物CLRHPY。
下文显示了克隆到pHEN1的NcoI位点中,导致pelB前导序列附着于构建物的N末端的PCR和连接终产物的核苷酸和氨基酸序列(SEQ ID No.48,49):
用于CL文库的引物表:
cllnco:5′-cttaccatgg ccgtggctgc accatctgtc ttcatcttcc cgccatctnn snnscagnns nnsnnsnnsn nsgcctctgt tgtgtgc-3′(SEQ ID No.56)
cllhpy:5′-tgacaacgtc agggtgctgc tgaggc-3′(SEQ ID No.57)
clrhpy:5′-tcagaacgtt gnnsnnsnns nnstacgaga aacacaaagt c-3′(SEQ ID No.58)
clrhpy3:5′-tcagaacgtt gnnsnnsnns nnsnnsnnsn nstacgagaa acacaaagtc-3′(SEQ ID No.59)
clrhpy5:5′-tcagaacgtt gnnsnnsnns nnsnnsnnsn nsnnsnnsta cgagaaacac aaagtc-3′(SEQ ID No.60)
clrnot:5′-catcgcggcc gcctctcccc tgttgaagct c-3′(SEQ ID No.61)
选择许多文库克隆(在噬菌粒载体pHEN1中克隆的突变的CL结构域)通过限制性分析和DNA测序进行检验,发现它们包含计划的***物,包括正确***的随机化序列。制备噬菌体的后续步骤遵循标准方案。简而言之,将连接混合液通过电穿孔转化到大肠杆菌TG1细胞中。随后用辅助噬菌体M13-KO7从大肠杆菌TG1细胞回收(rescue)噬菌体颗粒。然后以2步用PEG/NaCl从培养物上清液沉淀噬菌体颗粒,溶于水,并用于通过淘选进行的选择,或者它们可保存于-80℃。
实施例12:CH1文库
对Fab片段晶体结构的直观检查(使用人单克隆抗体3D6的Fab的结构:RSCB蛋白质数据库(http://www.rcsb.org/pdb/)条目1DFB.PDB(He XM,et al.Proc Natl Acad Sci U S A.1992 Aug 1;89(15):7154-8)及此蛋白质的二级和三级结构的计算机辅助分析(Protein Explorer用于此目的(http://molvis.sdsc.edu/protexpl/frntdoor.htm)))容许鉴定位于连接CH1结构域支架的β链的环区中的残基。这些残基包括第7-21位氨基酸、第25-39位氨基酸、第41-81位氨基酸、第83-85位氨基酸、第89-103位氨基酸和第106-117氨基酸(编号依照IMGT编号***)。
更具体的说,将人CH1结构域内的残基12-19及93-100随机化(SEQ ID No.54,55)。随机化是通过用其中相关密码子的位置以核苷酸序列5’-NNS-3’ 编码的PCR引物PCR扩增编码序列实现的,5’-NNS-3’潜在编码所有20种氨基酸,同时避免3种终止密码子中的2种。通过两个分开的PCR反应扩增文库***物,并将两个PCR片段经CH1结构域中天然存在的BstEII限制性位点连接到一起。引物还分别提供了限制性内切核酸酶位点NcoI和NotI供克隆到噬菌体展示载体pHEN中。噬菌体展示不包含CH1结构域的C末端半胱氨酸,但是可以稍后在使用改良CH1克隆时添加,例如用于构建Fab片段。
使用包含人单克隆抗体的完整重链作为***物的质粒,诸如pRcCMV-3D6HC,作为PCR扩增的模板。
下文显示了克隆到pHEN1的NcoI位点中,导致pelB前导序列附着于构建物的N末端的PCR和连接终产物的核苷酸和氨基酸序列(SEQ ID No.54,55):
用于CH1文库的引物表:
CH1LNCO:5′-acgtccatgg ccgcctccac caagggccca tcggtcttcc ccctggcacc ctcctccnns nnsnnsnnsn nsnnsnnsnn sgccctgggc tgcctggtc-3′(SEQ ID No.62)
CH1LBST:5′-ggcacggtca ccacgctgct gag-3′(SEQ ID No.63)
CH1RBST:5′-agcgtggtga ccgtgcccnn snnsnnsnns nnsnnsnnsa cctacatctg caacgtgaat c-3′(SEQ ID No.64)
CH1RNOT:5′-catagcggcc gcagatttgg gctcaacttt cttgtc-3′(SEQ ID No.65)
选择许多文库克隆(在噬菌粒载体pHEN1中克隆的突变的CH1结构域)通过限制性分析和DNA测序进行检验,发现它们包含计划的***物,包括正确***的随机化序列。制备噬菌体的后续步骤遵循标准方案。简而言之,将连接混合液通过电穿孔转化到大肠杆菌TG1细胞中。随后用辅助噬菌体M13-KO7从大肠杆菌TG1细胞回收(rescue)噬菌体颗粒。然后以2步用PEG/NaCl从培养物上清液沉淀噬菌体颗粒,溶于水,并用于通过淘选进行的选择,或者它们可保存于-80℃。
实施例13:CH1噬菌体文库对鸡卵溶菌酶(HEL)的淘选
用CH1噬菌体文库进行3轮淘选(见实施例12)。通过向每个孔中添加200μl下列溶液,用鸡卵溶菌酶包被Maxisorp 96孔板(Nunc):PBS,含下列浓度溶解的鸡卵溶菌酶:
第1轮淘选:2mg/ml HEL
第2轮淘选:1mg/ml HEL
第3轮淘选:1mg/ml HEL
于37℃温育1小时,接着每个孔用200μl2%奶粉(M-PBS)于室温封闭1 小时。
然后通过添加100μl噬菌体悬浮液和100μl 4%奶粉(M-PBS),接着于室温振摇温育45分钟、静置温育90分钟,容许表面展示噬菌体文库与所结合的鸡卵溶菌酶反应。
如下洗去未结合的噬菌体颗粒:
第1轮淘选:10x300μl T-PBS,5x300μl PBS
第2轮淘选:15x300μl T-PBS,10x300μl PBS
第3轮淘选:20x300μl T-PBS,20x300μl PBS。
通过向每个孔中添加200μl0.1M甘氨酸pH 2.2并于室温振摇温育30分钟,进行所结合噬菌体颗粒的洗脱。随后,通过添加60μl 2M Tris-碱中和噬菌体悬浮液,接着通过混合10ml指数式生长的培养物与0.5ml洗脱的噬菌体并于37℃温育30分钟,感染到大肠杆菌TG1细胞中。最后,将受感染的细菌涂布在含1%葡萄糖和100μg/ml氨苄青霉素的TYE培养基上,并于30℃温育过夜。
克隆针对溶菌酶选择的CH1突变体的选定克隆供可溶性表达
用微量制备试剂盒(midi-prep)分离来自通过3轮淘选选择的噬菌体的噬菌粒DNA。通过PCR分批扩增编码突变的CH1结构域的DNA,并以NcoI-NotI克隆到载体pNOTBAD/Myc-His中,该载体是***了NotI限制性位点以便于克隆的大肠杆菌表达载体pBAD/Myc-His(Invitrogen)。通过电穿孔将连接构建物转化到大肠杆菌LMG194细胞(Invitrogen)中,并于30℃在含1%葡萄糖和氨苄青霉素的TYE培养基上培养过夜。将选择的克隆接种到200μl含氨苄青霉素的2xYT培养基中,于30℃培养过夜,并通过添加L-***糖至终浓度0.1%而诱导。于16℃表达过夜后,通过离心收获细胞,并用100μl硼酸钠缓冲液pH 8.0于4℃处理过夜以制备周质提取物。取50μl周质提取物用于ELISA。
将在此第一次、初步ELISA中给出高信号的克隆如上所述以相同条件在20ml体积中培养。如上所述在1/20培养物体积中分离它们的周质提取物并通过ELISA(如下所述)测试供确认。
针对鸡卵溶菌酶选择的CH1突变体的ELISA
包被:微量滴定板(NUNC,Maxisorp),100μl/孔,100μg鸡卵溶菌酶/mlPBS,37℃,1小时
清洗:3x200μl PBS
封闭:1%BSA-PBS,室温,1小时
清洗:3x200μl PBS
周质提取物结合:50μl周质提取物,50μl2%BSA-PBS,室温,过夜
清洗:3x200μl PBS
一抗:抗His4(Qiagen),1:1000在1%BSA-PBS中稀释,室温,90分钟,100μl/孔
清洗:3x200μl PBS
二抗:山羊抗小鼠*HRP(SIGMA),1:1000在1%BSA-PBS中稀释,室温,90分钟,100μl/孔
清洗:3x200μl PBS
检测:3mg/ml OPD溶于Na-柠檬酸/磷酸缓冲液pH 4.5,0.4μl30%H2O2
停止:100ml3M H2SO4
吸光度读数:492/620nm
若克隆的ELISA信号是背景信号的至少3倍,则认为它是阳性的。
实施例14:CL噬菌体文库对鸡卵溶菌酶(HEL)的淘选
用CL噬菌体文库进行3轮淘选(见实施例11)。通过向每个孔中添加200μl下列溶液,用鸡卵溶菌酶包被Maxisorp 96孔板(Nunc):PBS,含下列浓度溶解的鸡卵溶菌酶:
第1轮淘选:2mg/ml HEL
第2轮淘选:1mg/ml HEL
第3轮淘选:1mg/ml HEL
于37℃温育1小时,接着每个孔用200μl2%奶粉(M-PBS)于室温封闭1小时。
然后通过添加100μl噬菌体悬浮液和100μl4%奶粉(M-PBS),接着于室温振摇温育45分钟、静置温育90分钟,容许表面展示噬菌体文库与所结合的鸡卵溶菌酶反应。
如下洗去未结合的噬菌体颗粒:
第1轮淘选:10x300μl T-PBS,5x300μl PBS
第2轮淘选:15x300μl T-PBS,10x300μl PBS
第3轮淘选:20x300μl T-PBS,20x300μl PBS。
通过向每个孔中添加200μl0.1M甘氨酸pH 2.2并于室温振摇温育30分钟,进行所结合噬菌体颗粒的洗脱。随后,通过添加60μl2M Tris-碱中和噬菌体悬浮液,接着通过混合10ml指数式生长的培养物与0.5ml洗脱的噬菌体并于37℃温育30分钟,感染到大肠杆菌TG1细胞中。最后,将受感染的细菌涂布在含1%葡萄糖和100μg/ml氨苄青霉素的TYE培养基上,并于30℃温育过夜。
克隆针对溶菌酶选择的CL突变体的选定克隆供可溶性表达
用微量制备试剂盒(midi-prep)分离来自通过3轮淘选选择的噬菌体的噬菌粒DNA。通过PCR分批扩增编码突变的CL结构域的DNA,并以NcoI-NotI克隆到载体pNOTBAD/Myc-His中,该载体是***了NotI限制性位点以便于克隆的大肠杆菌表达载体pBAD/Myc-His(Invitrogen)。通过电穿孔将连接构建物转化到大肠杆菌LMG194细胞(Invitrogen)中,并于30℃在含1%葡萄糖和氨苄青霉素的TYE培养基上培养过夜。将选择的克隆接种到200μl含氨苄青霉素的2xYT培养基中,于30℃培养过夜,并通过添加L-***糖至终浓度0.1%而诱导。于16℃表达过夜后,通过离心收获细胞,并用100μl硼酸钠缓冲液pH 8.0于4℃处理过夜以制备周质提取物。取50μl周质提取物用于ELISA。
将在此第一次、初步ELISA中给出高信号的克隆如上所述以相同条件在20ml体积中培养。如上所述在1/20培养物体积中分离它们的周质提取物并通过ELISA(如下所述)测试供确认。
针对鸡卵溶菌酶选择的CL突变体的ELISA
包被:微量滴定板(NUNC,Maxisorp),100μl/孔,100μg鸡卵溶菌酶/mlPBS,37℃,1小时
清洗:3x200μl PBS
封闭:1%BSA-PBS,室温,1小时
清洗:3x200μl PBS
周质提取物结合:50μl周质提取物,50μl2%BSA-PBS,室温,过夜
清洗:3x200μl PBS
一抗:抗His4(Qiagen),1:1000在1%BSA-PBS中稀释,室温,90分钟,100μl/孔
清洗:3x200μl PBS
二抗:山羊抗小鼠*HRP(SIGMA),1:1000在1%BSA-PBS中稀释,室温,90分钟,100μl/孔
清洗:3x200μl PBS
检测:3mg/ml OPD溶于Na-柠檬酸/磷酸缓冲液pH 4.5,0.4μl30%H2O2
停止:100ml3M H2SO4
吸光度读数:492/620nm
若克隆的ELISA信号是背景信号的至少3倍,则认为它是阳性的。
实施例15:两侧都随机化的免疫球蛋白结构域(双特异性工程改造的CH3结构域)的构建
此实施例描述了具有两种结合特异性的工程改造的免疫球蛋白结构域。
此工程改造的免疫球蛋白结构域的设计包括下列策略:
●使用衍生自特异性结合溶菌酶的CH3+5文库的工程改造的CH3结构域,克隆C24(见实施例10)作为起点
●在此经修饰的CH3结构域中鉴定这样的待随机化残基,它们连接免疫球蛋白折叠的β链,且与在生成克隆C24时突变的残基相比位于结构域的对侧
●设计这样的PCR引物,它们容许这些残基的随机化,并以与上文关于CH3、CH3+3和CH3+5文库所述相似的流程合成此工程改造的免疫球蛋白结构域
通过PCR连接含随机化位置的4个PCR产物并扩增全长***物。随后,它们经NcoI-NotI位点克隆到pHEN-1中并转化到大肠杆菌TG-1细胞中以构建约108个菌落的文库。将20个随机选择的菌落测序,发现随机化位置独立突变了。而且没有观察到“野生型”(C24)序列。依照标准方案生成噬菌体文库,噬菌体滴度达到6.32x1010TU/ml。
为了测试双特异性,选择重组人红细胞生成素(rhEPO)作为第二抗原,同时预期构建物保留其对鸡卵溶菌酶的最初的工程改造的特异性。在4轮淘选中选择rhEPO反应性噬菌体。为了保存在诱变后仍然应当结合鸡卵溶菌酶的C24克隆群,在第一轮对rhEPO选择后,噬菌体群对鸡卵溶菌酶(1mg/ml,溶于PBS)进行一轮淘选。在后续淘选轮次中在0.1M碳酸钠缓冲液pH 9.6 中以逐渐降低的浓度用200μl rhEPO包被微量滴定板(Maxisorp,Nunc)的5个孔(见下表)。用2%M-PBS封闭后,容许噬菌体在封闭剂中于室温结合2小时。用T-PBS清洗20次、用PBS清洗20次后,用0.1M甘氨酸pH2.2洗脱,并用2M Tris中和。洗脱的噬菌体立即用于感染指数式生长的TG-1。在含氨苄青霉素的培养基上选择受感染的细胞。用辅助噬菌体M13-KO7超感染后从培养物上清液回收(rescue)噬菌体颗粒,用PEG浓缩,并用于另一轮淘选。每轮淘选后以大肠杆菌转化单位测定输入和输出噬菌体数(表8)。
表8:
从板上刮下所得菌落,在含氨苄青霉素的2xYT中培养,并用微量制备试剂盒(midi-prep)分离它们的质粒DNA。通过PCR扩增***物,然后亚克隆到载体pNOTBAD中并转化到大肠杆菌菌株E104中。将4x72个菌落在200μl含氨苄青霉素的2xYT中培养并在次日用0.1%L-***糖诱导。于16℃表达24小时后,将它们用200μl硼酸钠缓冲液pH 8.0于4℃溶解6小时并将周质提取物用于ELISA。
对于ELISA,将Maxisorp板分别用PBS中鸡卵溶菌酶(20μg/ml)或0.1M碳酸钠缓冲液pH 9.6中的rhEPO于37℃包被1小时。用1%BSA-PBS封闭后,容许周质提取物在相同的封闭剂中结合过夜。用抗His-(4)抗体和偶联有HRP(用于鸡卵溶菌酶检测)或AP(用于rhEPO检测)的山羊抗小鼠IgG抗体展现结合。用1.25M H2SO4停止后在492/620nm读取OPD转变(HRP)的有色反应,在405/620nm读取pNPP转变(AP)。选择吸光度值有希望的14个克隆用于20ml规模的表达。用***糖于16℃诱导24小时后,收集细胞并在1ml硼酸钠缓冲液中于4℃溶解过夜,将溶解液用于ELISA。如上4份平行进行ELISA,使用没有周质提取物和没有抗原的孔作为阴性对照。依照SEQ ID No.42,43的克隆得到如下结果(表9)。
表9:
抗原 | 结合吸光度 | 无周质提取物 | 无抗原 | |
溶菌酶 | A492/620nm | 0.299 | 0.110 | 0.018 |
rhEPO | A405/620nm | 0.258 | 0.095 | 0.090 |
实施例16:工程改造的CH3结构域以Fab样型式提供双特异性
在此实施例中所使用的构建物中,抗体的VL和VH链都与经工程改造的CH3结构域融合。
使用识别HIV-1 gp41上表位的人单克隆抗体3D6的VL和VH区(He XM,et al.Proc Natl Acad Sci U S A.1992 89:7154-8.;Kohl J,et al.Ann N Y Acad Sci.1991 646:106-14.;Felgenhauer M,et al.Nucleic Acids Res.199018:4927)作为特异性结合鸡卵溶菌酶的经工程改造的CH3结构域克隆C24的融合配偶体。
为了促进经二硫键形成VL-CH3/VH-CH3二聚体,将残基Ser-Cys添加到C24序列的C末端。
两条链,3D6VL-C24和3D6VH-C24的核苷酸和氨基酸序列分别给出于SEQ ID No.47,46及SEQ ID No.45,44。
