CN101857637A

CN101857637A - 抗诺氟沙星多克隆抗体及其制备方法和应用

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Publication number: CN101857637A
Application number: CN 201010181727
Authority: CN
Inventors: 崔剑岚; 彭先芝; 黄秋鑫; 余以义; 张坤
Original assignee: Guangzhou Institute of Geochemistry of CAS
Current assignee: Guangzhou Institute of Geochemistry of CAS
Priority date: 2010-05-18
Filing date: 2010-05-18
Publication date: 2010-10-13

Abstract

本发明公开了一种抗诺氟沙星多克隆抗体及其制备方法和应用。该抗体是通过以下方法制备的：a)免疫原的制备：以诺氟沙星为半抗原，通过N-羟基琥珀酰亚胺活性酯法(NHS)将诺氟沙星与牛血清蛋白(BSA)偶联，得到免疫原；b)多克隆抗体的制备：将免疫原免疫动物，取动物血清，用免疫球蛋白A亲和层析法对血清进行纯化，最后获得的抗体，即为抗诺氟沙星多克隆抗体。该抗诺氟沙星多克隆抗体具有单一性高、灵敏度高、特异性强、并且能长期保存，能高效结合诺氟沙星的优点，因此可应用于检测诺氟沙星在水环境中的残留。

Description

抗诺氟沙星多克隆抗体及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及免疫学和环境分析化学检测领域，具体地说，涉及一种特异性捕获诺氟沙星药物残留的抗诺氟沙星多克隆抗体及其制备方法，和该抗诺氟沙星多克隆抗体在检测天然淡水和污水中诺氟沙星药物残留中的应用。

背景技术

诺氟沙星药物属于氟喹诺酮类抗生素，是一种用于治疗人类细菌感染的广谱抗生素。由于氟喹诺酮类抗生素的大量使用，诺氟沙星已经成为氟喹诺酮类在环境中残留的主要抗生素之一。抗生素的滥用会导致细菌产生耐药性，使到细菌感染更加难以控制。另一方面，诺氟沙星对人体的潜在毒理影响尚未清楚。因此，监测环境中的诺氟沙星药物残留具有重要意义。目前，尚无一种快速、廉价的方法对水环境中的诺氟沙星进行检测。传统的高效液相色谱法不仅样品前处理复杂，并且费用昂贵，推广使用受到限制。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种能与诺氟沙星特异性结合的抗诺氟沙星多克隆抗体及其制备方法。

本发明的能与诺氟沙星特异性结合的抗诺氟沙星多克隆抗体是通过以下方法制备的：

a)免疫原的制备：以诺氟沙星为半抗原，通过N-羟基琥珀酰亚胺活性酯法(NHS)将诺氟沙星与牛血清蛋白(BSA)偶联，得到免疫原；

b)多克隆抗体的制备：将免疫原免疫动物，取动物血清，用免疫球蛋白A亲和层析法对血清进行纯化，最后获得的抗体，即为抗诺氟沙星多克隆抗体。

利用上述方法制备的抗诺氟沙星多克隆抗体在4℃冰箱中能够保存2年。经冷冻干燥后，该抗体在-20℃冰箱中能够长期保存，年限在15年以上。

所述的动物优选为新西兰大白兔，利用上述方法制备的兔多克隆抗体，该抗体效价达到1∶1024000倍。

本发明的第二个目的是提供抗诺氟沙星多克隆抗体在检测诺氟沙星中的应用。

本发明所述的抗诺氟沙星多克隆抗体在检测诺氟沙星中的应用，其使用方法可为放射免疫法，酶联免疫法和免疫荧光法，其载体可为液相也可以为固相。对于固相载体而言，可以将本发明的抗诺氟沙星多克隆抗体固定于固相载体上，也可以将包被原固定于固相载体上。对于液相而言，通常可以向处在特定缓冲体系的待测样品中直接加入本发明的抗诺氟沙星多克隆抗体，然后在适于抗原抗体发生相互作用的温度(如室温)进行反应。

免疫检测中所用的第二抗体可以是放射性同位素标记的，包括但不限于使用选自：³²P、¹²⁵I、³⁵S或²H等；也可以是非放射性同位素标记的，包括但不限于使用选自：辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、生物素、链酶亲和素等标记。免疫检测中使用的检测剂，取决于检测过程使用的第二抗体标记物，本领域技术人员知晓如何选择合适的检测试剂。