设计这样的引物,它们容许扩增编码区,同时引入限制性位点(沉默突变)用于将编码区连接到一起。对于基因的表达,选择巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)表达***。将构建物克隆到合适的巴斯德毕赤氏酵母表达载体中:将3D6VL-C24克隆到pPIC9K中(最终的名称:pPIC9K3LC),将3D6VH-C24克隆到pPICZalphaA中(最终的名称:pPICZ3HC)。将构建物pPICZ3HC用Bgl II线性化,转化到巴斯德毕赤氏酵母GS115中,并在含zeocin的固体培养基上选择转化子。随后将转化子之一用作Sal I线性化的构建物pPIC9K3LC的宿主细胞。然后在RDB培养基上选择双重转化子。
将克隆接种到30ml YPG培养基中并培养至OD600=10,然后通过添加BMMY培养基中的1%甲醇而诱导。诱导于16℃持续36小时。通过离心取出上清液,然后浓缩约10倍。通过使用抗His(4)抗体的Western印迹验证了重组蛋白的存在,估计浓度是约50-100μg/l最初培养物。
第一功能测试用10倍浓缩的上清液进行。首先,将Maxisorp板的孔分别用PBS中的20μg/ml鸡卵溶菌酶或0.1M碳酸钠缓冲液pH 9.6中的 20μg/ml抗体3D6的表位于37℃包被1小时。3D6表位以重组生成的GST融合蛋白的形式使用。用1%BSA-PBS封闭后,容许浓缩的上清液在相同的封闭剂中结合过夜。用抗His(4)抗体和偶联有HRP的山羊抗小鼠IgG抗体展现结合,并以492/620nm源自OPD转变的有色反应显现(表10)。
表10
Claims (60)
1.用于工程改造免疫球蛋白的方法,包含在所述免疫球蛋白的结构环区域中的至少一处修饰并测定所述免疫球蛋白对抗原表位的结合,其中未修饰的免疫球蛋白不显著结合所述表位,所述方法包括下列步骤:
-提供编码包含至少一个结构环区域的免疫球蛋白的核酸,
-修饰至少一个所述结构环区域的至少一个核苷酸残基,
-将所述经修饰的核酸转移入表达***,
-表达所述经修饰的免疫球蛋白,
-使表达的经修饰的免疫球蛋白与表位接触,并
-测定所述经修饰的免疫球蛋白是否结合所述表位。
2.依照权利要求1的方法,其中所述免疫球蛋白特异性结合于至少两种不同表位。
3.依照权利要求1或2任一项的方法,包含在所述免疫球蛋白的至少一个结构环区域中至少一处修饰,并测定所述至少一个环区域对至少一种选自下组的分子的特异性结合:变应原、肿瘤相关抗原、自身抗原、酶、细菌抗原、真菌抗原、病毒抗原和原生动物抗原,其中包含未修饰结构环区域的免疫球蛋白不特异性结合所述至少一种分子。
4.用于制造免疫球蛋白或其药用制剂的方法,包含在所述免疫球蛋白的结构环区域中的至少一处修饰,并测定所述免疫球蛋白对抗原表位的结合,其中未修饰的免疫球蛋白不显著结合所述表位,所述方法包括下列步骤:
-提供编码包含至少一个环区域的免疫球蛋白的核酸,
-修饰至少一个所述环区域的至少一个核苷酸残基,
-将所述经修饰的核酸转移入表达***,
-表达所述经修饰的免疫球蛋白,
-使表达的经修饰的免疫球蛋白与表位接触,
-测定所述经修饰的免疫球蛋白是否结合所述表位,并
-提供结合所述表位的经修饰的免疫球蛋白并任选将其制成药用制剂。
5.用于制造特异性结合至少一种第一分子的多特异性免疫球蛋白或其药用制剂的方法,在所述免疫球蛋白的至少一个结构环区域中包含至少一处修饰,并测定所述至少一个环区域对至少一种选自下组的第二分子的特异性结合:变应原、肿瘤相关抗原、自身抗原、酶、细菌抗原、真菌抗原、病毒抗原和原生动物抗原,其中包含未修饰结构环区域的免疫球蛋白不特异性结合所述至少一种第二分子,该方法包括下列步骤:
-提供编码特异性结合至少一种第一分子、包含至少一个结构环区域的免疫球蛋白的核酸,
-修饰由所述核酸编码的至少一个所述环区域的至少一个核苷酸残基,
-将所述经修饰的核酸转移入表达***,
-表达所述经修饰的免疫球蛋白,
-使表达的经修饰的免疫球蛋白接触所述至少一种第二分子,
-测定所述经修饰的免疫球蛋白是否特异性结合第二分子,并
-提供对所述至少一种第二分子特异的经修饰的免疫球蛋白并任选将其制成药用制剂。
6.依照权利要求1-5任一项的方法,其中所述免疫球蛋白是人或鼠来源的。
7.依照权利要求6的方法,其中所述人免疫球蛋白选自下组:IgA1、IgA2、IgD、IgE、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4和IgM。
8.依照权利要求6的方法,其中鼠免疫球蛋白选自下组:IgA、IgD、IgE、IgG1、IgG2A、IgG2B、IgG3和IgM。
9.依照权利要求7或8的方法,其中所述免疫球蛋白包含免疫球蛋白的重链和/或轻链或其一部分。
10.依照权利要求7-9任一项的方法,其中所述免疫球蛋白包含免疫球蛋白的至少一个恒定区和/或至少一个可变区,或其包括微型结构域的部分。
11.依照权利要求10的方法,其中所述恒定区选自CH1、CH2、CH3、CH4、Igk-C、Igl-C及其组合。
12.依照权利要求11的方法,其中CH1、CH2、CH3和CH4的经修饰的的环区域包含第7-21位氨基酸、第25-39位氨基酸、第41-81位氨基酸、第83-85位氨基酸、第89-103位氨基酸和第106-117位氨基酸。
13.依照权利要求11的方法,其中人来源的Igk-C和Igl-C的环区域包含第8-18位氨基酸、第27-35位氨基酸、第42-78位氨基酸、第83-85位氨基酸、第92-100位氨基酸、第108-117位氨基酸和第123-126位氨基酸。
14.依照权利要求11的方法,其中鼠起源的Igk-C和Igl-C的环区域包含第8-20位氨基酸、第26-36位氨基酸、第43-79位氨基酸、第83-85位氨基酸、第90-101位氨基酸、第108-116位氨基酸和第122-125位氨基酸。
15.依照权利要求10的方法,其中人起源的免疫球蛋白的可变区的结构环区域包含第8-20位氨基酸、第44-50位氨基酸、第67-76位氨基酸和第89-101位氨基酸。
16.依照权利要求10的方法,其中鼠起源的免疫球蛋白的可变区的结构环区域包含第6-20位氨基酸、第44-52位氨基酸、第67-76位氨基酸和第92-101位氨基酸。
17.依照权利要求1-5任一项的方法,其中所述免疫球蛋白是骆驼起源的。
18.依照权利要求17的方法,其中所述免疫球蛋白包含至少一个选自CH1、CH2和CH3的恒定区。
19.依照权利要求18的方法,其中CH1、CH2和CH3的环区域包含第8-20位氨基酸、第24-39位氨基酸、第42-78位氨基酸、第82-85位氨基酸、第91-103位氨基酸和第108-117位氨基酸。
20.依照权利要求1-19任一项的方法,其中对至少一个核苷酸的修饰导致由所述核酸编码的免疫球蛋白的替换、缺失和/或***。
21.依照权利要求1-20任一项的方法,其中通过定点随机突变而修饰至少一个环区域的氨基酸。
22.依照权利要求21的方法,其中随机修饰的核酸分子包含至少一个具有序列5’-NNS-3’、5’-NNN-3’或5’-NNK-3’的核苷酸重复单元。
23.依照权利要求1-22任一项的方法,其中表达***包含载体。
24.依照权利要求1-23任一项的方法,其中经修饰的免疫球蛋白在宿主中表达,优选在细菌、酵母、植物细胞、动物细胞中或者在植物或动物中表达。
25.依照权利要求1-24任一项的方法,其中经修饰的免疫球蛋白对分子的特异性结合通过选自下组的结合测定法测定:免疫学测定法优选酶联免疫吸附测定法(ELISA)、表面等离振子共振测定法、饱和转移差异核磁共振光谱法、转移NOE(trNOE)核磁共振光谱法、竞争测定法、组织结合测定法、活细胞结合测定法和细胞提取物测定法。
26.依照权利要求1-25任一项的方法,其中经修饰的免疫球蛋白与选自下组的标记物偶联:有机分子、酶标记物、放射性标记物、有色标记物、荧光标记物、显色标记物、发光标记物、半抗原、洋地黄毒苷、生物素、金属复合物、金属、胶体金及其混合物。
27.由选自CH1、CH2、CH3、CH4、Igk-C、Igl-C的恒定区或其包括微型结构域的部分组成的免疫球蛋白,具有至少一个环区域,其中所述至少一个环区域包含至少一处氨基酸修饰,形成至少一个经修饰的环区域,其中所述至少一个经修饰的环区域特异性结合至少一种抗原表位。
28.由重链或轻链的可变区或其包括微型结构域的部分组成的免疫球蛋白,具有至少一个环区域,其中所述至少一个环区域包含至少一处氨基酸修饰,形成至少一个经修饰的环区域,其中所述至少一个经修饰的环区域特异性结合至少一种抗原表位。
29.依照权利要求27或28的免疫球蛋白,其中所述抗原选自下组:蛋白质分子、核酸和碳水化合物。
30.依照权利要求27-29任一项的免疫球蛋白,其中所述抗原选自下组:肿瘤相关抗原,特别是EpCAM,肿瘤相关糖蛋白-72(TAG-72),肿瘤相关抗原CA125,***特异膜抗原(PSMA),高分子量黑素瘤相关抗原(HMW-MAA),表达Lewis Y相关碳水化合物的肿瘤相关抗原,癌胚抗原(CEA),CEACAM5,HMFG PEM,粘蛋白MUC1,MUC18和细胞角蛋白肿瘤相关抗原,细菌抗原,病毒抗原,变应原,荧光素,溶菌酶,toll样受体9,红细胞生成素,CD2,CD3,CD3E,CD4,CD11,CD11a,CD14,CD18,CD19,CD20,CD22,CD23,CD25,CD28,CD29,CD30,CD33(p67蛋白),CD38,CD40,CD40L,CD52,CD54,CD56,CD80,CD147,GD3,IL-1,IL-1R,IL-2,IL-2R,IL-4,IL-5,IL-6,IL-6R,IL-8,IL-12,IL-15,IL-18,IL-23,干扰素α,干扰素β,干扰素γ;TNF-α,TNF-β2,TNFα,TNFαβ,TNF-R1,TNF-RII,FasL,CD27L,CD30L,4-1BBL,TRAIL,RANKL,TWEAK,APRIL,BAFF,LIGHT,VEG1,OX40L,TRAIL受体-1,A1腺苷受体,淋巴毒素β受体,TACI,BAFF-R,EPO;LFA-3,ICAM-1,ICAM-3,整联蛋白β1,整联蛋白β2,整联蛋白α4/β7,整联蛋白α2,整联蛋白α3,整联蛋白α4,整联蛋白α5,整联蛋白α6,整联蛋白αv,αVβ3整联蛋白,FGFR-3,角质形成细胞生长因子,VLA-1,VLA-4,L-选择蛋白,抗Id,E-选择蛋白,HLA,HLA-DR,CTLA-4,T细胞受体,B7-1,B7-2,VNR整联蛋白,TGFβ1,TGFβ2,eotaxin1,BLyS(B淋巴细胞刺激物),补体C5,IgE,因子VII,CD64,CBL,NCA 90,EGFR(ErbB-1),Her2/neu(ErbB-2),Her3(ErbB-3),Her4(ErbB4),组织因子,VEGF,VEGFR,内皮缩血管肽受体,VLA-4,碳水化合物诸如血型抗原和相关碳水化合物,Galili糖基化,促胃液素,促胃液素受体,肿瘤相关碳水化合物,半抗原NP帽或NIP帽,T细胞受体α/β,E-选择蛋白,地高辛,胎盘碱性磷酸酶(PLAP)和睾丸PLAP样碱性磷酸酶,运铁蛋白受体,类肝素酶I,人心肌球蛋白,糖蛋白IIb/IIIa(GPIIb/IIIa),人巨细胞病毒(HCMV)gH包膜糖蛋白,HIV gp120,HCMV,呼吸道合胞病毒RSV F,RSVF Fgp,VNR整联蛋白,Hep B gp120,CMV,gpIIbIIIa,HIV IIIB gp120 V3环,呼吸道合胞病毒(RSV)Fgp,单纯疱疹病毒(HSV)gD糖蛋白,HSV gB糖蛋白,HCMV gB包膜糖蛋白,产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)毒素及其片段。
31.依照权利要求27-30任一项的免疫球蛋白,其中CH3的第15-17位、第29-34位、第85.4-85.3位、第92-94位、第97-98位和/或第108-110位氨基酸残基进行了修饰。
32.依照权利要求27-31任一项的免疫球蛋白,其中所述修饰是缺失、替换、***或其组合。
33.依照权利要求27-32任一项的免疫球蛋白,其中当EpCam结合所述免疫球蛋白时,CH3区包含SEQ ID No.16或SEQ ID No.18,当荧光素结合所述免疫球蛋白时,CH3区包含SEQ ID No.20,当溶菌酶结合所述免疫球蛋白时,CH3区包含SEQ ID No.22,24,26,28,30或32,当TLR9结合所述免疫球蛋白时,CH3区包含SEQ ID No.34,36,38或40,而当溶菌酶和/或红细胞生成素结合所述免疫球蛋白时,CH3区包含SEQ ID No.42。
34.依照权利要求27-33任一项的免疫球蛋白,其中当溶菌酶和gp41结合所述免疫球蛋白时,它包含SEQ ID No.44或SEQ ID No.46。
35.依照权利要求27-34任一项的免疫球蛋白,其中经修饰的免疫球蛋白与选自下组的标记物或受体分子偶联:有机分子、酶标记物、放射性标记物、有色标记物、荧光标记物、显色标记物、发光标记物、半抗原、洋地黄毒苷、生物素、金属配合物、金属、胶体金及其混合物。
36.依照权利要求27-35任一项的或可通过依照权利要求1-26任一项的方法获得的免疫球蛋白用于制备供自动免疫接种的疫苗的用途。
37.依照权利要求27-35任一项的或可通过依照权利要求1-26任一项的方法获得的免疫球蛋白用于制备免疫球蛋白的蛋白质文库的用途。
38.蛋白质文库,其包含可通过依照权利要求27-35任一项的方法获得的或可通过依照权利要求1-26任一项的方法获得的免疫球蛋白。
39.用于特异性结合和/或检测分子的方法,包括下列步骤:
(a)使依照权利要求27-35任一项的经修饰的免疫球蛋白或可通过依照权利要求1-26任一项的方法获得的经修饰的免疫球蛋白接触怀疑含有所述分子的测试样品,并
(b)检测特异性免疫球蛋白/分子复合物的可能的形成。
40.用于特异性分离分子的方法,包括下列步骤:
(a)使依照权利要求27-35任一项的经修饰的免疫球蛋白或可通过依照权利要求1-26任一项的方法获得的经修饰的免疫球蛋白接触含有所述分子的样品,
(b)分离形成的特异性免疫球蛋白/分子复合物,并
(c)任选从所述复合物分离该分子。
41.用于将化合物靶向靶物的方法,包括下列步骤:
(a)将特异性结合所述化合物的依照权利要求27-35任一项的经修饰的免疫球蛋白或可通过依照权利要求1-26任一项的方法获得的经修饰的免疫球蛋白与所述化合物接触,
(b)将特异性免疫球蛋白/化合物复合物投递至靶物。
42.具有抗原结合位点的经修饰的免疫球蛋白,所述抗原结合位点对未修饰免疫球蛋白而言是外源的、并掺入一个或多个结构环中。
43.依照权利要求42的免疫球蛋白,其中所述抗原选自下组:变应原、肿瘤相关抗原、自身抗原、酶、细菌抗原、真菌抗原、病毒抗原和原生动物抗原。
44.依照权利要求42或43的免疫球蛋白,其中所述免疫球蛋白包含至少两个抗原结合位点,第一位点结合第一表位而第二位点结合第二表位。
45.依照权利要求42-44任一项的免疫球蛋白,其中所述免疫球蛋白包含至少两个环区域,第一环区域结合第一表位而第二环区域结合第二表位。
46.依照权利要求45的免疫球蛋白,其中所述环区域包含结构环。
47.由至少两个免疫球蛋白结构域或其包括微型结构域的部分构成的、依照权利要求42-46任一项的免疫球蛋白,且每个结构域包含至少一个抗原结合位点。
48.依照权利要求42-47任一项的免疫球蛋白,其中所述免疫球蛋白包含免疫球蛋白的至少一个恒定区结构域和/或至少一个可变区结构域或其包括微型结构域的部分。
49.依照权利要求42-48任一项的免疫球蛋白,其中所述免疫球蛋白包含与未修饰结构域具有至少50%同源性的结构域。
50.依照权利要求42-49任一项的免疫球蛋白,其中所述免疫球蛋白是双特异性抗体或双特异性单链抗体。
51.依照权利要求42-50任一项的免疫球蛋白,其中所述免疫球蛋白包含双特异性结构域或其包括微型结构域的部分。
52.依照权利要求42-51任一项的免疫球蛋白,用于治疗和预防用途。
53.依照权利要求42-51任一项的免疫球蛋白,用于制备和分析用途。
54.依照权利要求42-51任一项的免疫球蛋白,用于诊断用途。
55.由在结构环中具有不同修饰的、依照权利要求27-35和42-54任一项的至少100种免疫球蛋白组成的文库。
56.依照权利要求55的文库,其中所述免疫球蛋白是选自下组的免疫球蛋白:免疫球蛋白的结构域、微型结构域或其衍生物。
57.结合配偶体的试剂盒,包括:
(a)在一个或多个结构环中掺入有对免疫球蛋白而言外源的抗原结合位点的经修饰的免疫球蛋白,和
(b)包含所述抗原的表位的结合分子。
58.依照权利要求57的试剂盒的结合分子用于鉴定其所述经修饰的免疫球蛋白的结合特异性的用途。
59.依照权利要求57的试剂盒的结合分子用于测定所述经修饰的免疫球蛋白的效力的用途。
60.依照权利要求57的试剂盒的结合分子用于从由在结构环中具有不同修饰的至少100种免疫球蛋白组成的文库中选择所述经修饰的免疫球蛋白的用途。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US64114405P | 2005-01-05 | 2005-01-05 | |
US60/641,144 | 2005-01-05 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN200680001831.4A Division CN101098891B (zh) | 2005-01-05 | 2006-01-05 | 分子中互补决定区以外的区域中工程改造了的具有结合特性的合成免疫球蛋白结构域 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN103555733A true CN103555733A (zh) | 2014-02-05 |
Family
ID=36445146
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201310486561.2A Pending CN103555733A (zh) | 2005-01-05 | 2006-01-05 | 分子中互补决定区以外的区域中工程改造了的具有结合特性的合成免疫球蛋白结构域 |
CN200680001831.4A Active CN101098891B (zh) | 2005-01-05 | 2006-01-05 | 分子中互补决定区以外的区域中工程改造了的具有结合特性的合成免疫球蛋白结构域 |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN200680001831.4A Active CN101098891B (zh) | 2005-01-05 | 2006-01-05 | 分子中互补决定区以外的区域中工程改造了的具有结合特性的合成免疫球蛋白结构域 |
Country Status (23)
Country | Link |
---|---|
US (8) | US20090298195A1 (zh) |
EP (4) | EP1752471B9 (zh) |
JP (3) | JP4937138B2 (zh) |
KR (2) | KR101404512B1 (zh) |
CN (2) | CN103555733A (zh) |
AT (4) | ATE423140T1 (zh) |
AU (1) | AU2006204459B2 (zh) |
BR (1) | BRPI0606399A8 (zh) |
CA (1) | CA2594356C (zh) |
CY (3) | CY1108767T1 (zh) |
DE (3) | DE602006005200D1 (zh) |
DK (4) | DK1772465T3 (zh) |
EA (1) | EA018897B1 (zh) |
ES (4) | ES2321861T3 (zh) |
HR (3) | HRP20090087T3 (zh) |
IL (1) | IL184103A (zh) |
MX (1) | MX2007008118A (zh) |
NZ (1) | NZ555893A (zh) |
PL (3) | PL1772465T3 (zh) |
PT (4) | PT1699826E (zh) |
RS (3) | RS50830B (zh) |
SI (3) | SI1752471T1 (zh) |
WO (1) | WO2006072620A1 (zh) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN107207592A (zh) * | 2014-12-05 | 2017-09-26 | 默克专利有限公司 | 结构域交换的抗体 |
Families Citing this family (204)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
SI1797127T1 (sl) | 2004-09-24 | 2017-09-29 | Amgen Inc. | Modificirane fc-molekule |
CA2594356C (en) | 2005-01-05 | 2018-07-17 | F-Star Biotechnologische Forschungs- Und Entwicklungsges.M.B.H. | Synthetic immunoglobulin domains with binding properties engineered in regions of the molecule different from the complementarity determining regions |
US8008453B2 (en) | 2005-08-12 | 2011-08-30 | Amgen Inc. | Modified Fc molecules |
AT503889B1 (de) * | 2006-07-05 | 2011-12-15 | Star Biotechnologische Forschungs Und Entwicklungsges M B H F | Multivalente immunglobuline |
AT503861B1 (de) * | 2006-07-05 | 2008-06-15 | F Star Biotech Forsch & Entw | Verfahren zur manipulation von t-zell-rezeptoren |
AT503902B1 (de) * | 2006-07-05 | 2008-06-15 | F Star Biotech Forsch & Entw | Verfahren zur manipulation von immunglobulinen |
TW200831528A (en) | 2006-11-30 | 2008-08-01 | Astrazeneca Ab | Compounds |
EP1975178A1 (en) * | 2007-03-30 | 2008-10-01 | f-star Biotechnologische Forschungs- und Entwicklungsges.m.b.H. | Transcytotic modular antibody |
WO2008124858A2 (en) * | 2007-04-11 | 2008-10-23 | F-Star Biotechnologische Forschungs- Und Entwicklungsges. M.B.H. | Targeted receptor |
EP2160406B1 (en) | 2007-05-24 | 2013-10-02 | Baxter Healthcare SA | Antibodies useful for therapy and diagnosis of cancer |
WO2009000006A1 (en) * | 2007-06-26 | 2008-12-31 | F-Star Biotechnologische Forschungs- Und Entwicklungsges.M.B.H. | Display of binding agents |
MY163473A (en) | 2007-09-26 | 2017-09-15 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Modified antibody constant region |
US8557243B2 (en) | 2008-01-03 | 2013-10-15 | The Scripps Research Institute | EFGR antibodies comprising modular recognition domains |
BRPI0821906B1 (pt) | 2008-01-03 | 2022-06-07 | The Scripps Research Institute | Anticorpo isolado de comprimento total, seu uso, polinucleotideo, vetor, e célula hospedeira |
US8557242B2 (en) | 2008-01-03 | 2013-10-15 | The Scripps Research Institute | ERBB2 antibodies comprising modular recognition domains |
US8574577B2 (en) | 2008-01-03 | 2013-11-05 | The Scripps Research Institute | VEGF antibodies comprising modular recognition domains |
US8454960B2 (en) | 2008-01-03 | 2013-06-04 | The Scripps Research Institute | Multispecific antibody targeting and multivalency through modular recognition domains |
AU2009212747B2 (en) | 2008-01-31 | 2013-11-07 | The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Engineered antibody constant domain molecules |
AU2014200215B2 (en) * | 2008-01-31 | 2016-09-29 | The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Engineered antibody constant domain molecules |
EP2113255A1 (en) | 2008-05-02 | 2009-11-04 | f-star Biotechnologische Forschungs- und Entwicklungsges.m.b.H. | Cytotoxic immunoglobulin |
US20100136584A1 (en) * | 2008-09-22 | 2010-06-03 | Icb International, Inc. | Methods for using antibodies and analogs thereof |
ES2657220T3 (es) | 2008-10-02 | 2018-03-02 | Aptevo Research And Development Llc | Proteínas de unión multi-diana antagonistas de CD86 |
WO2010078916A1 (en) | 2008-12-19 | 2010-07-15 | Philogen S.P.A. | Immunocytokines for tumour therapy with chemotherapeutic agents |
CN101609096B (zh) * | 2009-07-21 | 2012-11-07 | 上海师范大学 | 肺癌标志物检测免疫层析试纸的制备方法 |
EP2461832B1 (en) | 2009-08-05 | 2017-06-28 | Philogen S.p.A. | Targeting of bone marrow neovasculature |
WO2011028952A1 (en) | 2009-09-02 | 2011-03-10 | Xencor, Inc. | Compositions and methods for simultaneous bivalent and monovalent co-engagement of antigens |
WO2011079308A2 (en) | 2009-12-23 | 2011-06-30 | Emergent Product Development Seattle, Llc | Compositions comprising tnf-alpha and il-6 antagonists and methods of use thereof |
EP3112382A1 (en) | 2009-12-29 | 2017-01-04 | Emergent Product Development Seattle, LLC | Heterodimer binding proteins and uses thereof |
WO2011100565A2 (en) * | 2010-02-12 | 2011-08-18 | Research Corporation Technologies | Multimeric proteins comprising immunoglobulin constant domains |
EP2407487A1 (en) | 2010-07-14 | 2012-01-18 | F-Star Biotechnologische Forschungs - und Entwicklungsges. M.B.H. | Multispecific modular antibody |
US20120100166A1 (en) | 2010-07-15 | 2012-04-26 | Zyngenia, Inc. | Ang-2 Binding Complexes and Uses Thereof |
WO2012016227A2 (en) | 2010-07-29 | 2012-02-02 | Xencor, Inc. | Antibodies with modified isoelectric points |
TW201302793A (zh) | 2010-09-03 | 2013-01-16 | Glaxo Group Ltd | 新穎之抗原結合蛋白 |
US20130273055A1 (en) | 2010-11-16 | 2013-10-17 | Eric Borges | Agents and methods for treating diseases that correlate with bcma expression |
US9255144B2 (en) | 2010-12-20 | 2016-02-09 | Medimmune Limited | Anti-IL-18 antibodies and their uses |
WO2012109553A2 (en) * | 2011-02-11 | 2012-08-16 | Research Corporation Technologies | Ch2 domain template molecules derived from rational grafting of donor loops onto ch2 scaffolds |
CA2833019A1 (en) | 2011-04-22 | 2012-10-26 | Emergent Product Development Seattle, Llc | Prostate-specific membrane antigen binding proteins and related compositions and methods |
CN107936121B (zh) | 2011-05-16 | 2022-01-14 | 埃泰美德(香港)有限公司 | 多特异性fab融合蛋白及其使用方法 |
CN106432506A (zh) | 2011-05-24 | 2017-02-22 | 泽恩格尼亚股份有限公司 | 多价和单价多特异性复合物及其用途 |
DK2728002T3 (da) | 2011-06-30 | 2022-04-04 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Heterodimeriseret polypeptid |
EP2546268A1 (en) | 2011-07-13 | 2013-01-16 | F-Star Biotechnologische Forschungs - und Entwicklungsges. M.B.H. | Internalising immunoglobulin |
US10851178B2 (en) | 2011-10-10 | 2020-12-01 | Xencor, Inc. | Heterodimeric human IgG1 polypeptides with isoelectric point modifications |
AU2012355435A1 (en) * | 2011-12-21 | 2014-07-17 | Amgen Inc. | Variant Fc-polypeptides with enhanced binding to the neonatal Fc receptor |