优选使用方法为间接竞争酶联免疫法，为实施该方法，本发明还提供了具体实施方案，它所使用的试剂包括酶联免疫的常规试剂，酶标板和抗诺氟沙星多克隆抗体，所述的酶标板是将诺氟沙星与卵清蛋白通过N-羟基琥珀酰亚胺活性酯法(NHS)偶联，将此偶联物作为包被原吸附于固相载体中而形成的。然后在酶标板上加入抗诺氟沙星多克隆抗体工作液和诺氟沙星样品溶液，样品中的诺氟沙星就会与固相载体中的包被原竞争有限的抗诺氟沙星多克隆抗体。通过洗涤，将结合了样品中游离的抗诺氟沙星多克隆抗体洗去，再使用酶标二抗标记已经与包被原结合的抗体，显色后，测定吸光光度值，该值与样品中诺氟沙星的含量呈负相关，与标准曲线比较即可得出诺氟沙星的含量。应用本方法可以高效、准确、简便检测样品中的诺氟沙星，适于大量样品筛选的定性、定量检测。因此本发明的间接竞争酶联免疫方法具有使用方便和成本低廉的优点。

利用本发明的抗诺氟沙星多克隆抗体可以检测污水和天然淡水等样品，所述的污水优选经过前处理，即将污水样本pH值调至7.3-7.5之间，再使用孔径为0.22μm的膜进行过滤，即可直接进行分析。所述的天然淡水的前处理优选为将样本的天然淡水的pH值调至7.3-7.5之间，使用孔径为0.22μm的膜进行过滤。取100ml进行固相微萃取，用5ml甲醇淋出，并用氮气吹干，再取1ml pH值为7.4的磷酸缓冲液重新溶解并稀释至相应的浓缩倍数，即可进行分析。河水浓缩倍数优选为10倍，湖水优选为20倍，井水优选为100倍。

本发明的抗诺氟沙星多克隆抗体单一性高、灵敏度高、特异性强、并且能长期保存，能高效结合诺氟沙星，因此可应用于检测诺氟沙星在水环境中的残留。

利用本发明的间接竞争酶联免疫方法检测诺氟沙星在天然淡水和污水中的残留，具有精确度高、准确度高、对设备仪器要求低、成本低、无放射性同位素污染的优点，有效填补了快速检测天然淡水和污水中诺氟沙星残留的空白，对日常水环境监测能够发挥重要作用。

附图说明

图1是诺氟沙星与牛血清蛋白(NFX-BSA)偶联后的紫外吸光光谱，并与诺氟沙星(NFX)和牛血清蛋白(BSA)的紫外图谱作比较；

图2是诺氟沙星检测标准曲线图。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1

一、抗诺氟沙星多克隆抗体的制备

(1)诺氟沙星免疫原的合成

a、取9.6mg诺氟沙星标准品(可市购)，17.25mg N-羟基琥珀酰亚胺和57.5mg EDC.HCL(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基-碳二亚胺盐酸盐)，溶于3ml N，N-二甲基甲酰胺中。

b、室温避光搅拌24小时，形成诺氟沙星标准品反应液。

c、取750mg的牛血清蛋白(BSA)溶于8ml(0.1M，pH 7.4)的磷酸盐缓冲液中。

d、将诺氟沙星标准品反应液在缓慢搅拌下加到牛血清蛋白溶液中，室温缓慢搅拌反应3小时。

e、将反应完的溶液对(0.1M，pH 7.4)磷酸盐缓冲液透析3天，每天更换透析液3-4次。

f、将透析后的反应液冷冻干燥，分装后在-20℃保存。其偶联后的紫外吸收光谱见于图1(2)动物免疫程序

a、采用新西兰大白兔作为免疫动物，以上述免疫原，对新西兰大白兔采取小剂量、低频率、长程免疫法进行免疫，初次免疫将0.5mg/kg(即按照每千克新西兰大白兔注射0.5mg免疫原的剂量)免疫原溶在0.5ml 0.9％(质量分数)的NaCl溶液中，再与等体积的弗氏完全佐剂充分乳化后，进行背部皮下多点注射。