AR090410A1 (es) * | 2012-01-09 | 2014-11-12 | Covx Technologies Ireland Ltd | Anticuerpos mutantes y conjugacion de los mismos |
CN102585000B (zh) * | 2012-02-22 | 2013-05-29 | 尉军 | 一种肿瘤标志物cd25自身抗体及应用 |
WO2013138643A1 (en) | 2012-03-16 | 2013-09-19 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services | Soluble engineered monomeric fc |
MX2019001355A (es) | 2012-05-10 | 2023-01-17 | Bioatla Llc | Anticuerpos monoclonales multiespecíficos. |
EP2855520B1 (en) * | 2012-06-04 | 2018-09-26 | Novartis AG | Site-specific labeling methods and molecules produced thereby |
JP6628966B2 (ja) | 2012-06-14 | 2020-01-15 | 中外製薬株式会社 | 改変されたFc領域を含む抗原結合分子 |
KR20210084688A (ko) | 2012-08-24 | 2021-07-07 | 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 | FcγRIIb 특이적 Fc영역 개변체 |
EP3721942A1 (en) | 2012-10-15 | 2020-10-14 | Medimmune Limited | Antibodies to amyloid beta |
US9365646B2 (en) | 2012-12-05 | 2016-06-14 | Novartis Ag | Compositions and methods for antibodies targeting EPO |
EP2940135B9 (en) | 2012-12-27 | 2021-09-08 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Heterodimerized polypeptide |
US10487155B2 (en) | 2013-01-14 | 2019-11-26 | Xencor, Inc. | Heterodimeric proteins |
US9701759B2 (en) | 2013-01-14 | 2017-07-11 | Xencor, Inc. | Heterodimeric proteins |
US10131710B2 (en) | 2013-01-14 | 2018-11-20 | Xencor, Inc. | Optimized antibody variable regions |
US11053316B2 (en) | 2013-01-14 | 2021-07-06 | Xencor, Inc. | Optimized antibody variable regions |
EP3620473A1 (en) | 2013-01-14 | 2020-03-11 | Xencor, Inc. | Novel heterodimeric proteins |
US10968276B2 (en) | 2013-03-12 | 2021-04-06 | Xencor, Inc. | Optimized anti-CD3 variable regions |
US9605084B2 (en) | 2013-03-15 | 2017-03-28 | Xencor, Inc. | Heterodimeric proteins |
AU2014207549B2 (en) | 2013-01-15 | 2018-12-06 | Xencor, Inc. | Rapid clearance of antigen complexes using novel antibodies |
EP2762496A1 (en) | 2013-02-05 | 2014-08-06 | EngMab AG | Method for the selection of antibodies against BCMA |
WO2014122144A1 (en) | 2013-02-05 | 2014-08-14 | Engmab Ag | BISPECIFIC ANTIBODIES AGAINST CD3ε AND BCMA |
JP6392315B2 (ja) | 2013-03-14 | 2018-09-19 | イミュソフト コーポレーション | インビトロでのメモリーb細胞分化方法およびvsv−g偽型ウイルスベクターを用いる形質導入方法 |
US10106624B2 (en) | 2013-03-15 | 2018-10-23 | Xencor, Inc. | Heterodimeric proteins |
CA2906927C (en) | 2013-03-15 | 2021-07-13 | Xencor, Inc. | Modulation of t cells with bispecific antibodies and fc fusions |
US10519242B2 (en) | 2013-03-15 | 2019-12-31 | Xencor, Inc. | Targeting regulatory T cells with heterodimeric proteins |
CN105451767B (zh) | 2013-03-15 | 2019-10-18 | 泽恩格尼亚股份有限公司 | 多价和单价多特异性复合物及其用途 |
US10858417B2 (en) | 2013-03-15 | 2020-12-08 | Xencor, Inc. | Heterodimeric proteins |
EP3783017A1 (en) | 2013-04-02 | 2021-02-24 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Fc region variant |
EP2789630A1 (en) | 2013-04-09 | 2014-10-15 | EngMab AG | Bispecific antibodies against CD3e and ROR1 |
SG10201800492PA (en) | 2013-04-29 | 2018-03-28 | Hoffmann La Roche | Human fcrn-binding modified antibodies and methods of use |
EP3027204B1 (en) | 2013-07-29 | 2022-01-05 | 2seventy bio, Inc. | Multipartite signaling proteins and uses thereof |
KR101800295B1 (ko) | 2013-09-04 | 2017-12-20 | 엘지디스플레이 주식회사 | 위치감지방법, 위치감지장치, 안테나 장치 및 디스플레이 장치 |
GB201317622D0 (en) * | 2013-10-04 | 2013-11-20 | Star Biotechnology Ltd F | Cancer biomarkers and uses thereof |
MX2016005689A (es) | 2013-10-31 | 2016-08-08 | Hutchinson Fred Cancer Res | Celulas no t efectoras y madre/progenitoras hematopoyeticas modificadas y usos de estas. |
CN113278076A (zh) * | 2013-11-11 | 2021-08-20 | 中外制药株式会社 | 含有改变了抗体可变区的抗原结合分子 |
KR102483822B1 (ko) | 2013-12-20 | 2023-01-03 | 프레드 허친슨 캔서 센터 | 태그된 키메라 이펙터 분자 및 그의 리셉터 |
KR20160104636A (ko) * | 2014-01-15 | 2016-09-05 | 에프. 호프만-라 로슈 아게 | 단백질 A-결합이 개선된 Fc-영역 변이체 |
US11059898B2 (en) * | 2014-03-24 | 2021-07-13 | Cancer Research Technology Limited | Modified antibodies containing modified IGG2 domains which elicit agonist or antagonistic properties and use thereof |
ME03666B (me) | 2014-03-28 | 2020-10-20 | Xencor Inc | Bispecifična antitela koja se vezuju za cd38 i cd3 |
BR112016030740A2 (pt) | 2014-07-01 | 2018-02-20 | Pfizer Inc. | diacorpos heterodiméricos biespecíficos e seus usos |
TWI679259B (zh) | 2014-08-11 | 2019-12-11 | 德商漢高智慧財產控股公司 | 光學透明的熱熔黏著劑及其用途 |
JP6708635B2 (ja) | 2014-10-09 | 2020-06-10 | エンクマフ エスアーエールエル | CD3εおよびROR1に対する二特異性抗体 |
TWI740809B (zh) | 2014-11-11 | 2021-10-01 | 日商中外製藥股份有限公司 | 包含經改變之抗體可變區之抗原結合分子的資料庫 |
US10259887B2 (en) | 2014-11-26 | 2019-04-16 | Xencor, Inc. | Heterodimeric antibodies that bind CD3 and tumor antigens |
KR20170084327A (ko) | 2014-11-26 | 2017-07-19 | 젠코어 인코포레이티드 | Cd3 및 cd38에 결합하는 이형이량체 항체 |
EP3223845B1 (en) | 2014-11-26 | 2021-05-19 | Xencor, Inc. | Heterodimeric antibodies that bind cd3 and cd20 |
PL3234107T3 (pl) | 2014-12-19 | 2023-01-16 | Immusoft Corporation | Limfocyty b do dostarczania in vivo środków terapeutycznych |
WO2016105450A2 (en) | 2014-12-22 | 2016-06-30 | Xencor, Inc. | Trispecific antibodies |
EP3816179A3 (en) | 2015-02-05 | 2021-08-04 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Fc region variant comprising a modified fcrn-binding domain |
US11000548B2 (en) | 2015-02-18 | 2021-05-11 | Enlivex Therapeutics Ltd | Combination immune therapy and cytokine control therapy for cancer treatment |
US11497767B2 (en) | 2015-02-18 | 2022-11-15 | Enlivex Therapeutics R&D Ltd | Combination immune therapy and cytokine control therapy for cancer treatment |
AU2016221305B2 (en) | 2015-02-18 | 2021-05-27 | Enlivex Therapeutics Rdo Ltd | Combination immune therapy and cytokine control therapy for cancer treatment |
US11304976B2 (en) | 2015-02-18 | 2022-04-19 | Enlivex Therapeutics Ltd | Combination immune therapy and cytokine control therapy for cancer treatment |
US11318163B2 (en) | 2015-02-18 | 2022-05-03 | Enlivex Therapeutics Ltd | Combination immune therapy and cytokine control therapy for cancer treatment |
US11596652B2 (en) | 2015-02-18 | 2023-03-07 | Enlivex Therapeutics R&D Ltd | Early apoptotic cells for use in treating sepsis |
WO2016141387A1 (en) | 2015-03-05 | 2016-09-09 | Xencor, Inc. | Modulation of t cells with bispecific antibodies and fc fusions |
MY196588A (en) | 2015-03-05 | 2023-04-19 | Hutchinson Fred Cancer Res | Immunomodulatory Fusion Proteins and uses Thereof |
TW201642897A (zh) | 2015-04-08 | 2016-12-16 | F 星生物科技有限公司 | Her2結合劑治療 |
JP6803339B2 (ja) | 2015-04-21 | 2020-12-23 | エンリヴェックス セラピューティクス リミテッド | 治療用のプールされた血液アポトーシス細胞調製物及びそれらの使用 |
EP3288570A4 (en) | 2015-04-29 | 2018-11-21 | Fred Hutchinson Cancer Research Center | Modified stem cells and uses thereof |
WO2016176651A2 (en) | 2015-04-29 | 2016-11-03 | Fred Hutchinson Cancer Research Center | Modified hematopoietic stem/progenitor and non-t effector cells, and uses thereof |
EP3932428A1 (en) | 2015-05-21 | 2022-01-05 | Harpoon Therapeutics, Inc. | Trispecific binding proteins and methods of use |
PT3331910T (pt) | 2015-08-03 | 2020-03-24 | Engmab Sarl | Anticorpos monoclonais contra o antigénio de maturação de células b (bcma) humano |
EP3334842B1 (en) | 2015-08-12 | 2022-03-02 | Novartis AG | Methods of treating ophthalmic disorders |
WO2017053469A2 (en) | 2015-09-21 | 2017-03-30 | Aptevo Research And Development Llc | Cd3 binding polypeptides |
BR112018006820A2 (pt) | 2015-10-05 | 2018-10-23 | Fredax Ab | anticorpos anti-psa (5a10) humanizados |
JP7058219B2 (ja) | 2015-12-07 | 2022-04-21 | ゼンコア インコーポレイテッド | Cd3及びpsmaに結合するヘテロ二量体抗体 |
JP6884155B2 (ja) | 2016-02-18 | 2021-06-09 | エンリヴェックス セラピューティクス リミテッド | 癌治療のための併用免疫療法及びサイトカイン制御療法 |
US10982136B2 (en) | 2016-02-26 | 2021-04-20 | The Regents Of The University Of California | Ligand-sensitized lanthanide nanocrystals as ultraviolet downconverters |
CN105664157A (zh) * | 2016-03-11 | 2016-06-15 | 江苏亲合力病毒检测工程有限公司 | 一种抗巨细胞病毒人源化抗体药物 |
WO2017157305A1 (en) | 2016-03-15 | 2017-09-21 | Generon (Shanghai) Corporation Ltd. | Multispecific fab fusion proteins and use thereof |
JP2019511500A (ja) | 2016-03-15 | 2019-04-25 | アストラゼネカ・アクチエボラーグAstrazeneca Aktiebolag | アミロイドベータの蓄積に関連する障害の処置のためのbace阻害剤と抗体または抗原結合性断片との組合せ |
US20190161530A1 (en) * | 2016-04-07 | 2019-05-30 | Bluebird Bio, Inc. | Chimeric antigen receptor t cell compositions |
EP4166161A1 (en) | 2016-04-14 | 2023-04-19 | Fred Hutchinson Cancer Center | Compositions and methods to program therapeutic cells using targeted nucleic acid nanocarriers |
KR102365977B1 (ko) | 2016-05-20 | 2022-02-22 | 하푼 테라퓨틱스, 인크. | 단일 쇄 가변 단편 cd3 결합 단백질 |
US11623958B2 (en) | 2016-05-20 | 2023-04-11 | Harpoon Therapeutics, Inc. | Single chain variable fragment CD3 binding proteins |
US10100106B2 (en) | 2016-05-20 | 2018-10-16 | Harpoon Therapeutics, Inc. | Single domain serum albumin binding protein |
RU2022104399A (ru) | 2016-06-14 | 2022-05-05 | Ксенкор, Инк. | Биспецифические антитела-ингибиторы контрольных точек |
JP7085708B2 (ja) | 2016-06-20 | 2022-06-17 | エフ-スター セラピューティクス リミテッド | Lag-3結合要素 |
LT3472207T (lt) | 2016-06-20 | 2021-05-10 | F-Star Delta Limited | Surišančios molekulės, kurios suriša pd-l1 ir lag-3 |
US10316088B2 (en) | 2016-06-28 | 2019-06-11 | Xencor, Inc. | Heterodimeric antibodies that bind somatostatin receptor 2 |
AU2017297603A1 (en) | 2016-07-14 | 2019-02-14 | Fred Hutchinson Cancer Research Center | Multiple bi-specific binding domain constructs with different epitope binding to treat cancer |
GB201612520D0 (en) | 2016-07-19 | 2016-08-31 | F-Star Beta Ltd | Binding molecules |
KR20230079499A (ko) | 2016-08-05 | 2023-06-07 | 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 | Il-8 관련 질환의 치료용 또는 예방용 조성물 |
WO2018044812A2 (en) | 2016-08-29 | 2018-03-08 | Fred Hutchinson Cancer Research Center | Chelating platform for delivery of radionuclides |
US10793632B2 (en) | 2016-08-30 | 2020-10-06 | Xencor, Inc. | Bispecific immunomodulatory antibodies that bind costimulatory and checkpoint receptors |
WO2018048812A1 (en) | 2016-09-06 | 2018-03-15 | The Regents Of The University Of California | Formulations of hydroxypyridonate actinide/lanthanide decorporation agents |
SG10201607778XA (en) | 2016-09-16 | 2018-04-27 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Anti-Dengue Virus Antibodies, Polypeptides Containing Variant Fc Regions, And Methods Of Use |
KR102562519B1 (ko) | 2016-10-14 | 2023-08-02 | 젠코어 인코포레이티드 | IL-15/IL-15Rα FC-융합 단백질 및 PD-1 항체 단편을 포함하는 이중특이성 이종이량체 융합 단백질 |
EP4295918A3 (en) | 2016-11-02 | 2024-03-20 | Bristol-Myers Squibb Company | Bispecific antibody against bcma and cd3 and an immunological drug for combined use in treating multiple myeloma |
EP3544997A4 (en) | 2016-11-23 | 2020-07-01 | Harpoon Therapeutics, Inc. | PROSTATE SPECIFIC MEMBRANE ANTIGEN BINDING PROTEIN |
MX2019006045A (es) | 2016-11-23 | 2019-11-11 | Harpoon Therapeutics Inc | Proteinas triespecificas dirigidas a psma y metodos de uso. |
WO2018106993A1 (en) * | 2016-12-09 | 2018-06-14 | H. Lee Moffitt Cancer Center And Research Institute Inc. | Tlr9-binding chimeric antigen receptors |
GB201700345D0 (en) | 2017-01-09 | 2017-02-22 | F-Star Beta Ltd | Conditional agonists of immune responses |
WO2018152326A1 (en) * | 2017-02-17 | 2018-08-23 | Denali Therapeutics Inc. | Engineered transferrin receptor binding polypeptides |
AU2018222749B2 (en) | 2017-02-17 | 2024-04-18 | Fred Hutchinson Cancer Center | Combination therapies for treatment of BCMA-related cancers and autoimmune disorders |
EP3589662A4 (en) | 2017-02-28 | 2020-12-30 | Harpoon Therapeutics, Inc. | INDUCTIBLE MONOVALENT ANTIGBINDING PROTEIN |
WO2018170475A1 (en) | 2017-03-17 | 2018-09-20 | Fred Hutchinson Cancer Research Center | Immunomodulatory fusion proteins and uses thereof |
CN115028727A (zh) | 2017-05-12 | 2022-09-09 | 哈普恩治疗公司 | 靶向msln的三特异性蛋白质及使用方法 |
AU2018265856B2 (en) | 2017-05-12 | 2023-04-27 | Harpoon Therapeutics, Inc. | Mesothelin binding proteins |
MA49517A (fr) | 2017-06-30 | 2020-05-06 | Xencor Inc | Protéines de fusion fc hétérodimères ciblées contenant il-15/il-15ra et domaines de liaison à l'antigène |
KR20200058510A (ko) | 2017-10-02 | 2020-05-27 | 데날리 테라퓨틱스 인크. | 효소 대체 요법 효소를 포함하는 융합 단백질 |
US10927180B2 (en) | 2017-10-13 | 2021-02-23 | Harpoon Therapeutics, Inc. | B cell maturation antigen binding proteins |
AU2018347582A1 (en) | 2017-10-13 | 2020-05-07 | Harpoon Therapeutics, Inc. | Trispecific proteins and methods of use |
KR20200085828A (ko) | 2017-11-08 | 2020-07-15 | 젠코어 인코포레이티드 | 신규의 항-pd-1 서열을 사용한 이중특이적 및 단일특이적 항체 |
US10981992B2 (en) | 2017-11-08 | 2021-04-20 | Xencor, Inc. | Bispecific immunomodulatory antibodies that bind costimulatory and checkpoint receptors |
JP7357616B2 (ja) | 2017-12-05 | 2023-10-06 | 中外製薬株式会社 | Cd3およびcd137に結合する改変された抗体可変領域を含む抗原結合分子 |
US11952413B2 (en) | 2017-12-14 | 2024-04-09 | 2Seventy Bio, Inc. | Dimerizing agent regulated immunoreceptor complexes comprising interleukin receptor signaling domains |
TW201930355A (zh) * | 2017-12-19 | 2019-08-01 | 英商F星貝塔有限公司 | 結合物件(三) |
MX2020006322A (es) | 2017-12-19 | 2020-09-18 | Xencor Inc | Proteinas de fusion il-2 fc modificadas. |
WO2019177543A1 (en) | 2018-03-15 | 2019-09-19 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Anti-dengue virus antibodies having cross-reactivity to zika virus and methods of use |
AU2019247415A1 (en) | 2018-04-04 | 2020-10-22 | Xencor, Inc. | Heterodimeric antibodies that bind fibroblast activation protein |
US10654944B2 (en) | 2018-04-10 | 2020-05-19 | Y-Biologics Inc. | Cell engaging binding molecules |
CN112437777A (zh) | 2018-04-18 | 2021-03-02 | Xencor股份有限公司 | 包含IL-15/IL-15RA Fc融合蛋白和TIM-3抗原结合结构域的靶向TIM-3的异源二聚体融合蛋白 |
WO2019204665A1 (en) | 2018-04-18 | 2019-10-24 | Xencor, Inc. | Pd-1 targeted heterodimeric fusion proteins containing il-15/il-15ra fc-fusion proteins and pd-1 antigen binding domains and uses thereof |
KR20210020903A (ko) * | 2018-05-14 | 2021-02-24 | 하푼 테라퓨틱스, 인크. | 면역글로불린 분자의 조건부 활성화를 위한 결합 모이어티 |
US20210284728A1 (en) * | 2018-05-14 | 2021-09-16 | Harpoon Therapeutics, Inc. | Dual binding moiety |
KR20210028155A (ko) * | 2018-05-17 | 2021-03-11 | 이뮤놈 인코포레이티드 | Ch3 도메인 에피토프 태그 |
GB201811404D0 (en) | 2018-07-12 | 2018-08-29 | F Star Beta Ltd | Anti-CD137 Antibodies |
GB201811408D0 (en) | 2018-07-12 | 2018-08-29 | F Star Beta Ltd | CD137 Binding Molecules |
GB201811410D0 (en) | 2018-07-12 | 2018-08-29 | F Star Beta Ltd | OX40 Binding molecules |
GB201811450D0 (en) | 2018-07-12 | 2018-08-29 | F Star Delta Ltd | Mesothelin and CD137 binding molecules |
GB201811415D0 (en) | 2018-07-12 | 2018-08-29 | F Star Beta Ltd | Anti-Mesothelin Anti bodies |
EP3820569A1 (en) | 2018-07-12 | 2021-05-19 | F-Star Beta Limited | Antibody molecules that bind pd-l1 and cd137 |
US20220048996A1 (en) | 2018-07-12 | 2022-02-17 | F-Star Beta Limited | Antibody molecules that bind cd137 and ox40 |