b、二免是间隔17天后，使用0.5mg/kg(即按照每千克新西兰大白兔注射0.5mg免疫原的剂量)诺氟沙星免疫原溶于0.5ml 0.9％(质量分数)的NaCl溶液中，再与等体积的弗氏不完全佐剂充分乳化后，进行背部皮下多点注射。

c、三免、四免、五免、六免都是间隔17天，使用0.25mg/kg(即按照每千克新西兰大白兔注射0.25mg免疫原的剂量)的诺氟沙星免疫原免疫，其配制方法与二免的注射免疫试剂相同，只是剂量浓度不同而已。

d、七免是六免17天后，使用0.25mg/kg(即按照每千克新西兰大白兔注射0.25mg免疫原的剂量)的诺氟沙星免疫原免疫溶于0.5ml 0.9％(质量分数)的NaCl溶液中，直接进行免疫注射。

e、七免十天后，颈静脉取血。血清使用免疫球蛋白A亲和层析法进行纯化。纯化使用密理博公司提供的抗体纯化蛋白A试剂盒，产品编号为LSK2ABA20，按照该试剂盒的操作说明书进行操作，获得抗体。

f、抗体效价实验：实验使用间接竞争酶联免疫法进行测定，测定具体方法如下：使用不同的包被原浓度和不同稀释浓度的抗体作棋盘式测试，以阴性对照两倍以上的读数为阳性结果，阳性结果中，以抗体最大的稀释倍数为抗体效价。从表1中可见，包被抗原为0.16mg/L，抗体在稀释1024000倍后，读数仍在阴性血清对照的两倍以上，则所获得的抗体效价在1∶1024000倍以上。

表1抗诺氟沙星多克隆抗体的效价实验表

三、应用抗诺氟沙星多克隆抗体检测诺氟沙星残留量的酶联免疫吸附试验—ELISA方法

1、样品前处理

(1)污水

将样本pH值调至7.3-7.5之间，再使用孔径为0.22μm的针式过滤膜进行过滤，取50μl进行分析。

(2)天然淡水

将样本pH值调至7.3-7.5之间，使用孔径为0.22μm的针式过滤膜进行过滤。取100ml进行固相萃取，用5ml甲醇淋出，并用氮气吹干，再取1ml pH值为7.4的磷酸缓冲液重新溶解并稀释至相应的浓缩倍数，即可进行分析。河水浓缩倍数优选为10倍，湖水优选为20倍，井水优选为100倍。最后在稀释好的样本中取50μl进行分析。

2、包被原的合成

(1)取9.6mg诺氟沙星标准品，17.25mg N-羟基琥珀酰亚胺和57.5mg EDC.HCL(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基-碳二亚胺盐酸盐)，溶于3ml N，N-二甲基甲酰胺中。

(2)室温避光搅拌24小时，形成诺氟沙星标准品反应液。

(3)取693mg的卵清蛋白溶于8ml(0.1M，pH 7.4)的磷酸盐缓冲液中。

(4)将诺氟沙星标准品反应液在缓慢搅拌下加到卵清蛋白溶液中，室温缓慢搅拌反应3小时。

(5)将反应完的溶液对(0.1M，pH 7.4)磷酸盐缓冲液透析3天，每天更换透析液3-4次。

(6)将透析后的反应液冷冻干燥，分装后在-20℃保存。

3、溶液的配置：

a、包被缓冲液：pH 9.6、0.05mol/L的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液。该缓冲液用于包被原的溶解与稀释。

b、封闭液：Ken-En-Tec公司的Synthetic Blocking Buffer，一种非蛋白封闭液。产品编号是4520A。

c、基础稀释液：pH 7.4的磷酸缓冲液(1.47mmol/L KH₂PO₄，10mmol/L Na₂HPO₄·12H₂O，2.7mmol/L KCl，137mmol/L NaCl)。

d、底物稀释液：pH 5.0的磷酸盐-柠檬酸缓冲液(0.2mol/L Na₂HPO₄，0.1mol/L柠檬酸)。该缓冲液用于邻苯二胺显色剂的溶解与稀释。

e、洗涤液：含有0.05％Tween-20的pH 7.4的磷酸缓冲液(1.47mmol/L KH₂PO₄，10mmol/LNa₂HPO₄·12H₂O，2.7mmol/L KCl，137mmol/L NaCl)。