KR102259473B1 (ko) | 2018-08-10 | 2021-06-02 | 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 | 항cd137 항원 결합 분자 및 그의 사용 |
EP3849565A4 (en) | 2018-09-12 | 2022-12-28 | Fred Hutchinson Cancer Research Center | REDUCING CD33 EXPRESSION FOR SELECTIVE PROTECTION OF THERAPEUTIC CELLS |
US20220054544A1 (en) * | 2018-09-21 | 2022-02-24 | Harpoon Therapeutics, Inc. | Conditionally active receptors |
KR20210086623A (ko) | 2018-09-25 | 2021-07-08 | 하푼 테라퓨틱스, 인크. | Ddl3 결합 단백질 및 사용 방법 |
CA3115096A1 (en) | 2018-10-03 | 2020-04-09 | Xencor, Inc. | Il-12 heterodimeric fc-fusion proteins |
WO2020079692A1 (en) | 2018-10-17 | 2020-04-23 | Biolinerx Ltd. | Treatment of metastatic pancreatic adenocarcinoma |
US11472890B2 (en) | 2019-03-01 | 2022-10-18 | Xencor, Inc. | Heterodimeric antibodies that bind ENPP3 and CD3 |
KR20210149779A (ko) | 2019-04-10 | 2021-12-09 | 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 | Fc 영역 개변 항체의 정제 방법 |
BR112021026832A2 (pt) | 2019-07-02 | 2022-05-10 | Hutchinson Fred Cancer Res | Vetores ad35 recombinantes e aprimoramentos da terapia gênica relacionada |
CN112898412A (zh) * | 2019-12-03 | 2021-06-04 | 复旦大学 | 一种高稳定性类Fab抗体及其制备方法和应用 |
JP7415005B2 (ja) | 2019-12-18 | 2024-01-16 | エフ・ホフマン-ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト | 二重特異性抗ccl2抗体 |
PE20230036A1 (es) | 2019-12-23 | 2023-01-10 | Denali Therapeutics Inc | Variantes de progranulina |
IL294226A (en) | 2019-12-27 | 2022-08-01 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Anti-ctla-4 antibodies and their use |
IL272194A (en) | 2020-01-22 | 2021-07-29 | Yeda Res & Dev | Multi-target antibodies for use in the treatment of diseases |
IL272389A (en) | 2020-01-30 | 2021-08-31 | Yeda Res & Dev | Kits containing antibodies to PD-L1 and their uses in therapy |
IL272390A (en) | 2020-01-30 | 2021-08-31 | Yeda Res & Dev | Cancer treatment methods |
TW202144395A (zh) | 2020-02-12 | 2021-12-01 | 日商中外製藥股份有限公司 | 用於癌症之治療的抗cd137抗原結合分子 |
WO2021168303A1 (en) | 2020-02-21 | 2021-08-26 | Harpoon Therapeutics, Inc. | Flt3 binding proteins and methods of use |
TWI799824B (zh) | 2020-03-31 | 2023-04-21 | 日商中外製藥股份有限公司 | Dll3靶向之多特異性抗原結合分子及其用途 |
US20230312753A1 (en) | 2020-05-04 | 2023-10-05 | Immunorizon Ltd. | Precursor tri-specific antibody constructs and methods of use thereof |
GB202007099D0 (en) | 2020-05-14 | 2020-07-01 | Kymab Ltd | Tumour biomarkers for immunotherapy |
US10973908B1 (en) | 2020-05-14 | 2021-04-13 | David Gordon Bermudes | Expression of SARS-CoV-2 spike protein receptor binding domain in attenuated salmonella as a vaccine |
US11919956B2 (en) | 2020-05-14 | 2024-03-05 | Xencor, Inc. | Heterodimeric antibodies that bind prostate specific membrane antigen (PSMA) and CD3 |
EP4200332A1 (en) | 2020-08-19 | 2023-06-28 | Xencor, Inc. | Anti-cd28 and/or anti-b7h3 compositions |
EP4200019A1 (en) | 2020-08-21 | 2023-06-28 | Genzyme Corporation | Fgfr3 antibodies and methods of use |
JPWO2022044248A1 (zh) | 2020-08-28 | 2022-03-03 | ||
CA3212665A1 (en) | 2021-03-09 | 2022-09-15 | Xencor, Inc. | Heterodimeric antibodies that bind cd3 and cldn6 |
WO2022192586A1 (en) | 2021-03-10 | 2022-09-15 | Xencor, Inc. | Heterodimeric antibodies that bind cd3 and gpc3 |
JP2024515303A (ja) * | 2021-04-19 | 2024-04-08 | ヤンセン バイオテツク,インコーポレーテツド | 操作された抗体定常領域変異体を有する分子 |
JP2024517872A (ja) | 2021-05-03 | 2024-04-23 | メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング | HER2を標的にするFc抗原結合性フラグメント-薬物抱合体 |
EP4346905A1 (en) | 2021-05-25 | 2024-04-10 | Merck Patent GmbH | Egfr targeting fc antigen binding fragment-drug conjugates |
KR20240021859A (ko) | 2021-06-18 | 2024-02-19 | 에프. 호프만-라 로슈 아게 | 이중특이적 항-ccl2 항체 |
AR126236A1 (es) | 2021-06-25 | 2023-10-04 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Uso del anticuerpo anti-ctla-4 |
TW202317627A (zh) | 2021-06-25 | 2023-05-01 | 日商中外製藥股份有限公司 | 抗ctla-4抗體 |
IL286430A (en) | 2021-09-14 | 2023-04-01 | Yeda Res & Dev | Multispecific antibodies for use in the treatment of diseases |
WO2024042104A1 (en) | 2022-08-26 | 2024-02-29 | Merck Patent Gmbh | Combination cancer treatment comprising an anti-msln/cd137 antibody and pd-1/pd-l1 inhibitor |
WO2024042105A1 (en) | 2022-08-26 | 2024-02-29 | Merck Patent Gmbh | Cancer treatment comprising an anti-msln/cd137 antibody and a chemotherapeutic |
Family Cites Families (107)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1985003947A1 (en) | 1984-03-01 | 1985-09-12 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Jr. U | T-cell receptor-specific for antigen polypeptides and related polynucleotides |
US6492107B1 (en) * | 1986-11-20 | 2002-12-10 | Stuart Kauffman | Process for obtaining DNA, RNA, peptides, polypeptides, or protein, by recombinant DNA technique |
DE3546806C2 (zh) * | 1985-03-30 | 1991-03-28 | Marc Genf/Geneve Ch Ballivet | |
US5892019A (en) * | 1987-07-15 | 1999-04-06 | The United States Of America, As Represented By The Department Of Health And Human Services | Production of a single-gene-encoded immunoglobulin |
US5223409A (en) | 1988-09-02 | 1993-06-29 | Protein Engineering Corp. | Directed evolution of novel binding proteins |
IL162181A (en) | 1988-12-28 | 2006-04-10 | Pdl Biopharma Inc | A method of producing humanized immunoglubulin, and polynucleotides encoding the same |
JP3283041B2 (ja) | 1990-07-13 | 2002-05-20 | 学校法人藤田学園 | 人工抗体 |
DK0564531T3 (da) | 1990-12-03 | 1998-09-28 | Genentech Inc | Berigelsesfremgangsmåde for variantproteiner med ændrede bindingsegenskaber |
PT100379B (pt) | 1991-04-10 | 1999-01-29 | Scripps Research Inst | Bibliotecas de receptores heterodimericos usando fagomideos |
US5270170A (en) | 1991-10-16 | 1993-12-14 | Affymax Technologies N.V. | Peptide library and screening method |
US5395750A (en) * | 1992-02-28 | 1995-03-07 | Hoffmann-La Roche Inc. | Methods for producing proteins which bind to predetermined antigens |
WO1993023537A1 (en) | 1992-05-08 | 1993-11-25 | Creative Biomolecules | Chimeric multivalent protein analogues and methods of use thereof |
DE69334287D1 (de) * | 1992-09-25 | 2009-07-09 | Avipep Pty Ltd | Zielmoleküle-bindende Polypeptide bestehend aus einer IG-artigen VL Domäne die an eine IG-artige VH Domäne gebunden ist |
US6194166B1 (en) * | 1993-05-24 | 2001-02-27 | Takara Shuzo Co., Ltd. | Gene regulating aureobasidin sensitivity |
US5536814A (en) | 1993-09-27 | 1996-07-16 | La Jolla Cancer Research Foundation | Integrin-binding peptides |
ATE204300T1 (de) | 1994-05-13 | 2001-09-15 | Biovation Ltd | Zielzellen-bindende chimäre peptide |
GB9501079D0 (en) | 1995-01-19 | 1995-03-08 | Bioinvent Int Ab | Activation of T-cells |
AUPO591797A0 (en) * | 1997-03-27 | 1997-04-24 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation | High avidity polyvalent and polyspecific reagents |
US5783186A (en) | 1995-12-05 | 1998-07-21 | Amgen Inc. | Antibody-induced apoptosis |
US6358709B1 (en) * | 1995-12-07 | 2002-03-19 | Diversa Corporation | End selection in directed evolution |
US6361974B1 (en) * | 1995-12-07 | 2002-03-26 | Diversa Corporation | Exonuclease-mediated nucleic acid reassembly in directed evolution |
US6352842B1 (en) * | 1995-12-07 | 2002-03-05 | Diversa Corporation | Exonucease-mediated gene assembly in directed evolution |
DE69731289D1 (de) | 1996-03-18 | 2004-11-25 | Univ Texas | Immunglobulinähnliche domäne mit erhöhten halbwertszeiten |
US6696251B1 (en) | 1996-05-31 | 2004-02-24 | Board Of Trustees Of The University Of Illinois | Yeast cell surface display of proteins and uses thereof |
WO1998039482A1 (en) | 1997-03-07 | 1998-09-11 | Sunol Molecular Corporation | Fusion proteins comprising bacteriophage coat protein and a single-chain t cell receptor |
US6057098A (en) | 1997-04-04 | 2000-05-02 | Biosite Diagnostics, Inc. | Polyvalent display libraries |
DK0985039T3 (da) | 1997-06-12 | 2008-06-09 | Novartis Int Pharm Ltd | Kunstige antistof-polypeptider |
GB9722131D0 (en) * | 1997-10-20 | 1997-12-17 | Medical Res Council | Method |
US6477506B1 (en) * | 1998-02-23 | 2002-11-05 | Sony Corporation | Terminal apparatus, information service center, transmitting system, and transmitting method |
DK2180007T4 (da) | 1998-04-20 | 2017-11-27 | Roche Glycart Ag | Glycosyleringsteknik for antistoffer til forbedring af antistofafhængig cellecytotoxicitet |
US6180343B1 (en) * | 1998-10-08 | 2001-01-30 | Rigel Pharmaceuticals, Inc. | Green fluorescent protein fusions with random peptides |
US6818418B1 (en) | 1998-12-10 | 2004-11-16 | Compound Therapeutics, Inc. | Protein scaffolds for antibody mimics and other binding proteins |
US6376246B1 (en) * | 1999-02-05 | 2002-04-23 | Maxygen, Inc. | Oligonucleotide mediated nucleic acid recombination |
DE60044223D1 (de) | 1999-01-19 | 2010-06-02 | Maxygen Inc | Durch oligonukleotide-vermittelte nukleinsäuren-rekombination |
US6897044B1 (en) | 1999-01-28 | 2005-05-24 | Biogen Idec, Inc. | Production of tetravalent antibodies |
EP1165775A2 (en) * | 1999-03-05 | 2002-01-02 | Maxygen, Inc. | Recombination of insertion modified nucleic acids |
US6472147B1 (en) | 1999-05-25 | 2002-10-29 | The Scripps Research Institute | Methods for display of heterodimeric proteins on filamentous phage using pVII and pIX, compositions, vectors and combinatorial libraries |
CA2373721C (en) | 1999-07-02 | 2013-10-15 | Genentech, Inc. | Compounds that bind her2 |
CA2406668C (en) | 1999-12-06 | 2015-11-24 | Board Of Trustees Of The University Of Illinois | High affinity tcr proteins and methods |
EP1118661A1 (en) | 2000-01-13 | 2001-07-25 | Het Nederlands Kanker Instituut | T cell receptor libraries |
JP2003274960A (ja) | 2000-02-03 | 2003-09-30 | Japan Science & Technology Corp | 可溶性t細胞受容体タンパク質およびその作成方法 |
AU2001232204A1 (en) | 2000-02-22 | 2001-09-03 | Ahuva Nissim | Chimeric and tcr phage display libraries, chimeric and tcr reagents and methods of use thereof |
WO2001070947A2 (en) | 2000-03-20 | 2001-09-27 | Maxygen, Inc. | Method for generating recombinant dna molecules in complex mixtures |
WO2001083525A2 (en) | 2000-05-03 | 2001-11-08 | Amgen Inc. | Modified peptides, comprising an fc domain, as therapeutic agents |
AU2001261628A1 (en) | 2000-05-16 | 2001-11-26 | Euroceltique S.A. | Cd28 synthebody for the modulation of immune responses |
AU2001264946A1 (en) * | 2000-05-24 | 2001-12-03 | Imclone Systems Incorporated | Bispecific immunoglobulin-like antigen binding proteins and method of production |
US6406863B1 (en) | 2000-06-23 | 2002-06-18 | Genetastix Corporation | High throughput generation and screening of fully human antibody repertoire in yeast |
WO2002006469A2 (en) | 2000-07-18 | 2002-01-24 | Enchira Biotechnology Corporation | Methods of ligation mediated chimeragenesis utilizing populations of scaffold and donor nucleic acids |
JP2002058479A (ja) | 2000-08-14 | 2002-02-26 | Canon Inc | 構造認識アミノ酸配列の取得方法 |
CA2418835A1 (en) | 2000-10-16 | 2002-04-25 | Phylos, Inc. | Protein scaffolds for antibody mimics and other binding proteins |
AU2002233994A1 (en) * | 2000-11-08 | 2002-05-21 | Incyte Genomics, Inc. | Secreted proteins |
GB0029407D0 (en) * | 2000-12-01 | 2001-01-17 | Affitech As | Product |
EP2357187A1 (en) | 2000-12-12 | 2011-08-17 | MedImmune, LLC | Molecules with extended half-lives, compositions and uses thereof |
WO2002059263A2 (en) | 2000-12-19 | 2002-08-01 | Sunol Molecular Corporation | Transgenic animals comprising a humanized immune system |
IL141539A0 (en) | 2001-02-20 | 2002-03-10 | Yeda Res & Dev | Dna molecules and cells transfected therewith |
AU2002256371B2 (en) * | 2001-04-26 | 2008-01-10 | Amgen Mountain View Inc. | Combinatorial libraries of monomer domains |
US20030157561A1 (en) * | 2001-11-19 | 2003-08-21 | Kolkman Joost A. | Combinatorial libraries of monomer domains |
EP1281757A1 (en) | 2001-07-31 | 2003-02-05 | Direvo Biotech AG | Method for the production of nucleic acids consisting of stochastically combined parts of source nucleic acids |
MXPA04001974A (es) | 2001-08-31 | 2004-07-16 | Avidex Ltd | Receptor de celula t soluble. |
JP4578098B2 (ja) | 2001-10-01 | 2010-11-10 | ダイアックス、コープ | 多重鎖真核ディスプレイベクターとその使用 |
ES2384235T3 (es) | 2001-10-22 | 2012-07-02 | The Scripps Research Institute | Compuestos dirigidos a integrinas |
US20040043424A1 (en) * | 2001-11-15 | 2004-03-04 | Baughn Mariah R | Immunoglobulin superfamily proteins |
US20050069549A1 (en) | 2002-01-14 | 2005-03-31 | William Herman | Targeted ligands |
US20040063924A1 (en) * | 2002-01-28 | 2004-04-01 | Y Tom Tang | Secreted proteins |
US20030157091A1 (en) * | 2002-02-14 | 2003-08-21 | Dyax Corporation | Multi-functional proteins |
US20040018508A1 (en) * | 2002-02-19 | 2004-01-29 | Syntherica Corporation | Surrogate antibodies and methods of preparation and use thereof |
US7317091B2 (en) | 2002-03-01 | 2008-01-08 | Xencor, Inc. | Optimized Fc variants |
US20040132101A1 (en) * | 2002-09-27 | 2004-07-08 | Xencor | Optimized Fc variants and methods for their generation |
DE60333554D1 (de) | 2002-03-04 | 2010-09-09 | Imclone Llc | Kdr-spezifische humane antikörper und deren anwendung |
US20040097711A1 (en) * | 2002-03-12 | 2004-05-20 | Henry Yue | Immunoglobulin superfamily proteins |
EP1394251A1 (en) | 2002-08-23 | 2004-03-03 | Direvo Biotech AG | Method for the selective randomization of polynucleotides |
CA2501870C (en) | 2002-10-09 | 2013-07-02 | Avidex Limited | Single chain recombinant t cell receptors |
EP2390268B1 (en) | 2002-11-08 | 2017-11-01 | Ablynx N.V. | Single domain antibodies directed against tumour necrosis factor-alpha and uses therefor |
NZ570811A (en) | 2002-11-09 | 2009-11-27 | Immunocore Ltd | T cell receptor display |
EP1567553A2 (en) | 2002-12-03 | 2005-08-31 | Avidex Ltd. | Complexes of receptors |
GB0304068D0 (en) | 2003-02-22 | 2003-03-26 | Avidex Ltd | Substances |
WO2005021595A1 (en) | 2003-08-28 | 2005-03-10 | Euro-Celtique S.A. | Methods of antibody engineering using antibody display rules |
WO2005070966A2 (en) | 2004-01-16 | 2005-08-04 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Fusion polypeptides capable of activating receptors |
EP2053062A1 (en) * | 2004-03-24 | 2009-04-29 | Xencor, Inc. | Immunoglobin variants outside the Fc region |
US7785903B2 (en) | 2004-04-09 | 2010-08-31 | Genentech, Inc. | Variable domain library and uses |
DE602005011617D1 (de) | 2004-05-19 | 2009-01-22 | Medigene Ltd | Hochaffiner ny-eso-t-zellen-rezeptor |
DE602005009825D1 (de) | 2004-05-19 | 2008-10-30 | Medigene Ltd | Verfahren zur verbesserung von t-zellrezeptoren |
GB0411773D0 (en) | 2004-05-26 | 2004-06-30 | Avidex Ltd | Method for the identification of polypeptides which bind to a given peptide mhc complex or cd 1-antigen complex |
KR20180091967A (ko) | 2004-07-22 | 2018-08-16 | 제넨테크, 인크. | Her2 항체 조성물 |
SI1797127T1 (sl) | 2004-09-24 | 2017-09-29 | Amgen Inc. | Modificirane fc-molekule |
AU2005291039A1 (en) | 2004-10-01 | 2006-04-13 | Avidex Ltd. | T-cell receptors containing a non-native disulfide interchain bond linked to therapeutic agents |