f、诺氟沙星标准溶液：将诺氟沙星标准品溶于水中，配成浓度为0μg/L、0.01μg/L、0.1μg/L、0.5μg/L、1μg/L、5μg/L、10μg/L、100μg/L的诺氟沙星标准溶液。

g、抗诺氟沙星多克隆抗体工作液：用基础稀释液将抗诺氟沙星多克隆抗体作64000倍稀释成工作浓度。

h、辣根过氧化物酶标记羊抗兔抗抗体工作液：用基础稀释液将辣根过氧化物酶标记羊抗兔抗抗体原液作5000倍稀释成工作浓度。该抗抗体购自Pierce公司，产品编号为31460。

i、显色剂：现配现用，10mg邻苯二胺溶于25ml底物稀释液，避光20-30分钟，再加入10μl H₂O₂。

j、终止液：2mol/L H₂SO₄。

4、酶标板的包被：

向96孔酶标板的小孔中加入100μl 0.16mg/L包被原溶液，包被原溶液是将包被原溶于包被原缓冲液中，配置而成，用封板膜封好后在37℃中温育90分钟后取出，用洗板机洗板4次，每孔用350μl洗涤液，每次间隔30秒，洗第二次后浸泡3分钟(即第一次与第二次洗涤间隔时间为30秒，第二次洗涤后浸泡3min后再进行第三次洗涤，第三次洗涤和第四次洗涤的间隔时间为30秒)，最后用吸水纸吸干，以下的洗板程序皆与此相同。再加入封闭液，每孔250μl，封闭7-8分钟，洗板，用吸水纸吸干，由此而制备成含有包被原的酶标板。

5、实验方法：

在上述方法制备的含有包被原的酶标板的小孔中加入诺氟沙星系列标准溶液或样品溶液50μl，再加入抗诺氟沙星多克隆抗体工作液50μl，37℃温育60分钟，用洗涤液洗板，再用吸水纸吸干。在酶标板的小孔中加入酶标二抗溶液，即辣根过氧化物酶标记羊抗兔抗抗体工作液，37℃温育60分钟，用洗涤液洗涤，拍干。加入显色剂100μl于酶标板的小孔中，避光显色6-8分钟，加入终止液50μl，轻轻震荡摇匀，然后在波长492nm下用酶标仪测定每孔的吸光值。

实验一、标准曲线实验：

诺氟沙星标准溶液的配置：将诺氟沙星标准品溶于pH值为7.4的磷酸缓冲液(1.47mmol/L KH₂PO₄，10mmol/L Na₂HPO₄·12H₂O，2.7mmol/L KCl，137mmol/L NaCl)中，配成浓度为0μg/L、0.01μg/L、0.1μg/L、0.5μg/L、1μg/L、5μg/L、10μg/L、100μg/L的诺氟沙星标准溶液。

在含有包被原的酶标板的小孔中分别加入上述诺氟沙星系列标准品溶液50μl，再分别加入抗诺氟沙星多克隆抗体工作液50μl，37℃温育60分钟，用洗涤液洗板，再用吸水纸吸干。在酶标板的小孔中加入酶标二抗溶液，即辣根过氧化物酶标记羊抗兔抗抗体工作液，37℃温育60分钟，用洗涤液洗涤，拍干。加入显色剂100μl于酶标板的小孔中，避光显色6-8分钟，加入终止液50μl，轻轻震荡摇匀，然后在波长492nm下用酶标仪测定每孔的吸光值。每个标准溶液做四个重复。

检测结果分析过程为：用所获得的每个浓度的标准溶液的吸光平均值(B)除以不含诺氟沙星的溶液(0标准)的吸光光度值(B₀)再乘以100％，即百分吸光光度值，计算公式为：

百分吸光光度值(％)＝(B/B₀)×100％

公式中B为标准溶液的平均吸光值，B₀为诺氟沙星浓度为0μg/L标准溶液的平均吸光光度值。以诺氟沙星标准品溶液的浓度取10为底数的对数值为X轴，百分吸光度值为Y轴，作出标准曲线。

本实验中各个标准品溶液的吸光光度值如表2所示，其中每个浓度重复测试4次，取平均值绘制成标准曲线，如图2所示，其回归方程为Y＝0.625-0.294X。

表2各个标准品溶液的吸光光度值

用同样的方法测得样品溶液的百分吸光光度值，从诺氟沙星标准曲线中读出样品中诺氟沙星的含量或者从回归方程中计算出样品中诺氟沙星的含量。

按照上述的ELISA法和液相色谱-质谱法(LC-MS)分别检测污水、河水、湖水和井水样品中诺氟沙星的含量，其结果见于表3。

表3比较ELISA法和液相色谱-质谱法对实际样品的检测

ELISA法使用一式四份对样品进行检测并取平均值，LC-MS使用两份平行样品进行检测取平均值。从表3可以看出，两者对同一样品测定的诺氟沙星浓度具有一致性，表明本发明检测诺氟沙星的间接竞争酶联免疫方法，其检测结果是具有可信性，因此能用于检测诺氟沙星。

实验二精密度试验

1、标准可重复试验：

每批按照步骤三中的应用抗诺氟沙星多克隆抗体检测诺氟沙星残留量的酶联免疫吸附试验—ELISA方法的测定浓度为0.5μg/L，1μg/L，5μg/L的诺氟沙星标准品溶液的吸光光度值，每个浓度做8个微孔，每个浓度重复3次，计算相对标准偏差(RSD)，结果见表4：

表4标准样品可重复性试验

结果表明相对标准偏差范围在3.7％～9.8％，具有较好的精密度。

2、样品可重复试验：

取诺氟沙星标准品溶液，添加到样品中，分别取诺氟沙星终浓度为0.2μg/L，0.5μg/L两个不同的浓度，按照步骤三中的应用抗诺氟沙星多克隆抗体检测诺氟沙星残留量的酶联免疫吸附试验—ELISA方法的进行测定，每个浓度重复测试3次，每批测定4个微孔，分别计算相对标准偏差，其结果见于表5。

表5实际样品加标可重复试验

结果表明相对标准偏差在1.3％～7.3％之间，具有较好的精密度。

实验三准确度

1、取不同浓度的诺氟沙星标准品溶液添加到样品中，对样品进行添加回收试验，每个浓度做4个平行，取平均值得到的回收率，结果见于表6。

表6准确度试验结果

结果表明在PBS缓冲液中添加回收率为90.0％～108.4％之间；在生活污水中添加回收率为96.5％～104.8％；在河水中添加回收率为62.8％～75.7％之间；在湖水中添加回收率为85.5％～113.4％。由此可以说明本发明的抗诺氟沙星多克隆抗体的准确度较好。

实验四抗体特异性试验

特异性用交叉反应率来表示，交叉反应率指抗体与不同结构的抗原发生结合的能力。

选择与诺氟沙星结构相似的其他三种氟喹诺酮类药物，配制成不同浓度，替代诺氟沙星标准溶液，测定其标准曲线，并计算IC₅₀抑制浓度，得出交叉反应率，结果见于表7。

交叉反应率(％)＝(IC₅₀时诺氟沙星的浓度/IC₅₀时近似物的浓度)×100％

表7交叉反应率

药物名称	交叉反应率(％)
药物名称	交叉反应率(％)	氧氟沙星	＜0.1
环丙沙星	＜0.1	氧氟沙星	＜0.1
环丙沙星	＜0.1	恩诺沙星	＜0.1

结果表明，本发明所获得的抗诺氟沙星多克隆抗体与其它相似物的交叉反应率均低于0.1％，具有高度的特异性。

Claims

1.一种抗诺氟沙星多克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

a)免疫原的制备：以诺氟沙星为半抗原，通过N-羟基琥珀酰亚胺活性酯法将诺氟沙星与牛血清蛋白偶联，得到免疫原；

2.根据权利要求1所述的抗诺氟沙星多克隆抗体的制备方法，其特征在于所述的动物为新西兰大白兔。

3.一种根据权利要求1所述的抗诺氟沙星多克隆抗体的制备方法制备的抗诺氟沙星多克隆抗体。

4.权利要求3所述的抗诺氟沙星多克隆抗体在检测诺氟沙星中的应用。