CA2587766A1 (en) | 2004-11-10 | 2007-03-01 | Macrogenics, Inc. | Engineering fc antibody regions to confer effector function |
US20080274133A1 (en) | 2004-11-18 | 2008-11-06 | Avidex Ltd. | Soluble Bifunctional Proteins |
GB0425732D0 (en) | 2004-11-23 | 2004-12-22 | Avidex Ltd | Gamma-delta t cell receptors |
CA2594356C (en) | 2005-01-05 | 2018-07-17 | F-Star Biotechnologische Forschungs- Und Entwicklungsges.M.B.H. | Synthetic immunoglobulin domains with binding properties engineered in regions of the molecule different from the complementarity determining regions |
GB0503546D0 (en) | 2005-02-21 | 2005-03-30 | Hellenic Pasteur Inst | Antibody |
US8008453B2 (en) | 2005-08-12 | 2011-08-30 | Amgen Inc. | Modified Fc molecules |
BRPI0710011A2 (pt) | 2006-04-14 | 2011-08-02 | Trubion Pharmaceuticals Inc | proteìnas de ligação compreendendo articulação de imunoglobulina e regiões fc dotadas de funções efetoras fc alteradas |
AT503889B1 (de) | 2006-07-05 | 2011-12-15 | Star Biotechnologische Forschungs Und Entwicklungsges M B H F | Multivalente immunglobuline |
AT503902B1 (de) | 2006-07-05 | 2008-06-15 | F Star Biotech Forsch & Entw | Verfahren zur manipulation von immunglobulinen |
AT503861B1 (de) | 2006-07-05 | 2008-06-15 | F Star Biotech Forsch & Entw | Verfahren zur manipulation von t-zell-rezeptoren |
US7514271B2 (en) | 2007-03-30 | 2009-04-07 | International Business Machines Corporation | Method of forming high density planar magnetic domain wall memory |
EP1975178A1 (en) | 2007-03-30 | 2008-10-01 | f-star Biotechnologische Forschungs- und Entwicklungsges.m.b.H. | Transcytotic modular antibody |
WO2009000006A1 (en) | 2007-06-26 | 2008-12-31 | F-Star Biotechnologische Forschungs- Und Entwicklungsges.M.B.H. | Display of binding agents |
AU2009212747B2 (en) | 2008-01-31 | 2013-11-07 | The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Engineered antibody constant domain molecules |
EP2113255A1 (en) | 2008-05-02 | 2009-11-04 | f-star Biotechnologische Forschungs- und Entwicklungsges.m.b.H. | Cytotoxic immunoglobulin |
CA2765478A1 (en) | 2009-07-09 | 2011-01-13 | F-Star Biotechnologische Forschungs- Und Entwicklungsges.M.B.H. | Stabilized immunoglobulin constant domains |
US20120010388A1 (en) | 2010-04-16 | 2012-01-12 | Gottfried Himmler | LeY SPECIFIC BIOTHERAPEUTIC |
EP2407487A1 (en) | 2010-07-14 | 2012-01-18 | F-Star Biotechnologische Forschungs - und Entwicklungsges. M.B.H. | Multispecific modular antibody |
US20140087957A1 (en) | 2012-09-25 | 2014-03-27 | Marko Vuskovic | Methods, assays and kits for cancer diagnosis and screening utilizing glycan-binding and glycan epitopes |
GB201317622D0 (en) | 2013-10-04 | 2013-11-20 | Star Biotechnology Ltd F | Cancer biomarkers and uses thereof |
TW201642897A (zh) | 2015-04-08 | 2016-12-16 | F 星生物科技有限公司 | Her2結合劑治療 |
-
2006
- 2006-01-05 CA CA2594356A patent/CA2594356C/en active Active
- 2006-01-05 DE DE602006005200T patent/DE602006005200D1/de active Active
- 2006-01-05 PT PT06703578T patent/PT1699826E/pt unknown
- 2006-01-05 ES ES06011173T patent/ES2321861T3/es active Active
- 2006-01-05 EP EP06121439A patent/EP1752471B9/en active Active
- 2006-01-05 RS RSP-2009/0267A patent/RS50830B/sr unknown
- 2006-01-05 RS RSP-2009/0076A patent/RS50752B/sr unknown
- 2006-01-05 SI SI200630199T patent/SI1752471T1/sl unknown
- 2006-01-05 MX MX2007008118A patent/MX2007008118A/es active IP Right Grant
- 2006-01-05 EP EP06011173A patent/EP1772465B1/en active Active
- 2006-01-05 PL PL06011173T patent/PL1772465T3/pl unknown
- 2006-01-05 PT PT08168439T patent/PT2028193E/pt unknown
- 2006-01-05 PT PT06121439T patent/PT1752471E/pt unknown
- 2006-01-05 CN CN201310486561.2A patent/CN103555733A/zh active Pending
- 2006-01-05 DK DK06011173T patent/DK1772465T3/da active
- 2006-01-05 AT AT06011173T patent/ATE423140T1/de active
- 2006-01-05 PL PL06121439T patent/PL1752471T3/pl unknown
- 2006-01-05 EA EA200701443A patent/EA018897B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2006-01-05 KR KR20077014725A patent/KR101404512B1/ko active IP Right Grant
- 2006-01-05 ES ES06703578T patent/ES2323651T3/es active Active
- 2006-01-05 ES ES06121439T patent/ES2320374T3/es active Active
- 2006-01-05 PL PL06703578T patent/PL1699826T3/pl unknown
- 2006-01-05 RS RSP-2009/0212A patent/RS50785B/sr unknown
- 2006-01-05 JP JP2007549891A patent/JP4937138B2/ja active Active
- 2006-01-05 KR KR1020137018696A patent/KR20130105885A/ko not_active Application Discontinuation
- 2006-01-05 EP EP08168439A patent/EP2028193B1/en active Active
- 2006-01-05 WO PCT/EP2006/050059 patent/WO2006072620A1/en active Application Filing
- 2006-01-05 EP EP06703578A patent/EP1699826B1/en active Active
- 2006-01-05 AT AT06703578T patent/ATE425186T1/de active
- 2006-01-05 AU AU2006204459A patent/AU2006204459B2/en active Active
- 2006-01-05 NZ NZ555893A patent/NZ555893A/en unknown
- 2006-01-05 DE DE602006003695T patent/DE602006003695D1/de active Active
- 2006-01-05 SI SI200630309T patent/SI1699826T1/sl unknown
- 2006-01-05 DK DK08168439.1T patent/DK2028193T3/da active
- 2006-01-05 AT AT06121439T patent/ATE414718T1/de active
- 2006-01-05 ES ES08168439T patent/ES2384039T3/es active Active
- 2006-01-05 DK DK06121439T patent/DK1752471T3/da active
- 2006-01-05 PT PT06011173T patent/PT1772465E/pt unknown
- 2006-01-05 AT AT08168439T patent/ATE548386T1/de active
- 2006-01-05 CN CN200680001831.4A patent/CN101098891B/zh active Active
- 2006-01-05 US US11/722,517 patent/US20090298195A1/en not_active Abandoned
- 2006-01-05 DE DE602006005526T patent/DE602006005526D1/de active Active
- 2006-01-05 DK DK06703578T patent/DK1699826T3/da active
- 2006-01-05 SI SI200630280T patent/SI1772465T1/sl unknown
- 2006-01-05 BR BRPI0606399A patent/BRPI0606399A8/pt not_active Application Discontinuation
-
2007
- 2007-06-21 IL IL184103A patent/IL184103A/en active IP Right Grant
-
2009
- 2009-02-12 HR HR20090087T patent/HRP20090087T3/xx unknown
- 2009-02-18 CY CY20091100172T patent/CY1108767T1/el unknown
- 2009-04-20 HR HR20090228T patent/HRP20090228T1/xx unknown
- 2009-05-18 CY CY20091100528T patent/CY1110895T1/el unknown
- 2009-06-02 HR HR20090326T patent/HRP20090326T1/xx unknown
- 2009-06-11 CY CY20091100617T patent/CY1109143T1/el unknown
-
2011
- 2011-05-31 US US13/149,871 patent/US9856311B2/en active Active
- 2011-06-01 US US13/151,207 patent/US20110251375A1/en not_active Abandoned
- 2011-06-01 US US13/151,195 patent/US9045528B2/en active Active
- 2011-12-19 JP JP2011277069A patent/JP5483294B2/ja active Active
-
2013
- 2013-12-17 JP JP2013260218A patent/JP5717833B2/ja active Active
-
2017
- 2017-03-31 US US15/476,029 patent/US10385118B2/en active Active
-
2019
- 2019-04-16 US US16/386,067 patent/US11084868B2/en active Active
- 2019-11-22 US US16/692,220 patent/US11499249B2/en active Active
-
2022
- 2022-10-11 US US17/963,509 patent/US20230340696A1/en active Pending
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN107207592A (zh) * | 2014-12-05 | 2017-09-26 | 默克专利有限公司 | 结构域交换的抗体 |
CN107207592B (zh) * | 2014-12-05 | 2021-11-23 | 默克专利有限公司 | 结构域交换的抗体 |
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN101098891B (zh) | 分子中互补决定区以外的区域中工程改造了的具有结合特性的合成免疫球蛋白结构域 | |
JP6681855B2 (ja) | 新規な多価免疫グロブリン |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20140205 |
|
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |