CN101627128A - 膀胱癌生物标记及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及鉴定和选择新的生物标记以及鉴定和选择新的生物标记组合，所述生物标记及其组合在膀胱癌个体与没有膀胱癌个体之间差异性表达。特异性和/或选择性与本发明生物标记之产物杂交的多核苷酸和蛋白质也涵盖在本发明范围内，用于诊断膀胱癌的包含所述多核苷酸和蛋白质的试剂盒同样如此。本发明还涵盖所述特异性和/或选择性与本发明生物标记之产物杂交的多核苷酸和蛋白质用于监测个体中疾病消退以及监测治疗方案之功效的用途。本发明还提供应用本发明生物标记之产物鉴定针对膀胱癌的新治疗靶标的方法。

Description

膀胱癌生物标记及其用途

本申请要求于2005年5月2日提交的美国临时申请60/676,921和于2005年10月21日提交的美国临时申请60/729,056的权益，其通过参考并入本文。

本申请包括光盘，一式两份(2张光盘：表-拷贝1和表-拷贝2)，其全部内容通过参考并入本文。每张光盘是相同的并且含有以下文件(对应于表1-7和11-12)：

1.技术领域

本发明包括鉴定和选择新的膀胱癌生物标记，其包括早期膀胱癌生物标记，以及鉴定和选择新的生物标记组合，与没有膀胱癌的个体相比，具有膀胱癌或者浅表性膀胱癌的个体差异性表达所述新的生物标记组合。测量本发明的生物标记和生物标记组合的产物表达表明，在诊断个体具有膀胱癌方面具有特别的优势。本发明还包括特异性和/或选择性地与本发明生物标记之产物杂交/结合的多聚核苷酸和蛋白质。本发明还提供应用本发明生物标记产物鉴定化合物的方法，所述化合物结合和/或调节本发明生物标记基因的活性。经此方法鉴定的化合物可用于开发研究膀胱癌和膀胱癌发展的分析方法。此外，经此方法鉴定的化合物可用作开发预防性和治疗性组合物的先导化合物，用于预防、治疗、控制和/或缓解膀胱癌或其症状。

2.背景技术

膀胱癌是男性中第四位最常诊断的癌症，并且是女性患者中第八位最常诊断出的癌症(Greenlee et al.，Cancer Statistics，2001)。已证明暴露于香烟、芳族胺、煤燃烧副产物、氯化化合物和某些醛类化合物环境增加人们患膀胱癌的风险。膀胱癌自身对死亡率的影响较低，然而，该癌向其它位置的转移显著增加了死亡风险。因此，鉴定膀胱癌的诊断方法将是有益的。具体地，允许早期检测和介入的诊断方法将具有极大的益处。

当前应用的膀胱癌筛选方法包括应用膀胱镜检查；膀胱冲洗和/或尿细胞学检查。这些方法的每一种让医生查看膀胱和/或膀胱细胞以检测肿瘤或者其它的膀胱细胞异常。然而，这些方法是花费巨大的，因此对于未被怀疑具有膀胱癌风险增加的人来说，这些方法作为筛选方法是不实际的。另一惯用的筛选技术是血尿分析(即，检查尿中的血)。尽管血尿是膀胱癌最常见的症状，但它还可能指示许多另外的潜在诊断(即，低特异性)。例如，在英国对血尿门诊患者的前瞻性分析中，只有19.2％的全部血尿患者通过细胞检查被确定具有膀胱癌。此外，这些方法对较早期膀胱癌的那些患者甚至具有更低的特异性和敏感性。

因此，在本领域中需要相对便宜的和足够敏感和特异性的筛选膀胱癌的方法，以改善对具有膀胱癌风险的那些患者的检测。还需要具有更大能力筛选相对早期膀胱癌的方法，以允许对发现患有膀胱癌的那些患者实施早期干涉和更多的治疗选择。

3.发明内容

本发明涵盖鉴定和选择新的膀胱癌生物标记以及鉴定和选择浅表性(早期)膀胱癌生物标记以及鉴定这些生物标记的组合，从而提供简单的和相对便宜的检验，进而提供对膀胱癌筛选的改善。本文公开的方法以及使用这些方法所鉴定的生物标记和生物标记之组合的产物证明，它们在筛选患者以鉴定膀胱癌风险增加的患者方面具有特别的优点。应当理解的是，为了测量本发明生物标记的产物，与本发明鉴定的生物标记之产物及其衍生物特异性和/或选择性杂交/结合的多聚核苷酸和蛋白质也涵盖在本发明的范围内，含有所述多聚核苷酸和蛋白质用于诊断患有膀胱癌个体的试剂盒同样如此。此外，本发明还涵盖与本发明生物标记之产物特异性和/或选择性杂交的多聚核苷酸和蛋白质用于监测个体中膀胱癌发展以及监测治疗方案之功效的用途。本发明还提供应用本发明生物标记之产物用于鉴定膀胱癌的新治疗靶标的鉴定方法。

3.1定义

以下提供具体术语的定义，其用于以后的书面说明。

如本文所用的，术语“3’端”是指mRNA的末端，最多为最后1000个核苷酸或者所述mRNA的1/3，其中3’末端核苷酸是与(有可能存在的)多聚A尾邻接的编码或者非翻译区的末端核苷酸。也就是说，mRNA的3’端不包括有可能存在的多聚A尾。基因的“3’区”是指位于基因3’端处或者其内的多核苷酸(双链或者单链)，包括但不限于有可能存在的3’非翻译区以及基因的3’蛋白质编码区。3’区不短于8个核苷酸长并且不超过1000个核苷酸长。3’区其它可能的长度包括但不限于10、20、25、50、100、200、400和500个核苷酸。

如本文所用的，术语“5’端”是指从所述mRNA的第一个核苷酸开始的mRNA的末端，最多为所述mRNA前1000个核苷酸或者所述mRNA的1/3(其中所述mRNA的全长不包括多聚腺苷酸尾)。基因的“5’区”是指位于基因5’端处或其内的多核苷酸(双链或者单链)，并且包括但不限于有可能存在的5’非翻译区以及基因的5’蛋白质编码区。所述5’区不短于8个核苷酸长并且不超过1000个核苷酸长。所述5’区其它可能的长度包括但不限于10、20、25、50、100、200、400和500个核苷酸。

如本文所用的，术语“扩增”当用于核酸序列时，是指一种方法，由此从模板核酸产生一或多拷贝的特定核酸序列，优选通过聚合酶链式反应的方法实施(Mullis and Faloona，1987，Method Enzymol.，155：335)。“聚合酶链式反应”或“PCR”是指用于扩增特定核酸模板序列的体外方法。在一些实施方案中，PCR反应包括一系列重复的温度循环并且通常以50-100μl的体积实施。反应混合物包括各种dNTP(四种脱氧核苷酸dATP、dCTP、dGTP和dTTP的每一种)、引物、缓冲液、DNA聚合酶和核酸模板。PCR反应可以包括提供一组多核苷酸引物，其中第一引物含有互补于所述核酸模板的一条链中区域并且引发合成互补DNA链的序列，第二引物含有互补于所述靶核酸序列第二链中区域并且引发合成互补DNA链的序列，以及应用核酸聚合酶作为模板依赖性聚合剂来扩增所述核酸模板序列，其在允许以下PCR循环步骤的条件下实施：(i)使扩增所需引物与模板序列内所含靶核酸序列进行退火，(ii)延伸所述引物，其中核酸聚合酶合成引物延伸产物。“一组多核苷酸引物”或者“一组PCR引物”可以包括两种、三种、四种或者多种引物。在一个实施方案中，应用exo-Pfu DNA聚合酶在PCR反应中扩增核酸模板。其它扩增方法包括但不限于连接酶链式反应(LCR)、基于多核苷酸特异性的扩增(polynucleotide-specificbased amplication)(NSBA)或者本领域任何已知的其它方法。

如本文所用的，多肽的“氨基末端”区是指由位于mRNA 5’端或其内的多核苷酸序列(双链或者单链)编码的多肽序列。如本文所用的，“氨基末端”区是指从所述多肽第一个氨基酸开始的多肽之氨基末端，最多为所述多肽前300个氨基酸或者所述多肽的1/3。多肽的“氨基末端”区不短于3个氨基酸长并且不超过350个氨基酸长。多肽“氨基末端”区的其它可能长度包括但不限于5、10、20、25、50、100和200个氨基酸。

如本文所用的，在蛋白质性剂(例如，蛋白质、多肽、肽和抗体)的范畴内，术语“类似物”是指具有与第二蛋白质性剂相似或相同功能、但并不一定包括与第二蛋白质性剂相似或者相同氨基酸序列的蛋白质性剂，或者具有与第二蛋白质性剂相似或者相同结构的蛋白质性剂。具有相似氨基酸序列的蛋白质性剂是指满足以下至少一项的第二蛋白质性剂：(a)与第二蛋白质性剂的氨基酸序列具有至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少99％一致性之氨基酸序列的蛋白质性剂；(b)在严谨条件下与编码第二蛋白质性剂至少5个连续氨基酸残基、至少10个连续氨基酸残基、至少15个连续氨基酸残基、至少20个连续氨基酸残基、至少25个连续氨基酸残基、至少40个连续氨基酸残基、至少50个连续氨基酸残基、至少60个连续氨基酸残基、至少70个连续氨基酸残基、至少80个连续氨基酸残基、至少90个连续氨基酸残基、至少100个连续氨基酸残基、至少125个连续氨基酸残基或者至少150个连续氨基酸残基的核苷酸序列杂交的核苷酸序列所编码的蛋白质性剂；和(c)与编码第二蛋白质性剂的核苷酸序列具有至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或者至少99％一致性之核苷酸序列所编码的蛋白质性剂。与第二蛋白质性剂具有相似结构的蛋白质性剂是指与所述第二蛋白质性剂具有相似二级、三级或者四级结构的蛋白质性剂。可以通过本领域技术人员已知的方法确定蛋白质性剂的结构，所述方法包括但不限于肽测序、X-射线晶体学、核磁共振、圆二色性和晶体电子显微镜。

为确定两个氨基酸序列或者两个核酸序列的一致性百分率，为了最佳比对目的，对所述序列进行比对(例如，可以在第一氨基酸序列或者核酸序列中引入缺口用于与第二氨基酸或者核酸序列的最佳比对)。随后对在相应氨基酸位置或者核苷酸位置的氨基酸残基或者核苷酸进行比对。当所述第一序列中的位置由所述第二序列中相应位置上相同的氨基酸残基或者核苷酸所占据时，那么所述分子在该位置上是一致的。所述两个序列之间的一致性百分率是所述序列共有的一致位置数目的函数(即，一致性％＝一致的重叠位置数/位置总数×100％)。在一个实施方案中，所述两个序列的长度相等。

还可以应用数学算法完成对两个序列之间一致性百分率的确定。用于两个序列比对的数学算法的一个优选、非限制性实施例是以下的算法：Karlin和Altschul，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87：2264-2268，由Karlin and Altschul，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90：5873-5877改进。该算法被整合入Altschul et al.，1990，J.Mol.Biol.215：403的NBLAST和XBLAST程序中。BLAST核苷酸搜索可以用NBLAST核苷酸程序来实施，所述程序参数设置为，例如评分＝100、字长＝12以获得与本发明核酸分子同源的核苷酸序列。可以用XBLAST程序实施BLAST蛋白质搜索，所述程序参数设置为，例如评分-50、字长＝3以获得与本发明蛋白质分子同源的氨基酸序列。为获得用于比对目的的缺口比对，可以利用缺口BLAST，如Altschul et al.，1997，Nucleic Acids Res.25：3389-3402中所述。作为替代，可以应用PSI-BLAST实施迭代搜索，其检测分子之间的远缘关系(Id.)。当应用BLAST、缺口BLAST和PSI-Blast程序时，可以应用各个程序(例如，XBLAST和NALAST)的缺省参数(见，例如NCBI网站)。用于序列比对的数学算法的另一优选、非限制性实施例是Myers和Miller，1988，CABIOS 4：11-17所述的算法。该算法被整合于ALIGN程序(2.0版本)，其是GCG序列比对软件包的一部分。当应用ALIGN程序用于比对氨基酸序列时，可以使用PAM120加权残基表、缺口长度罚分为12和缺口罚分为4。可以应用与上述相似的技术，在允许或不允许缺口的条件下，确定两个序列之间的一致性百分率。计算一致性百分率时，通常只考虑精确匹配的情况。

如本文所用的，在非蛋白质类似物的范畴内，术语“类似物”是指具有与第一有机或者无机分子相似或者相同功能并且与所述第一有机或者无机分子在结构上相似的第二有机或者无机分子。

如本文所用的，术语“生物标记”是指基因，与不具有膀胱癌或者一定阶段之膀胱癌的个体(尽管个体可以具有其它疾病)相比在具有膀胱癌或者所述阶段之膀胱癌的个体中差异性表达的基因，并且可以包括与不具有膀胱癌的个体相比在具有浅表性膀胱癌的个体中差异性表达的基因。

本文所用的术语“生物标记特异性引物”是指一组引物，其可产生与本发明生物标记的一个或多个RNA产物之一部分互补的双链DNA。例如，所述引物可以包括能够选择性杂交与本发明生物标记互补的RNA、cDNA或者EST以产生延伸产物的第一引物，以及能够选择性杂交所述延伸产物的第二引物，其被用来产生与本发明生物标记互补的双链DNA。

本文所用的术语“生物标记特异性探针”是指与独特生物标记之RNA产物选择性和特异性杂交的探针。在一个实施方案中，生物标记特异性探针可以是具有荧光团和淬灭剂的探针，例如

探针或者Molecular

探针。在另一实施方案中，生物标记特异性探针是附着于阵列并且与独特生物标记之一个或多个RNA产物(或者对应于所述RNA产物的cDNA、EST或者PCR产物)选择性和特异性杂交的探针。生物标记特异性探针可以包括寡核苷酸探针并且还可以包括更长的探针(例如，100、150、200、250、300、350、400、450、500个核苷酸等)。

如本文所用的，术语“膀胱癌”是指一种疾病，其中膀胱内衬层的细胞丧失了调控其生长的能力，由此导致形成肿瘤的细胞团。如本文所用的，术语“早期膀胱癌”或者“浅表性膀胱癌”是指非侵袭性膀胱癌(例如，根据AJCC指南确定的Ta或者Tia型)(Herr et al.，2001)。

如本文所用的，术语“血核酸样品”是指源于血的核酸并且可以包括源于全血、离心裂解血、无血清全血或者分级血(包括外周血白细胞(PBL)或者如本文所述的其它血液成分)的核酸。全血意思是指未分级的血并且包括血滴，其中血滴包括5μl、10μl、15μl、20μl、25μl、30μl的体积。离心裂解血或者“裂解血”的意思是未分级的全血，其混合有裂解缓冲液并如本文所述进行离心(见实施例2)。无血清血意思是指未分级的全血，其中如本文所述离心去除血清或血浆(见实施例2)。优选地，血核酸样品是全血或者离心裂解血并且是总RNA、mRNA或者是对应于mRNA的核酸，例如从所述血中分离的cDNA。核酸样品还可以包括源于总RNA、mRNA或者cDNA的PCR产物。

如本文所用的，多肽的“羧基末端”区是指由位于mRNA 3’端或其内的多核苷酸序列(双链或者单链)编码的多肽序列。如本文所用的，“羧基末端”区是指多肽的羧基末端，最多为从所述多肽最后氨基酸计的所述多肽的300个氨基酸或者所述多肽的1/3。“3’端”不包括有可能存在的多聚腺苷酸尾。多肽的“羧基末端”区不短于3个氨基酸长并且不超过350个氨基酸长。多肽“羧基末端”区的其它可能长度包括但不限于5、10、20、25、50、100和200个氨基酸。

如本文所用的，术语“组织样品”是指源于组织的细胞，所述组织不是血，并且可以包括膀胱组织、脑组织、心脏组织、肺组织、***等。“组织核酸样品”是总RNA、mRNA或者是对应于RNA的核酸，例如cDNA。组织核酸样品还可以包括源于总RNA、mRNA或者cDNA的PCR产物。

如本文所用的，术语“本发明的生物标记的组合”是指如表1、表3、表4、表6、表7和表10、表11或者表12所公开的任何一种或多种生物标记。本发明的生物标记组合还包括如表1和表2所公开的任何两种或者多种生物标记的任何组合，只要所述组合的至少一种生物标记是来自表1即可。本发明的生物标记组合还包括如表4和表5所公开的任何两种或多种生物标记的任何组合，只要所述组合的至少一种生物标记是来自表4即可。本发明的生物标记组合还包括如表11和表2所公开的任何两种或多种生物标记的任何组合，只要所述组合的至少一种生物标记是来自表11即可。

如本文所用的，术语“化合物”和“试剂”是可互换使用的。

如本文所用的，“基本由...组成的(consisting essentially of)”是指可用来诊断或者筛选膀胱癌和/或诊断或筛选浅表性膀胱癌的生物标记的最大数。在一个实施方案中，用于诊断膀胱癌和/或浅表性膀胱癌的生物标记基本由表1生物标记中至少任意的、最多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、100、125、150、175、200、225、250个或者所有的所述生物标记组成。在另一实施方案中，用于诊断膀胱癌的生物标记基本由表7生物标记中至少任何的、最多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、100、125、150、175、200个或者所有的所述生物标记组成。在另一实施方案中，用于诊断膀胱癌的生物标记基本由表10生物标记中至少任何的、最多1、2、3、4、5、6、7、8、9个或者所有的所述生物标记组成。在另一实施方案中，用于诊断膀胱癌的生物标记基本至少由表1生物标记中至少任意的、最多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、13、15、20、25、30、35、40、45、50、100、125、150、175、200个所述生物标记与PCT申请No.PCT/US04/020836所公开生物标记中至少任何的、最多1、2、3、4、5、6、7、8、9或者10、15、20、30、40、50、100、200、300、400、500、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000个或者所有的所述生物标记组合而组成，该PCT申请的所述生物标记在表2中提供。在另一实施方案中，用于诊断浅表性或者早期阶段膀胱癌的生物标记基本由表4生物标记中至少任意的、最多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500个或者所有的所述生物标记组成。在另一实施方案中，用于诊断浅表性膀胱癌的生物标记基本由表4生物标记中至少任意的、最多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500个或者所有的所述生物标记与PCT申请No.PCT/US04/020836所公开生物标记中至少任意的、最多1、2、3、4、5、6、7、8、9或者10、15、20、30、40、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、1000、1500、2000、2500个或者所有的所述生物标记组合而组成，该PCT申请的所述生物标记在表5中提供。在另一实施方案中，用于诊断膀胱癌和/或浅表性膀胱癌的生物标记基本由表11生物标记中至少任何的、最多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、100、125、150、175、200、225、250个或者所有的所述生物标记组成。在另一实施方案中，用于诊断膀胱癌和/或浅表性膀胱癌的生物标记基本由表12生物标记中至少任何的、最多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、100、125、150、175、200、225、250个或者所有的所述生物标记组成。

如本文所用的，在本发明的范畴内，术语“对照”或“对照样品”是指一种或多种组织核酸样品和/或血核酸样品和/或一个或多个个体，所述个体被分类为具有***癌、具有一个或多个阶段的膀胱癌包括浅表性膀胱癌；没有膀胱癌或者没有一定阶段的膀胱癌(例如浅表性膀胱癌)；其中应用本领域技术人员已知的那些技术(例如，用于检测尿中核基质蛋白质(称作

)水平升高的

静脉内pyloegram(IVP)成像，CT扫描，MRI扫描，骨扫描或者超声等)。术语对照或者对照样品还可以指源于一个或多个个体的数据的汇编，所述个体被诊断为正常(没有膀胱癌)、具有膀胱癌或者具有一定阶段的膀胱癌(例如浅表性膀胱癌)。本领域技术人员应当理解术语对照是用在试验的范畴内并且将取决于所希望的比较。如本文所用的，术语“对照”在筛选预防性或者治疗性试剂的范畴内是指用于测定或者方法的标准或者参考，其它条件可以与其进行比较。

如本文所用的，术语“数据”或者“生物标记数据”通常是指反映生物标记产物的丰度或者水平的数据，所述产物包括由生物标记编码的RNA和蛋白质之一或者两种。

如本文所用的，术语“衍生物”在蛋白质性剂(例如，蛋白质、多肽、肽和抗体)的范畴内是指蛋白质性剂，其包括已通过引入一个或多个氨基酸残基取代、缺失和/或添加而被改变的氨基酸序列。本文所用的术语“衍生物”还指已被修饰的蛋白质性剂，即，将任何类型的分子共价连接于所述蛋白质性剂。例如，以非限制的方式，可以通过例如糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、通过已知保护/封闭基团衍生化、蛋白质水解切割、连接于细胞配体或者其它蛋白质等修饰抗体。可以通过应用本领域公知的技术，包括但不限于特异性化学切割、乙酰化、甲酰化、衣霉素代谢合成等进行化学修饰而产生蛋白质性剂的衍生物。此外，蛋白质性剂衍生物可以包含一种或多种非典型的氨基酸。蛋白质性剂衍生物拥有与从其衍生的蛋白质性剂相似或相同的功能。

如本文所用的，术语“衍生物”在非蛋白质衍生物的范畴内是指基于第一有机或无机分子结构而形成的第二有机或无机分子。有机分子衍生物包括但不限于通过，例如，添加或者去掉羟基、甲基、乙基、羧基或者氨基所修饰的分子。有机分子还可以被酯化、烷基化和/或磷酸化。

本文所用的“膀胱癌诊断”或者“诊断膀胱癌”、“筛选膀胱癌”、“筛选膀胱癌阶段”根据本发明的一个方面是指确定人具有膀胱癌和/或具有浅表性膀胱癌可能性的过程。所述术语是指诊断或者筛选膀胱癌或者膀胱癌阶段的常规医学诊断技术，以及如本发明所涵盖的诊断和/或筛选方法。诊断膀胱癌的常规医学诊断技术包括身体检查和病史、医学评估，包括尿检和适当的实验室检验，其可以包括用

检测尿中核基质蛋白质(被称作

)水平升高、静脉内pyloegram(IVP)成像、CT扫描、MRI扫描、骨扫描或者超声等。在一个具体实施实施方案中，“诊断***癌”是指在两个选项间进行确定：例如个体具有膀胱癌或特定阶段的膀胱癌或者个体没有膀胱癌或特定阶段的膀胱癌。在一个具体实施方案中，术语“诊断或者筛选膀胱癌”是指在两个选项间进行确定，例如对于“诊断膀胱癌”而言，确定个体具有膀胱癌或者个体没有膀胱癌的可能性。对于“诊断浅表性膀胱癌”而言，确定个体具有浅表性膀胱癌或者没有膀胱癌的可能性。在另一具体实施方案中，“诊断”是指在三个选项间的确定，其中一个选项是不能以足够的程度确定个体是具有膀胱癌还是没有膀胱癌(例如确定结果是不确定的)。在另一实施方案中，“诊断或筛选膀胱癌”可包括不能以足够的程度确定个体是可以表征为具有膀胱癌或特定阶段膀胱癌的还是没有膀胱癌或特定阶段膀胱癌的选项。本领域技术人员应当理解的是，在此范畴中“足够程度确定”取决于在医学上对诊断敏感性和特异性的要求。更具体地说，足够程度确定包括大于50％敏感性和/或特异性、大于60％敏感性和/或特异性、大于70％敏感性和/或特异性、大于80％敏感性和/或特异性、大于90％敏感性和/或特异性以及100％敏感性和/或特异性。

如本文所用的，通过RNA或蛋白质的量或水平而测量，术语“差异性表达”是指在本发明一种或多种生物标记的RNA和/或蛋白质产物表达水平上的差异。就RNA来说可以包括在一个样品中所述生物标记的mRNA和/或一种或多种所述mRNA剪接变体的表达水平与在第二样品中通过测量RNA的量或水平测定的相同的本发明之一种或多种生物标记的RNA(包括mRNA和/或所述mRNA的一种或多种剪接变体)表达水平对比的差异。“差异性表达的”或者“差异性表达”还可以包括测量一个样品或者样品群体中由本发明生物标记编码的蛋白质或者一种或多种蛋白质变体，并与蛋白质表达的量或者水平比较，所述蛋白质包括本发明生物标记的一种或多种蛋白质变体。可以根据本发明所述以及本领域技术人员所理解的来确定差异性表达。术语“差异性表达的”或者“表达水平变化”是指在一个样品中通过测量RNA量和蛋白质量所测定的生物标记特定产物的可测量表达水平与在第二样品中所述生物标记特定产物的可测量表达水平相比的增加或者降低。所述第一样品和第二样品不需要来自不同的患者，而可以是在不同的时间点上从同一患者采集的样品。术语“差异性表达的”或者“表达水平的变化”还可以指在一些样品群体中特定生物标记的可测量表达水平与在另一些样品群体中所述生物标记的可测量表达水平相比的增加或者降低。如本文所用的，“差异性表达”当表示单一样品时，可以应用在所述样品中特定生物标记的表达水平与对照群体特定生物标记的平均表达水平相比的比率来量度，其中所述比率不等于1.0。还可以应用差异性表达来包括将一些样品的第一群体与一些样品的第二群体或者将单一样品与样品群体进行比较，其中应用表达水平的比率或者应用p-值。当应用p-值时，对核酸转录物(包括hnRNA和mRNA)差异表达的统计学显著性的测量是鉴定第一和第二群体之间的差异性表达，当p-值小于0.3、0.2、0.1、小于0.05、小于0.01、小于0.005、小于0.001等时，认为具有统计学显著性。当基于基因产物表达水平的比率确定差异性表达时，如果与第二样品相比，在第一样品中其RNA或者蛋白质产物水平的比率大于或小于1.0的话，RNA或者蛋白质基因产物被差异性表达。例如，基因的RNA或者蛋白质产物的比率大于1，例如1.2、1.5、1.7、2、3、4、10、20或者比率小于1，例如0.8、0.6、0.4、0.2、0.1、0.05是差异性表达的指标。在本发明的另一实施方案中，如果在核酸群体中第一转录物的表达平均水平与在第二群体中其表达平均水平的比率大于或小于1.0，核酸转录物(包括hnRNA和mRNA)被差异性表达。例如，比率大于1，例如1.2、1.5、1.7、2、3、4、10、20或者比率小于1，例如0.8、0.6、0.4、0.2、0.1、0.05将是差异性表达的指标。在本发明的另一实施方案中，如果在第一样品中其表达水平与第二群体的平均值的比率大于或小于1.0并且包括例如，比率大于1，例如1.2、1.5、1.7、2、3、4、10、20或者比率小于1，例如0.8、0.6、0.4、0.2、0.1、0.05，核酸转录物(包括hnRNA和mRNA)被差异性表达。“差异性增加表达”是指相对标准(比如第二群体表达水平的平均值)的1.1倍、1.2倍、1.4倍、1.6倍、1.8倍或者更大。“差异性降低表达”是指相对标准(比如第二群体表达水平的平均值)小于1.0倍、0.8倍、0.6倍、0.4倍、0.2倍、0.1倍或更小。

如本文所用的，术语“药物功效”是指药物的有效性。通常通过对已接受或正接受药物治疗患者的临床反应的测定来测量“药物功效”。如果药物达到了预期的临床结果，例如，如本说明书中所述减轻了骨关节炎的症状或者防止了骨关节炎的发展，就认为药物具有高度的功效。药物的吸收量可以被用来预测患者的反应。一般规则是当药物剂量增加时，在患者中见到更大的效果，直至达到最大预期效果。如果在达到最大点之后施用更多的药物，副作用通常将增加。

如本文所用的，术语“有效量”是指足以减轻或缓解膀胱癌或其一种或多种症状的发展和/或严重性、防止膀胱癌或其一种或多种症状的发展、复发或发作、防止膀胱癌或其一种或多种症状恶化、或者增强或改善另一疗法的预防性或治疗性效果的化合物量。

如本文所用的，术语“片段”在蛋白质性剂的范畴内是指肽或者多肽，其包括多肽或者蛋白质的至少5个连续氨基酸残基、至少10个连续氨基酸残基、至少15个连续氨基酸残基、至少20个连续氨基酸残基、至少25个连续氨基酸残基、至少40个连续氨基酸残基、至少50个连续氨基酸残基、至少60个连续氨基酸残基、至少70个连续氨基酸残基、至少80个连续氨基酸残基、至少90个连续氨基酸残基、至少100个连续氨基酸残基、至少125个连续氨基酸残基、至少150个连续氨基酸残基、至少175个连续氨基酸残基、至少200个连续氨基酸残基或者至少250个连续氨基酸残基的氨基酸序列。在一个具体实施方案中，蛋白质或者多肽的片段保留所述蛋白质或者多肽的至少一种功能。在另一实施方案中，蛋白质或者多肽的片段保留所述蛋白质或者多肽的至少一种、两种、三种、四种或者五种功能。优选地，抗体的片段保留免疫特异性结合抗原的能力。

如本文所用的，术语“融合蛋白质”是指多肽，其包括第一蛋白质或者多肽或者其片段、或者其功能性片段、或者其类似物或衍生物的氨基酸序列，以及异源蛋白质、多肽或者肽(即，不同于所述第一蛋白质或者其片段、类似物或衍生物的第二蛋白质或者多肽或者其片段、类似物或衍生物)的氨基酸序列。在一个实施方案中，融合蛋白质包括与异源蛋白质、多肽或者肽融合的预防或者治疗剂。根据此实施方案，所述异源蛋白质、多肽或者肽可以是或者不是不同类型的预防或者治疗剂。

如本文所用的，术语“基因表达模式(pattern)”、“基因表达谱(profile)”可以交换使用并且包括本发明两种或多种生物标记的RNA或者蛋白质产物的表达模式。例如，关于RNA产物的基因表达模式或者样式还可以被称为“核酸阵列表达谱”并且构成多数靶核酸序列与杂交的多数核酸探针在阵列上的杂交，从而区分膀胱癌或者早期膀胱癌个体与非膀胱癌个体。“基因表达模式”、“基因表达谱”还可以指对应于本发明两种或多种生物标记的蛋白质丰度水平的模式，其是通过本领域公知的测量所述蛋白质水平的任何方法来确定的。例如，所述模式可以是所述模式的数学表达式，例如数学方程式、向量等。

如本文所述的，术语“杂交于”和“杂交”是指与互补核酸的序列特异性非共价结合反应，例如靶核酸序列和核酸成员之间在阵列上的反应。

如本文所用的，术语“免疫球蛋白”是指由一种或多种基本上由免疫球蛋白基因编码的多肽或者其抗原结合片段组成的蛋白质。已知的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α(IgA1和IgA2)、γ(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、δ、ε和μ恒定区基因，以及许多的免疫球蛋白可变区基因。由在NH2-末端的可变区基因(约110个氨基酸)和在COOH-末端的κ或者λ恒定区基因编码全长免疫球蛋白“轻链”(约25Kd或者214个氨基酸)。相似地由可变区基因(约116个氨基酸)和其它前述恒定区基因(例如，γ，编码约330个氨基酸)之一编码全长免疫球蛋白“重链”(约50Kd或者446个氨基酸)。

如本文所用的，关于治疗的术语“联合”是指应用超过一种治疗(例如，超过一种预防剂和/或治疗剂)。术语“联合”的应用不限制对对象施用治疗(例如，预防和/或治疗剂)的顺序。可以在向对象施用第二治疗(例如，第二预防剂或者治疗剂)之前(例如，5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或者12周之前)、同时或者随后(例如，5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或者12周之后)施用第一治疗(例如，第一预防或者治疗剂)。

如本文所用的，当相对于表达模式使用术语“疾病指标”或者“膀胱癌指标”时，是表示诊断膀胱癌和/或早期阶段膀胱癌的表达模式并且可以包括增加个体患有膀胱癌和/或早期阶段膀胱癌可能性的模式。

如本文所用的，术语基因的“内部编码区”是指位于本文所定义基因的5’区和3’区之间的多核苷酸(双链的或者单链的)。“内部编码区”不短于8个核苷酸长并且可以长达1000个核苷酸或者更长。所述“内部编码区”的其它可能长度包括但不限于10、20、25、50、100、200、400和500个核苷酸。5’、3’和内部区不是重叠的并且可以但不需要是连续的，并且可以但不需要合计达所述相应基因的全长。

如本文所用的，术语多肽的“内部多肽区”是指位于多肽的氨基末端区和羧基末端区之间的多肽序列，如本文定义的。多肽的“内部多肽区”不短于3个氨基酸长并且可以长达350个氨基酸或更长。多肽的“内部多肽区”的其它可能长度包括但不限于5、10、20、25、50、100和200个氨基酸。

多肽的氨基末端、羧基末端和内部多肽区是非重叠的并且可以但不需要是连续的，并且可以但不需要合计达所述相应多肽的全长。

如本文所用的，当“分离”或者“纯化”用于核酸时，表示天然序列已从其正常的细胞环境(例如，染色体)被移去或者在非天然环境(例如，人工合成的)中被合成。因此，“分离”或者“纯化”序列可以是在无细胞溶液中或者被置于不同的细胞环境中。术语“纯化”不意味所述序列只有核苷酸存在，而是基本上没有(约90-95％纯)天然的非核苷酸物质与其相连，并且由此与分离的染色体相区别。

如本文所用的，术语“分离”和“纯化”在蛋白质性剂(例如，肽、多肽、蛋白质或者抗体)的范畴内是指蛋白质性剂，其基本上没有细胞物质，并且在一些实施方案中，基本上没有源于其所来源细胞或者组织的异源蛋白质性剂(即，污染蛋白质)，或者当用化学合成时，其基本上没有化学前体或者其它的化学物。短语“基本无细胞物质”包括蛋白质性剂制备物，其中所述蛋白质性剂与细胞的细胞组分相分开，所述蛋白质性剂是从所述细胞分离的或者经重组产生的。因此，基本上没有细胞物质的蛋白质性剂包括蛋白质性剂制备物，其具有小于约30％、20％、10％或者5％(干重)的异源蛋白质性剂(例如，蛋白质、多肽、肽或者抗体；还被称为“污染蛋白质”)。当所述蛋白质性剂是经重组产生时，还优选基本不含所述蛋白质性剂的培养基，即，培养基代表少于约20％、10％或者5％体积的蛋白质制备物。当通过化学合成产生所述蛋白质性剂时，优选基本上没有化学前体或者其它化学物，即，将涉及所述蛋白质性剂合成的化学前体或者其它化学物分开。因此，这样的蛋白质性剂制备物具有少于约30％、20％、10％、5％(干重)的不同于所述感兴趣蛋白质性剂的化学前体或者化合物。优选地，本文公开的蛋白质性剂是分离出的。

如本文所用的，术语“表达水平”是指用本领域技术人员公知的确定方法确定对应于基因的特定核酸或者蛋白质的量。对于对应于本发明生物标记的RNA、hnRNA、mRNA或者mRNA剪接变体，可以通过杂交以及其它测量法比如实时定量RT PCR来确定表达水平，所述测量法包括应用

green、

和分子信标(Molecular Beacons)技术。应注意，本文所用的确定差异性表达水平可以包括目视检查指定核酸或者蛋白质的量之间的差异，例如通过分析Northern印迹或者Western印迹。

如本文所用的，“配体”是分子，其特异性结合由本发明生物标记的基因所编码的多肽。配体可以是核酸(RNA或者DNA)、多肽、肽或者化合物。本发明的配体可以是肽配体，例如，支架肽、线性肽或者环状肽。在一个优选实施方案中，所述多肽配体是抗体。该抗体可以是人抗体、嵌合抗体、重组抗体、人源化抗体、单克隆抗体或者其抗原结合片段、或者多克隆抗体。所述抗体可以是完整的免疫球蛋白，例如，IgA、IgG、IgE、IgD、IgM或者其亚型。所述抗体可以偶联功能性部分(例如，具有生物或者化学功能的化合物)，其可以是第二种不同多肽(a second differentpolypeptide)、治疗药物、细胞毒性剂、可检测部分或者固相载体(solidsupport)。本发明的多肽配体例如抗体与多肽相互作用，所述多肽由生物标记的基因之一所编码，所述相互作用具有高亲和性和特异性。例如，所述多肽配体结合多肽，所述多肽由生物标记的基因之一所编码，其中亲和常数为至少10⁷M^-1，优选至少10⁸M^-1、10⁹M^-1或者10¹⁰M^-1。

如本文所用的，术语“大多数”是指表示超过组合物总量50％(例如，51％、60％、或者70％、或者80％、或者90％、或者最高为100％)的量。术语“大多数”当用于阵列时，它表示超过总核酸成员的50％(例如，51％、60％、或者70％、或者80％、或者90％、或者最高为100％)，所述核酸成员与阵列的固相衬底稳定结合。

如本文所用的，术语“控制”是指对象获得的源于治疗(例如，预防或者治疗剂)的有益效果，该治疗不导致骨关节炎治愈。在某些实施方案中，向对象施用一种或多种治疗以“控制”骨关节炎，从而防止骨关节炎的发展或者恶化。

如本文所用的，“mRNA完整性”是指来自组织样品或者血样品的mRNA提取物的质量。在一个实施方案中，通过用本领域众所周知的方法(例如，通过RNA琼脂糖凝胶电泳(例如，Ausubel et al.，John Weley &Sons，Inc.，1997，Current Protocols in Molecular Biology))检测RNA是否被降解来确定mRNA的完整性。优选地，mRNA样品具有良好完整性(例如，mRNA的降解少于10％，优选少于5％并且更优选少于1％)以真实地代表从中提取mRNA的软骨或者血样品的基因表达水平。

如本文所用的，术语“无反应的(non-responsive)”和“顽固性的”描述用目前可用疗法治疗的患者，其膀胱癌的一种或多种症状在临床上没有被充分地治疗和/或缓解。

如本文所用的，术语“正常的”是指没有显示任何膀胱癌征兆或者其症状(包括血尿)的、并且没有被诊断为患有膀胱癌或者患有膀胱癌可能性的个体或者个体群体。优选地，所述“正常的”是指患膀胱癌风险没有增加的个体或者个体群体。此外，优选所述正常的个体没有接受影响膀胱癌的药物治疗并且没有被诊断患有任何其它的疾病。更优选地，正常的个体与所检验的样本相比具有相似的性别、年龄。根据本发明“正常的”还表示从正常个体分离的样品并且包括从正常个体分离的总RNA或者mRNA。采自正常个体的样品可以包括从组织样品分离的RNA。

如本文所用的，“核酸”与术语“多聚核苷酸”可互换使用并且它通常表示任何的多聚核糖核苷酸或者多聚脱氧核糖核苷酸，其可以是未经修饰的RNA或者DNA或者经修饰的RNA或者DNA或者其任何组合。“核酸”包括但不限于单-和双-链核酸。如本文所用的，术语“核酸”还包括如上所述的DNA或者RNA，其包含一个或多个修饰的碱基。因此，为了稳定性或者其它原因而对其骨架进行了修饰的DNA或者RNA是“核酸”。本文所用的术语“核酸”包含经化学、酶促或者代谢修饰的核酸形式，以及病毒和细胞(包括例如，简单的和复杂的细胞)的特征DNA和RNA的化学形式。“核酸”或者“核酸序列”还可以包括单链或双链RNA或DNA的区域或者其任何组合并且根据本发明的一些实施方案可以包括表达序列标签记(EST)。EST是基因经表达的序列的一部分(即，序列的“标签”)，其通过mRNA区域的逆转录而来从而形成cDNA。

如本文所定义的，“核酸阵列”是指众多的独特核酸(或者“核酸成员”)，其附着于支持物，其中各个核酸成员附着于支持物的特定预选区域中。在一个实施方案中，附着于支持物表面的核酸成员是DNA。在一个优选实施方案中，附着于支持物表面的核酸成员是cDNA或者寡核苷酸。在另一优选实施方案中，附着于支持物表面的核酸成员是通过聚合酶链式反应(PCR)合成的cDNA。本文所用的术语“核酸”可以与术语“多核苷酸”互换使用。在另一优选实施方案中，“核酸阵列”是指附着于Southern和/或Northern印迹技术使用的硝酸纤维素膜或者其它膜的众多独特核酸。

如本文所用的，“核酸探针”包括能够在阵列上通过几种非共价键结合相互作用(包括互补碱基配对相互作用)结合核酸成员之互补序列的核酸。如本文所用的，核酸探针可用包括天然的(即，A、G、C或者T)或者修饰的碱基(7-脱氮鸟嘌呤核苷、次黄嘌呤核苷等)。此外，可以通过不同于磷酸二酯键的连接方式来连接核酸探针中的碱基，只要它不干扰杂交即可(即，核酸探针在标准的严谨条件或者选择性杂交条件下仍特异性结合其互补序列)。因此，核酸探针可以是肽核酸，其中组成的碱基是通过肽键而不是磷酸二酯键来连接的。

如本文所用的，“核酸靶标”或者“核酸成员”被定义为能够结合阵列的核酸。所述核酸靶标可以是对应于基因或者其部分的分离的核酸序列，或者所述核酸靶标可以是从样品分离的总RNA或者mRNA。优选地，所述核酸靶标或者核酸标记是源于人的软骨、血或者滑液提取物。更优选地，所述核酸靶标是单链或者双链DNA、RNA或者DNA-RNA杂交体，它们来自于人的软骨、血或者滑液的总RNA提取物，并且优选来自mRNA提取物。

在一个实施方案中，结合于阵列的‘靶标’序列的常规核酸阵列可以是人全基因组的代表，例如Affymetrix芯片，并且将包括两种或多种表1所述基因或者基因探针的或者由它们组成的分离生物标记应用于常规阵列。

在另一实施方案中，结合于阵列的序列可以是分离的寡核苷酸、cDNA、EST或者PCR产物，它们对应于被应用于阵列的本发明总细胞RNA的生物标记。

如本文所用的，术语“寡核苷酸”被定义为包含两个或多个并且优选超过三个脱氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸的分子。它的准确大小将取决于许多因素，而这些因素又依赖于寡核苷酸的最终功能以及用途。所述寡核苷酸可以是约8至约1000个核苷酸长。尽管在本发明中可应用8-100个核苷酸的寡核苷酸，优选的寡核苷酸范围约8至约15个碱基长、约8至约20个碱基长、约8至约25个碱基长、约8至约30个碱基长、约8至约40个碱基长或者约8至约50个碱基长。

如本文所用的，短语“药用可接受盐”包括但不限于酸性或者碱性基团的盐，其可存在于应用本发明方法所鉴定的化合物中。碱性化合物能够与各种无机和有机酸形成许多种盐。可用来制备该碱性化合物的药用可接受酸加成盐的酸是那些形成非毒性酸加成盐的酸，即所述盐包含药用可接受阴离子，包括但不限于硫酸、柠檬酸、马来酸、乙酸、草酸、盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硝酸、硫酸、酸式硫酸(bisulfate)、磷酸、酸式磷酸、异烟酸盐(isonicotinate)、乙酸盐、乳酸盐、水杨酸盐、柠檬酸盐、酸式柠檬酸盐、酒石酸盐、油酸盐、鞣酸盐、泛酸盐、酒石酸氢盐、抗坏血酸盐、琥珀酸盐、马来酸盐、龙胆酸盐(gentisinate)、延胡索酸盐、葡糖酸盐、葡糖二酸盐(glucaronate)、蔗糖酸盐(saccharate)、甲酸盐、苯甲酸盐、谷氨酸盐、甲磺酸盐(methanesulfonate)、乙磺酸盐(ethanesulfonate)、苯磺酸盐(benzenesulfonate)、对甲苯磺酸盐和双羟萘酸盐(即，1，1’-亚甲基-双-(2-羟基-3-萘甲酸盐))。包含氨基部分的化合物可以与各种氨基酸(除上述各种酸之外)形成药用可接受盐。酸性化合物能够与各种药用可接受阳离子形成碱盐(base salts)。所述盐的实例包括碱金属或者碱土金属盐，并且尤其是钙、镁、钠、锂、锌、钾和铁盐。

如本文所用的，“多核苷酸”涵盖超过8个核苷酸长的双链DNA、单链DNA和双链或单链RNA。

如本文所用的，“由...编码的多肽序列”是指基因的蛋白质编码区翻译后获得的氨基酸序列，如本文所定义的。通过Genbank登记号(见表3和/或表6和/或表12)识别关于本发明各个生物标记的mRNA核苷酸序列并且通过蛋白质登记号(见表3和/或表6和/或表12)识别相应的多肽序列。

当用蛋白质或者蛋白质片段免疫宿主动物时，蛋白质的许多区域可以诱导产生特异性结合所述蛋白质指定区域或者三维结构的抗体；这些区域或者结构被称为表位或者抗原决定簇。如本文所用的，“抗原性片段”是指多肽的一些部分，其含有一个或多个表位。表位可以是线性的，主要包括来自所述抗原的线性序列，或者是构象的，包括由其它序列以遗传方式分开的但是在针对多肽配体的结合位置在结构上聚在一起的序列。“抗原性片段”最多可以为5000、1000、500、400、300、200、100、50或者25或者20或者10或者5个氨基酸长的任意长度。

如本文所用的，“预选区域(pre-selected region)”、“预定区域(predefined region)”或者“独特位置”是指基质上的局部区域，用其意在沉积核酸，并且在本文的其它方面替代性地表示为“所选区域”或者仅仅是“区域”。预选区域可以具有任意的适宜形状，例如，圆形、矩形、椭圆形、楔形等。在一些实施方案中，预选区域小于约1cm²，更优选小于1mm²、仍更优选小于0.5mm²，并且在一些实施方案中小于0.1mm²。在“预选区域”、“预定区域”或者“独特位置”的核酸成员是可以根据它在所述区域或者独特位置上的位置确定其身份(例如，序列)的一个核酸成员。

如本文所用的，术语“预防”、“防止”是指由于施用根据本发明方法鉴定的一种或多种化合物或者施用如此的化合物与另一治疗的组合而导致防止轻度骨关节炎或者其一种或多种症状的发展、复发或者发作。

本文所用的术语“引物”是指寡核苷酸，无论其是以纯化的限制酶切消化产生的天然形式还是由合成产生的，当其置于合适的条件下时能够作为合成的起始位点，在所述条件下引物延伸产物(其互补于核酸链)的合成被诱发，即，在存在核苷酸和诱导剂比如DNA聚合酶以及合适的温度和pH条件下。所述引物可以是单链的或者双链的并且必须足够长，从而在存在所述诱导剂的条件下启动预期延伸产物的合成。所述引物的准确长度将取决于许多因素，包括温度、引物来源和所用方法。例如，对于诊断应用，根据靶序列的复杂性，寡核苷酸引物通常包含15-25个或更多的核苷酸，尽管它可以包含更少的核苷酸。涉及确定引物适宜长度的因素对于本领域的技术人员是易于知道的。通常，本发明具体描述的设计和选择引物的方法是根据标准的并且本领域众所周知的方法，见Dieffenbach，C.W.，Lowe，T.M.J.，Dveksler，G.S.(1995)General Concepts for PCR PrimerDesign.In：PCR Primer，A Laboratory Manual(Eds.Dieffenbach，C.W，and Dveksler，G.S.)Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York，133-155；Innis，M.A.，and Gelfand，D.H.(1990)Optimization of PCRs.In：PCR protocols，A Guide to Methods and Applications(Eds.Innis，M.A.，Gelfand，D.H.，Sninsky，JJ.，and White，T.J.)Academic Press，San Diego，3-12；Sharrocks，A.D.(1994)The design of primers for PCR.In：PCRTechnology，Current Innovations(Eds.Griffin，H.G.，and Griffin，A.M，Ed.)CRC Press，London，5-11.

如本文所用的，术语“探针”表示寡核苷酸和其类似物并且是指一定范围的化学物种，其通过与靶序列的核苷酸碱基的氢键结合相互作用识别所述多核苷酸靶序列。所述探针或者靶序列可以是单链或双链的RNA或者单链或双链的DNA或者DNA和RNA碱基的组合。探针至少8个核苷酸长并且小于整个基因的全长。探针可以是10、20、30、50、75、100、150、200、250、400、500和最多为2000个核苷酸长。探针可以包括经修饰的寡核苷酸，从而具有可通过荧光、化学发光等检测的标签。还可以修饰所述探针从而使其既具有可检测的标签又具有淬灭分子，例如

和Molecular

探针。

寡核苷酸和其类似物可以是RNA或者DNA，或者RNA或DNA的类似物，通常被称为反义寡聚体或者反义寡核苷酸。这样的RNA或者DNA类似物包括但不限于2-′O-烷基糖修饰物、甲基膦酸酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、formacetal、3’-thioformacetal、砜、氨基磺酸酯和硝基氧骨架修饰物和碱基部分已被修饰的类似物。此外，寡聚体类似物可以是多聚体，其中糖部分已被修饰或者已由另一适合部分所取代，由此而得的多聚体包括但不限于吗啉代类似物和肽核酸(PNA)类似物(Egholm，et al.Peptide Nucleic Acids(PNA)-Oligonucleotide Analogues with an AchiralPeptide Backbone，(1992))。

探针还可以是任何寡核苷酸类似物类型在一起的混合物或者与天然DNA或RNA组合的混合物。同时，所述寡核苷酸和其类似物可以单独使用或者与一种或多种另外的寡核苷酸或者其类似物组合使用。

如本文所用的，术语“生物标记的产物”或者“生物标记产物”是指RNA或者蛋白质，其对应于所述生物标记或者由其编码(即，从基因或者遗传元件转录而来或者从RNA翻译而来，所述RNA是从所述基因或者遗传元件转录而来)。例如，在一些实施方案中，从所述生物标记产生的RNA可以包括一种或多种以下物种：hnRNA、mRNA和/或一种或多种mRNA剪接变体。在一些实施方案中，从分子标记产生的蛋白质可以包括在血中发现的任何蛋白质，所述蛋白质对应于从所述生物标记产生的RNA。

如本文所用的，术语“预防剂”是指可用于预防骨关节炎的任何化合物。在某些实施方案中，术语“预防剂”是指在本文描述的筛选测定方法中鉴定的化合物。在某些实施方案中，术语“预防剂”是指在本文所述筛选测定方法中所鉴定化合物之外的试剂，已知所述试剂可用于、或者已经或者目前正用于预防或者阻止骨关节炎或者其一种或多种症状的发作、发生和/或发展。

如本文所用的，短语“预防有效量”是指治疗(例如，预防剂)的量，其足以导致预防骨关节炎或者其一种或多种症状的发生、复发或者发作。

如本文所用的，术语“蛋白质”和“多肽”和“蛋白质性剂”可以互换使用，其是指由肽键连在一起的氨基酸链，其可任选地包括天然的或者非天然的氨基酸。任选地，所述蛋白质或者肽可以包括除氨基酸以外的其它分子。所述链可以是任意长度。在一个具体实施方案中，蛋白质由少于200个、少于175个、少于150个、少于125个、少于100个、少于50个、少于45个、少于40个、少于35个、少于30个、少于25个、少于20个、少于15个、少于10个或者少于5个氨基酸通过肽键连接而组成。在另一实施方案中，蛋白质由至少200个、至少250个、至少300个、至少350个、至少400个、至少450个、至少500个或者更多的氨基酸通过肽键连接而组成。

如本文所用的，“多数”或者“一组”是指超过2，例如3或更多、10或更多、100或更多、或者1000或更多、或者10000或更多。

如本文所用的，术语“RNA部分”和“其部分”在本发明生物标记的RNA产物的范畴内是指RNA转录物，其包含本发明生物标记的RNA产物的至少6个、至少9个、至少15个、至少18个、至少21个、至少24个、至少30个、至少60个、至少90个、至少99个、至少108个、或者更多核苷酸的核酸序列。

本文所用的术语“本发明生物标记的产物”是指由对应于本发明生物标记的基因表达的RNA和/或蛋白质。“本发明生物标记的RNA产物”包括一种或多种产物，其可以包括核内不均一RNA(“hnRNA”)、mRNA和mRNA的所有或一些剪接变体，根据本文公开的教导其表达量度可以被用作生物标记。“本发明生物标记的蛋白质产物”包括一种或多种所述生物标记的产物，其可以包括蛋白质、蛋白质变体和任何翻译后的修饰蛋白质。

如本文所用的，术语“选择性扩增的”或者“选择性扩增”是指一种过程，由此从模板核酸选择性产生一或多拷贝的特定靶核酸序列。选择性扩增或者选择性扩增的与通常的扩增相比，其可被用作与例如随机引物和寡聚dT引物相组合来扩增核酸序列(例如，mRNA)群体的方法。优选通过聚合酶链式反应(Mullis and Faloona，1987，Methods Enzymol.155：335)实施选择性扩增。

如本文所用的，术语“选择性结合”在本发明所涵盖的蛋白质范畴内是指任何两个肽、蛋白质、多肽和抗体的特异性相互作用，其中与任何另外的肽、蛋白质、多肽和抗体相比，所述相互作用优选在任何两个肽、蛋白质、多肽和抗体之间发生。例如，当两个分子是蛋白质分子时，所述第一分子上的结构识别并结合所述第二分子上的结构，而不是其它的蛋白质。本文使用的术语“选择性结合”表示分子结合它的特异性结合伙伴，其中所述分子是以超过它结合非特异性分子时的至少2倍亲和性和优选至少10倍、20倍、50倍、100倍或更高的亲和性与其特异性结合伙伴结合。

本文使用的“选择性杂交”在本发明的范畴内是指发生在本发明包含的多核苷酸和本发明生物标记的RNA、或其互补物、或蛋白质产物之间的杂交，其中与所述基因组中其它基因的RNA产物相比，所述杂交使得所述核苷酸优先结合本发明生物标记的RNA产物。在一个优选实施方案中，“选择性杂交”的多核苷酸是以大于70％、大于80％、大于90％和最优选100％(即与另外RNA物质发生交叉杂交优选小于30％、小于20％、小于10％)的选择性进行杂交的多核苷酸。本领域技术人员应理解的是，“选择性杂交”本发明生物标记的RNA产物的多核苷酸可以通过考虑长度和组成来确定。

如本文所用的，“特异性杂交”、“特异性的杂交”是指当两个核酸序列基本互补(对于至少14-25个核苷酸片段而言，至少约65％互补、优选至少约75％互补、更优选至少约90％互补)时发生的杂交。见Kanehisa，M.，1984，Nucleic acids Res.，12：203，其通过参考并入本文。因此，预期一定程度的错配是被容许的。这样的错配可以是小的，比如单-、双-或者三-个核苷酸。作为替代，错配区域可以包含环(loop)，其被规定为在连续系列的4个或多个核苷酸中存有错配的区域。许多因素影响两个核酸杂交的效率和选择性，例如，在阵列上核酸成员与靶核酸序列的杂交。这些因素包括核酸成员的长度、核苷酸序列和/或组成、杂交温度、缓冲液组成和在核酸成员需要杂交的区域中潜在的位阻。在核酸长度与核酸和靶序列的退火效率和精确性之间存在正相关。具体地说，较长序列比较短序列具有较高的解链温度(T_M)，并且在指定的靶序列内很少可能被重复，由此使非特异性杂交最小化。杂交温度与核酸成员退火效率反向变化。相似地，在杂交混合物中有机溶剂(例如甲酰胺)的浓度与退火效率反向变化，而在杂交混合物中增加盐浓度有利于退火。在严谨退火条件下，较长的核酸比较短的核酸杂交效率更高，其在更加放宽的条件下也是充分的。

如本文所用的，术语“特异性结合”是指两个分子的相互作用，例如配体和蛋白质或者肽、或者抗体和蛋白质或者肽，其中所述相互作用取决于各个分子上特定结构的存在。例如，当所述两个分子是蛋白质分子时，在第一分子上的结构识别并结合第二分子上的结构，而不是一般的蛋白质。本文使用的“特异性结合”表示分子结合其特异性结合伙伴，其是以超过它结合非特异性分子时至少2倍的亲和性，和优选至少10倍、20倍、50倍、100倍或者更高的亲和性与其特异性结合伙伴结合。

如本文所用的，术语“标准严谨条件”和“严谨条件”表示只有当序列之间有至少95％和优选至少97％一致性时才发生杂交，其中所述一致性区域包含至少10个核苷酸。在一个实施方案中，在将序列在42℃孵育过夜后，所述序列在严谨条件下杂交，之后施用严谨洗剂(0.2×SSC，65℃)。清洗的严谨程度可以依清洗的温度、pH、离子强度、二价阳离子浓度、体积和持续时间而变化。例如，可以通过在探针解链温度之下的温度实施杂交来改变杂交的严谨性。探针的解链温度可以应用以下公式来计算：

对介于14-70个核苷酸长的寡核苷酸探针，解链温度(Tm)的摄氏温度可以应用下面的公式计算：Tm＝81.5+16.6(log[Na+])+0.41(G+C分数)-(600/N)，其中N是寡核苷酸的长度。

例如，在具有约1M浓度Na+的杂交缓冲液中，杂交温度可以以5℃的增量从68℃降到42℃。杂交之后，可以在杂交温度下用2×SSC，0.5％SDS清洗滤膜。这些条件在50℃以上的被认为是“中度严谨性”条件，在50℃以下的被认为是“低严谨性条件”。一个具体实施例的“中度严谨性”杂交条件是在55℃实施上述杂交的条件。一个具体实施例的“低严谨性”杂交条件是在45℃实施上述杂交的条件。

如果在含有甲酰胺的溶液中实施杂交，退火核酸链的解链温度可以应用以下方程计算：Tm＝81.5+16.6(log[Na⁺])+0.41(G+C分数)-(0.63％甲酰胺)-(600/N)，其中N是探针的长度。

例如，可以在含有甲酰胺的缓冲液(比如6×SSC)中，在42℃条件下实施杂交。在此情形中，在杂交缓冲液中甲酰胺的浓度可以以5％的增量从50％降到0％以鉴定探针同源性水平降低的克隆。杂交之后，可以用6×SSC，0.5％SDS，在50℃清洗滤膜。当杂交液包含25％以上的甲酰胺时，认为杂交条件为“中度严谨性”条件，当杂交液包含25％以下的甲酰胺时，认为是“低严谨性”条件。一个具体实施例的“中度严谨性”杂交条件是在30％甲酰胺实施上述杂交的条件。一个具体实施例的“低严谨性”杂交条件是在10％甲酰胺实施上述杂交的条件。

如本文所用的，术语“对象”和“患者”和“个体”可以互换使用，它们是指动物(例如，哺乳动物、鱼、两栖动物、爬行动物、鸟和昆虫)。在一个具体实施方案中，对象是哺乳动物(例如，非人的哺乳动物和人)。在另一个实施方案中，对象是宠物(例如，狗、猫、豚鼠、猴和鸟)、家畜(例如，马、牛、猪、山羊和鸡)或者实验室动物(例如，小鼠和大鼠)。在另一实施方案中，对象是灵长类动物(例如，黑猩猩和人)。在另一实施方案中，对象是人。

如本文所用的，术语“协同的”是指应用本文描述的方法之一鉴定的化合物和另一治疗(例如，试剂)的组合，其比不同治疗的加和效应更加有效。优选地，所述另外的治疗已经或者目前用来预防、治疗、控制或者改善膀胱癌或者其症状。各个治疗(例如，预防剂或者治疗剂)组合的协同效应允许向膀胱癌对象应用一种或多种治疗的较低剂量和/或以较低频率施用所述治疗。利用较低剂量的治疗(例如，预防剂或者治疗剂)和/或以较低频率施用所述治疗的能力降低了与向对象施用所述试剂有关的毒性，并且没有降低所述治疗在预防、治疗、控制或者改善膀胱癌中的功效。此外，协同效应可以导致各种治疗(例如，各种试剂)在预防、治疗、控制或者改善膀胱癌中的功效提高。最后，各种治疗(例如，预防剂或者治疗剂)组合的协同效应可以避免或者降低与单独施用任一治疗有关的有害的或者不希望的副作用。

如本文所用的，术语“治疗剂”是指任意化合物，其可被用来治疗、控制或者改善膀胱癌或者其一种或多种症状。

如本文所用的，术语“治疗有效量”是指足以导致膀胱癌或其一种或多种症状改善、防止膀胱癌发展、引起膀胱癌退化或者增强或改善另一治疗(例如，治疗剂)的治疗效果的治疗(例如，治疗剂)量。

如本文所用的，术语“治疗”和“处理”(treat)是指降低或者改善膀胱癌或其一种或多种症状的进展、严重性和/或复发，这是由施用根据本发明方法鉴定的一种或多种化合物、或者施用根据本发明鉴定的一种或多种化合物与另一治疗的组合而产生的。

如本文所用的，术语“上调的”或者“表达水平增加”在本发明的范畴内涉及基因表达的产物，其中能够根据应用测定分析或者其它类似分析确定的所述产物的量度表明，与在从正常个体或者来自具有不同鉴定疾病状态或者阶段的个体分离的组织和血中的相同基因相比，在从膀胱癌个体或者根据AJCC分阶指南(AJCC staging guidelines)确定的膀胱癌的鉴定疾病状态或者阶段的个体分离的组织和血中，所述基因表达水平增加。根据本发明，“表达水平增加”是指表达增加至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％或者更多，例如20％、30％、40％、或者50％、60％、70％、80％、90％或者更多、或者大于1倍，最高为2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、50倍、100倍或者更多，所述表达是通过，例如，根据本发明方法的杂交强度来测量的。例如，上调的序列包括，与从正常个体分离的组织相比，在从具有膀胱癌的个体分离的组织或者血中表达水平增加的序列。上调的序列还可以包括，与另一阶段的膀胱癌相比，在从具有某一阶段膀胱癌的个体分离的组织或者血中表达水平增加的序列。

附图说明

在此将结合以下附图来描述本发明：

图1是本发明一个实施方案的示意图，其显示实施例9中7种生物标记对比的所有21种可能组合。对于由生物标记的各种可能组合产生的每种分类器的逻辑斯蒂回归(logistic regression)的ROC以蓝色标示。对于每种所得到的分类器，以红色标示敏感性，其中特异性被设定为90％。关于每种分类器的特异性以绿色标示，其中敏感性被设定为90％。

图2是本发明一个实施方案的示意图，其显示实施例9中指出的7种生物标记中2种生物标记对比的所有210种可能。对于由生物标记的各种可能组合产生的每种分类器的对数回归的ROC以蓝色标示。对于每种所得到的分类器，以红色标示敏感性，其中特异性被设定为90％。关于每种分类器的特异性以绿色标示，其中敏感性被设定为90％。

图3是本发明一个实施方案的示意图，其显示实施例9中指出的7种生物标记中3种生物标记对比的1330种可能的1295种(请注意，可以实施穷尽性搜索，但在该情形中没有完成)。对于由生物标记的各种可能组合产生的每种分类器的对数回归的ROC以蓝色标示。对于每种所得到的分类器，以红色标示敏感性，其中特异性被设定为90％。关于每种分类器的特异性以绿色标示，其中敏感性被设定为90％。

图4是本发明一个实施方案的示意图，其显示实施例9中指出的7种生物标记中4种生物标记对比的5985种可能的5250种(请注意，可以通过仅增加计算机的分析时间来实施穷尽性搜索)。对于由生物标记的各种可能组合产生的每种分类器的对数回归的ROC以蓝色标示。对于每种所得到的分类器，以红色标示敏感性，其中特异性被设定为90％。关于每种分类器的特异性以绿色标示，其中敏感性被设定为90％。

3.2实施方案

本文描述了一种组合物，其包含两种或者多种分离多核苷酸的集合，每一种所述多核苷酸与生物标记选择性杂交。这些生物标记是在表1中鉴定的基因。在一个实施方案中，可以应用所述组合物测量列于表1的这些生物标记的任意至少两种之每一种的表达水平。在一个实施方案中，所述多核苷酸组合物可用于定量RT-PCR(QRT-PCR)。

本文描述了一种组合物，其包含两种或者多种分离多核苷酸的集合，每一种所述多核苷酸与生物标记选择性杂交。这些生物标记是在表1和/或表2中鉴定的基因。在一个实施方案中，可以应用所述组合物测量列于表1和/或表2的这些生物标记的任意至少两种之每一种的表达水平。在一个实施方案中，所述多核苷酸组合物可用于定量RT-PCR(QRT-PCR)。

本文描述了一种组合物，其包含两种或者多种分离多核苷酸的集合，每一种所述多核苷酸与生物标记选择性杂交。这些生物标记是在表11中鉴定的基因。在一个实施方案中，可以应用所述组合物测量列于表11的这些生物标记的任意至少两种之每一种的表达水平。在一个实施方案中，所述多核苷酸组合物可用于定量RT-PCR(QRT-PCR)。

本文描述了一种组合物，其包含两种或者多种分离多核苷酸的集合，每一种所述多核苷酸选择性杂交至生物标记的RNA产物。在表3中鉴定了所述生物标记的RNA产物。在一个实施方案中，可以应用所述组合物测量这些RNA产物的至少两种的表达水平。在一个实施方案中，所述多核苷酸组合物可用于定量RT-PCR(QRT-PCR)。

本文描述了一种组合物，其包含两种或者多种分离多核苷酸的集合，每一种所述多核苷酸与生物标记选择性杂交。这些生物标记是在表4中鉴定的基因。在一个实施方案中，可以应用所述组合物测量这些生物标记的至少两种的表达水平。在一个实施方案中，所述多核苷酸组合物可用于定量RT-PCR(QRT-PCR)。

本文描述了一种组合物，其包含两种或者多种分离多核苷酸的集合，每一种所述多核苷酸与生物标记选择性杂交。所述生物标记是在表4和表5中鉴定的基因，并且这些生物标记的至少一种选自表4。在一个实施方案中，可以应用所述组合物测量所述生物标记的至少两种的表达水平。在一个实施方案中，所述多核苷酸组合物可用于定量RT-PCR(QRT-PCR)。

本文描述了两种或者多种分离多核苷酸的集合，每一种所述多核苷酸选择性杂交至生物标记的RNA产物，其中在表6中鉴定了所述生物标记的RNA产物。在一个实施方案中，可以应用所述组合物测量所述RNA产物的至少两种的表达水平。在一个实施方案中，所述多核苷酸组合物可用于定量RT-PCR(QRT-PCR)。

本文描述了一种组合物，其包含两种或者多种分离多核苷酸的集合，每一种所述多核苷酸选择性杂交至生物标记。所述生物标记是在表7中鉴定的基因。在一个实施方案中，可以应用所述组合物测量所述生物标记的至少两种的表达水平。在一个实施方案中，所述多核苷酸组合物可用于定量RT-PCR(QRT-PCR)。

本文描述了一种组合物，其包含两种或者多种分离多核苷酸的集合，每一种所述多核苷酸选择性杂交至生物标记。所述生物标记是在表10中鉴定的基因。在一个实施方案中，可以应用所述组合物测量所述生物标记的至少两种的表达水平。在一个实施方案中，所述多核苷酸组合物可用于定量RT-PCR(QRT-PCR)。

本文描述了一种组合物，其包含两种或者多种分离蛋白质的集合，每种分离蛋白质选择性结合生物标记的蛋白质产物，其中所述生物标记选自表1所列的基因。在一个实施方案中，用所述组合物测量所述生物标记的至少两种的表达水平。

本文描述了一种组合物，其包含两种或者多种分离蛋白质的集合，每种分离蛋白质选择性结合生物标记的蛋白质产物，其中所述生物标记是列于表1和表2的基因，至少一种生物标记选自表1。在一个实施方案中，用所述组合物测量所述生物标记的至少两种的表达水平。

本文描述了一种组合物，其包含两种或者多种分离蛋白质的集合，每种分离蛋白质选择性结合生物标记的蛋白质产物，其中所述生物标记的蛋白质产物是列于表3的蛋白质。在一个实施方案中，用所述组合物测量所述蛋白质产物的至少两种的表达水平。

本文描述了一种组合物，其包含两种或者多种分离蛋白质的集合，每种分离蛋白质选择性结合生物标记的蛋白质产物，其中所述生物标记是列于表4的基因。在一个实施方案中，用所述组合物测量所述生物标记的至少两种的表达水平。

本文描述了一种组合物，其包含两种或者多种分离蛋白质的集合，每种分离蛋白质选择性结合生物标记的蛋白质产物，其中所述生物标记选自列于表4和表5的基因，至少一种所述生物标记选自表4。在一个实施方案中，用所述组合物测量所述生物标记的至少两种的表达水平。

本文描述了一种组合物，其包含两种或者多种分离蛋白质的集合，每种分离蛋白质选择性结合生物标记的蛋白质产物，其中所述生物标记的蛋白质产物选自列于表6的蛋白质。在一个实施方案中，用所述组合物测量所述蛋白质产物的至少两种的表达水平。

本文描述了一种组合物，其包含两种或者多种分离蛋白质的集合，每种分离蛋白质选择性结合生物标记的蛋白质产物，其中所述生物标记选自列于表7的基因。在一个实施方案中，用所述组合物测量这些生物标记的至少两种的表达水平。

本文描述了一种组合物，其包含两种或者多种分离蛋白质的集合，每种分离蛋白质选择性结合生物标记的蛋白质产物，其中所述生物标记包括列于表10的基因。在一个实施方案中，用所述组合物测量所述生物标记的至少两种的表达水平。

在本文上面段落中描述的组合物中，所述分离蛋白质是生物标记之蛋白质产物的配体，并且这些配体可以是抗体，包括单克隆抗体。

在本文上面段落中描述的组合物中，所述分离的多核苷酸可以是单链或双链RNA、或者单链或双链DNA。

本文描述了一种诊断或者预测个体膀胱癌的方法，其包括以下步骤：

a)确定在从个体获得的血中表达的一种或多种RNA转录物的水平，其中所述的一种或多种RNA转录物对应于表1的一种或多种生物标记，和

b)将步骤a)的血中所述一种或多种RNA转录物之每一种的水平与在来自一个或多个没有膀胱癌个体的血中的所述一种或多种RNA转录物之每一种的水平进行比较，

其中检测在步骤b)的比较中所述一种或多种RNA转录物之每一种的差异性表达是步骤a)个体中膀胱癌的指标。

本文描述了一种诊断或者预测个体膀胱癌的方法，其包括以下步骤：

a)确定在从个体获得的血中表达的两种或多种RNA转录物的水平，其中所述的两种或多种RNA转录物对应于表1和表2的一种或多种生物标记，其中至少一种所述的RNA转录物对应于表1的生物标记，和

b)将在步骤a)的血中的一种或多种RNA转录物之每一种的水平与在来自一个或多个没有膀胱癌个体的血中的所述一种或多种RNA转录物之每一种的水平进行比较，

其中检测在步骤b)的比较中所述一种或多种RNA转录物之每一种的差异性表达是步骤a)个体中膀胱癌的指标。

本文描述了一种诊断或预测个体膀胱癌的方法，其包括以下步骤：

a)确定在从个体获得的血中表达的一种或多种RNA转录物的水平，其中所述的一种或多种RNA转录物对应于表4的一种或多种生物标记，和

b)将在步骤a)的血中的一种或多种RNA转录物之每一种的水平与在来自一个或多个没有膀胱癌个体的血中的所述一种或多种RNA转录物之每一种的水平进行比较，

其中检测在步骤b)的比较中所述一种或多种RNA转录物之每一种的差异性表达是步骤a)个体中膀胱癌的指标。

本文描述了一种诊断或预测个体膀胱癌的方法，其包括以下步骤：

a)确定在从个体获得的血中表达的两种或多种RNA转录物的水平，其中所述的两种或多种RNA转录物对应于表4和表5的一种或多种生物标记，其中至少一种所述的RNA转录物对应于表4的生物标记，和

b)将在步骤a)的血中的一种或多种RNA转录物之每一种的水平与在来自一个或多个没有膀胱癌个体的血中的所述一种或多种RNA转录物之每一种的水平进行比较，

其中检测在步骤b)的比较中所述一种或多种RNA转录物之每一种的差异性表达是步骤a)个体中膀胱癌的指标。

本文描述了一种诊断或预测个体膀胱癌的方法，其包括以下步骤：

a)确定在从个体获得的血中表达的一种或多种RNA转录物的水平，其中所述的一种或多种RNA转录物对应于表7的一种或多种生物标记，和

b)将在步骤a)的血中的一种或多种RNA转录物之每一种的水平与在来自一个或多个没有膀胱癌个体的血中的所述一种或多种RNA转录物之每一种的水平进行比较，

其中检测在步骤b)的比较中所述一种或多种RNA转录物之每一种的差异性表达是步骤a)个体中膀胱癌的指标。

本文描述了一种诊断或预测个体膀胱癌的方法，其包括以下步骤：

a)确定在从个体获得的血中表达的一种或多种RNA转录物的水平，其中所述的一种或多种RNA转录物对应于表10的一种或多种生物标记，和

b)将在步骤a)的血中的一种或多种RNA转录物之每一种的水平与在来自一个或多个没有膀胱癌个体的血中的所述一种或多种RNA转录物之每一种的水平进行比较，

其中检测在步骤b)的比较中所述一种或多种RNA转录物之每一种的差异性表达是步骤a)个体中膀胱癌的指标。

本文描述了一种诊断或预测个体膀胱癌的方法，其包括以下步骤：

a)确定在从个体获得的血中表达的一种或多种RNA转录物的水平，其中所述的一种或多种RNA转录物的每一种对应于选自表1的生物标记，和

b)将在步骤a)的血中的一种或多种RNA转录物之每一种的水平与在来自一个或多个具有膀胱癌个体的血中的所述一种或多种RNA转录物之每一种的水平进行比较，

c)将在步骤a)的血中的所述一种或多种RNA转录物之每一种的水平与在来自一个或多个没有膀胱癌个体的血中的所述一种或多种RNA转录物之每一种的水平进行比较，

d)确定步骤a)的所述一种或多种RNA转录物的水平是否可以相比于步骤c)的所述转录物水平来对步骤b)的所述转录物水平进行分类，

其中所述确定是步骤a)个体具有膀胱癌的指标。

本文描述了一种诊断或预测个体早期阶段膀胱癌的方法，其包括以下步骤：

a)确定在从个体获得的血中表达的一种或多种RNA转录物的水平，其中所述的一种或多种RNA转录物的每一种对应于选自表4的生物标记，和

b)将在步骤a)的血中的一种或多种RNA转录物之每一种的水平与在来自一个或多个具有早期阶段膀胱癌个体的血中的所述一种或多种RNA转录物之每一种的水平进行比较，

c)将在步骤a)的血中的所述一种或多种RNA转录物之每一种的水平与在来自一个或多个没有膀胱癌个体的血中的所述一种或多种RNA转录物之每一种的水平进行比较，

d)确定步骤a)的所述一种或多种RNA转录物的水平是否可以相比于步骤c)的所述转录物水平来对步骤b)的所述转录物水平进行分类，

其中所述确定是步骤a)个体具有早期阶段膀胱癌的指标。

本文描述了一种诊断或预测个体膀胱癌的方法，其包括以下步骤：

a)确定在从个体获得的血中表达的一种或多种RNA转录物的水平，其中所述的一种或多种RNA转录物的每一种对应于选自表7的生物标记，和

b)将在步骤a)的血中的一种或多种RNA转录物之每一种的水平与在来自一个或多个具有膀胱癌个体的血中的所述一种或多种RNA转录物之每一种的水平进行比较，

c)将在步骤a)的血中的所述一种或多种RNA转录物之每一种的水平与在来自一个或多个没有膀胱癌个体的血中的所述一种或多种RNA转录物之每一种的水平进行比较，

d)确定步骤a)的所述一种或多种RNA转录物的水平是否可以相比于步骤c)的所述转录物水平来对步骤b)的所述转录物水平进行分类，

其中所述确定是步骤a)个体具有膀胱癌的指标。

本文描述了一种诊断或者预测个体膀胱癌的方法，其包括以下步骤：

a)确定在从个体获得的血中表达的一种或多种RNA转录物的水平，其中所述的一种或多种RNA转录物的每一种对应于选自表10的生物标记，和

b)将在步骤a)的血中的一种或多种RNA转录物之每一种的水平与在来自一个或多个具有膀胱癌个体的血中的所述一种或多种RNA转录物之每一种的水平进行比较，

c)将在步骤a)的血中的所述一种或多种RNA转录物之每一种的水平与在来自一个或多个没有膀胱癌个体的血中的所述一种或多种RNA转录物之每一种的水平进行比较，

d)确定步骤a)的所述一种或多种RNA转录物的水平是否可以相比于步骤c)的所述转录物水平来对步骤b)的所述转录物水平进行分类，

其中所述确定是步骤a)个体具有膀胱癌的指标。

本文描述了一些方法，包括如何诊断和/或预测膀胱癌的一些方法，其中血样由已被裂解的全血、血滴、或者全血或全血滴组成。

本文描述了一些方法，包括如何诊断和/或预测膀胱癌的一些方法，其还包括从所述血样分离RNA的步骤。

本文描述了一些方法，包括如何诊断和/或预测膀胱癌的方法，其包括确定一种或多种RNA转录物之每一种的水平的步骤，这可以包括定量RT-PCR(QRT-PCR)。

在一些情形中，QRT-PCR应用与所述一种或多种转录物或者其互补物杂交的引物。所述引物包括15-25个核苷酸长的那些引物。

本文描述了一些方法，包括如何诊断和/或预测膀胱癌的一些方法，其包括确定所述的一种或多种RNA转录物之每一种水平的步骤，这包括杂交第一种多量分离核酸分子，所述分离核酸分子对应于所述的一种或多种转录物、对应于包含第二种多量分离核酸分子的阵列。在这些方法中，所述的第一种多量分离核酸分子包括RNA、DNA、cDNA、PCR产物或者EST。

本文描述了一种用于诊断或者预测膀胱癌的试剂盒，其包含：

a)两种生物标记特异性引发工具，其被设计用来产生互补于选自表1、4、7或10；11或13任一个中生物标记的双链DNA，其中所述第一引发工具包含可选择性杂交与所述生物标记互补之RNA、cDNA或者EST的序列以生成延伸产物，以及第二引发工具，其能够选择性杂交所述延伸产物，

b)具有逆转录酶活性的酶，

c)具有热稳定性DNA聚合酶活性的酶，和

d)标记工具；

其中应用所述引物检测所检验对象中所述生物标记的定量表达水平。

本文描述了一种诊断或者预测个体膀胱癌的方法，其包括以下步骤：

a)确定在从个体获得的血中表达的一种或多种蛋白质的水平，其中所述的一种或多种蛋白质由列于表1的一种或多种生物标记所编码，和

b)将在步骤a)的血中的所述一种或多种蛋白质之每一种的水平与在来自一个或多个没有肝癌个体的血中的所述一种或多种蛋白质之每一种的水平进行比较，

其中检测比较步骤b)中所述的一种或多种蛋白质之每一种水平的差异是步骤a)个体中肝癌的指标。

本文描述了一种诊断或者预测个体膀胱癌的方法，其包括以下步骤：

a)确定在从个体获得的血中表达的一种或多种蛋白质的水平，其中所述的一种或多种蛋白质由列于表1的一种或多种生物标记所编码，和

b)将在步骤a)的血中的所述一种或多种蛋白质之每一种的水平与在来自一个或多个具有膀胱癌个体的血中的所述一种或多种蛋白质之每一种的水平进行比较，

c)将步骤a)血中的所述一种或多种蛋白质之每一种的水平与在来自一个或多个没有膀胱癌个体的血中的所述一种或多种蛋白质之每一种的水平进行比较，

d)确定步骤a)的所述一种或多种蛋白质的水平是否可以相比于步骤c)中所述蛋白质的水平对步骤b)中所述蛋白质的水平进行分类，

其中所述确定是步骤a)个体具有膀胱癌的指标。

本文描述了一些方法，包括用于诊断或者预测膀胱癌的方法，其包括确定所述的一种或多种蛋白质之每一种水平的步骤，该步骤包括应用一种或多种抗体，其中所述的一种或多种抗体的每一种对表3所列生物标记的蛋白质产物有特异性。

本文描述了一些方法，包括用于诊断或者预测膀胱癌的方法，其包括一种或多种抗体，所述抗体可以是单克隆抗体、fv、scfv、dab、fd、fab和fab’₂。

本文描述了一些鉴定生物标记和/或生物标记组合的方法，其可用于预后分析(prognosing)和/或诊断膀胱癌，包括将已知具有膀胱癌个体的生物标记的表达水平与已知没有膀胱癌个体的所述水平进行比较，所述生物标记选自表1和/或表2或表7或表10或表11和/或表12。

本文描述了一些鉴定生物标记和/或生物标记组合的方法，其可用于预后分析和/或诊断早期阶段膀胱癌，包括将已知具有早期阶段膀胱癌个体的生物标记的表达水平与已知没有膀胱癌个体的所述水平进行比较，所述生物标记选自表3和/或表4。

4.表

参照表1-7可以更好地理解本发明的目的和特征，其包括在说明书的实施例部分之后。

在本发明的一个实施方案中，表1是显示生物标记的表，所述生物标记区分膀胱癌和正常的情形。以它们的基因标识符(gene ID)注释生物标记。列1是AffySpotID，列2是p值，列3是倍数变化(膀胱癌/对照)，列4是GeneID，列5是基因符号和列6是基因说明。

在本发明的一个实施方案中，表2是显示生物标记的表，所述生物标记区分膀胱癌和正常的情形，如之前在PCT专利申请PCT/US04/020836中所鉴定的。以它们的基因ID号注释生物标记。列1是基因ID，列2是人RNA登记号，列3是人蛋白质登记号，列4是基因符号和列5是基因说明。

在一个实施方案中，表3是显示对应于表1中鉴定的生物标记的产物的表，包括RNA产物，其由核酸的参考登记号表示，以及蛋白质产物，其由蛋白质的参考登记号表示。以它们的基因ID注释并确定基因。列1是AffySpotID，列2是基因ID，列3是人RNA登记号，列4是人蛋白质登记号，列5是基因符号和列6是基因说明。

在本发明的一个实施方案中，表4是显示区分早期阶段膀胱癌和正常情形的生物标记的表。以它们的基因ID注释生物标记。列1是AffySpotID，列2是基因ID，列3是基因符号，列4是人RNA登记号，列5是人蛋白质登记号和列6是基因说明。

在本发明的一个实施方案中，表5是显示区分早期阶段膀胱癌和正常情形的生物标记的表，如之前在PCT专利申请PCT/US04/020836中所鉴定的。以它们的基因ID注释生物标记。列1是基因ID，列2是人RNA登记号，列3是人蛋白质登记号，列4是基因符号和列5是基因说明。

在一个实施方案中，表6是显示对应于表4中鉴定的生物标记的产物的表，包括RNA产物，其由核酸的参考登记号表示，以及蛋白质产物，其由蛋白质的参考登记号表示。以它们的基因ID注释和确定基因。列1是AffySpotID，列2是基因ID，列3是人RNA登记号，列4是人蛋白质登记号和列5是基因符号。

在一个实施方案中，表7是显示表1和表4共有的生物标记的表。列1是AffySpotID，列2是p值，列3是基因ID，列4是基因符号、列5是人RNA登记号和列5是蛋白质登记号。

表8是例举数据的表，通过将表达数据应用于使用分对数(logit)的数学模型，所述数据可用来形成ROC曲线。

表9是列举可能的报告基因和报告基因产物的特性的表。

在一个实施方案中，表10是显示具体选择表1中鉴定的以及在表3中进一步注释的生物标记的表。

在一个实施方案中，表11是显示对同样在表1中鉴定的349种生物标记之选集的表，相对于睾丸细胞癌或者肾细胞癌，所述生物标记区分膀胱癌。以它们的基因ID注释生物标记。列1是AffySpotID，列2是ReprRNA登记号，列3是基因ID，列4是基因符号，列5是倍数变化(膀胱癌/对照)，列6是对疾病p值(膀胱癌/对照)(BC对C)的调整，列7是倍数变化(膀胱癌对其它癌症)和列8是对膀胱癌p值(膀胱癌对其它癌症)的调整。

在一个实施方案中，表12是显示对应于表11鉴定的生物标记的所选产物的表，包括RNA产物，其由核酸的参考登记号表示，以及蛋白质产物，其由蛋白质的参考登记号表示。以它们的基因ID注释并鉴定基因。列1是AffySpoptID，列2是基因ID，列3是基因符号，列4是人RNA登记号和列5是人蛋白质登记号。

在一个实施方案中，表13是显示对表1鉴定的生物标记之具体选集的表。

表14是显示对应于表13所选生物标记的人RNA产物和人蛋白质产物的序列之登记号的表。

表15是对针对表13所列生物标记的生物标记特异性引物的选集，其依据实施例4来应用。

表16显示，根据实施例4的描述，关于列于表13生物标记的RNA产物的实时定量RT-PCR(QRT-PCR)的结果。

在本发明的一个实施方案中，表17是对分离的抗体的显示，所述抗体选择性结合表13所列生物标记的蛋白质产物并且可从商业获得。

在本发明的一个实施方案中，表18是生物标记特异性引物和相应的生物标记特异性探针的选集，它们选择性扩增互补于所示RNA产物(其是表13所示生物标记的产物)的双链DNA。

在本发明的一个实施方案中，表19显示所选的2个基因的组合，其可用来筛选膀胱癌。

表20显示本发明一个实施方案的利用4种生物标记对比组合的分类集合，其中所述生物标记选自表13的那些生物标记。

表21显示本发明一个实施方案的利用3种生物标记对比组合的分类集合，其中所述生物标记选自表13的那些生物标记。

表22显示本发明一个实施方案的利用2种生物标记对比组合的分类集合，其中所述生物标记选自表13的那些生物标记。

表23显示本发明一个实施方案的利用生物标记对比组合的分类集合，其中所述生物标记选自表13的那些生物标记。

5.发明详细说明

在本发明实践中部分地利用分子生物学的常规技术、微生物学和重组DNA技术，其在本领域的技术范围内。这些技术在文献中有充分的描述。见例如，Sambrook，Fritsch & Maniatis，1989，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Second Edition；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait，ed.，1984)；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Harnes & S.J.Higgins，eds.，1984)；A Practical Guide to Molecular Cloning(B.Perbal，1984)；and aseries，Methods in Enzymology(Academic Press，Inc.)；Short Protocols In Molecular Biology，(Ausubel et al.，ed.，1995)。本文提及的所有的专利、专利申请和出版物，既包括上文的又包括下述的，它们的全部内容通过参考并入本文。

本文所公开的发明鉴定了可用于诊断膀胱癌和/或早期阶段膀胱癌的生物标记和生物标记组合。为了应用这些生物标记，本发明教导了对这些生物标记的产物的鉴定，所述产物包括RNA产物和蛋白质产物。本发明还涵盖寡核苷酸、cDNA、DNA、RNA、PCR产物、合成DNA、合成RNA，和其片段，或者特异性和/或选择性杂交至本发明生物标记的RNA产物的天然的修饰核苷酸的其它组合。本发明还公开蛋白质、肽、抗体、配体，和其片段，包括抗原结合片段，它们特异性和/或选择性杂交至本发明生物标记的蛋白质产物。可以应用对本发明生物标记的RNA产物具有特异性和/或选择性的那些多核苷酸实施对本发明生物标记和生物标记组合的RNA产物表达的测量，从而定量所述RNA产物的表达。在本发明的一个具体实施方案中，对于所述RNA产物具有特异性和/或选择性的多核苷酸是探针或者引物。在一个实施方案中，这些多核苷酸是核酸探针的形式，其可以与人造的阵列杂交。在另一实施方案中，可以应用商品阵列测量所述RNA产物的表达并且本发明教导哪些基因组合用于分析。在另一实施方案中，在应用的一些技术中，比如实时定量RT PCR，应用例如

Green、或者应用

或者Molecular Beacon技术，以探针和引物的形式应用对本发明生物标记的RNA产物具有特异性和/或选择性的多核苷酸，其中以正向引物、反向引物、TaqMan标记的探针或者Molecular Beacon标记的探针的形式使用所应用的多核苷酸。在一个具体实施方案中，从测量本发明RNA产物表达水平中获得的结果可以输入本发明的模型中，其被用来鉴定生物标记的组合，以确定由该模型定义的诊断结果。在一个优选实施方案中，同样的方法被用来产生表达数据，该数据被用来产生数学模型，该模型被用来诊断所检验的个体。

本发明还考虑应用本文公开的蛋白质或者多肽，并且本领域技术人员知道如何测量本发明生物标记的蛋白质产物。随后可以应用本领域技术人员公知的技术(例如，所述技术包括比如Western印迹、免疫沉淀反应、蛋白质微阵列分析等)测量对应于本发明生物标记的蛋白质产物的水平。本领域技术人员应当理解的是，测量本发明生物标记的蛋白质产物的表达水平需要特异性或者选择性结合一种或多种蛋白质产物的蛋白质，所述蛋白质产物对应于本发明的各种生物标记。随后可以将代表本发明生物标记的蛋白质产物表达水平的数据输入模型中，产生的所述模型用来鉴定所述组合从而确定由该模型所定义的诊断结果。在一个优选实施方案中，应用同样的方法产生表达数据，用该数据产生用来诊断所检验个体的数学模型。

5.1用于本发明的样品

除非本文另外指出，可以根据本发明的方法应用来自对象的膀胱组织样品，比如所述样品可以是血样、血清样品和***样品。可以根据本发明的方法从对象获得并利用的对象样品包括但不限于无症状对象、显现或者展示膀胱癌的1、2、3、4种或者更多症状的对象、经临床诊断具有膀胱癌和/或早期阶段膀胱癌的对象、易患膀胱癌的对象(例如，具有家族膀胱癌史的对象、具有膀胱癌遗传倾向性的对象和其生活方式导致他们易患膀胱癌或者增加发生膀胱癌可能性的对象)、怀疑具有膀胱癌的对象、经受膀胱相关病症治疗的对象、具有膀胱癌和至少一种另外病症的对象(例如，具有2、3、4、5种或者更多病症的对象)、没有经受膀胱癌治疗的对象、经医师(例如，内科医生)确定为健康的或者无膀胱癌(即，正常的)对象、已对膀胱癌进行过治疗的对象(包括已对膀胱癌进行过成功治疗的对象)、正控制膀胱癌的对象和还未被诊断患有膀胱癌的对象。

在另一实施方案中，可从其获得样品并利用的对象具有早期阶段膀胱癌。在进一步的实施方案中，可从其获得样品的对象是接受检验的个体，其中不了解该个体是否具有膀胱癌，和/或不了解所检验对象具有何阶段的膀胱癌。

5.1.1组织

在一个方面中，应用任何公知的方法从一个或多个对象获得组织样品。在一个具体实施方案中，从怀疑患有膀胱癌的个体获得组织。优选地，在应用前，将所述组织样品保存在液氮中。在一个具体实施方案中，分离最少0.05g的组织样品以获得总RNA。在另一实施方案中，分离最少0.025g的组织样品以获得总RNA。可依照本发明应用的组织样品的量足以用来检测本发明的一种或多种核酸序列或者氨基酸序列。

5.1.2血液

在本发明的一个方面中，根据本领域众所周知的方法从对象获得血样。可以从本文描述的任何对象获得血样。在一些实施方案中，通过简便地针刺对象的皮肤来收集血滴。如本文公开的，血滴包括小于1ml的体积。在一些实施方案中，通过针刺收集的血滴是非常理想的。可以应用本领域公知的方法(尤其是本领域公知的静脉切开放血的方法)从对象身体的任何部分(例如，指、手、腕、臂、腿、足、踝、胃和颈)取血。

所收集的血量将依赖于收集部位、本发明方法所必需的量和对象的舒适程度而变化。然而，本发明一个实施方案的优点是实施本发明方法必需的血量是如此的小，以至于为了获得样品不需要更多的介入性过程。例如，在一些实施方案中，所需要的仅是血滴。可以通过，例如，简便地针刺获得所述血滴。在一些实施方案中，收集的血量足以检测列于表1-7、或者10-12的任一基因中一种、两种、三种、四种、五种、十种或者更多种基因的表达。同样地，在一些实施方案中，收集的血量是小于或等于1ml、小于或等于500μl、小于或等于250μl、小于或等于200μl、小于或等于100μl、小于或等于50μl、小于或等于20μl、小于或等于10μl、小于或等于1μl、小于或等于0.5μl、小于或等于0.1μl或者小于或等于0.01μl。然而，本发明并不限于所述的实施方案。在一些实施方案中，可以应用较多的血，并且在一些实施方案中，可以应用较多的血来实现本发明的方法。同样地，在不同的具体实施方案中，从对象收集0.001ml、0.005ml、0.01ml、0.05ml、0.1ml、0.15ml、0.2ml、0.25ml、0.5ml、0.75ml、1ml、1.5ml、2ml、3ml、4ml、5ml、10ml、15ml或者更多的血。在另一实施方案中，从对象收集0.001ml至15ml、0.01ml至10ml、0.1ml至10ml、0.1ml至5ml、1至5ml的血。

在本发明的一些实施方案中，血被保存在K3/EDTA管中。在另一实施方案中，可以应用用于保存血的含有稳定剂的管，如美国专利No.6,617,170(其通过参考并入本文)中所公开的。在另一实施方案中，可以应用由PreAnalytiX，Qiagen/BD公司提供的PAXgenen^TM血RNA***(PAXgene^TM blood RNA system)来收集血。仍在另一实施方案中，可以应用由Applied Biosystems提供的Tempus^TM血RNA收集管。Tempus^TM收集管提供闭合抽空塑料管，其包含用于全血收集的RNA稳定剂。

所收集的收集血在根据本发明的方法应用之前，被任选地但优选地保存在冷藏温度下，比如4℃或者在冰上。在一些实施方案中，所述的血被保持在4℃或者在冰上只1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、10小时或者最多24小时。在一些实施方案中，除了对血的保存或者代替对血的保存之外，保存分离的核酸或者蛋白质一段时间以待后用。可以保存所述的生物标记一小时或者更长、一天或者更长、一周或者更长、一个月或者更长、一年或者更长、或者无限期。

在一个方面中，根据本领域众所周知的静脉切开放血方法，从正常的个体或者从被诊断患有或者怀疑具有骨关节炎的个体获取全血。全血包括未分级的全血，其包括已去除了血清或者血浆的血并且根据本领域众所周知的方法(例如，优选在300至800×g条件下适度离心5至10分钟)已从剩下的血样中分离了RNA或者mRNA的血。在一个具体实施方案中，未分级的全血还涵盖，根据本领域公知的方法，将血与裂解缓冲液(例如，裂解缓冲液(IL)：0.6g EDTA、1.0g KHCO₂、8.2g NH₄Cl，用NaOH调节pH至7.4)混合处理的全血，离心所述样品并保留细胞沉淀，以及提取RNA或者mRNA(例如，“裂解的全血”)(见例如Sambrook et al.)。应用全血是优选的，因为它避免了昂贵地和耗时地分离出血中各个类型细胞(Kimoto，1998，Mol.Gen.Genet 258：233-239；Chelly J et al.，1989，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 86：2617-2621；Chelly J et al.，1988，Nature333：858-860)的需要。

在本发明的一些实施方案中，对从对象收集的全血进行分级(即，分成不同的成分)。在本发明的一些具体实施方案中，应用本领域公知的技术，从收集自对象的全血中分离血细胞。例如，可以用Ficoll-Hypaque(Pharmacia)梯度离心处理从对象收集的全血以分离血细胞。所述的离心将红细胞(红血球)与各种类型的有核细胞以及血浆分开。尤其是，Ficoll-Hypaque梯度离心可用来分离外周血白细胞(PBL)，其可根据本发明的方法应用。

通过举例但非限制的方式，根据以下所述可以获得巨噬细胞。通过注射器抽取血，接着经Ficoll-Hypaque梯度离心而从对象的外周血分离单核细胞。用对象自己的血清或者用AB+人血清预包被组织培养皿并在37℃下孵育1小时。用移液管移去未附着的细胞。将冷的(4℃)溶于磷酸盐缓冲溶液的1mM EDTA加到存在于培养皿的附着细胞并且将所述培养皿置于室温下15分钟。收集细胞，用RPMI缓冲液清洗并悬浮在RPMI缓冲液中。通过将巨噬细胞与巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)一起在37℃孵育，可以导致巨噬细胞数量增加。可以通过向所述分子偶联亲和性化合物来标记抗巨噬细胞特异性表面标记(比如Mac-1)的抗体以促进对巨噬细胞的检测和分离。可以应用的亲和性化合物包括但不限于生物素、光敏生物素、荧光素异硫氰酸酯(FITC)或藻红蛋白(PE)，或者本领域已知的其它化合物。随后，通过本领域公知的方法，比如但不限于各种细胞分选方法、亲和色谱法和淘选法，将附着了标记抗体的细胞与没有结合所述抗体的细胞分开。

应用荧光激活细胞分选仪(FACS)可以分选血细胞。荧光激活细胞分选(FACS)是公知的方法，其基于粒子的荧光特性来分开粒子，包括细胞。见，例如，Kamarch，1987，Methods Enzymol 151：150-165。激光激发粒子个体中的荧光部分导致产生小电荷，这允许从混合物中电磁分离正和负粒子。用荧光染料(比如FITC或者藻红蛋白)标记抗体或者配体，所述的抗体或者配体是用来检测存在于特定血细胞表面上的血细胞抗原决定簇。将所述细胞与荧光标记的抗体或者配体一起孵育一段时间，该段时间足以允许所述标记的抗体或者配体结合细胞。让所述细胞经过细胞分选仪，这允许将感兴趣的细胞与其它细胞分开。FACS分选的粒子可以直接被沉积在微量滴定板的各个孔中以辅助分离。

在本发明的一些实施方案中，还可以应用磁珠分离血细胞。例如，可以应用磁性活化细胞分选(MACS)技术分选血细胞，该技术是基于粒子结合磁珠(0.5-100m直径)的能力分离粒子的方法。对磁性微球可以实施许多种可用的修饰，包括共价添加特异性识别细胞-固相表面分子或者半抗原的抗体。随后，施加磁场，从而以物理学方式操作所选择的珠。在一个具体实施方案中，将针对血细胞表面标记的抗体偶联至磁珠。随后将所述的珠与血细胞培养物混合以允许结合。接下来让细胞通过磁场，从而分离出感兴趣的具有血细胞表面标记的细胞。随后可以分离这些细胞。

在一些实施方案中，可以用抗体包被培养皿表面，并被用于根据称为淘选法的方法分离血细胞。可以用特定血细胞特异性抗体包被分离的皿。首先可以将细胞加入用感兴趣的血细胞特异性抗体包被的器皿中。在彻底漂洗后，结合于该器皿的细胞将是表达感兴趣的血细胞标记的细胞。细胞表面抗原决定簇或者标记的实例包括，但不限于，T淋巴细胞和自然杀伤细胞的CD2、T淋巴细胞的CD3、白细胞的CD11a、T淋巴细胞的CD28、B淋巴细胞的CD19、B淋巴细胞的CD20、B淋巴细胞的CD21、B淋巴细胞的CD22、B淋巴细胞的CD23、白细胞的CD29、单核细胞的CD14、血小板的CD41、血小板的CD61、粒细胞的CD66、粒细胞的CD67以及单核细胞和巨噬细胞的CD68。

可以将全血分离成各种类型的细胞，比如白细胞、血小板、红细胞等，并可以根据本发明的方法应用这些类型的细胞。还可以应用标准技术将白细胞分成粒细胞和无粒细胞并且这些细胞可以根据本发明的方法来应用。可以应用标准技术将粒细胞分成不同的细胞类型比如嗜中性粒细胞、嗜酸细胞和嗜碱细胞并且这些细胞可以根据本发明的方法来应用。可以应用标准技术将无粒细胞分成淋巴细胞(例如，T淋巴细胞和B淋巴细胞)和单核细胞并且这些细胞可以根据本发明的方法来应用。应用标准技术可以将T淋巴细胞与B淋巴细胞分开以及将辅助T细胞与细胞毒T细胞分开并且这些细胞可以根据本发明的方法来应用。在将分离的血细胞(例如，白细胞)用于本方法之前，可以用标准技术将所述细胞冷冻。

可用于本发明的血样的量应足够检测本发明的一种或多种核酸或者氨基酸序列。在一个具体实施方案中，可用于本发明的血样量的范围从1μl至100ml，优选10μl至50ml，更优选10μl至25ml和最优选10μl至1ml。

5.1.3血清

在本发明的一个方面中，根据本领域众所周知的方法，首先从对象分离血样，随后离心分离该样品，从而将血清与血的其余组分分开，由此来获得对象的血清。可以从本文描述的任何对象中获得血清样品。收集的血清量将依收集血的位置、本发明方法的必需量和对象的舒适程度而变化。然而，本发明一个实施方案的优点是，提供实施本发明方法足够血清的必需血量可以是如此的小以至于为了获得样品不需要较多的介入过程。例如，在一些实施方案中，所需要的是一滴血并且收集的血清量是等于或小于1ml、等于或小于500μl、等于或小于250μl、等于或小于200μl、等于或小于100μl、等于或小于50μl、等于或小于20μl、等于或小于10μl、等于或小于1μl、等于或小于0.5μl、等于或小于0.1μl或者等于或小于0.01μl。然而，本发明并不限于这些实施方案。在一些实施方案中，可应用更多的血，并且在一些实施方案中，可应用更多的血来获得足够的血清以实施本发明的方法。

5.2RNA制备

在本发明的一个方面中，为了测量本发明生物标记的RNA产物，从个体分离RNA。如本文所述从组织样品中分离RNA。样品可以来自单一患者或者可以来自多个患者的合并。

在另一个方面中，如本文所述从骨关节炎患者的血样中直接分离RNA。样品可以来自单个患者或者可以来自多个患者的合并。

根据本领域众所周知的方法从组织样品中提取总RNA。在一个实施方案中，根据以下方法从组织中纯化RNA。从个体或者患者移出感兴趣的组织后，将该组织在液氮中快速冷冻，以防止RNA的降解。一旦加入一定体积的组织胍盐溶液，就将组织样品在组织研磨器(tissuemizer)中以两次或者三次10秒脉冲来研磨组织样品。为制备组织胍盐溶液(1L)，将590.8g异硫氰酸胍溶于约400ml经DEPC处理的H₂O。加入25ml的2MTris-Cl，pH 7.5(终浓度0.05M)和20ml的Na₂EDTA(终浓度0.01M)，搅拌该溶液过夜，将体积调至950ml，并加入50ml的2-ME。

将匀浆化的组织样品在12℃条件下以12,000×g离心10分钟。在存在0.1体积20％十二烷基肌氨酸钠的条件下在65℃孵育所得到的上清液2分钟，在9ml的5.7M CsCl溶液(0.1g CsCl/ml)之上形成层，并且在22℃下以113,000×g离心过夜进行分离。在小心的移去上清液后，将管倒转并排空。将该管的底部(含有RNA沉淀)置于50ml的塑料管中并在存在3ml组织重悬缓冲液(5mM EDTA，0.5％(v/v)十二烷基肌氨酸钠，5％(v/v)2-ME)的条件下在4℃孵育过夜(或更长时间)从而让RNA沉淀完全重悬。按顺序地，用25∶24∶1的苯酚/氯仿/异戊醇，接着用24∶1的氯仿/异戊醇抽提所得到的RNA溶液，加入3M的醋酸钠(pH 5.2)和2.5体积的100％乙醇进行沉淀，并重悬在DEPC水中(Chirgwin et al.，1979，Biochemistry，18：5294)。

作为替代，按照以下单一步骤方案从组织中分离RNA。在玻璃特氟隆匀浆器中通过匀浆化制备感兴趣的组织，其中每100mg的组织加入1ml的变性溶液(4M硫代硫酸胍，25mM柠檬酸钠，pH 7.0，0.1M 2-ME，0.5％(w/v)N-十二烷基肌氨酸)。在将匀浆转移至5ml聚丙烯管之后，顺序地添加0.1ml的2M醋酸钠(pH 4)，1ml的水-饱和苯酚和0.2ml的49∶1的氯仿/异戊醇。在添加每个成分之后混合该样品，并且在添加了所有成分后在0-4℃孵育15分钟。将该样品在4℃下以10,000×g离心20分钟进行分离，添加1ml的100％异丙醇进行沉淀，在-20℃孵育30分钟并在4℃下以10,000×g离心10分钟进行沉淀。将得到的RNA沉淀溶于0.3ml的变性溶液中，转移到微离心管中，在-20℃下添加0.3ml的100％异丙醇沉淀30分钟，并在4℃下以10,000×g离心10分钟。在70％乙醇中清洗RNA沉淀，干燥，并重悬于100-200μl经DEPC处理的水中或者经DEPC处理的0.5％SDS中(Chomczynski and Sacchi，1987，Anal.Biochem.，162：156)。

优选地，在液氮条件下将所述组织样品处理成细微粉末并且应用

试剂(GIBCO/BRL)提取总RNA。

作为替代，从血中分离RNA。在一个实施方案中，按照以下步骤分离RNA。以3份裂解缓冲液对1份血的比率向血样中添加裂解缓冲液(裂解缓冲液(1L)0.6g EDTA；1.0g KHCO₂，8.2g NH₄Cl，用NaOH将pH调至7.4)。混合样品并置于冰上5-10分钟，直至透明为止。在4℃下以1000rpm离心裂解样品10分钟，并吸取上清液。将沉淀重悬于5ml的裂解缓冲液，并在4℃下以1000rmp再离心10分钟。以约6ml的对10ml原始血样的比率应用

(GIBCO/BRL)将沉淀的细胞匀浆化并充分漩涡振荡。将样品置于室温5分钟。以每1ml

应用1.2ml氯仿的量提取RNA。在4℃下以12,000×g离心样品5分钟并收集上层。以每1ml

对0.5ml的比率向上层添加异丙醇。将样品置于-20℃过夜或者置于-20℃一小时。按照公知的方法沉淀RNA，将RNA沉淀风干，并将沉淀重悬于经DEPC处理过的ddH₂O。还可以将RNA样品保存在75％乙醇中，对于运输来说该样品在室温下是稳定的。

作为替代，如上所述应用

试剂(GIBCO/BRL)从滑液中分离RNA。

通过在260/280nm处的吸光度以及琼脂糖凝胶电泳然后接着在紫外光下的检查来评估RNA的纯度和完整性。

5.3本发明的生物标记

在一个实施方案中，本发明提供了生物标记和生物标记的组合，其中所述生物标记的一个或多个产物的表达水平的量度是膀胱癌的指标。在另一实施方案中，本发明提供了生物标记和生物标记组合，其中可以应用所述生物标记的一个或多个产物的表达水平的量度来诊断个体是否具有膀胱癌和/或早期阶段膀胱癌。

表1提供关于本发明生物标记的基因名称和相关基因ID(先前的基因座连锁ID)的列表，其中可以单独地或者组合地应用所述生物标记表达水平的量度来诊断个体为具有膀胱癌；或不具有膀胱癌。如本领域技术人员所理解的，可以应用基因ID来确定对应所列生物标记的所有所述RNA转录物和所有所述蛋白质的序列。

表2提供公开于PCT申请No.PCT/US04/020836的生物标记，其可以与表1公开的一种或多种生物标记相组合并根据本文的教导来诊断膀胱癌或者区分具有膀胱癌或不具有膀胱癌的人。

表3具体地公开了对应所述生物标记之RNA产物的参考登记号和对应表1所列生物标记之蛋白质产物的参考登记号。

表4提供关于本发明生物标记的基因名称和相关基因ID的列表，其中可以单独地或者组合地应用所述生物标记表达水平的量度来诊断个体为具有早期阶段膀胱癌；或不具有膀胱癌。如本领域技术人员所理解的，可以应用基因ID来确定对应所列生物标记的所有所述RNA转录物和所有所述蛋白质的序列。

表5提供公开于PCT申请No.PCT/US04/020836的生物标记，其可以与表4公开的一种或多种生物标记相组合并根据本文的教导来诊断早期阶段膀胱癌或者区分具有早期阶段膀胱癌或不具有膀胱癌的人。

表6具体地公开了对应所述生物标记之RNA产物的参考登记号和对应表4所列生物标记之蛋白质产物的参考登记号。

表7具体地公开了关于本发明生物标记的基因名称和相关基因ID的列表，所述基因可以区分膀胱癌和非膀胱癌。

表10具体地公开了关于选择的表1中鉴定的生物标记的基因名称和相关基因ID的列表，所述基因可以区分膀胱癌和非膀胱癌。

表11提供关于选择的本发明生物标记的基因名称和相关基因ID(先前的基因座连锁ID)的列表，其中可以单独地或者组合地应用所述生物标记表达水平的量度来诊断个体为具有膀胱癌；或不具有膀胱癌。如本领域技术人员所理解的，可以应用基因ID来确定对应所列生物标记的所有所述RNA转录物和所有所述蛋白质的序列。

表12具体地公开了对应所述生物标记之RNA产物的参考登记号和对应表11所列生物标记之蛋白质产物的参考登记号。

本发明由此涵盖为了上述各个目的，应用本领域技术人员公知的以及本文概述的那些方法来测量这些生物标记和生物标记组合的表达。

5.4生物标记组合

在一个实施方案中，本发明生物标记的组合包括表1所列生物标记的任何数目、最多为2、3、4、5、6、7、8、10、20、30、40、50、100、125、150、175、200或者所有的任意组合。在本发明的另一实施方案中，本发明生物标记的组合包括任一或者任意数目的最多为1、2、3、4、5、6、7、8、10、20、30、40、50、100、125、150、175、200个或者所有表1所列生物标记与任一或者任意数目的最多为1、2、3、4、5、6、7、8、10、20、30、40、50、100、250、500、750、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000个或者所有表2所列生物标记组合在一起的任何组合，测量其产物的表达可以被用来诊断个体是否具有膀胱癌或者没有膀胱癌。在另一实施方案中，本发明生物标记的组合包括任意数目的最多为2、3、4、5、6、7、8、10、20、30、40、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、1000、1250、1500、1750、2000个或者所有表3所列RNA和/或蛋白质产物的任何组合。在另一实施方案中，本发明生物标记的组合包括任意数目的最多为2、3、4、5、6、7、8、10、20、30、40、50、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500个或者所有表4所列生物标记的任何组合。在本发明的另一实施方案中，本发明生物标记的组合包括任一或者任意数目的最多为1、2、3、4、5、6、7、8、10、20、30、40、50、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500个或者所有表4所列生物标记与任一或者任意数目的最多为1、2、3、4、5、6、7、8、10、20、30、40、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、1000、1250、1500、1750、2000、2250个或者所有表5所列生物标记组合在一起的任何组合，测量其产物的表达可以被用来诊断个体是否具有早期膀胱癌或者没有膀胱癌。在另一实施方案中，本发明生物标记的组合包括意数目的最多为2、3、4、5、6、7、8、10、20、30、40、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、1000、1250、1500、1750、2000、2250、2500、2750、3000、3250个或者所有表6所列RNA和/或蛋白质产物的任何组合。在本发明的另一实施方案中，本发明生物标记的组合包括任一或者任意数目的最多为1、2、3、4、5、6、7、8、10、20、30、40、50、75、100、125、150、175、200个或者所有表7所列生物标记的任何组合。在另一实施方案中，本发明生物标记的组合包括任意数目的最多为2、3、4、5、6、7、8、9个或者所有表10所列生物标记的任何组合。

例如，在Feller，Intro to Probability Theory，Third Edition，volume 1，1968，ed.J.Wiley中描述了n个基因的子集m的可能组合数目，其应用下列通式：

m！/(n)！(m-n)！

在一个实施方案中，其中n是2和m是19，就有：

$\frac{19!}{2!(19-2)!}=\frac{19\×18\×17\×16\×15\×14\×13\×12\×11\×10\×9\×8\×7\×6\×5\×4\×3\×2\×1}{(2\×1)(19\×18\×17\×16\×15\×14\×13\×12\×11\×10\×9\×8\×7\×6\×5\×4\×3\×2\×1)}$

$=\frac{{1.21610}^{17}}{{7.1110}^{14}}=171$

种特定双基因组合。可以独立地使用这些双基因组合中每一组合的基因表达的量度来确定患者是否具有膀胱癌。在另一具体实施方案中，其中m是19和n是3，就有19！/3！(19-3)！个特定三基因组合。可以独立地将这些特定三基因组合中的每一种作为确定患者是否具有膀胱癌的模型。

5.5选择具体可用的生物标记组合

尽管在本发明表1-7和10-13的任何表中的生物标记组合可分别用于诊断膀胱癌和/或早期膀胱癌，本发明还提供选择和评估生物标记组合的手段，所述生物标记组合来自可用于诊断膀胱癌的任何特定的表或者表组合。

为了鉴定可用的生物标记组合，应用数学模型来建立分类器(classifier)，其能够应用反映生物标记组合中每个生物标记表达水平的数据来区分膀胱癌和/或早期膀胱癌与非膀胱癌，其中所述的每个生物标记选自在表1-7和10-13之一个或多个中鉴定的那些生物标记。随后评估或者评价分类器的区分膀胱癌和/或早期膀胱癌与非膀胱癌的能力，从而选择能最佳诊断个体具有膀胱癌和/或早期膀胱癌的那些分类器(以及由此的那些生物标记组合)。

通过应用代表训练群体内每个个体的两个或多个所选生物标记产物的表达水平的数据并应用于数学模型来建立分类器。为了确保得到的分类器具有期望的效用，训练群体的表型特征是很重要的。例如，在一个实施方案中，应用的训练群体包括两个表型亚组：已知具有膀胱癌的个体和已知没有膀胱癌的个体，并且所述生物标记选自表1和/或表2或表7或表10或表11和/或表12。在另一实施方案中，应用的训练群体包括两个表型亚组：已知具有早期阶段膀胱癌的个体和已知没有膀胱癌的个体，并且所述生物标记选自表3和/或表4。

输入到所述数学模型的数据可以是代表生物标记产物表达水平的任何数据。在一个实施方案中，输入到所述数学模型的关于每个生物标记的数据是应用本领域技术人员公知的用来测量基因表达水平的任何方法获得的数据，所述的测量基因表达水平包括测量生物标记的RNA产物和/或测量生物标记的蛋白质产物。在一个优选实施方案中，输入到数学模型的数据是应用实时定量PCR(qRT-PCR)获得的数据。

为了鉴定尤其可用的生物标记组合，可以开发对于表1、表2、表1和表2组合、表4、表5、表4和表5组合、表7或者表10中任一种用于每种可能的生物标记组合的分类器，能够并在随后评价该分类器从而选择那些最适用于诊断膀胱癌或者早期膀胱癌的那些评价分类器。

为了开发分类器，应用数学模型。可以从以下各项选择可用于本发明的数学模型：回归模型、逻辑斯蒂回归模型(logistic regression model)、神经网络、聚类模型、主成分分析、最近邻域分类分析、线性判别分析、二次判别分析、支持向量机(Support Vector Machine)、决策树、遗传算法、应用袋模型的分类器优化法(classifier optimization using bagging)、应用加强的分类器优化法(classifier optimization using boosting)、应用随机子空间方法的分类器优化法(classifier optimization using the randomsubspace method)、投影寻踪法(a projection pursuit)和加权投票法(wighted voting)。

随后，按照第5节的描述评价和/或排序生成的分类器，从而鉴定对于诊断个体患有膀胱癌和/或早期膀胱癌具有足够敏感性和/或特异性的那些分类器。为了评价所述分类器，可以检验分类器以确定分类器依本文所述正确鉴别训练群体中每个个体的能力。还可以通过确定分类器正确鉴别“评价群体”的一个或多个个体的能力来评估或者评价所生成的分类器。评价群体与下述第5.7节中描述的训练群体是相似的，不过评价群体是由未用来生成分类器的一个或多个个体组成的。同样地，评价群体包括已被诊断为具有例如膀胱癌的个体(第一表型亚组)和没有膀胱癌的个体(第二表型亚组)。在一个实施方案中，评价群体包括所述训练群体的成员，加上一个或多个未用于所述训练群体的成员。在一些实施方案中，所述训练群体中小于或等于5％、小于或等于10％、小于或等于20％、小于或等于30％、小于或等于50％或者小于或等于90％的成员与所述所评价群体是共同的。

如本领域技术人员所理解的，这允许预测分类器正确表征表型特征未知的个体的能力。

可以应用得到的分类器诊断未知的或者检验的个体以确定所述检验个体是否具有膀胱癌和/或早期阶段膀胱癌。在一个实施方案中，可以应用两个或多个分类器(“分类器组”)来确定对检验个体的诊断。例如，在一些实施方案中，选择排序前10的分类器、排序前20的分类器、排序前100的分类器。在一些实施方案中，选择排序前1至500的任意分类器。在一些情形中，应用分类器组进行诊断，在一个实施方案中，对于所述检验个体的诊断，每个分类器投一张票，从而对所述检验对象的诊断被确定为分类器组合的结果。在另外一些实施方案中，对每个分类器使用不同的加权模式。例如，加权模式可以包括基于一些因素(比如分类器的原始得分、对数比值比率(logs odd ratio)(“分对数(logit)”)、每个分类器的系数的大小、它们的一些组合等)的加权。

在一个实施方案中，直接使用分类器或者分类器组进行如上所述的诊断。然而在另一实施方案中，已鉴定的组合可独立于坚定所述基因的分类器来使用。例如，可以监测由10个基因产生的基因表达谱来评估检验个体，其中将所述检验个体的基因表达谱与膀胱癌个体的所述10个基因的基因表达谱和没有膀胱癌个体中所述10个基因的基因表达谱进行比较。

5.6向数学模型输入数据来选择诊断膀胱癌和早期阶段膀胱癌尤其有用的 生物标记组合

例如，为了鉴定可用于诊断个体患有膀胱癌或者没有膀胱癌的那些生物标记，将对应生物标记的一种或多种mRNA产物的表达水平的数据用于训练群体的个体，具有膀胱癌的第一表型亚组个体和没有膀胱癌的第二表型亚组个体，所述生物标记是表1和/或表2和/或表7和/或表10和/或表11中的生物标记。为了将所述训练群体表征为指定的表型亚组的目的，可以应用诊断膀胱癌的任何方法。在一个优选实施方案中，对所述训练群体来说，利用细胞检查来确定对膀胱癌的诊断。

在另一实施方案中，为了鉴定可用于诊断个体患有早期阶段膀胱癌或者没有膀胱癌的那些生物标记，反映训练群体内个体的生物标记的一种或多种mRNA产物的表达水平的数据包括具有早期阶段膀胱癌的个体和没有膀胱癌的个体的数据，所述生物标记是表4和/或表5中的生物标记。

在另一实施方案中，将反映生物标记的一种或多种蛋白质产物的表达水平的数据用于训练群体的个体，具有膀胱癌的第一表型亚组个体和没有膀胱癌的第二表型亚组个体，所述生物标记是表1和/或表2和/或表7和/或表10中的生物标记。为了将所述训练群体表征为指定的表型亚组的目的，可以应用诊断膀胱癌的任何方法。

在另一实施方案中，将反映生物标记的一种或多种蛋白质产物的表达水平的数据用于训练群体的个体，具有膀胱癌的第一表型亚组个体和没有膀胱癌的第二表型亚组个体，所述生物标记是表1和/或表2和/或表7和/或表10和/或表11中的生物标记。为了将所述训练群体表征为指定的表型亚组的目的，可以应用诊断膀胱癌的任何方法。

5.7训练群体

在一些实施方案中，参照或者训练群体包括10-30个对象。在另一实施方案中，所述训练群体包含30-50个对象。仍在另一些实施方案中，所述参照群体包含两个或多个群体，其中每一个群体包含50至100、100至500、500至1000、或者超过1000个对象。

在一些实施方案中，优选训练群体的每一表型亚组(即膀胱癌和非膀胱癌成员)的成员，以使得训练群体的每一表型亚组具有关于至少1、2、3、4、5、6个、1或多个、2或多个、3或多个、4或多个、5或多个、6或更多个、1-1000个其它表型的类似分布。例如，年龄、性别、遗传变异信息(例如，基因SNP突变、限制性片段长度多态性、微卫星标记、限制性片段长度多态性以及短串联重复特征的存在、缺乏)、治疗方案；共存疾病(co-morbidities)；代谢物的浓度、血液化学水平、和/或卫生(health)和/或健康(wellness)的其它指标。

5.8数学模型

5.8.1回归模型

在一些实施方案中，将关于待检验的每一生物标记组合的表达数据用于回归模型，优选逻辑斯蒂回归模型。所述的回归模型将确定关于所检验生物标记每种可能组合的方程，每个方程提供乘以反映由所述模型代表的每个个体生物标记的表达水平之数据的系数。

通常，可以将感兴趣的多元回归方程写为

Y＝α+β₁X₁+β₂X₂+…+β_kX_k+ε

其中，因变量Y表示存在(当Y为正值时)或者缺乏(当Y为负值时)第一表型特征(例如，具有轻度骨关节炎)。该模型表明因变量Y依赖于解释变量k(对于来自训练群体中第一和第二表型亚组的对象的k个选择基因来说，测量值表示在感兴趣组织中所述基因产物的水平)，加上误差项，该误差项包括各种未特别指定的省略因子。在上述模型中，在保持其它解释变量不变的条件下，参数β₁代表第一解释变量X₁对因变量Y的影响。相似地，β₂给出了解释变量X₂对Y的影响，保持其余解释变量不变。

逻辑斯蒂回归模型是线性回归的非线性变换。逻辑斯蒂回归模型被称为“分对数(logit)”模型并且可以被表示为

ln[p/(1-p)]＝α+β₁X₁+β₂X₂+…+β_kX_k+ε或者

$[p/(1-p)]={\exp }^{\mathrm{\α}}{\exp }^{{\mathrm{\β}}_1{X}_1}{\exp }^{{\mathrm{\β}}_2{X}_2}\×\·\·\·\×{\exp }^{{\mathrm{\β}}_k{X}_k}{\exp }^{\mathrm{\ϵ}}$

其中，ln是自然对数，log^exp，其中exp＝2.71828...，

p是事件Y发生的概率，p(Y＝1)，

p/(1-p)是“比值比”，

ln[p/(1-p)]是对数比值比，或者“分对数”，并且

该模型的其它所有组分与上述一般回归方程是相同的。本领域技术人员应当理解的是，可以将α和ε项变为相同的常数。实际上，在一些优选实施方案中，用单一项表示α和ε。“逻辑斯蒂”分布是S形分布函数。分对数分布限制估计概率(p)处于0-1之间。

在本发明的一些实施方案中，通过最大似然估计(MLE)拟合逻辑斯蒂回归模型。换句话说，通过最大似然法确定系数(例如，α、β₁、β₂...)。似然是条件性概率(例如，P(Y|X)，给定X时Y的概率)。似然函数(L)测量观测特定因变量值集合(Y₁、Y₂、...、Y_n)在样品数据集中发生的概率。它被表示为因变量乘积的概率：

L＝Prob(Y₁*Y₂***Y_n)

似然函数越高阶，观测Y在样品中的概率越大。MLE涉及找到让似然函数的对数尽可能一样大(LL＜0)或者让似然函数的对数尽可能小-2倍(-2LL)的系数(α、β₁、β₂、...)。在MLE中，对参数α、β₁、β₂、...进行一些初始的估计。随后计算确定这些参数估计的数据的似然性。重新计算所述数据的似然性改进参数的估计。重复该过程，直至参数估计没有太多变化(例如，概率变化小于0.01或者0.001)为止。在Hastie，The Elementsof Statistical Learning，Springer，New York，2001，pp.95-100可以找到逻辑斯蒂回归和拟合逻辑斯蒂回归模型的实例，其整体通过参考并入本文。

5.8.2神经网络

在另一实施方案中，可以利用对本发明各个生物标记之表达的测量来训练神经网络。神经网络是一种两阶回归或者分类模型。神经网络具有分层结构，其包括输入单元(input units)(和偏倚(the bias))层，该层通过权重层(layer of weights)与输出单元层相连。对于回归而言，输出单元层通常包括恰好一个输出单元。然而，神经网络可以以无缝方式处理很多定量响应。同样地，可以使用神经网络以鉴定区分超过两种群体的生物标记。在一个具体实施例中，可以应用来自表1所述生物标记(包括在表3中指出的那些生物标记)的产物的表达数据训练神经网络，从而鉴定相比没有膀胱癌的，对膀胱癌有特异性的那些生物标记组合。作为结果，可以应用经试验的神经网络直接鉴定可用作阶段特异性生物标记的生物标记组合。在一些实施方案中，应用EasyNN-Plus4.0g版软件包(NeuralPlanner Software Inc.)中的包含十神经元(十隐藏单元)单一隐藏层的反向传播神经网络(见，例如Abdi，1994，“A neural network primer”，J.Biol.System.2，247-283)。

在Duda et al.，2001，Pattern Classification，Second Edition，JohnWiley & Sons，Inc.，New York；和Hastie et al.，2001，The Elements ofStatistical Learning，Springer-Verlag，New York中描述了神经网络，其整体以参考并入本文。

5.8.3其它数学模型

上述的模式分类和统计技术仅是一些类型模型的实例，其可被用来构建针对膀胱癌的模型，例如在Duda and Hart，Pattern Classification andScene Analysis，1973，John Wiley & Sons，Inc.，New York(其整体通过参考并入本文)的211-256页中描述的聚类；主成分分析(见例如Jolliffe，1986，Principal Component Analysis，Springer，New York，其通过参考并入本文)；最近邻域分类分析(见例如Duda，Pattern Classification，Second Edition，2001，John Wiley & Sons，Inc；和Hastie，2001，The Elements of StatisticalLearning，Springer，New York)；线性判别分析(见例如Duda，PatternClassification，Second Edition，2001，John Wiley & Sons，Inc；和Hastie，2001，The Elements of Statistical Learning，Springer，New York；Venables &Ripley，1997，Modern Applied Statistics with s-plus，Springer，New York)；支持向量机(见例如Cristianini and Shawe-Taylor，2000，An Introduction toSupport Vector Machines，Cambridge University Press，Cambridge，Boseret al，1992，″A training algorithm for optimal margin classifiers，inProceedings of the 5^th Annual ACM Workshop on Computational LearningTheory，ACM Press，Pittsburgh，PA，pp.142-152；Vapnik，1998，StatisticalLearning Theory，Wiley，New York，所有所述文献通过参考并入本文)。

5.9选择生物标记组合来选择分类器

优选选择所有生物标记在随后部分中应用。因此，应用代表各个生物标记的产物水平的数据来评估所有可能的生物标记组合。在一些实施方案中，不可能选择所有可能的组合，因此首先选择生物标记的子集并在接下来应用生物标记子集的组合。如所理解的，基于所选生物标记的期望数目，选择标准将依赖于获得代表生物标记产物水平数据的可用来源和/或计算与评估所选生物标记所有或者部分可能组合的分类器的可用计算机来源。在一些实施方案中，可以评估的选择的生物标记之期望数目是4,000；3,000；2,000；1,000；900；800；700；600；500；400；300；200；190；180；170；160；150；140；130；120；110；100；90；80；70；60；50；40；30；20；10。

在本发明的一个实施方案中，评估表1中生物标记的各种可能组合。在本发明的另一实施方案中，评估表1的2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60等个生物标记的各种可能组合。在本发明的另一实施方案中，评估表1所有生物标记的2和/或3和/或4和/或5和/或6和/或7和/或8和/或9和/或10个生物标记的各种可能组合。在本发明的另一实施方案中，评估表1部分生物标记的2和/或3和/或4和/或5和/或6和/或7和/或8和/或9和/或10个生物标记的各种可能组合。在本发明的另一实施方案中，所评估的表1部分生物标记为20、30、40、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200、225或者250个表1的生物标记。仍在本发明的另一实施方案中，根据个体p值对所选的表1的部分生物标记进行排序，其中所述p值表示各个生物标记单个区分具有膀胱癌的成员和没有膀胱癌成员的能力，随后选择经排序的生物标记的前60、50、40、30、20或10的个体并利用所选的所有生物标记的2和/或3和/或4和/或5和/或6和/或7和/或8和/或9和/或10个生物标记的各种可能组合来创建分类器，并评估分类器区分具有膀胱癌的成员和没有膀胱癌成员的能力。仍在另一实施方案中，选择表1生物标记的子集，它们的p值小于0.5、小于0.1、小于0.05、小于0.01、小于0.005、小于0.001、小于0.0005、小于0.0001、小于0.00005、小于0.00001、小于0.000005、小于0.000001等。在一些实施方案中，根据所述生物标记产物在两个或多个特征亚组之间展示的差异表达水平来选择表1生物标记的子集。应注意在测量血中的差异倍数变化时，倍数变化的差异可能是非常小的，因此在一些实施方案中，对生物标记的选择是基于差异倍数变化，其中所述倍数变化大于1.2、大于1.3、大于1.4、大于1.5、大于1.6、大于1.7、大于1.8、大于1.9、大于2.0、大于2.1、大于2.2、大于2.3、大于2.4、大于2.5、大于2.6、大于2.7、大于2.8、大于2.9、大于3.0、大于3.1、大于3.2、大于3.3、大于3.4、大于3.5、大于4.0等。在一些实施方案中，如本领域技术人员所理解的，基于p值和倍数变化形成组合有助于选择生物标记。因此在一些实施方案中，首先根据由生物标记数据产生的p值，按照上述选择生物标记，随后根据从生物标记数据确定的差异倍数变化对所述生物标记进行再选择。在另一些实施方案中，首先基于差异倍数变化来选择生物标记，随后根据p值进行再选择。在一些实施方案中，应用一种或多种选择标准和随后的排序允许选择排序后生物标记的前2.5％、5％、7.5％、10％、12.5％、15％、17.5％、20％、30％、40％、50％或者更多的生物标记来形成分类器。在本发明的另一实施方案中，以在所评估的组合中包含至少一个来自表1的生物标记为条件，评估表1和表2生物标记的各种可能组合。在本发明的另一实施方案中，评估表1的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60等个的生物标记组合表2的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60等个的生物标记的各种可能组合。在本发明的另一实施方案中，评估表1和表2组合的所有生物标记的2和/或3和/或4和/或5和/或6和/或7和/或8和/或9和/或10个生物标记组合的穷举搜索。在本发明的另一实施方案中，评估表1和表2的部分生物标记的2和/或3和/或4和/或5和/或6和/或7和/或8和/或9和/或10个生物标记的各种可能组合。在本发明的另一实施方案中，所评估的表1和表2的部分生物标记为表1的20、30、40、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200、225或者250个生物标记与表2的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、75、100、150、200、300等个生物标记的组合。仍在本发明的另一实施方案中，所选的表1和表2的部分生物标记根据个体的p值进行排序，其中所述p值表示各个生物标记单个区分具有膀胱癌的成员和没有膀胱癌成员的能力。仍在另一实施方案中，选择表1和表2生物标记的子集，它的p值小于0.5；小于0.1、小于0.05、小于0.01、小于0.005、小于0.001、小于0.0005、小于0.0001、小于0.00005、小于0.00001、小于0.000005、小于0.000001等。在一些实施方案中，根据由生物标记产物展示的差异表达水平选择表1和表2生物标记的子集。在测量血中差异倍数变化时应注意的是，倍数变化的差异可能是非常小的，因此在一些实施方案中，对生物标记的选择是基于差异倍数变化，其中所述倍数变化大于1.2、大于1.3、大于1.4、大于1.5、大于1.6、大于1.7、大于1.8、大于1.9、大于2.0、大于2.1、大于2.2、大于2.3、大于2.4、大于2.5、大于2.6、大于2.7、大于2.8、大于2.9、大于3.0、大于3.1、大于3.2、大于3.3、大于3.4、大于3.5、大于4.0等。在一些实施方案中，如本领域技术人员所理解的，基于p值和倍数变化形成组合有助于选择生物标记。因此在一些实施方案中，首先根据由生物标记数据产生的p值，按照上述选择生物标记，随后根据从生物标记数据确定的差异倍数变化对所述生物标记进行再选择。在另一些实施方案中，首先基于差异倍数变化来选择生物标记，随后根据p值进行再选择。在一些实施方案中，应用一种或多种选择标准和随后的排序允许选择所排序生物标记的前2.5％、5％、7.5％、10％、12.5％、15％、17.5％、20％、30％、40％、50％或者更多的生物标记进行应用，这使得利用所有选择的生物标记的2和/或3和/或4和/或5和/或6和/或7和/或8和/或9和/或10个生物标记的各种可能组合来创建分类器，并评估所述分类器区分具有膀胱癌的成员和没有膀胱癌成员的能力。

在本发明的另一实施方案中，评估表4中生物标记的各种可能组合。在本发明的另一实施方案中，评估表4的2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500等个生物标记的各种可能组合。在本发明的另一实施方案中，评估表4所有生物标记的2和/或3和/或4和/或5和/或6和/或7和/或8和/或9和/或10个生物标记的各种可能组合。在本发明的另一实施方案中，评估表4部分生物标记的2和/或3和/或4和/或5和/或6和/或7和/或8和/或9和/或10个生物标记的各种可能组合。在本发明的另一实施方案中，所评估的表4部分生物标记为20、30、40、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200、225、250、300、350、400、450或者500个表4的生物标记。仍在本发明另一实施方案中，根据个体的p值对所选的表4的部分生物标记进行排序，其中所述p值表示各个生物标记单个区分具有浅表性膀胱癌的成员和没有膀胱癌成员的能力，随后选择经排序的生物标记的前60、50、40、30、20或10的个体并利用所选的所有生物标记的2和/或3和/或4和/或5和/或6和/或7和/或8和/或9和/或10个生物标记的各种可能组合来创建分类器，并评估分类器区分具有浅表性膀胱癌的成员和没有膀胱癌成员的能力。仍在本发明的另一实施方案中，选择表4的部分生物标记，其p值小于0.5、小于0.1、小于0.05、小于0.01、小于0.005、小于0.001、小于0.0005、小于0.0001、小于0.00005、小于0.00001、小于0.000005、小于0.000001等。在一些实施方案中，根据由所述生物标记产物展示的差异表达水平，选择表4生物标记的子集形成用于输入分类器的组合。应注意在测量血中差异倍数变化时，倍数变化差异可能非常小，因此在一些实施方案中，对生物标记的选择是基于差异倍数变化，其中所述倍数变化大于1.2、大于1.3、大于1.4、大于1.5、大于1.6、大于1.7、大于1.8、大于1.9、大于2.0、大于2.1、大于2.2、大于2.3、大于2.4、大于2.5、大于2.6、大于2.7、大于2.8、大于2.9、大于3.0、大于3.1、大于3.2、大于3.3、大于3.4、大于3.5、大于4.0等。在一些实施方案中，如本领域技术人员所理解的，基于p值和倍数变化形成组合有助于选择生物标记。因此，在一些实施方案中，首先根据由生物标记数据产生的p值，按照上述选择生物标记，随后根据从生物标记数据确定的差异倍数变化对所述生物标记进行再选择。在另一些实施方案中，首先基于差异倍数变化来选择生物标记，随后根据p值进行再选择。在一些实施方案中，应用一种或多种选择标准和随后的排序允许选择所排序生物标记的前2.5％、5％、7.5％、10％、12.5％、15％、17.5％、20％、30％、40％、50％或者更多的生物标记进行应用，这使得利用所有选择的生物标记的2和/或3和/或4和/或5和/或6和/或7和/或8和/或9和/或10个生物标记的各种可能组合来创建分类器，并评估所述分类器区分具有膀胱癌的成员和没有膀胱癌成员的能力。在本发明的另一实施方案中，以在评估的组合中包含至少一个来自表4的生物标记为条件，评估表4和表5生物标记的各种可能组合。在本发明的另一实施方案中，评估表4中1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60等个生物标记与表5中1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60等个生物标记相组合的各种可能组合。在本发明的另一实施方案中，评估表4和表5组合的所有生物标记的2和/或3和/或4和/或5和/或6和/或7和/或8和/或9和/或10个生物标记组合的穷举搜索。在本发明的另一实施方案中，评估表4和表5的部分生物标记的2和/或3和/或4和/或5和/或6和/或7和/或8和/或9和/或10个生物标记的各种可能组合。在本发明的另一实施方案中，所评估的表4和表5的部分生物标记为表4的20、30、40、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200、225或者250、300、350、400、450、500个生物标记与表5的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、75、100、150、200、300、500、1000、1250、1500、1750、2000、2250等个生物标记的组合。仍在本发明的另一实施方案中，根据个体的p值对所选的表4的部分生物标记进行排序，其中所述p值表示各个生物标记单个区分具有浅表性膀胱癌的成员和没有膀胱癌成员的能力，随后选择经排序的生物标记的前60、50、40、30、20或10的个体并利用所选的所有生物标记的2和/或3和/或4和/或5和/或6和/或7和/或8和/或9和/或10个生物标记的各种可能组合来创建分类器，并评估分类器区分具有浅表性膀胱癌的成员和没有膀胱癌成员的能力。仍在本发明的另一实施方案中，选择表4和表5部分的生物标记，它们的p值小于0.5、小于0.1、小于0.05、小于0.01、小于0.005、小于0.001、小于0.0005、小于0.0001、小于0.00005、小于0.00001、小于0.000005、小于0.000001等。在一些实施方案中，根据由所述生物标记产物展示的差异表达水平选择表4和/或表5的生物标记子集以形成用于输入分类器的组合。应注意在测量血中差异倍数变化时，所述倍数变化差异可能非常小，因此在一些实施方案中，对生物标记的选择是基于差异倍数变化，其中所述倍数变化大于1.2、大于1.3、大于1.4、大于1.5、大于1.6、大于1.7、大于1.8、大于1.9、大于2.0、大于2.1、大于2.2、大于2.3、大于2.4、大于2.5、大于2.6、大于2.7、大于2.8、大于2.9、大于3.0、大于3.1、大于3.2、大于3.3、大于3.4、大于3.5、大于4.0等。在一些实施方案中，如本领域技术人员所理解的，基于p值和倍数变化形成组合有助于选择生物标记。因此在一些实施方案中，首先根据由生物标记数据产生的p值，按照上述选择生物标记，随后根据从生物标记数据确定的差异倍数变化对所述生物标记进行再选择。在另一些实施方案中，首先基于差异倍数变化来选择生物标记，随后根据p值进行再选择。在一些实施方案中，应用一种或多种选择标准和随后的排序允许选择经排序生物标记的前2.5％、5％、7.5％、10％、12.5％、15％、17.5％、20％、30％、40％、50％或者更多的生物标记进行应用，这使得利用所选的所有生物标记的2和/或3和/或4和/或5和/或6和/或7和/或8和/或9和/或10个生物标记的各种可能组合来创建分类器，并评估所述分类器区分具有膀胱癌的成员和没有膀胱癌成员的能力。

在本发明另一实施方案中，评估表7中生物标记的各种可能组合。在本发明的另一实施方案中，评估表7的2、3、4、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200等个生物标记的各种可能组合。在本发明的另一实施方案中，根据个体的p值(如表1所述)对表7的生物标记进行排序，其中所述p值表示各个生物标记单个区分具有膀胱癌的成员和没有膀胱癌成员的能力，随后评估经排序的生物标记的前60、50、40、30、20或10个体的所有可能组合，从而选择最能区分具有膀胱癌的成员和没有膀胱癌成员的那些组合。仍在另一实施方案中，利用表7所有生物标记的2和/或3和/或4和/或5和/或6和/或7和/或8和/或9和/或10个生物标记的组合来创建分类器，所述分类器区分膀胱癌和非膀胱癌。仍在另一实施方案中，应用表7的最多2、3、4、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、125、150、175或者200个生物标记的2和/或3和/或4和/或5和/或6和/或7和/或8和/或9和/或10个组合来创建分类器，随后评估所述分类器区分膀胱癌和非膀胱癌的能力。仍在另一实施方案中，应用表7前200、175、150、125、100、90、80、70、60、50、40、30、20或者10种生物标记(基于p值)的2和/或3和/或4和/或5和/或6和/或7和/或8和/或9和/或10个组合来创建分类器，随后评估所述分类器区分膀胱癌和非膀胱癌的能力。仍在本发明的另一实施方案中，选择表7的部分生物标记，它们的p值小于0.5、小于0.1、小于0.05、小于0.01、小于0.005、小于0.001、小于0.0005、小于0.0001、小于0.00005、小于0.00001、小于0.000005、小于0.000001等。在一些实施方案中，根据所述生物标记产物展示的差异表达水平来选择表7生物标记子集以形成用于输入分类器的组合。应注意在测量血中差异倍数变化时，所述倍数变化差异可能是非常小的，因此在一些实施方案中，对生物标记的选择是基于差异倍数变化，其中所述倍数变化大于1.2、大于1.3、大于1.4、大于1.5、大于1.6、大于1.7、大于1.8、大于1.9、大于2.0、大于2.1、大于2.2、大于2.3、大于2.4、大于2.5、大于2.6、大于2.7、大于2.8、大于2.9、大于3.0、大于3.1、大于3.2、大于3.3、大于3.4、大于3.5、大于4.0等。在一些实施方案中，如本领域技术人员所理解的，基于p值和倍数变化形成组合有助于选择生物标记。因此在一些实施方案中，首先根据由生物标记数据产生的p值，按照上述选择生物标记，随后根据从生物标记数据确定的差异倍数变化对所述生物标记进行再选择。在另一些实施方案中，首先基于差异倍数变化来选择生物标记，随后根据p值进行再选择。在一些实施方案中，应用一种或多种选择标准和随后的排序允许选择经排序生物标记的前2.5％、5％、7.5％、10％、12.5％、15％、17.5％、20％、30％、40％、50％或者更多的生物标记进行应用，这使得利用所选的所有生物标记的2和/或3和/或4和/或5和/或6和/或7和/或8和/或9和/或10个生物标记的各种可能组合来创建分类器，并评估所述分类器区分具有膀胱癌的成员和没有膀胱癌成员的能力。

仍在另一实施方案中，利用表10所有生物标记的2和/或3和/或4和/或5和/或6和/或7和/或8和/或9和/或10个生物标记的所有组合来创建分类器，该分类器可以区分膀胱癌和非膀胱癌。

在本发明的另一实施方案中，评估表11生物标记的2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60等个生物标记的各种可能组合。在本发明的另一实施方案中，评估表11所有生物标记的2和/或3和/或4和/或5和/或6和/或7和/或8和/或9和/或10个生物标记的各种可能组合。在本发明的另一实施方案中，评估表11部分生物标记的2和/或3和/或4和/或5和/或6和/或7和/或8和/或9和/或10个生物标记的各种可能组合。在本发明的另一实施方案中，所评估的表11的部分生物标记是表11的20、30、40、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200、225或者250个生物标记。仍在本发明的另一实施方案中，根据个体的p值对所选的表11的部分生物标记进行排序，其中所述p值表示各个生物标记单个区分具有膀胱癌的成员和没有膀胱癌成员的能力，随后选择经排序的生物标记的前60、50、40、30、20或10的个体并利用所选的所有生物标记的2和/或3和/或4和/或5和/或6和/或7和/或8和/或9和/或10个生物标记的各种可能组合来创建分类器，并评估分类器区分具有膀胱癌的成员和没有膀胱癌成员的能力。仍在本发明的另一实施方案中，选择表11的部分生物标记，它们的p值小于0.5、小于0.1、小于0.05、小于0.01、小于0.005、小于0.001、小于0.0005、小于0.0001、小于0.00005、小于0.00001、小于0.000005、小于0.000001等。在一些实施方案中，根据所述生物标记产物展示的差异表达水平来选择表11生物标记的子集以形成用于输入分类器的组合。应注意在测量血中差异倍数变化时，所述倍数变化差异可能是非常小的，因此在一些实施方案中，对生物标记的选择是基于差异倍数变化，其中所述倍数变化大于1.2、大于1.3、大于1.4、大于1.5、大于1.6、大于1.7、大于1.8、大于1.9、大于2.0、大于2.1、大于2.2、大于2.3、大于2.4、大于2.5、大于2.6、大于2.7、大于2.8、大于2.9、大于3.0、大于3.1、大于3.2、大于3.3、大于3.4、大于3.5、大于4.0等。在一些实施方案中，如本领域技术人员所理解的，基于p值和倍数变化形成组合有助于选择生物标记。因此在一些实施方案中，首先根据由生物标记数据产生的p值，按照上述选择生物标记，随后根据从生物标记数据确定的差异倍数变化对所述生物标记进行再选择。在另一些实施方案中，首先基于差异倍数变化来选择生物标记，随后根据p值进行再选择。在一些实施方案中，应用一种或多种选择标准和随后的排序允许选择经排序生物标记的前2.5％、5％、7.5％、10％、12.5％、15％、17.5％、20％、30％、40％、50％或者更多的生物标记进行应用，这使得利用所有选择的生物标记的2和/或3和/或4和/或5和/或6和/或7和/或8和/或9和/或10个生物标记的各种可能组合来创建分类器，并评估所述分类器区分具有膀胱癌的成员和没有膀胱癌成员的能力。在本发明的另一实施方案中，以在评估的组合中包含至少一个来自表11的生物标记为条件，评估表11和表2组合的生物标记的各种可能组合。在本发明的另一实施方案中，评估表11的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60等个生物标记并组合表2的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60等个生物标记的各种可能组合。在本发明的另一实施方案中，评估表1和表2组合的所有生物标记的2和/或3和/或4和/或5和/或6和/或7和/或8和/或9和/或10个生物标记组合的穷举搜索。在本发明的另一实施方案中，评估表11和表2的部分生物标记的2和/或3和/或4和/或5和/或6和/或7和/或8和/或9和/或10个生物标记的各种可能组合。在本发明的另一实施方案中，所评估的表11和表2的部分生物标记为表11的20、30、40、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200、225或者250个生物标记与表2的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、75、100、150、200、300等个生物标记的组合。仍在本发明的另一实施方案中，根据个体的p值对所选的表11的部分生物标记进行排序，其中所述p值表示各个生物标记单个区分具有膀胱癌的成员和没有膀胱癌成员的能力，随后选择经排序的生物标记的前60、50、40、30、20或10的个体并利用所选的所有生物标记的2和/或3和/或4和/或5和/或6和/或7和/或8和/或9和/或10个生物标记的各种可能组合来创建分类器，并评估分类器区分具有膀胱癌的成员和没有膀胱癌成员的能力。仍在本发明的另一实施方案中，选择表11和表2的部分生物标记，它们的p值小于0.5、小于0.1、小于0.05、小于0.01、小于0.005、小于0.001、小于0.0005、小于0.0001、小于0.00005、小于0.00001、小于0.000005、小于0.000001等。在一些实施方案中，根据由所述生物标记产物展示的差异表达水平选择表11和/或表2的生物标记子集以形成用于输入分类器的组合。应注意在测量血中差异倍数变化时，所述倍数变化差异可能非常小，因此在一些实施方案中，对生物标记的选择是基于差异倍数变化，其中所述倍数变化大于1.2、大于1.3、大于1.4、大于1.5、大于1.6、大于1.7、大于1.8、大于1.9、大于2.0、大于2.1、大于2.2、大于2.3、大于2.4、大于2.5、大于2.6、大于2.7、大于2.8、大于2.9、大于3.0、大于3.1、大于3.2、大于3.3、大于3.4、大于3.5、大于4.0等。在一些实施方案中，如本领域技术人员所理解的，基于p值和倍数变化形成组合有助于选择生物标记。因此在一些实施方案中，首先根据由生物标记数据产生的p值，按照上述选择生物标记，随后根据从生物标记数据确定的差异倍数变化对所述生物标记进行再选择。在另一些实施方案中，首先基于差异倍数变化来选择生物标记，随后根据p值进行再选择。在一些实施方案中，应用一种或多种选择标准和随后的排序允许选择经排序生物标记的前2.5％、5％、7.5％、10％、12.5％、15％、17.5％、20％、30％、40％、50％或者更多的生物标记进行应用，这使得利用所选的所有生物标记的2和/或3和/或4和/或5和/或6和/或7和/或8和/或9和/或10个生物标记的各种可能组合来创建分类器，并评估所述分类器区分具有膀胱癌的成员和没有膀胱癌成员的能力。

5.10评估分类器

一旦应用数学模型计算了一个或多个分类器，可以评估所述分类器以确定哪些分类器对于预期的目的是最有效的。在本发明的一个优选实施方案中，评估或者评价各个分类器正确表征训练群体中各个个体具有膀胱癌或者没有膀胱癌的能力。例如，可以应用交叉验证法-留一交叉验证(Leave One out Cross Validation)、n-叠交叉验证(n-fold crossvalidation)、应用标准统计学方法的刀切法分析(jackknife analysis)和其它公开的方法来评估所述分类器。如本文所用的，评估所述分类器的过程被称为“评价(scoring)”。在一些实施方案中，应用训练群体实施评价。在另一些实施方案中，按照本文所述应用“评价群体(scoring population)”实施评价。仍在另一些实施方案中，既应用“训练群体”又应用“评价群体”来实施评价。在一个实施方案中，所述评价群体除包括一个或多个未用于训练群体的成员外，还包括所述训练群体的成员。在一些实施方案中，有等于或小于5％、等于或小于10％、等于或小于20％、等于或小于30％、等于或小于50％或者等于或小于90％的所述训练群体的成员与所述评价群体是共同的。

在一些实施方案中，应用百分数校正预测(percent correctpredictions)统计评价各个分类器。“百分数校正预测”统计假定，如果估计的p大于或等于0.5，那么预期所述事件将发生，否则不发生。通过分配这些概率为0和1，对训练群体中样本的值进行比较，从而确定采集训练群体多少百分数的样本是正确的。

在一个实施方案中，用来评估分类器正确表征训练群体中各个个体能力的方法是评估所述分类器敏感性(TPF，真阳性率(true positivefraction))和1-特异性(TNF，真阴性率(true negative fraction))的方法。例如，在一个实施方案中，应用接受器工作特征(Receiver OperatingCharacteristic)(“ROC”)。ROC提供了几个参数来评估所述方程产生的诊断结果的敏感性和特异性。例如，在一个实施方案中，应用ROC面积(曲线下面积)评估所述方程。在一个优选实施方案中，ROC面积大于0.5、0.6、0.7、0.8、0.9是优选的。另一方面，得分1.0的理想的ROC面积表示具有100％的敏感性和100％的特异性。

按照相关领域技术人员的理解，曲线下面积将包含在ROC曲线中的二维信息转换成一维信息。在另一些实施方案中，直接利用来自ROC曲线二维方面的信息。例如，ROC曲线还提供有关分类器敏感性和特异性的信息。在一些实施方案中，基于敏感性或者特异性选择分类器。这可以是重要的评价指标。例如，对于将个体误诊为患病而非将个体误诊为正常时较为安全的情形，具有高特异性(即较小量的假阴性)的诊断分类器可以是重要的。因此，在一些实施方案中，可以设置关于敏感性或者特异性的截断值并且根据剩余变量对分类器进行排序或者评价。在一些实施方案中，应用产生数据的任何已知方法来产生各个分类器的ROC曲线。在一些实施方案中，应用微阵列产生数据。在一些实施方案中，利用定量RT-PCR产生数据。

在一些实施方案中，分类器是加权的逻辑斯蒂回归模型，其特征在于多范畴分对数模型。例如，在一些实施方案中，分类器辨别两个不同特征组。在另一些实施方案中，分类器辨别超过两个的不同特征组。在Agresti，An Introduction to Categorical Data Analysis，John Wiley & Sons，Inc.，1996，New York，第7和8章中描述了分对数模型，包括多范畴分对数模型，该文献通过参考并入本文。表8例举了基于表达数据，用来形成ROC曲线的数据，该数据被用于应用分对数的数据模型：

ln[p/(1-p)]＝α+β₁X₁+β₂X₂+ε

表8：分对数ln[p/(1-p)]＝α+β₁X₁+β₂X₂+ε的值

表8的每一行对应评价群体中不同的样本。左列代表关于被采样分类器的分对数的结果。根据列于左手列的分对数分值对表8中的样本进行排序。右手列具体地说明了特征的存在或者缺少，所述特征是在回归方程式中所考虑的。可以应用表8来计算ROC曲线，其中为了计算ROC曲线数据点，考虑表8的每一行作为阈截断值。然后，为了评估分类器的预测性质，可以计算ROC曲线下的面积。

5.11本发明生物标记的产物

如本领域技术人员理解的，鉴定一种或多种生物标记的组合，所述生物标记在膀胱癌和非膀胱癌之间差异表达，允许对检验个体进行膀胱癌诊断，其中使用反映所鉴定的生物标记(基因)组合的产物之表达水平的数据。

本发明各个生物标记的产物包括RNA和蛋白质。本发明生物标记的RNA产物是本发明生物标记的转录产物并且包括hnRNA、mRNA以及一种或多种mRNA剪接变体的群体。为实践本发明，可以将对本发明生物标记的一种或多种RNA产物群体的测量用于诊断目的。更具体地说，本发明包含对所述生物标记的那些RNA产物群体的测量，所述生物标记产物在膀胱癌和/或早期膀胱癌与非膀胱癌之间差异表达。

在本发明的一个实施方案中，所测量的本发明生物标记的RNA产物是RNA产物的群体，包括hnRNA、mRNA和所述mRNA的所有剪接变体。在另一实施方案中，所测量的本发明生物标记的RNA产物是mRNA的群体。在本发明另一实施方案中，所测量的本发明生物标记的RNA产物是在血中表达的mRNA群体。仍在本发明另一实施方案中，所测量的本发明生物标记的RNA产物是所述mRNA的一种或多种剪接变体的群体。仍在本发明另一实施方案中，所测量的本发明生物标记的RNA产物是在血中表达的mRNA的一种或多种剪接变体的群体。在另一实施方案中，本发明生物标记的RNA产物是对应于在表1-2、4-5、7和10的任一表中鉴定的基因座链接(基因ID)的所有mRNA。在本发明另一实施方案中，所测量的本发明生物标记的RNA产物是对应于表3和6的任一表中基因座链接(locus link)(基因ID)的RNA产物。在本发明另一实施方案中，所测量的本发明生物标记的RNA产物是对应于在血中表达的基因座链接(基因ID)的那些RNA产物。

本发明的范围还包括本发明生物标记的蛋白质产物并且包括由本发明生物标记而产生的全部蛋白质产物群体。如本领域技术人员所理解的，由本发明生物标记而产生的全部蛋白质群体包括蛋白质、由剪接的mRNA变体而产生的蛋白质变体和经翻译后修饰的蛋白质。在一个实施方案中，本发明生物标记的蛋白质产物是对应于在表1-2、4-5、7和10-11的任一表中鉴定的基因座链接(基因ID)的所有蛋白质。在本发明的另一实施方案中，所测量的本发明生物标记的蛋白质产物是对应于表3和6的任一表中基因座链接(基因ID)的蛋白质。在本发明另一实施方案中，所测量的本发明生物标记的蛋白质产物是对应于在血中表达的基因座链接(基因ID)的那些蛋白质。为实践本发明，可以将对本发明生物标记的一种或多种蛋白质产物群体的测量用于诊断目的。更具体地说，本文包含了对所述生物标记的那些蛋白质产物群体的测量并且可用于诊断目的，所述生物标记的蛋白质产物在具有膀胱癌和/或早期阶段膀胱癌的个体与没有膀胱癌个体之间差异表达。

在本发明的一个实施方案中，所测量的本发明生物标记的蛋白质产物是从本发明生物标记之RNA产物翻译而产生的全部蛋白质产物的群体。在另一实施方案中，本发明生物标记的蛋白质产物是在血中表达的那些蛋白质产物。仍在本发明另一实施方案中，本发明的任一或多种生物标记的蛋白质产物是从任一或多种mRNA剪接变体翻译而来的任一或多种蛋白质产物。仍在本发明另一实施方案中，本发明生物标记的蛋白质产物是从在血中表达的任一或多种mRNA剪接变体翻译而来的任一或多种蛋白质产物。

5.12应用组合鉴定来诊断膀胱癌和/或早期阶段膀胱癌

如本文所描述的，运用应用了对应于所检验生物标记组合的各个生物标记之表达水平的数据的数学模型(例如逻辑斯蒂回归等)创建分类器。分类器应用数学函数将代表所检验生物标记组合各个生物标记表达水平的数据转换成确定个体是否具有膀胱癌和/或早期阶段膀胱的诊断结果。通过将关于检验个体的数据输入分类器或者分类器组中的各个分类器产生诊断确定结果，可以应用分类器直接诊断个体是否具有膀胱癌和/或早期膀胱癌。例如，应用逻辑斯蒂回归创建所述分类器，所述分类器采用以下形式：

Y＝α+β₁X₁+β₂X₂+…+β_kX_k+ε

其中方程的X₁、X₂、...X_k表示，代表在感兴趣的组织中有关用来产生分类器的所述组合的k选项生物标记的基因产物水平的测量值。因此为了诊断检验个体，将有关所述方程的各个生物标记的测量值输入并且Y值确定所述检验个体的诊断结果。

还可以单独地应用分类器进行组合鉴定。例如，如果选择了应用三个生物标记的分类器(例如，具有ROC曲线下面积得分为0.9，这表明高敏感性和高特异性)，那么可以测量检验个体中有关所述三个生物标记每一个的产物丰度并将所述三个生物标记每一个的丰度测量值与一个或多个个体进行比较，所述个体来自个体具有膀胱癌和/或早期膀胱癌的对照群体、来自个体没有膀胱癌的对照群体，从而确定所检验个体的表达模式是与膀胱癌和/或早期膀胱癌的对照更相似还是与没有膀胱癌的对照更相似。在一个优选实施方案中，例如，通过测量在检验个体中所鉴定的生物标记组合的RNA和/或蛋白质产物的水平并输入所述分类器，就可以应用产生的分类器来诊断个体。在一个实施方案中，应用相同的方法产生表达数据，用所述表达数据产生用来诊断检验个体的数学模型。

5.13应用组合鉴定来监测膀胱癌的消退

本发明教导鉴定可用生物标记组合和有关那些组合的分类器用于诊断个体具有早期阶段膀胱癌或者没有膀胱癌目的的能力。本领域技术人员应理解，与没有膀胱癌的情形相比较用来诊断早期阶段膀胱癌的组合和分类器还可用于确定个体在关于他们膀胱癌的严重性方面是否有消退，例如对治疗的反应。例如，应用一种或多种组合鉴定，在治疗之前可以将个体鉴定为具有早期阶段膀胱癌。在治疗之后，可以再次检验个体以确定所述个体是否仍具有早期阶段膀胱癌。如果个体能够不再被鉴定为治疗前阶段的话，这本身可以表明治疗是有效的。此外，治疗可以导致膀胱癌阶段的消退，这使得现在诊断个体为不具有膀胱癌。

5.14应用多核苷酸测量本发明生物标记的产物

依照测量本发明生物标记RNA产物表达的手段，可以应用下述的一项或多项，按照本领域技术人员的理解，结合一种或多种方法测量本发明样品中RNA的表达：寡核苷酸、cDNA、DNA、RNA、PCR产物、合成DNA、合成RNA或者天然的修饰核苷酸的其它组合，其特异性杂交至本发明生物标记的一种或多种RNA产物。在另一具体实施方案中，应用寡核苷酸、cDNA、DNA、RNA、PCR产物、合成DNA、合成RNA或者天然的修饰核苷酸的寡核苷酸的其它组合，其特异性杂交至本发明生物标记的一种或多种RNA产物。在一个优选实施方案中，应用寡核苷酸、cDNA、DNA、RNA、PCR产物、合成DNA、合成RNA或者天然的核苷酸经修饰的寡核苷酸的其它组合，其既特异性地又选择性地杂交至本发明生物标记的一种或多种RNA产物。

5.15测量本发明生物标记之RNA产物的技术

阵列杂交

在本发明的一个实施方案中，可以应用用来测量本发明RNA产物的多核苷酸作为与支持物稳定结合的核酸成员，在本发明一个方面中所述支持物包括阵列。核酸成员的长度范围可以为8-1000个核苷酸长并选择对于本发明生物标记之RNA产物具有特异性的核酸成员。在一个实施方案中，这些成员对本发明生物标记的RNA产物具有特异性和/或选择性。仍在另一实施方案中，这些成员对本发明生物标记的mRNA产物具有特异性和/或选择性。在一个优选实施方案中，这些成员对本发明生物标记的mRNA产物的所有变体具有特异性和/或选择性。仍在另一优选实施方案中，这些成员对本发明生物标记的mRNA变体的一种或多种变体具有特异性和/或选择性。所述核酸成员可以是单链的或者双链的，和/或可以是寡核苷酸或者从cDNA扩增的PCR片段。优选地，寡核苷酸约20-30个核苷酸长。EST优选100-600个核苷酸长。本领域技术人员应当理解，可以利用本发明生物标记的部分表达区域作为阵列上的探针。更具体地，互补于本发明基因和/或源于本发明基因的cDNA或者EST的寡核苷酸是可用的。在本发明的一些实施方案中，能够特异性地和/或选择性地杂交至本发明生物标记之RNA产物的多核苷酸可以被点在用于本发明的阵列之上。对基于寡核苷酸的阵列而言，选择对应于感兴趣基因的可用作探针的寡核苷酸在本领域中是众所周知的。更具体地，选择允许杂交靶核酸的区域是很重要的。诸如寡核苷酸的Tm、GC百分含量、二级结构的程度和核酸长度的一些因素是重要的因素。见例如美国专利No.6,551,784。在一个实施方案中，所述阵列由10-1000个核苷酸长的能够杂交至本发明各个生物标记的一种或多种产物的序列组成，所述的本发明生物标记公开于表1、表2、表4、表5和表7和/或表10和/或表11，包括那些在表3和表6和/或表12中指出的特异性RNA和/或蛋白质产物。

用本发明阵列杂交并分析的靶核酸样品优选来自人软骨、血或者滑液。关于该过程的限制在于用作靶核酸样品的RNA可用量。优选地，对于本发明的应用而言，需要获得至少1微克的总RNA。与PCR和针对mRNA亚种的引物(例如，多聚T寡核苷酸)结合，可以应用较少量的RNA。

靶标的制备

本发明阵列的靶标优选源于人血和/或人膀胱组织。

靶核酸是能够结合核酸探针或者核酸成员的互补序列，所述结合是通过一种或多种类型的化学键，通常通过互补碱基配对，通常通过氢键结合。

如本文所用的，“源于mRNA转录物的核酸”或者“对应于mRNA的核酸”是指完全以合成的mRNA转录物或者其亚序列作为模板的核酸。因此，从mRNA逆转录的cDNA、从所述cDNA转录的RNA、从所述cDNA扩增的DNA、从所述扩增的DNA转录的RNA等都源于或者对应于所述mRNA转录物，并且对这些衍生或者对应产物的检测指示或者按比例指示样品中所述原始转录物的存在和/或丰度。因此，合适的靶核酸样品包括但不限于一个或多个基因的mRNA转录物、从所述mRNA逆转录的cDNA、从所述cDNA转录的cRNA、从一个或多个基因扩增的DNA、从扩增的DNA转录的RNA等。本文中应用的核酸靶标优选源于人软骨、血或者滑液。优选地，所述靶标是源于人软骨、血或者滑液提取物的核酸。核酸可以是应用本领域公知的方法(例如，逆转录或者PCR)从人软骨、血或者滑液mRNA提取物合成的单链或者双链的DNA、RNA或者DNA-RNA杂交体。

在最简单的实施方案中，这样的核酸靶标包括总mRNA或者对应于mRNA(例如，cDNA)的核酸样品，所述mRNA分离自组织或者血样品。在另一实施方案中，应用例如酸胍-苯酚-氯仿提取方法从指定的样品中分离总mRNA，并且通过寡聚dT柱色谱或者通过应用(dT)n磁珠分离多聚A+mRNA(见，例如，Sambrook et al.，Molecular Cloning：A LaboratoryManual(2nd ed.)，Vols.1-3，Cold Spring Harbor Laboratory，(1989)，或Current Protocols in Molecular Biology，F.Ausubel et al.，ed.GreenePublishing and Wiley-Interscience，New York(1987))。在一个优选实施方案中，应用

试剂(GIBCO/BRL，Invitrogen Life Technologies，Cat.No.15596)提取总RNA。通过在260/280nm处的吸光度和琼脂糖凝胶电泳接着紫外光下检查来评估RNA的纯度和完整性。

在一些实施方案中，在杂交之前扩增靶核酸样品是理想的，例如在应用有限量的组织时。本领域的技术人员应当理解，无论应用何种扩增方法，如果定量结果是理想的，必须注意应用维持或者控制所扩增核酸的相对频率的方法。“定量”扩增方法对于本领域技术人员是众所周知的。例如，定量PCR包括应用相同的引物同时共扩增已知量的对照序列。这提供了内部标准，其可被用来校准PCR反应。随后高密度阵列可以包括对所述内部标准有特异性的探针，所述内标用于定量所扩增的核酸。在PCRProtocols，A Guide to Methods and Applications，Innis et al.，Academic Press，Inc.N.Y.，(1990)中提供了定量PCR的详细方案。

其它合适的扩增方法包括但不限于聚合酶链式反应(PCR)(Innis，etal.，PCR Protocols.A Guide to Methods and Application.Academic Press，Inc.San Diego，(1990))、连接酶链式反应(LCR)(见Wu and Wallace，1989，Genomics，4：560；Landegren，et al.，1988，Science，241：1077以及Barringer，et al.，1990，Gene，89：117，transcription amplification(Kwoh，et al.，1989，Proc.Natl.Acad.Sci USA，86：1173)和自主序列复制(Guatelli，et al.，1990，Proc.Nat.Acad.Sci.USA，87：1874)。

在一个特别优选的实施方案中，用逆转录酶和由寡聚dT和编码噬菌体T7启动子的序列组成的引物逆转录靶核酸样品mRNA，从而提供单链DNA模板。应用DNA聚合酶聚合第二DNA链。合成双链cDNA之后，加入T7RNA聚合酶并且从所述cDNA模板转录RNA。对各个单一cDNA模板的连续几轮转录产生扩增的RNA。体外转录方法对于本领域的技术人员是众所周知的(见，例如，上述的Sambrook)并且该特定方法在VanGelder，et al.，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87：1663-1667中有详细的描述，其表明按照此方法的体外扩增保持了各种RNA转录物的相对频率。此外，Eberwine et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：3010-3014提供了一种方案，其应用两轮经由体外转录的扩增从而实现最初原材料大于10⁶倍的扩增，由此，即使在生物学样品是有限的情形中也允许表达检测。

标记靶标或者核酸探针

可以标记靶标或者探针。

在本发明中可以应用任何可分析检测的标记，该标记被附着于或者整合于分子。可分析检测标记是指经分析被检测和定量的任何分子、部分或者原子。

适于本发明应用的可检测标记包括可通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学、电学、光学或者化学手段检测的任何组合物。本发明可用的标记包括用标记的链亲合素偶联物染色的生物素、磁珠(例如，Dynabeads^TM)、荧光染料(例如，荧光素、得克萨斯红(texas red)、罗丹明、绿色荧光蛋白等)、放射性标记(例如，³H、¹²⁵I、³⁵S、¹⁴C或者³²P)、酶(例如，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶和在ELISA中常用的其它酶)和发色标记比如胶体金或者有色玻璃或者塑料(例如，聚苯乙烯、聚丙烯、胶乳等)珠。一些专利教导了这类标记的应用，包括美国专利No.3,817,837、3,850,752、3,939,350、3,996,345、4,277,437、4,275,149和4,366,241，其全部通过参考并入本文。

检测所述标记的手段对于本领域技术人员是众所周知的。因此，例如，可以应用照相胶片或者闪烁记数器检测放射性际记，可以应用光电探测器检测发射光来检测荧光标记。通常通过提供酶底物和检测由酶对底物作用产生的反应产物来检测酶标记，以及通过简单地肉眼观察有色标记来检测发色标记。

可以通过许多本领域技术人员众所周知的手段来掺入所述标记。然而，在一个优选实施方案中，在制备样品核酸的扩增步骤期间同时掺入所述标记。因此，例如，应用标记引物或者标记核苷酸的聚合酶链式反应(PCR)将提供标记的扩增产物。在一个优选实施方案中，如上所述，应用标记核苷酸(例如，荧光素标记的UTP和/或CTP)的转录扩增向转录的核酸中掺入标记。

作为替代，可以向原始核酸样品(例如，mRNA、多聚A mRNA、cDNA等)直接添加标记或者在扩增完成之后直接向扩增产物添加。向核酸附着标记的手段对于本领域的技术人员是众所周知的，包括例如，切口平移或者末端标记(例如用标记的RNA)，其是通过激酶对核酸作用以及随后附着(连接)核酸连接物，该连接物将样品核酸连接至标记(例如，荧光团)。

在一个优选实施方案中，通过花青染料(例如，Cy-3/Cy-5dUTP，Cy-3/Cy-5dCTP(Amersham Pharmacia))或者alexa染料(Khan，et al.，1998，Cancer Res.58：5009-5013)来实施荧光团修饰。

在一个优选实施方案中，用不同的荧光染料对用于比较的两个靶样品进行标记，所述荧光染料产生可辨别的检测信号，例如，用Cy5标记从正常软骨制得的靶标和用Cy3标记从轻度骨关节炎软骨制得的靶标。同时将不同标记的靶样品与相同的微阵列杂交。在一个优选实施方案中，应用本领域公知的方法纯化标记的靶标，例如通过乙醇纯化或者柱纯化。

在一个优选实施方案中，所述靶标将包括一种或多种对照分子，所述分子杂交至微阵列上的对照探针以使从所述微阵列产生的信号标准化。优选地，标记的标准化靶标是核酸序列，其完全互补于对照寡核苷酸，所述对照寡核苷酸被点加在如上所述的微阵列上。从杂交后的标准化对照获得的信号提供在有关杂交条件、标记强度、“读取”效率以及可引起完全杂交信号在阵列之间变化的其它因素方面变化的对照。在一个优选实施方案中，从阵列中所有其它探针读取的信号(例如，荧光强度)除以来自所述对照探针的信号(例如，荧光强度)，由此使测量值标准化。

选择优选的标准化靶标以反映存在于样品中的其它靶标的平均长度，然而，对它们的选择涵盖了长度范围。还可以选择标准化的对照以反映阵列中其它探针的(平均)碱基组成，然而，在一个优选实施方案中，使用仅一个或几个标准化探针并且对它们进行选择以使得充分杂交(即，没有二级结构和没有自身杂交)并且不匹配任何靶分子。

标准化探针被定位于阵列中的任何位置或者整个阵列的多个位置以控制杂交效率的空间变化。在一个优选实施方案中，标准化对照被定位于阵列的角或者边缘以及中间。

杂交条件

核酸杂交包括在探针或者靶核酸成员与其互补靶标通过互补碱基配对可以形成稳定杂交双链体的条件下提供变性探针或者靶核酸成员和靶核酸。随后洗掉未形成杂交双链体的核酸，留下待检测的杂交核酸，通常通过附着的可检测标记进行检测。一般公认通过增加温度或者降低含核酸缓冲液的盐浓度使核酸变性。在低严谨条件下(例如，低温和/或高盐)将形成杂交双链体(例如，DNA:DNA、RNA:RNA或者RNA:DNA)，甚至在退火的序列不是完全互补的情形。因此，在较低严谨性条件下杂交特异性降低。相反地，在较高严谨性条件下(例如，较高温度或者较低盐浓度)成功的杂交要求较少的错配。

本发明规定杂交条件，包括Dig杂交混合物(Boehringer)；或者基于甲酰胺的杂交溶液，例如在Ausubel et al.，见上和Sambrook et al.，见上中描述的。

优化杂交条件的方法对于本领域技术人员是众所周知的(见，例如，Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology，Vol.24：Hybridization With Nucleic acid Probes，P.Tijssen，ed.Elsevier，N.Y.，(1993))。

杂交之后，从支持物表面去除未杂交的标记或者未标记核酸，可方便地应用清洗，由此在衬底表面上产生杂交靶核酸的模式。许多种清洗溶液对于本领域技术人员是公知的并且可以被使用。可以在各种方式中用基于所检验核酸的特定标记而选择的特定检测方式来检测或者观察所得到的标记的、杂交的寡核苷酸和/或核酸的杂交模式，其中典型的检测手段包括闪烁计数、放射自显影、荧光测量、量热器测量、光发射测量等。

图像获取和数据分析

在杂交和任何清洗步骤和/或随后的处理之后，如上所述，检测所获得的杂交模式。在检测或者观察杂交模式中，不但检测而且定量标记的强度或者信号值，其表示将测量来自杂交各个点的信号并将其与对应由已知量末端标记靶核酸发出信号的单位值进行比较，从而获得以杂交模式杂交于阵列上特定点的各个末端标记靶标拷贝数的计数或者绝对值。

分析收集自杂交阵列的数据的方法在本领域中是众所周知的。例如，在杂交检测涉及荧光标记的情形中，数据分析可以包括以下步骤：确定荧光强度，其是来自所收集数据的衬底位置的函数，去除异常值(即，从规定的统计学分布偏离的数据)以及计算来自余下数据的所检验核酸的相对结合亲和性。将得到的数据显示为具有各个区域强度的图像，所述强度根据结合的寡核苷酸和/或核酸与所检验核酸之间的结合亲和性而变化。

应用以下检测方案来同时分析待比较的两个软骨样品，其中用不同的荧光染料标记各个样品。

扫描微阵列各个成分的第一荧光颜色。各个阵列成分的荧光强度与样品中所述基因的表达水平成比例。

对第二荧光标记重复实施扫描。两个荧光强度的比率提供对两个组织样品中相对基因表达水平的非常准确和定量的测量。

在一个优选实施方案中，从图像中确定固定的靶核酸序列的荧光强度，所述图像是用装备有激光激发源和适用于Cy3和Cy5荧光剂的干涉滤光片的常规共焦显微镜所采集的。对每种荧光剂实施单独的扫描，其中每个象素分辨率为225μm²以及65,536级灰阶。分割图像来鉴定杂交区域、标准化两个荧光剂图像之间的强度以及计算关于每个靶标的标准化的平均荧光值是按照Khan，et al.，1998，Cancer Res.58：5009-5013.Chen，et al.，1997，Biomed.Optics 2：364-374的描述。应用图像之间的标准化来调整在用两个不同荧光剂进行标记并对其进行检测中的不同效率。通过平衡点加在阵列上的一组内部对照基因的一个信号强度比值来实现该目标。

在另一优选实施方案中，在Cy3和Cy5通道中扫描阵列并保存为单独的16位TIFF图像。合并所述图像并应用软件进行分析，其包括网格化过程以捕获来自阵列上各个点的杂交强度数据。收集各个点的荧光强度和减去背景的杂交强度并且计算测量的Cy5对Cy3平均强度的比率。应用线性回归方法进行标准化并假定测量的Cy5对Cy3强度的散布图的斜率应为1。计算平均比率并用来重定数据的比例以及将所述斜率调整为一。应用不等于1的表达比率作为差异性基因表达的指标。

在一个特别优选的实施方案中，其中期望定量样品中一种或多种核酸序列的转录水平(以及由此的表达)，所述靶核酸样品是一种在其中一个或多个基因的mRNA转录物的浓度或者源于所述mRNA转录物的核酸浓度与所述基因的转录水平(以及由此的表达水平)成比例的核酸样品。相似地，杂交信号强度与杂交的核酸量成比例是优选的。尽管相对严谨的比例性(例如，转录比率加倍导致样品核酸库中的mRNA转录物加倍以及杂交信号加倍)是优选的，技术人员应认识到，所述比例性可以是更加宽松的以及甚至是非线性的并且仍提供有意义的结果。因此，例如，在靶mRNA浓度5倍的差异导致杂交强度3-6倍差异的情形中，测定对于大部分目标是足够的。在要求较精确的定量情形中，运行适当的对照以修正在如本文所述的样品制备以及杂交中引入的变化。此外，按照本领域技术人员众所周知的方法，应用连续稀释的“标准”靶mRNA来制定标准曲线。当然，在希望对转录物的存在或者缺少进行简单检测的情形中，不需要复杂的对照或者校准。

例如，如果在杂交后阵列上的核酸成员未被标记，这表明在任一样品中未表达包括所述核酸成员在内的基因。如果核酸成员被单一染料标记，它表明只在一个样品中表达了标记的基因。阵列中的核酸成员被两种染料标记就表明在两种样品中表达了所述基因。甚至在每个细胞中表达了一次的基因被检测到(100,000分之一的敏感性)。在两个待比较的样品中，表达强度的差异是差异性表达的指标，在所述的两个样品中所述强度的比率不等于1.0，优选小于0.7或者大于1.2，更优选小于0.5或者大于1.5。

RT-PCR

在本发明的一个方面中，可以通过应用逆转录(RT)并结合聚合酶链式反应(PCR)扩增来自样品的生物标记之RNA产物来测量本发明生物标记RNA产物的表达水平。根据本发明的一个实施方案，如本领域技术人员所理解的，RT可以是定量的。

来自样品的总RNA或者mRNA被用作模板并且应用本发明生物标记转录部分之特异性引物来启动逆转录。将RNA逆转录成cDNA的方法是众所周知的并且在Sambrook et al.，1989见上中有描述。可以利用可从商业获得的软件(例如，Primer Designer 1.0，Scientific Software等)来实施对引物的设计，所述软件应用本领域众所周知的和标准的方法。

应用设计和选择本发明涵盖的引物方案的一个实施方案描述了涉及设计用于实时PCR和SYBR-Green测定的引物的原则和步骤。优选地，该方案使用国家生物技术信息中心(The National Center forBiotechnology Information)(NCBI)的搜索引擎并应用PrimerQuest引物设计软件。PrimerQuest是基于网络的软件，其由Integrated DNATechnologies，Inc.(IDT)所开发。该软件是基于Whitehead Institute forBiomedical Research开发的Primer3。

在一个实施方案中，设计本发明涵盖的引物时所用准则是产物或者扩增子的长度为100-150个碱基、最佳Tm优选为60℃(可接受的范围为58-62℃)和最优选的GC含量为50％(45-55％的优选范围也是可接受)。有帮助的是，避免每个引物3’端的3个碱基序列互补于自身或者另一引物，从而降低“引物-二聚体”形成。还有帮助的是，避免引物序列内和引物对之间的互补序列。优选地，避免在3’端连续的3个或多个G或者C，以及单一碱基重复大于3个碱基。优选避免G/C和A/T富集结构域的不均衡分布，并且在一个具体实施方案中，所述引物在3’端具有G或者C。有帮助的是，引物的3’端不是T，因为3’端为T的引物对错配有较大的耐受性。还有帮助的是，避免错配，尤其是在3’端的错配；并且在3’端布置至少7个独特的碱基是有益的。还可以应用评分方案选择可用的引物，从而帮助避免所选引物的自身互补。因此例如，指定配对的得分为+1，错配为-1，单pb缺口为-2并且接下来选择得分尽可能低的引物，但是在一个实施方案中，引物的得分小于5。优选地，避免基因组扩增，并且同样地，优选任一引物应当跨越内含子。优选地，应当设计引物以使得一半的或者至少7个引物的核苷酸杂交至一个外显子的3’端并且余下的杂交至相邻外显子的5’端。除了在一个进一步选择的实施方案中，设计的引物跨外显子-外显子连接子，从而区分或者防止基因组序列的扩增。在另一替代性实施方案中，设计引物从而避免已知的SNP。

可以应用引物软件程序来帮助设计和选择本发明涵盖的引物，比如“引物搜寻软件(The Primer Quest software)”，其可以通过以下网站链接获得：biotools.idtdna.com/primerquest/。

当搜索和更新来自人类基因组数据库(Human Genome Database)的序列信息用于生物标记引物设计时，以下网站链接是可用的：1)NCBILocusLink Homepage：www.ncbi.nlm.nih.gov/LocusLink/，和2)EnsembleHuman Genome Browser：www.ensembl.org/Homo sapiens，优选应用相关的生物标记信息，比如基因或者序列说明、登记或者序列ID、基因符号、RefSeq#和/或UniGene#。

一旦获得了正确的靶DNA序列，将从其产生引物，最好注意来自LocusLink链接或者来自Ensembl Gene Browser有关感兴趣基因的外显子-内含子边界。优化引物设计的一个优选手段是应用PrimerQuest软件中BASIC、STANDARD和ADVANCE的三个选项。

优选应用PrimerQuest软件的BASIC功能，在Sequence Information下，首先将引物的名称输入[Name]框以及将靶序列剪切并粘贴至[Sequence]框，应用实时PCR参数设置值有选择地设计PCR引物。在标准序列设计条件下，优选50作为引物设置返回数(Number of Primer Set to Return)以及用人作为错引发库(Mispriming Library)来使用。在一个实施方案中，有帮助的是，在标准引物设计高级功能(Advanced Function ofStandard Primer Design)下输入以下选项：最佳引物大小：20(nt)、最佳引物Tm：60(℃)、最佳引物GC％：50(％)、产物大小范围：100-150。此外，在标准功能下，优选可以微调以下选项：引物选择、靶标、排除区域(ExcludedRegions)、包含区域(Included regions)和起始密码子位置。

一旦输入或者选择了所需的参数，搜索可能引物选择的PrimerQuest被启动，产生对潜在正向和反向引物的详细说明，包括实际的序列、其起始位置、长度、Tm、GC％、产物大小罚值和预测二级结构的工具-mFold。以下两个标准是最有用的：优选的ΔG应当大于-3.0kcal.mol^-1，以及优选的Tm应当小于50℃并不大于55℃。解释散点图较困难一些，但是一般最好不选择在散点图中产生长对角线的黑点，因为它非常可能形成发夹结构。

优选地，引物对于靶序列应当是唯一的并且不匹配假基因，其可以通过应用[BLAST]检查引物的特异性来证实。优选地，可以应用由IDTBioTools提供的OligoAnalyzer 3.0检查形成自身二聚体和异二聚体的可能性。优选地，可以应用由IDT BioTools或者Primer3提供的有关选择最佳可能引物对的信息和指南，所述引物对将用于本发明生物标记的研究。优选的是，只有按照解链曲线分析和琼脂糖凝胶电泳分离确定的，产生单一扩增子并且其大小符合预期产物的那些引物被用在所述生物标记的研究中。

以下相关的参考文献通过参考并入本文：Dieffenbach，C.W.，Lowe，T.M.J.，Dveksler，G.S.(1995)General Concepts for PCR Primer Design.In：PCR Primer，A Laboratory Manual(Eds.Dieffenbach，C.W，and Dveksler，G.S.)Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York，133-155，Innis，M.A.，and Gelfand，D.H.(1990)Optimization of PCRs.In：PCR protocols，A Guide to Methods and Applications(Eds.Innis，M.A.，Gelfand，D.H.，Sninsky，J.J.，and White，TJ.)Academic Press，San Diego，3-12，Sharrocks，A.D.(1994)The design of primers for PCR.In：PCR Technology，CurrentInnovations(Eds.Griffin，H.G.，and Griffin，A.M，Ed.)CRC Press，London，5-11。

随后应用逆转录产物作为PCR的模板。

PCR提供快速扩增特定核酸序列的方法，该方法应用由热稳定的、依赖DNA的DNA聚合酶催化的多循环DNA复制来扩增感兴趣的靶序列。PCR要求存在有待扩增的核酸、位于待扩增序列旁侧的两个单链寡核苷酸引物、DNA聚合酶、三磷酸脱氧核糖核苷酸、缓冲液和盐。

PCR方法在本领域中是众所周知的。按照Mullis and Faloona，1987，Methods Enzymol.，155：335(其通过参考并入本文)中的描述实施PCR。应用模板DNA(至少1fg，更可用1-1000ng)和至少25pmol的寡核苷酸引物来实施PCR。典型的反应混合物包括：2μl的DNA、25pmol的寡核苷酸引物、2.5μl的10H PCR缓冲液1(Perkin-Elmer，Foster City，CA)、0.4μl的1.25μM dNTP、0.15μl(或者2.5单位)的Taq DNA聚合酶(Perkin-Elmer，Foster City，CA)和去离子水，总体积为25μl。覆盖矿物油并且应用可编程热循环仪实施PCR。

按照实际的严谨性要求调整PCR循环各步骤的时长和温度，以及循环数。按照所预期的引物与模板退火的效率以及可耐受的错配程度来确定退火温度和时间选择。本领域的普通技术人员具有良好的优化引物退火条件严谨性的能力并且在其知识范围内。应用的退火温度为30℃-72℃。模板分子的初始变性发生在92℃-99℃，大约4分钟，接着为由变性(94-99℃，15秒至1分钟)、退火(根据以上论述确定温度，1-2分钟)和延伸(72℃，1分钟)组成的20-40个循环。最终的延伸步骤通常在72℃实施4分钟，并且之后可以为4℃条件下的不定时(0-24小时)步骤。

还可以实施QRT-PCR(其特征在于定量)以提供对基因表达水平的定量测量。在QRT-PCR中，可以在两个步骤中实施逆转录和PCR，或者逆转录结合PCR可以同时被实施。对于具有可从商业获得试剂盒(比如Taqman(Perkin Elmer，Foster City，CA))的这些技术之一，用转录特异性反义探针来实施。该探针对PCR产物(例如，源于基因的核酸片段)有特异性并且用复合于寡核苷酸5’端的淬灭剂和荧光报告探针制备所述探针。将不同的荧光标记附着于不同的报告分子，这允许在一个反应中测量两种产物。当Taq DNA聚合酶被激活时，该酶利用其5’至3’的外切酶活性将结合于模板的探针上的荧光报告分子切掉。在缺少淬灭剂的情形中，所述报告分子是荧光剂。报告分子中颜色的变化与各个特定产物的量成比例并通过荧光计来测量，因此，测量各个颜色的量并由此定量PCR产物。在96孔板中实施PCR反应，以使得同时处理和测量源于许多个体的样品。Taqman***具有另外的优点，其不需要凝胶电泳并且当应用标准曲线时允许定量。

可用于不用电泳定量检测PCR产物的第二技术应用嵌入(intercolating)染料，比如可从商业获得的QuantiTect SYBR绿染料(SYBR Green)PCR(Qiagen，Valencia California)。应用作为荧光标记的SYBR绿染料(其在PCR阶段期间被掺入PCR产物)实施RT-PCR并产生与PCR产物的量成比例的荧光。

在RNA逆转录之后，可以应用Taqman和QuantiTect SYBR***。可以在与PCR步骤相同的反应混合物中实施逆转录(一步方案)或者在用PCR扩增之前，先实施逆转录(二步方案)。

此外，对于定量测量mRNA表达产物的其它***是公知的，包括Molecular

其应用具有荧光分子和淬灭分子的探针，所述探针能够形成发夹结构，使得在发夹形式中，荧光分子被淬灭，并且当杂交时，荧光的增加提供了对基因表达的定量测量。

可以使用应用TaqMan^TM、SybrGreen、Molecular

等的QRT-PCR来确定反应扩增的RNA水平的定量值。在一定的荧光阈值水平(至少在背景荧光水平之上)上测量荧光并确定达到所述阈值水平的循环(Ct值)。因此，Ct值是依赖浓度的PCR循环数，此时扩增产物(扩增子)的荧光在预设的阈值水平上。该阈值可以是荧光相对于背景变得可区别时的水平或者更优选反应指数扩增的水平。为了确定用于输入数学模型的值的目的，优选应用ΔCt。ΔCt是在被测量基因(即扩增的)和对照基因(有时被称为管家基因)的产物之间确定的Ct值变化量。如本领域技术人员所理解的，所述对照基因应该是表达水平不发生变化的基因。典型的对照基因是β-肌动蛋白或者GAPDH。

其它定量测量RNA表达的技术包括但不限于聚合酶链式反应、连接酶链式反应、Qβ复制酶(见，例如，国际申请No.PCT/US87/00880)、等温扩增方法(见，例如，Walker et al.(1992)PNAS 89：382-396)、链置换扩增反应(SDA)、修复链式反应、不对称定量PCR(见，例如，美国公开No.US200330134307A1)和多重微球珠测定(multiplex microspherebead assay)，其描述见于Fuja et al.，2004，Journal of Biotechnology108：193-205。

可以通过应用基于转录的扩增***(TAS)从样品扩增RNA来测量基因表达水平，所述***包括核酸序列扩增(NASBA)和3SR。见，例如，Kwoh et al(1989)PNAS USA 86：1173；国际公开No.WO 88/10315；和美国专利No.6,329,179。在NASBA中，可以应用常规的苯酚/氯仿抽提、热变性、裂解缓冲液处理和微型离心(minispin)柱分离DNA和RNA或者盐酸胍提取RNA来制备用于扩增的核酸。这些扩增技术涉及将具有靶特异性序列的引物退火。在聚合之后，用RNase H消化DNA/RNA杂交体，而对双链DNA分子再次进行热变性。在任一情形中，通过加入第二靶特异性引物使得单链DNA完全变成双链，接着是聚合。随后，通过聚合酶(比如T7或者SP6)作用，使双链DNA分子成倍地被转录。在等温循环反应中，将RNA逆转录成双链DNA，并且用聚合酶(比如T7或者SP6)转录一次。所得产物，无论是截短的还是完整的，都显示是靶特异性序列。

可以应用几种技术来分离扩增产物。例如，可以通过应用常规方法的琼脂糖、琼脂糖-丙烯酰胺或者聚丙稀酰胺凝胶电泳来分离扩增的产物，见Sambrook et al.，1989。还可以按照本发明使用不用电泳定量检测PCR产物的几种技术(见例如PCR Protocols，A Guide to Methods andApplications，Innis et al.，Academic Press，Inc.N.Y.，(1990))。例如，可以利用色谱技术实现分离。有许多种可以在本发明中应用的色谱法：吸附、分配、离子交换和分子筛、HPLC和许多应用它们的专门技术，包括柱、纸、薄层和气相色谱(Freifelder，Physical Biochemistry Applications toBiochemistry and Molecular Biology，2nd ed.，Wm.Freeman and Co.，NewYork，N.Y.，1982)。

分离方法的另一实例是通过共价标记寡核苷酸引物来实施的，所述引物被用在具有各种类型小分子配体的PCR反应中。在一个这样的分离中，在各个寡核苷酸上存在不同的配体。也许是抗体或者亲合素(如果配体是生物素)的分子，其特异性结合所述配体之一，应用所述分子包被板(比如96孔ELISA板)的表面。一经向如此制备的板的表面施加PCR反应，PCR产物便特异性结合于该表面。在清洗该板以去除未结合试剂之后，加入含有第二分子(其结合第一配体)的溶液。该第二分子与某种报告***相联系。如果PCR产物已产生的话，所述第二分子只结合所述的板，由此两种寡核苷酸引物被掺入PCR终产物中。随后在商用板读取器中检测和定量PCR产物的量，差不多同样地检测和定量ELISA反应。类似ELISA的***(比如在此描述的)已经由Raggio Italgene公司开发出来，其商品名为C-Track。

为了确认感兴趣的核酸序列的扩增必须观察扩增产物。一种典型的观察方法包括用溴化乙锭染色凝胶并在UV光下观察。作为替代，如果用放射性或者荧光标记核苷酸整体标记了扩增产物，随后可以让扩增产物暴光于x-射线胶片或者在适当的激发光谱下观察，之后分离。

在一个实施方案中，间接地实现观察。在分离扩增产物之后，使标记的核酸探针与感兴趣的所扩增核酸序列接触。优选地，探针优选与发色团偶联，但探针可以是放射性标记的。在另一实施方案中，探针与结合伴侣(比如抗体或者生物素)偶联，其中结合对的其它成员携带可检测部分。

在另一实施方案中，通过Southern印迹和应用标记探针的杂交实施检测。涉及Southern印迹的技术对于本领域技术人员是众所周知的并且可以在许多关于分子方案的标准书中找到。见Sambrook et al.，1989，见上。简单地，通过凝胶电泳分离扩增产物。随后让凝胶与膜(比如硝酸纤维素)接触，其允许转移核酸和非共价结合。其后，用发色团偶联探针孵育膜，该探针能够与靶扩增产物杂交。通过将膜暴光于x射线胶片或者离子发射装置来实施检测。

前述的一个实例在美国专利No.5,279,721中有描述，该专利通过参考并入本文，其公开了关于自动电泳和转移核酸的设备和方法。所述设备允许不用凝胶外部操作的电泳和印迹，并且非常理想地适于实施本发明的方法。

核酸酶保护测定

在本发明另一实施方案中，可以应用核酸酶保护测定(包括核糖核酸酶保护测定和S1核酸酶测定)检测和定量本发明生物标记的RNA产物。在核酸酶保护测定中，反义探针(具有，例如，放射性标记或者非同位素标记)在溶液中与RNA样品杂交。杂交后，单链的、未杂交的探针和RNA被核酸酶所降解。应用丙烯酰胺凝胶分离余下被保护的片段。通常，溶液杂交比基于膜的杂交更加有效，并且它能够容纳最高100μg的RNA样品，而相比较的印迹杂交最高为20-30μg。

核糖核酸酶保护测定是核酸酶保护测定的最常用类型，其要求应用RNA探针。在包含S1核酸酶的测定中只能应用寡核苷酸和其它单链的DNA探针。通常，单链的、反义探针必须与靶RNA完全同源以防止核酸酶切割探针：靶标杂交体。

Northern印迹

按照本领域普通技术人员公知的常规Northern杂交技术，还可以应用标准的Northern印迹测定来确定RNA转录物的大小，鉴定选择性剪接的RNA转录物和本发明生物标记RNA产物的相对量。在Northern印迹中，首先在变性条件下的琼脂糖凝胶中经由电泳按照大小分离RNA样品。随后将RNA转移至膜，与标记的探针交联和杂交。可以应用非同位素或者高比活性的放射性标记探针，包括随机引物的、切口平移的或者PCR产生的DNA探针、体外转录RNA探针和寡核苷酸。此外，可以应用只具有部分同源性的序列(例如，来自不同物种或者基因组DNA片段的cDNA，其也许包含外显子)作为探针。标记的探针(例如，放射性标记的cDNA，其包含所述DNA序列的全长的、单链DNA或者片段)可以是任意长度，最高至少20、至少30、至少50或者至少100个连续核苷酸长。可以通过任何本领域技术人员公知的许多不同方法标记所述探针。用于这些研究的最常见标记是放射性元素、酶、当暴露于紫外光时发射荧光的化学物以及其它的材料。有许多荧光材料是公知的并且可被用作标记。这些包括但不限于荧光素、罗丹明、金胺、Texas红、AMCA蓝和Lucifer黄。一种具体的检测材料是抗兔抗体，其在山羊中制备并且经异硫氰酸酯偶联荧光素。还可以用放射性元素或者用酶标记蛋白质。可以应用目前任何可用的计数方法来检测放射性标记。同位素的非限制性实例包括³H、¹⁴C、³²P、³⁵S、³⁶Cl、⁵¹Cr、⁵⁷Co、⁵⁸Co、⁵⁹Fe、⁹⁰Y、¹²⁵I、¹³¹I和¹⁸⁶Re。酶标记同样是可用的，并且可以用目前任何利用比色法、分光光度法、荧光分光光度法、电流分析法或者气体定量分析法的技术进行检测。通过与桥连分子(比如碳二亚胺、二异氰酸酯、戊二醛等)的反应将酶与所选的粒子偶联。可以利用本领域技术人员公知的任何酶。这类酶的实例包括但不限于过氧化物酶、β-D-半乳糖苷酶、脲酶、葡糖氧化酶加过氧化物酶和碱性磷酸酶。美国专利No.3,654,090、3,850,752和4,016,043被参考作为实例，它们公开了替代性的标记材料和方法。

5.16测量本发明生物标记蛋白质产物的技术

蛋白质产物

可以利用标准技术确定样品中存在的一种或多种感兴趣蛋白质的量。例如，可以施用应用了例如免疫测定法比如例如Western印迹、免疫沉淀反应接十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、免疫细胞化学等的标准技术来确定样品中存在的一种或多种感兴趣蛋白质的量。检测感兴趣蛋白质的优选试剂是能结合感兴趣蛋白质的抗体，优选具有可检测标记的抗体。

对于所述的检测方法，应用本领域技术人员众所周知的技术能够很容易地分离来自待分析样品的蛋白质。例如，蛋白质分离的方法可以按照Harlow和Lane(Harlow，E.and Lane，D.，Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York(1988))中的描述。

检测一种或多种感兴趣蛋白质的优选方法包括通过蛋白质-特异性抗体相互作用的那些检测法。例如，可以按照本文的描述利用针对感兴趣蛋白质的抗体。可以利用本领域技术人员众所周知的技术产生抗体。见，例如，本申请的第5.19.1节和美国公开No.20040018200的第5.2节有关产生所述抗体技术的更详细论述，其通过参考并入本文。简单地说，这样的抗体可以是多克隆的，或者更优选是单克隆的。例如，可以应用完整的抗体或者结合抗原的抗体片段(例如，Fab或者F(ab’)2)。优选地，抗体是人的或者人源化抗体。

例如，可以应用对感兴趣的蛋白质具有特异性的抗体或者抗体片段定量地或者定性地检测所述蛋白质的存在。这可以通过例如免疫荧光技术来实施。另外，可以以组织学方式(比如免疫荧光或者免疫电子显微镜)应用抗体(或者其片段)来原位检测感兴趣的蛋白质。可以通过从患者获取组织学样品(例如，活检标本)并向其施用针对蛋白质的标记抗体来实施原位检测。优选通过在生物学样品上覆盖标记的抗体(或片段)来施用所述抗体(或片段)。通过应用这样的步骤，不但能够确定感兴趣蛋白质的存在，还能够确定其在样品内的细胞(例如，软骨细胞和淋巴细胞)中的分布、存在。可以利用众所周知的各种组织学方法(比如染色方法)，从而实现所述的原位检测。

对感兴趣蛋白质的免疫测定通常包括用可检测的标记抗体孵育生物学样品，所述抗体能够鉴定感兴趣的蛋白质，以及通过许多本领域众所周知的任意技术来检测结合抗体。如以下更详细的论述，术语“标记的”可以表示将可检测物质通过例如偶联(即，物理连接)连接至抗体的抗体直接标记，并且还可以表示通过与另一被直接标记试剂之反应性的抗体间接标记。间接标记的实例包括应用荧光标记的第二抗体检测第一抗体。

例如，可以使生物学样品接触并固定于支持相或者载体比如硝酸纤维素，或者其它能够固定细胞、细胞颗粒或者可溶性蛋白质的支持物。随后可以用合适的缓冲液清洗所述支持相，接着用经可检测标记的指纹基因特异性抗体进行处理。随后可以用缓冲液第二次清洗支持相以去除未结合抗体。随后可以通过常规手段检测支持相上结合标记的量。

在蛋白质性剂的范畴内，“支持相或者载体”意指能够结合抗原或者抗体的任何支持物。众所周知的支持物或者载体包括玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、葡聚糖、尼龙、淀粉酶、天然的或者修饰的纤维素、聚丙烯酰胺、辉长岩和磁石。对于本发明的目的，所述载体特性可以在某种程度上是可溶的或者是不溶的。支持材料实质上可以具有任何可能的结构形式，只要偶联的分子能够结合抗原或者抗体即可。因此，支持物的构形可以是球形，比如珠形，或者圆柱形，比如试管的内表面，或者杆的外表面。作为替代，所述表面可以是平的，比如薄片、测试片等。优选的支持物包括聚苯乙烯珠。本领域的技术人员应知道另外许多合适的载体，用于结合抗体或者抗原，或者将能够用常规试验确认合适的载体。

特异性抗体可以被可检测标记的方式之一是将其与酶连接并用于酶免疫测定(EIA)(Voller，A.，“The Enzyme Linked Immunosorbent Assay(ELISA)”，1978，Diagnostic Horizons 2：1-7，Microbiological AssociatesQuarterly Publication，Walkersville，MD)；Voller，A.et al，1978，J.Clin.Pathol.31：507-520；Butler，J.E.，1981，Meth.Enzymol.73：482-523；Maggio，E.(ed.)，1980，Enzyme Immunoassay，CRC Press，Boca Raton，FL；Ishikawa，E.et al.，(eds.)，1981，Enzyme Immunoassay，Kgaku Shoin，Tokyo)。结合于抗体的酶将与适合的底物反应，优选生色底物，以这样的方式从而产生可被检测的化学部分，例如，通过分光光度法、荧光法或者视觉手段检测。可被用来可检测地标记抗体的酶包括但不限于苹果酸脱氢酶、葡萄球菌核酸酶、Δ-5-类固醇异构酶、酵母醇脱氢酶、α-甘油磷酸脱氢酶、丙糖磷酸异构酶、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、天门冬酰胺酶、葡糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、过氧化氢酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、葡糖淀粉酶和乙酰胆碱酯酶。可以用比色法完成所述检测，该方法使用酶的发色底物。还可以通过底物酶反应程度与类似制备标准的视觉比较来完成检测。

还可以应用另外许多免疫测定法的任何方法来完成检测。例如，利用放射性标记抗体或者抗体片段，能够通过应用放射性免疫测定(RIA)(见，例如，Weintraub，B.，Principles of Radioimmunoassays，SeventhTraining Course on Radioligand Assay Techniques，The Endocrine Society，March，1986，其通过参考并入本文)检测感兴趣的蛋白质。可以通过诸如应用γ粒子计数管或者闪烁计数器的手段或者通过放射自显影法检测放射性同位素(例如，¹²⁵I、¹³¹I、³⁵S或者³H)。

还能够用荧光化合物标记抗体。当荧光标记的抗体暴露于适当波长的光时，随后可以借助荧光来检测它的存在。在最常用的荧光标记化合物中有荧光素异硫氰酸酯、罗丹明、藻红蛋白、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、邻苯二甲醛和荧光胺。

还可以应用发射荧光的金属比如¹⁵²Eu或者其它镧系元素可检测地标记抗体。可以利用所述金属的螯合基(比如二乙烯三胺五乙酸(DTPA)或者乙二胺四乙酸(EDTA))将这些金属附着于抗体。

还可以将抗体与化学发光化合物偶联来可检测地标记所述抗体。随后通过检测在化学反应过程中产生的发光的存在来确定化学发光标记抗体的存在。尤其有用的化学发光标记化合物的实例是鲁米诺、异鲁米诺、theromatic acridinium ester(吖啶鎓酯)、咪唑、吖啶鎓酯盐(acridiniumsalt)和草酸酯。

同样地，可以应用生物发光化合物标记本发明的抗体。生物发光是一类在生物***中发现的化学发光，其中催化性蛋白质增加化学发光反应的效率。通过检测发光的存在来确定生物发光蛋白质的存在。对于标记来说，重要的生物发光化合物是荧光素、荧光素酶和水母素(aequorin)。

蛋白质阵列

可以将特异性和/或选择性结合本发明生物标记蛋白质产物的多肽固定在蛋白质阵列上。可以将蛋白质阵列用作诊断工具，例如，用来筛选存在本发明生物标记的多肽蛋白质产物的医学样品(比如膀胱组织和/或血)。所述蛋白质阵列还可以包括抗体以及其它配体，例如，它们结合由本发明生物标记编码的多肽。

例如，在De Wildt et al.，2000，Nature Biotech.18：989-994；Luekinget al.，1999，Anal.Biochem.270：103-111；Ge，2000，Nuc.Acids Res.28：e3；MacBeath and Schreiber，2000，Science 289：1760-1763；国际公开No.WO01/40803和WO 99/51773A1；和美国专利No.6,406,921中描述了产生多肽阵列的方法。例如，应用商用自动化装置，例如Genetic MicroSystems和Affymetrix(Santa Clara，California，USA)或者BioRobotics(Cambridge，UK)的装置以高速点加多肽的阵列。阵列的衬底可以是，例如，硝酸纤维素、塑料、玻璃，例如经表面改性的玻璃。所述阵列还可以包括多孔基质，例如丙烯酰胺、琼脂糖或者同类的聚合物。

例如，所述阵列可以是抗体阵列，例如，如De Wildt(见上)中所述。可以以阵列形式在滤膜上培养产生多肽配体的细胞。诱导多肽产生，并将表达的抗体固定在滤膜的细胞位置上。可以将有关阵列各个位置上结合程度的信息保存为特征文件(profile)，例如保存在计算机数据库中。

在一个实施方案中，所述阵列是蛋白质产物阵列，其包括任意量的、最多为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50个、所有或者任意本发明生物标记的组合。在另一实施方案中，阵列是蛋白质产物阵列，其基本由列于表1生物标记的任意量的、最多为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50个、所有或者任意生物标记组合而组成。在另一实施方案中，阵列是蛋白质产物阵列，其基本由列于表1生物标记的任意量的、最多为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50个、所有或者任意生物标记组合，包括在表3中所指的那些，以及表2任意量的、最多为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50个生物标记而组成，其中所述组合的至少一个生物标记是选自表1。在另一实施方案中，阵列是蛋白质产物阵列，其基本由列于表4生物标记的任意量的、最多为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50个、所有或者任意生物标记组合而组成。在另一实施方案中，阵列是蛋白质产物阵列，其基本由列于表4生物标记的任意量的、最多为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50个、所有或者任意生物标记组合，包括在表6中所指的那些，以及表5任意量的、最多为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50个生物标记而组成，其中所述组合的至少一个生物标记是选自表4。在另一实施方案中，阵列是蛋白质产物阵列，其基本由列于表7生物标记的任意量的、最多为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50个、所有或者任意生物标记组合而组成。

在本发明的一个方面中提供抗体或者其抗原结合片段，将其结合于阵列，该阵列选择性地结合本发明生物标记的蛋白质产物。

5.17蛋白质生产

可以应用标准重组核酸方法表达本发明的多肽或者抗体(例如，本发明生物标记的蛋白质产物)。通常上，将编码多肽的核酸序列克隆至核酸表达载体。当然，如果蛋白质包括多重多肽链，那么必须将每个链克隆至表达载体，例如，相同的或者不同的载体，其在相同的或者不同的细胞中被表达。如果蛋白质足够小，即，该蛋白质是小于50个氨基酸的肽，就可以应用自动有机合成方法合成所述蛋白质。从核酸表达载体表达出包含本发明生物标记5’区、3’区或者内部编码区的多肽，所述核酸表达载体仅包含对应本发明生物标记5’区、3’区或者内部编码区的那些核苷酸序列。生产抗体的方法，所述抗体针对本发明生物标记的蛋白质产物、或者针对由本发明生物标记之5’区、3’区或者内部编码区所编码的多肽。

用于表达多肽的表达载体除包含编码多肽或者其片段的区段以外，还可能包含调节序列，包括例如启动子，其被可操作地连接至感兴趣的核酸。有大量合适的载体和启动子对于本领域的技术人员是公知的并且可以商业产生本发明的重组构建体。以举例的方式提供以下载体。细菌的：pBs、phagescript、PsiX174、pBluescript SK、pBs KS、pNH8a、pNH16a、pNH18a、pNH46a(Stratagene，La Jolla，California，USA)；pTrc99A、pKK223-3、pKK233-3、pDR540和pRIT5(Pharmacia，Uppsala，Sweden)。真核生物的：pWLneo、pSV2cat、pOG44、PXTI、pSG(Stratagene)、pSVK3、pBPV、pMSG和pSVL(Pharmacia)。一个优选类别的优选文库是展示文库，其在下面进行描述。

可以应用本领域众所周知的方法构建载体，该载体包含本发明的多肽和适当的转录/翻译控制信号。这些方法包括体外重组DNA技术、合成技术和体内重组/遗传重组。例如见，在Sambrook&Russell，MolecularCloning：A Laboratory Manual，3^rd Edition，Cold Spring HarborLaboratory，N.Y.(2001)和Ausubel et al，Current Protocols in MolecularBiology(Greene Publishing Associates and Wiley Interscience，N.Y.(1989)中描述的技术。可以从应用CAT(氯霉素转移酶)载体的任何期望基因或者具有选择标记的其它载体选择启动子区。两个适合的载体是pKK232-8和pCM7。有特定名称的细菌启动子包括lacI、lacZ、T3、T7、gpt、λP和trc。真核生物启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸腺嘧啶核苷激酶启动子、SV40早期和晚期启动子、来自逆转录病毒的LTR启动子、小鼠金属硫蛋白-I启动子和各种本领域公知的组织特异性启动子。在一些具体的实施方案中，启动子是诱导型启动子。在另一些实施方案中，启动子是组成型启动子。仍在另一些实施方案中，启动子是组织特异性启动子。

通常上，重组表达载体将包括复制起点和允许转化宿主细胞的可选择标记，例如，大肠杆菌(E.coli)和酿酒酵母(S.cerevisiae)营养缺陷型标记(比如URA3、LEU2、HIS3和TRPl基因)的氨苄青霉素抗性基因，以及源于高表达基因指导下游结构序列转录的启动子。所述启动子可以是源于编码糖酵解酶(比如3-磷酸甘油酸激酶(PGK)、a-因子、酸性磷酸酶或者热休克蛋白以及其它)的操纵子。在适当时相中将本发明的多核苷酸与起始和终止序列以及优选地前导序列(其能够指导翻译的蛋白质分泌至细胞周质间隙或者细胞外介质)装配在一起。任选地，本发明的核酸可以编码融合蛋白质，该蛋白质包含N-末端识别肽，其赋予期望的特性，例如，使表达的重组载体稳定或者使其纯化简单化。通过将本发明的多核苷酸与适合的翻译起始和终止信号***任选地具有功能性启动子的可操作阅读相(operable reading phase)中来构建有用的细菌表达载体。所述载体将包含一种或多种可选择表型标记和复制起点，从而确保载体的保持，并且如果期望的话，提供在宿主内的扩增。适合用于转化的原核生物宿主包括大肠杆菌、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)和假单胞菌属(Pseudomonas)、链霉菌属(Streptomyces)和葡萄球菌(Staphylococcus)属内的各个种，而其它的原核生物宿主也可以作为选项。

作为代表性的但非限制性的实例，有用的细菌表达载体可以包含可选择标记和源于市场上可买到质粒的细菌复制起点，包括熟知的克隆载体pBR322(ATCC 37017)的遗传元件。所述的商业载体包括，例如，pKK223-3(Pharmacia Fine Chemicals，Uppsala，Sweden)和pGEM1(Promega，Madison，Wisconsin，USA)。

本发明提供经遗传改造以包含本发明多核苷酸的宿主。例如，所述宿主细胞可以包含本发明的核酸，其是应用公知的转化、转染或者感染方法引入宿主细胞的。本发明还提供经遗传改造以表达本发明多核苷酸的宿主细胞，其中所述多核苷酸经操作与宿主细胞异源的调节序列相连，所述调节序列驱动细胞中多核苷酸的表达。

本发明还提供含有本发明载体的宿主细胞，其中已经应用公知的转化、转染或者感染方法将核酸引入宿主细胞。宿主细胞可以是真核宿主细胞，比如哺乳动物细胞、低等真核宿主细胞，比如酵母细胞，或者可以是原核细胞，比如细菌细胞。例如，通过磷酸钙转染、DEAE、葡聚糖介导的转染或者电穿孔(Davis，L.et al.，Basic Methods in Molecular Biology(1986))可以实现将重组构建体引入宿主细胞。还可以使用无细胞翻译***，应用源于本发明DNA构建体的RNA产生所述的蛋白质。

可以应用任何宿主/载体***表达一种或多种列于表2的基因或者剪接变体。Sambrook et al.，in Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Second Edition，Cold Spring Harbor，New York(1989)描述了用于原核和真核宿主的合适克隆和表达载体，所述文献以整体通过参考并入本文。最优选的宿主细胞是不正常表达特定多肽的或者以低水平天然表达所述多肽的宿主细胞。

在一个具体实施方案中，改造宿主细胞以在可诱导调节元件控制下表达内源性基因，包括本发明的多核苷酸，在此情形中，可以通过同源重组置换内源性基因的调节序列。如本文所述，可以应用基因打靶，用分离自不同基因的调节序列或者由遗传工程方法合成的新的调节序列置换基因现有的调节区域。所述调节序列可以包括启动子、增强子、支架附着区、负调节元件、转录起始位点、调节蛋白质结合位点或者所述序列的组合。作为替代，影响产生的RNA或者蛋白质结构或者稳定性的序列可以被置换、去除、添加，或者另外通过打靶进行修饰，包括多聚腺苷酸信号、mRNA稳定性元件、剪接位点、用于增强或者改进蛋白质转运或者分泌特性的前导序列、或者其它改变或者改善蛋白质或者RNA分子功能或者稳定性的序列。

本发明的宿主还可以是酵母或者其它真菌。在酵母中，可以应用大量含有组成型或者诱导型启动子的载体。有关论述见Ausubel et al.(eds)，Current Protocols in Molecular Biology，Vol.2，Greene Publish.Assoc.&Wiley Interscience，Ch.13(1988)；Grant et al.，1987，“Expression andSecretion Vectors for Yeast”，Methods Enzymol.153：516-544；Glover，DNACloning，Vol.II，IRL Press，Wash.，D.C.，Ch.3(1986)；Bitter，1987，“Heterologous Gene Expression in Yeast”，Methods Enzymol.152：673-684；和Strathern et al.(eds)，The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces，Cold Spring Harbor Press，Vols.I and II(1982)。

潜在的合适酵母菌株包括酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)菌株、假丝酵母属(Candida)，或者能够表达异源性蛋白质的酵母菌株。潜在的合适细菌菌株包括大肠杆菌(Escherichia coli)、肠杆菌科(enterobacteriaceae)比如粘质沙雷氏菌(Serratia marescans)，杆状菌比如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)、假单胞菌属(Pseudomonads)或者能够表达异源蛋白质的任何细菌菌株。如果在酵母或者细菌中制备蛋白质，可能必须修饰所产生的蛋白质，例如通过对适当位点的磷酸化或者糖基化以获得功能性蛋白质。可以应用公知的化学或者酶学方法实现所述的共价附着。

可以利用各种哺乳动物细胞培养***来表达重组蛋白质。哺乳动物表达***的实例包括猴COS细胞诸如猴肾成纤维细胞的COS-7细胞系(见Gluzman，1981，Cell 23：175(1981)的描述)、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、人肾293细胞、人表皮A431细胞、人Colo205细胞、3T3细胞、CV-1细胞、正常二倍体细胞、源于体外原代组织培养的细胞株、原代外植体(primary explants)、HeLa细胞、小鼠L细胞、BHK、HL-60、U937、HaK、C127、3T3或者Jurkat细胞和其它能够表达相容载体的细胞系。哺乳动物表达载体将包含复制起点、适合的启动子以及还含有必须的核糖体结合位点、多聚腺苷酸化位点、剪接供体和受***点、转录终止序列和5’旁侧非转录序列。

可以通过任何常规方法破碎表达蛋白质的微生物细胞，包括冻融交替、声波处理、机械破裂或者应用细胞裂解剂。通常通过首先在细胞沉淀中提取，接着一步或多步盐析、水性离子交换或者体积排阻色谱步骤来分离在细菌培养中产生的重组多肽。在一些实施方案中，模板核酸还编码多肽标签，例如五或六组氨酸。

可以应用本领域熟知的技术分离重组蛋白质。例如，Scopes(ProteinPurification：Principles and Practice，Springer-Verlag，New York(1994))提供了许多纯化重组(和非重组)蛋白质的常规方法。所述方法包括，例如，离子交换色谱、体积排阻色谱、亲和色谱、选择性沉淀、透析和疏水作用色谱。

本领域普通技术人员对本文描述的技术方案所作的改变、变型和其它实施不脱离本发明的精神和范围。

提供以下实施例，以使本文描述的发明得到更加全面的理解。应当理解的是，这些实施例仅用于举例说明的目的，并且不能以任何方式将其解释为对本发明的限制。

5.18鉴定用于预防、治疗、控制或者缓解膀胱癌或者其症状的化合物的方 法

5.18.1鉴定调节生物标记表达或者活性的化合物的方法

本发明提供鉴定化合物的方法，该化合物结合本发明生物标记之产物。本发明还提供鉴定化合物的方法，该化合物调节本发明生物标记之产物的表达和/或活性。经由这些方法鉴定的化合物可用于研发一种或多种研究膀胱癌的动物模型。此外，经由这些方法鉴定的化合物可在开发用于预防、治疗、控制和/或改善骨关节炎或其症状的预防性和治疗性组合物中被用作先导化合物。所述方法是非常有用的，因为测试潜在的体内预防剂和治疗剂所涉及的努力和巨大花费被有效地集中于通过本文描述的体外和离体方法鉴定的那些化合物。

本发明提供鉴定待检验化合物的方法，其中检验所述化合物预防、治疗、控制或者改善膀胱癌或者其症状的能力，所述方法包括以下各项：(a)将表达本发明一种或多种生物标记的蛋白质产物或其片段、或者表达本发明一种或多种生物标记的RNA产物或其片段的细胞与试验化合物接触；和(b)确定所述试验化合物结合所述蛋白质产物、蛋白质片段、RNA产物或RNA部分(RNA portion)的能力，由此如果化合物结合所述蛋白质产物、蛋白质片段、RNA产物、RNA部分，那么待检验化合物预防、治疗、控制或者改善膀胱癌或其症状的能力就得到确认。例如，所述细胞可以是酵母细胞或者哺乳动物来源的细胞。例如，通过将所述试验化合物与放射性同位素或者酶标偶联，使得可以通过检测偶联物中的标记化合物来确定所述试验化合物与所述蛋白质产物、蛋白质片段、RNA产物或者RNA部分的结合，由此可以实现对所述试验化合物结合所述蛋白质产物、蛋白质片段、RNA产物或者RNA部分的能力的确定。例如，可以用¹²⁵I、³⁵S、¹⁴C或者³H直接地或者间接地标记试验化合物，并通过直接计数放射性发射或者通过闪烁计数来检测放射性同位素。作为替代，可以用例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或者荧光素酶酶促标记试验化合物，并通过确定适合底物转化为产物来检测酶标记物。在一个具体实施方案中，测定包括，将表达本发明一种或多种生物标记的蛋白质产物或其片段或者表达本发明一种或多种生物标记的RNA产物或其片段的细胞与已知结合所述蛋白质产物、蛋白质片段、RNA产物或者RNA部分的化合物接触，从而形成测定混合物，将该测定混合物与试验化合物接触，并确定所述试验化合物与所述蛋白质产物、蛋白质片段、RNA产物或者RNA部分相互作用的能力，其中确定所述试验化合物与所述蛋白质产物、蛋白质片段、RNA产物或者RNA部分相互作用的能力包括确定所述试验化合物与所述的已知化合物相比优先结合所述蛋白质产物、蛋白质片段、RNA产物或者RNA部分的能力。

本发明提供鉴定待检验化合物的方法，其中检验所述化合物预防、治疗、控制或者改善膀胱癌或者其症状的能力，所述方法包括以下各项：(a)将本发明一种或多种生物标记的蛋白质产物或其片段、或者本发明一种或多种生物标记的RNA产物或其片段与试验化合物接触；和(b)确定所述试验化合物结合所述蛋白质产物、蛋白质片段、RNA产物或RNA部分的能力，由此如果化合物结合所述蛋白质产物、蛋白质片段、RNA产物、RNA部分(RNA portion)，那么待检验化合物预防、治疗、控制或者改善膀胱癌或其症状的能力就得到确认。可以直接地或者间接地确定所述试验化合物与所述蛋白质产物或者蛋白质片段的结合。在一个具体实施方案中，测定包括，将本发明一种或多种生物标记的蛋白质产物或其片段或者本发明一种或多种生物标记的RNA产物或其片段与已知结合所述蛋白质产物、蛋白质片段、RNA产物或者RNA部分的化合物接触，从而形成测定混合物，将该测定混合物与试验化合物接触，并确定所述试验化合物与所述蛋白质产物、蛋白质片段、RNA产物或者RNA部分相互作用的能力，其中确定所述试验化合物与所述蛋白质产物、蛋白质片段、RNA产物或者RNA部分相互作用的能力包括确定所述试验化合物与所述的已知化合物相比优先结合所述蛋白质产物、蛋白质片段、RNA产物或者RNA部分的能力。可以应用本领域熟知的技术确定试验化合物和本发明生物标记蛋白质产物或其片段或者本发明生物标记RNA产物或其部分之间的结合。

在本发明上述测定方法的一些实施方案中，可以按要求固定本发明生物标记的RNA产物或其部分，或者它的靶分子，从而易于从所述RNA产物或者RNA部分、所述靶分子或者两者的未复合形式中分离复合形式，以及从而适应自动化测定。在本发明上述测定方法的超过一个实施方案中，可以按要求固定本发明生物标记的蛋白质产物或者其片段，或者它的靶分子，从而易于从一种或两种所述蛋白质的未复合形式中分离复合形式，以及从而适应自动化测定。可以在适于容纳反应物的任何容器中实现试验化合物与本发明生物标记蛋白质产物或其片段的结合。这样容器的实例包括微量滴定板、试管和微离心管。在一个实施方案中，可以提供加入了结构域的融合蛋白质，所述结构域允许一种或两种所述蛋白质与基质结合。例如，谷胱甘肽-S-转移酶(GST)融合蛋白质可以被吸附于谷胱甘肽琼脂糖凝胶珠(Sigma Chemical；St.Louis，MO)或者由谷胱甘肽衍生化的微量滴定板，其随后与所述试验化合物，以及或者与非吸附的靶蛋白质或者本发明生物标记蛋白质产物或其片段结合，并且在有益于复合物形成的条件下(例如，在盐和pH的生理条件下)孵育混合物。孵育之后，清洗珠或者微量滴定板以去除任何未结合的成分，并且例如按上述，直接地或者间接地测量复合物形成。作为替代，可以使所述复合物从基质解离，并且可以应用标准技术确定本发明生物标记蛋白质产物或者其片段的结合水平。

还可以在本发明的筛选测定中应用其它将蛋白质固定于基体的技术。例如，可以利用生物素和链亲合素的结合来固定本发明生物标记之蛋白质产物或者其片段，或者靶分子。可以应用本领域熟知技术(例如，生物素化试剂盒，Pierce Chemicals；Rockford，IL)从生物素-NHS(N-羟基-琥珀酸亚胺)制备本发明生物标记的生物素化蛋白质产物或者靶分子，并固定在链霉亲合素包被的96孔板(Pierce Chemical)的孔中。作为替代，可以将对本发明生物标记之蛋白质产物或者其片段有反应活性的抗体衍生化至板的孔中，并通过抗体结合将蛋白质捕获在孔中。检测这样的复合物的方法，除了上述GST固定复合物的那些方法以外，包括应用与本发明生物标记之蛋白质产物有反应活性的抗体的络合物免疫检测，以及酶联测定，其依靠对与本发明生物标记蛋白质产物或者其片段，或者靶分子结合的酶活性的检测。

还可以应用诸如在两个杂交测定或者三个杂交测定中作为“诱饵蛋白质”的蛋白质或者蛋白质片段(见例如，美国专利No.5,283,317；Zervoset al.(1993)Cell 72：223-232；Madura et al.(1993)J.Biol.Chem.268：12046-12054；Bartel et al.(1993)Bio/Techniques 14：920-924；Iwabuchiet al.(1993)Oncogene 8：1693-1696；和国际专利公开No.WO 94/10300)来确定本发明生物标记蛋白质产物或其片段与试验化合物的相互作用或者结合。

本发明提供鉴定待检验化合物预防、治疗、控制或者改善骨关节炎或者其症状的能力的方法，所述方法包括：(a)将表达本发明一种或多种生物标记的蛋白质或者RNA产物的细胞与试验化合物接触；(b)孵育期之后，确定在(a)中存在的蛋白质或者RNA产物的量；和(c)将(a)中的量与尚未与所述试验化合物接触的相应对照细胞中存在的量进行比较，因此如果所述的蛋白质或者RNA产物的量相对对照中的量有变化，那么待检验化合物预防、治疗、控制或者改善骨关节炎或其症状的能力就被确定。在一个具体实施方案中，通过本文描述的测定法(例如，微阵列或者RT-PCR)或者本领域技术人员熟知的测定法，确定所述表达水平相对于对照中的表达水平改变了5％、10％、15％、25％、30％、40％、50％、5-25％，10-30％、至少1倍、至少1.5倍、至少2倍、4倍、5倍、10倍、25倍、1-10倍或者5-25倍。在一些替代实施方案中，所述的方法包括，确定存在于所述细胞的列于表1(包括表3所列的那些具体产物)的本发明生物标记或者列于表1(包括表3所列的那些具体产物)的与列于表2的生物标记的任意一种或多种产物组合的任意至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少12、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、1-5、1-10、5-10、5-25或者10-40个、所有或者任意生物标记组合的蛋白质或者RNA产物的量，并与对照中那些产物的量进行比较。

仍在另一些替代实施方案中，这样的方法包括，确定存在于所述细胞的列于表4(包括表6所列的那些具体产物)的本发明生物标记或者列于表4(包括表6所列的那些具体产物)的与列于表5的生物标记的任意一种或多种产物组合的任意至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少12、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、1-5、1-10、5-10、5-25或者10-40个、所有或者任意生物标记组合的蛋白质或者RNA产物的量，并与对照中那些产物的量进行比较。

对在本文描述的基于细胞测定中利用的细胞可以用本领域公知的技术进行改造以表达本发明的生物标记。见例如，美国专利No.6,245,527中名为“Recombinant Expression Vectors and Host Cells”的III部分，其通过参考并入本文。作为替代，可以应用内源表达本发明生物标记的细胞。例如，可以应用无限增殖的膀胱组织细胞。

在一个具体实施方案中，从“正常的”个体、或者具有膀胱癌和/或早期阶段膀胱癌的个体分离软骨细胞，在存在或者缺少试验化合物的条件下，孵育所述细胞不同的时间(即，30分钟、1小时、5小时、24小时、48小时和96小时)。当筛选预防性或者治疗性试剂时，应用本发明生物标记或者其功能性部分的全序列克隆转染无限增殖化膀胱组织细胞。在存在或者缺少试验化合物的条件下，培养转染的细胞不同的时间(即，1、2、3、5、7、10或14天)。孵育之后，从所述细胞制备靶核酸样品并与探针核酸杂交，所述核酸探针对应于在正常的、膀胱癌的或者早期膀胱癌的细胞中差异性表达的核酸序列。例如，用放射性标记，按照本领域和本文描述的众所周知的方法标记所述核酸探针。例如，按照Ausubel et al.，见上或者Sambrook et al.，见上，通过northern印迹实施杂交。按照本文所述，在阵列上，靶标与来自正常个体的样品，相对于与来自膀胱癌或者早期膀胱癌个体RNA的差异性杂交是对应于差异性表达细胞的特定核酸序列的RNA表达水平的指标。作为在存在所述试验化合物条件下孵育步骤的结果，靶序列表达水平的变化是化合物增加或减少相应软骨细胞特定核酸序列表达的指标。

本发明还提供鉴定待检验化合物预防、治疗、控制或者改善膀胱癌或者其症状的能力的方法，所述方法包括：(a)将无细胞提取物与编码本发明一种或多种生物标记蛋白质或者RNA产物的核酸序列和试验化合物接触；(b)确定在(a)中存在的蛋白质或者RNA产物的量；和(c)将(a)中的量与尚未与所述试验化合物接触的相应对照细胞中存在的量进行比较，因此如果所述的蛋白质或者RNA产物的量相对对照中的量有变化，那么待检验化合物预防、治疗、控制或者改善膀胱癌或其症状的能力就被确定。在一个具体实施方案中，通过本文描述的测定法(例如，微阵列或者RT-PCR)或者本领域技术人员熟知的测定法，确定所述表达水平相对于对照中的表达水平改变了5％、10％、15％、25％、30％、40％、50％、5-25％，10-30％、至少1倍、至少1.5倍、至少2倍、4倍、5倍、10倍、25倍、1-10倍或者5-25倍。在一些替代实施方案中，所述的方法包括，确定存在于所述提取物的本发明生物标记的至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少12、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、1-5、1-10、5-10、5-25或者10-40个、所有或者任意生物标记组合的蛋白质或者RNA产物的量，并与对照中那些产物的量进行比较。

在某些实施方案中，确定本发明生物标记之RNA产物的量，在另一些实施方案中，确定本发明生物之标记蛋白质产物的量，而仍在另一些实施方案中，确定本发明生物标记之RNA和蛋白质产物的量。确定本发明生物标记RNA或者蛋白质产物量的标准方法和组合物可以被使用。这样的方法和组合物在上面已详细描述。

在一些具体实施方案中，在本文描述的筛选测定中，应用试剂盒确定本发明生物标记蛋白质或者RNA产物的量。这样的试剂盒包含测量本发明生物标记至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50个、所有或者任意生物标记组合的任意量的、最多至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50个或者更多的蛋白质或者RNA产物表达所需的材料和试剂。在一些具体实施方案中，试剂盒还可以包含在不同方法中应用的另外一种或多种试剂，比如：(1)从血或者组织纯化RNA的试剂；(2)产生检验核酸的引物；(3)dNTP和/或rNTP(预混合的或者分开的)，任选具有一种或多种独特标记的dNTP和/或rNTP(例如，生物素化的或者Cy3或Cy5标记的dNTP)；(4)合成后标记试剂，比如荧光染料的化学活性衍生物；(5)酶，比如逆转录酶、DNA聚合酶等；(6)各种缓冲介质，例如，杂交和清洗缓冲液；(7)标记的探针纯化试剂和组分，比如离心柱等；和(8)蛋白质纯化试剂；(9)信号生成和检测试剂，例如，链亲合素-碱性磷酸酶偶联物、化学荧光或者化学发光底物等。在一些具体实施方案中，试剂盒包含预先标记的质量控制蛋白质和/或RNA转录物(优选mRNA)用作对照。

在一些实施方案中，试剂盒是qRT-PCR试剂盒。在另一些实施方案中，试剂盒是核酸阵列和蛋白质阵列。根据本发明，这样的试剂盒将至少包含与本发明核酸成员结合的阵列及其装配工具。作为替代，可以在阵列上预装配本发明的蛋白质或者核酸成员。

在一个具体实施方案中，测量本发明生物标记的RNA产物的试剂盒包含测量RNA产物表达所必需的材料和试剂。例如，可以应用微阵列或者RT-PCR试剂盒并且只包含测量本发明生物标记任意量的、最多至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50个、所有或者任意生物标记组合的RNA产物水平所必须的那些试剂和材料。作为替代，在一些实施方案中，试剂盒可以包含不限于测量本发明生物标记任意量的、最多为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50个、所有或者任意生物标记组合的RNA产物水平所必需的那些材料和试剂。例如，微阵列试剂盒可以包含测量本发明生物标记任意量的、最多为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50个、所有或者任意生物标记组合的RNA产物水平所必须的试剂和材料，还可以包含测量不同于本发明生物标记的任何量的、最多至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50个或者更多基因RNA产物水平所必须的试剂和材料。在一个具体实施方案中，微阵列或者RT-PCR试剂盒包含测量本发明生物标记任意量的、最多至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50个、所有或者任意生物标记组合的，和不是本发明生物标记的任意量的、最多1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、300、350、400、450、500、1000、5000、15,000、20,000个或者更多基因的，或者不是本发明生物标的任意量的、1-10、1-100、1-150、1-200、1-300、1-400、1-500、1-1000、25-100、25-200、25-300、25-400、25-500、25-1000、100-150、100-200、100-300、100-400、100-500、100-1000或500-1000、1000-5000、5000-10,000、10,000-20,000个或者更多基因的RNA产物水平所必须的试剂和材料。

对于核酸微阵列试剂盒，所述试剂盒通常包含附着于支持物表面的探针。可以用可检测标记来标记所述探针。在一个具体实施方案中，所述探针对本发明生物标记任意量的、最多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50个、所有或者任意生物标记组合的5’区、3’区、内部编码区、外显子、内含子、外显子连接子或者外显子-内含子连接子具有特异性。微阵列试剂盒可以包含实施测定的使用说明以及解释和分析由施行所述测定产生的数据的方法。试剂盒还可以包含杂交试剂和/或，当探针与靶核酸序列杂交时，检测产生信号所需的试剂。通常上，微阵列试剂盒的材料和试剂在一个或多个容器中。试剂盒的各个组分通常在适合其自身的容器中。

对于RT-PCR和/或qRT-PCR试剂盒，所述试剂盒通常包含预选的对本发明生物标记的任意量、最多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50个、所有或者任意生物标记组合的特定RNA产物(例如，外显子、内含子、外显子连接子和外显子-内含子连接子)具有特异性的引物。RT-PCR和/或qRT-PCR试剂盒还可以包含适于逆转录和/或扩增核酸的酶(例如，聚合酶比如Taq)，和逆转录和扩增的反应混合物所需的脱氧核苷酸和缓冲液。RT-PCR试剂盒还可以包含对本发明生物标记的任意量、最多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50个、所有或者任意生物标记组合具有特异性的探针。所述探针可以用或者不用可检测探针(例如，荧光标记)进行标记。RT-PCR试剂盒的各个组分通常在适合其自身的容器中。因此，这些试剂盒通常包含适于各个试剂、酶、引物和探针的不同容器。此外，RT-PCR试剂盒可以包含实施测定的使用说明以及解释和分析由施行所述测定产生的数据的方法。

对于基于抗体的试剂盒，所述试剂盒可以包含，例如：(1)第一抗体(其可以附着于或者不附着于支持物)，其结合感兴趣的蛋白质(例如，本发明生物标记任意量的、最多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50个、所有或者任意生物标记组合的蛋白质产物)；和，任选地，(2)不同于第一抗体的第二抗体，其结合所述蛋白质或者第一抗体并且被偶联于可检测标记(例如，荧光标记、放射性同位素或者酶)。基于抗体的试剂盒还可以包含实施免疫沉淀的珠。所述的基于抗体试剂盒的各个组分通常在适于其自身的容器中。因此，这些试剂盒通常包含适于各种抗体的不同容器。此外，基于抗体的试剂盒可以包含实施测定的使用说明以及解释和分析由施行所述测定产生的数据的方法。

也可实施基于报告基因的测定以鉴定待测定化合物的预防、治疗、处理或减轻骨关节炎及其症状的能力。在一个具体实施方案中，本发明提供鉴定待测定化合物的预防、治疗、处理或减轻骨关节炎及其症状的能力的方法，所述方法包括：(a)将化合物与表达报告基因构建体的细胞接触，所述构建体包含与本发明生物标记物的调控元件(例如启动子/增强子元件)可操作连接的报告基因；(b)测定所述报告基因的表达；和(c)将(a)中的量与相应对照细胞中的相比较，所述对照细胞不与测试化合物相接触，使得如果所表达报告基因的量相对于对照细胞中的量发生改变，待检测的化合物预防、治疗、处理或减轻骨关节炎及其症状的能力就得到鉴定。根据此实施方案，所述细胞可天然的表达所述生物标记或进行改造以表达所述生物标记。在另一个实施方案中，本发明提供鉴定待检测的化合物预防、治疗、处理或减轻骨关节炎及其症状的能力的方法，所述方法包括：(a)将化合物与无细胞提取物和报告基因构建体相接触，所述构建体包含与本发明生物标记物的调控元件(例如启动子/增强子元件)可操作连接的报告基因；(b)测定所述报告基因的表达；和(c)将(a)中的量与相应对照中的相比较，所述对照不与测试化合物相接触，使得如果所表达报告基因的量相对于对照中的量发生改变，待检测的化合物预防、治疗、控制或减轻骨关节炎及其症状的能力就得到鉴定。

任何本领域技术人员公知的报告基因可用于本发明方法所使用的报告基因构建体。报告基因指编码易于检测到的RNA转录物或蛋白质的核苷酸序列，所述检测是通过其存在(通过，例如，RT-PCR，Northern印迹，Western印迹，ELISA等)或活性完成的。报告基因的非限制性实例在下文表9中列出。可通过任何本领域技术人员公知的方法获得报告基因和确定所述元件的核苷酸序列。报告基因的核苷酸序列可，例如，从文献中或数据库中(例如GenBank)获得。或者，编码报告基因的多核苷酸可从来自合适来源的核酸产生。如果含有编码特定报告基因的核酸的克隆不可用，但是所述报告基因序列已知，那么编码报告基因的核酸可以化学合成或者从合适来源(例如，cDNA文库，或者从核酸，优选poly A+RNA中产生的cDNA文库，所述核酸是从表达所述报告基因的任何组织或细胞中分离到的)通过PCR扩增获得。一旦报告基因的核苷酸序列被确定，所述报告基因的核苷酸序列可使用本领域公知的方法进行操作，以操作核酸序列，例如重组DNA技术，定点突变，PCR等(见，例如，所述技术描述于Sambrook et al.，1990，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，2d Ed.，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY和Ausubel et al.，eds.，1998，Current Protocols in Molecular Biology，JohnWiley&Sons，NY，其通过参考以整体并入本文)，以产生具有不同氨基酸序列的报告基因，例如产生氨基酸取代、缺失和/或***。

表9：报告基因和报告基因产物的性质

报告基因	蛋白质活性和检测
		CAT(氯霉素乙酰基转移酶)	转移放射性乙酰基到氯霉素或者通过薄层色谱和自显影检测
GAL(β-半乳糖苷酶)	水解无色半乳糖苷以产生有色产物
		GUS(β-葡糖苷酸酶)	水解无色葡萄糖苷酸以产生有色产物
LUC(荧光素酶)	氧化荧光素，发光
		GFP(绿色荧光蛋白)	无底物荧光蛋白
SEAP(分泌型碱性磷酸酶)	与合适底物或与产生发色团的底物发生发光反应
		HRP(辣根过氧化物酶)	存在氧化氢时，氧化3，3’，5，5’-四甲基联苯胺以形成有色复合物
AP(碱性磷酸酶)	与合适底物或与产生发色团的底物发生发光反应

根据本发明，天然或通常表达一种或多种、所有或任意组合的本发明生物标记的细胞可用于本文描述的方法。或者，可使用本领域公知的和本文所述方法中使用的技术改造细胞以表达任意一种或多种，所有或任意组合的本发明生物标记、或者报告基因。这样技术的实例包括但不限于，磷酸钙沉淀(见，例如，Graham & Van der Eb，1978，Virol.52：546)、葡聚糖介导的转染、磷酸钙介导的转染、聚凝胺(polybrene)介导的转染、原生质体融合、电穿孔、包装核酸到脂质体中、和直接显微注射核酸到核内。

在一个具体实施方案中，本文所述方法使用的细胞是软骨细胞、淋巴细胞(T或B淋巴细胞)、单核细胞、嗜中性粒细胞、巨嗜细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、红细胞或血小板。在一个优选实施方案中，本文所述方法使用的细胞是膀胱癌细胞。在另一个优选实施方案中，本文所述方法使用的细胞是淋巴细胞。在另一个优选实施方案中，本文所述方法使用的细胞是白细胞。在又一个优选实施方案中，本文所述方法使用的细胞是血液中所有细胞。本文所述方法使用的细胞是从来源(例如组织)中得到的永生细胞系。

任何允许核酸翻译，任选的但是优选的，允许核酸转录的无细胞提取物可用于本文所述的方法。无细胞提取物可从任何物种来源的细胞中分离得到。例如，无细胞翻译提取物可分离自人类细胞、培养的小鼠细胞、培养的大鼠细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、爪蟾***、兔网织红细胞、麦芽、或者黑麦胚(见，例如，Krieg & Melton，1984，Nature 308：203和Dignam et al.，1990Methods Enzymol.182：194-203)。或者，无细胞翻译提取物，例如兔网织红细胞裂解物和麦芽提取物，可购自，例如，Promega，(Madison，WI)。在一个优选实施方案中，无细胞提取物是分离自人类细胞的提取物。在一个具体实施方案中，人类细胞是Hela细胞、淋巴细胞或膀胱细胞。

除了调节本发明生物标记的RNA和/或蛋白质产物表达水平的能力之外，也可期望，至少在某些例子中，化合物调节本发明生物标记之蛋白质产物的活性。因此，本发明提供鉴定待检测的化合物预防、治疗、控制或减轻膀胱癌及其症状的能力的方法，其包含鉴定化合物调节本发明一个或多个生物标记的蛋白质产物活性方法。这样的方法可包括：(a)将表达本发明一个或多个生物标记的蛋白质产物的细胞与测试化合物相接触；(b)在孵育期之后，确定蛋白质产物的活性水平；和(c)比较所述活性水平与未和所述测试化合物相接触的相应对照细胞中的活性水平，使得，如果(a)中的活性水平相对于对照细胞中活性水平发生改变，那么测试化合物预防、治疗、控制或减轻膀胱癌及其症状的能力得到鉴定。在一个具体实施方案中，活性水平相对于对照中的活性水平改变最高5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％，5-25％、10-30％，至少1倍、至少1.5倍、至少2倍、4倍、5倍、10倍、25倍，1-10倍或5-25倍，如通过使用本文所述的测定(例如微阵列或RT-PCR)或本领域技术人员公知的测定所确定的。在替代实施方案中，这样的方法包括，相比于对照中的活性水平，确定细胞中存在的任意数量的最高至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种、至少12种、至少15种、至少20种、至少25种、至少30种、至少35种、至少40种、至少45种、至少50种、1-5种、1-10种、5-10种、5-25种、或10-40种、所有或任何组合的本发明生物标记的蛋白质产物的活性水平。

本发明提供鉴定待检测的化合物预防、治疗、控制或减轻膀胱癌及其症状的能力的方法，其包括：(a)将带有本发明一个或多个生物标记之蛋白质产物的编码核酸的无细胞提取物与测试化合物相接触；(b)在孵育期之后，确定蛋白质产物的活性水平；和(c)比较所述活性水平与未和所述测试化合物相接触的相应对照中的活性水平，使得，如果(a)中的活性水平相对于对照中活性水平发生改变，那么测试化合物预防、治疗、控制或减轻膀胱癌及其症状的能力得到鉴定。在一个具体实施方案中，活性水平相对于对照中的活性水平改变最高1％？5％、10％、15％、25％、30％、40％、50％、5-25％、10-30％、至少1倍、至少1.5倍、至少2倍、4倍、5倍、10倍、25倍、1-10倍或5-25倍，如通过使用本文所述的测定(例如微阵列或qRT-PCR)或本领域技术人员公知的测定所确定的。在替代实施方案中，这样的方法包括，相比于对照中的活性水平，确定样品中存在的任意数量的最高至少1种、至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种、至少12种、至少15种、至少20种、至少25种、至少30种、至少35种、至少40种、至少45种、至少50种、1-5种、1-10种、5-10种、5-25种、或10-40种、所有或任何组合的本发明生物标记的蛋白质产物的活性水平。

可应用标准技术确定本发明生物标记之蛋白质产物的活性水平。

5.18.2所述化合物的生物活性

在鉴定待检测的化合物预防、治疗、控制或减轻膀胱癌及其症状的能力之后(方便起见，本文称作“先导”化合物)，可进一步研究所述化合物。例如，通过本方法鉴定的化合物可另外在可接受的肿瘤和优选膀胱癌动物模型中进行体内测试。另外，可对通过所述方法鉴定的化合物的特异性进行分析。

在一个实施方案中，可通过测定靶细胞的细胞生长或生存力来测定先导化合物的效果。这样的测定可使用与膀胱癌相关的细胞类型(例如膀胱衬里细胞)的代表性细胞实施。或者，可使用细胞系的细胞筛选先导化合物，以替代培养来自患者的细胞。

许多本领域公知的测定可用于评估与先导化合物接触之后患者细胞或细胞系的存活和/或生长；例如，细胞增殖可通过溴脱氧尿苷(BrdU)掺入(见，例如Hoshino et al，1986，Int.J.Cancer 38，369；Campana et al.，1988，J.Immunol.Meth.107：79)或(³H)-胸腺密啶核苷掺入(见，例如Chen，J.，1996，Oncogene 13：1395-403；Jeoung，J.，1995，J.Biol.Chem.270：18367-73)，通过直接细胞计数，通过检测已知基因(比如原癌基因(例如，fos，myc)或细胞周期标记(Rb，cdc2，cyclinA，D1，D2，D3，E等))的转录、翻译或活性的改变来测定。这样的蛋白质和RNA(例如mRNA)的水平和活性可通过任何本领域公知的方法确定。例如，可通过已知免疫诊断方法(例如使用市售抗体的western印迹或免疫沉淀)对蛋白质定量。mRNA可使用本领域公知且常规的方法定量，例如，使用northern分析，RNase保护，与逆转录相关的聚合酶链式反应。细胞存活力可通过使用台盼兰染色或其它本领域已知的细胞死亡或存活标记来评估。在一个具体实施方案中，测定细胞ATP水平以确定细胞存活力。可评估分化，例如，视觉上基于形态学上的改变来评估。

动物模型

化合物在人体应用之前，可在合适的动物模型***中进行测试。这样的动物模型***包括但不限于大鼠、小鼠、鸡、牛、猴、猪、狗、兔等。可应用任何本领域公知的动物***。在某些实施方案中，在小鼠模型中测试化合物。可重复施用化合物。

公认的动物模型可用于检测通过上述方法所鉴定的化合物用于预防、治疗、控制和/或改善膀胱癌或其症状的效力。

毒性

根据本发明鉴定的化合物的毒性和/或效力可按照标准药用程序，在细胞培养物或实验动物中进行测定，例如，测定LD₅₀(使群体中50％致死的剂量)和ED₅₀(对群体中50％有疗效的剂量)。可用于评定根据本发明鉴定的化合物的细胞毒性的细胞和细胞系，包括但不限于，外周血单核细胞(PBMC)，Caco-2细胞，和Huh7细胞。毒性和疗效之间的剂量比是治疗指数，并且其可表述为LD₅₀/ED₅₀。显示出大治疗指数的根据本发明鉴定的化合物是优选的。尽管可应用显示出毒副作用的根据本发明鉴定的化合物，但是应当小心的设计递送***，其将这样的药剂靶向其作用的组织位点，以使得对未感染细胞的潜在损伤最小化，并且由此减少副作用。

从细胞培养测定和动物研究中获得的数据可用于***阐述根据本发明鉴定的化合物用于人体的剂量范围。这样的药剂的剂量优选的处于循环浓度范围中，其包括很少毒性或没有毒性的ED₅₀。根据所采用的剂型和施用途径，所述剂量可在此范围中变化。对于本发明的方法中使用的任意药剂，可最先从细胞培养测定中推测治疗有效剂量。可在动物模型中***阐述剂量，以获得循环血浆浓度范围，其包括在细胞培养中测定的IC₅₀(即，达到对症状的最大抑制之一半的化合物浓度)。这样的信息可用于更精确地测定人体中的有用剂量。例如，可通过高效液相色谱测定血浆水平。

同源物或类似物设计

显示出所需生物学活性的化合物可用作先导化合物用于开发或设计具有有益药物活性的同源物或类似物。例如，一旦鉴定出先导化合物，可采用分子建模技术来设计所述化合物的变体，其可以是更有效的。分子建模***的实例有CHARM和QUANTA程序(Polygen Corporation，Waltham，MA)。CHARM执行能量最小化和分子动力学函数。QUANTA执行构建、图形建模和分子结构分析。QUANTA允许彼此间的交互式构建、修饰、可视化、以及分子行为分析。

许多文章综述了与特异性蛋白质相互作用的药物的计算机建模，例如Rotivinen et al.，1988，Acta Pharmaceutical Fennica 97：159-166；Ripka，1998，New Scientist 54-57；McKinaly & Rossmann，1989，Annu.Rev.Pharmacol.Toxiciol.29：111-122；Perry & Davies，OSAR：QuantitativeStructure-Activity Relationships in Drug Design pp.189-193(Alan R.Liss，Inc.1989)；Lewis & Dean，1989，Proc.R.Soc.Lond.236：125-140and141-162；Askew et al.，1989，J.Am.Chem.Soc.111：1082-1090.也有其它筛选和图形化描述化学物质的计算机程序，其来自多个公司，例如BioDesign，Inc.(Pasadena，California)，Allelix，Inc.(Mississauga，Ontario，Canada)，and Hypercube，Inc.(Cambridge，Ontario).尽管这些主要是设计用于对特定蛋白质有特异性的药物，但是可使它们适用于设计对任何所鉴定的区域有特异性的药物。可使用上述针对生物学活性的筛选，对所述类似物和同源物与感兴趣蛋白质(即本发明生物标记的蛋白产物)的结合进行检测。作为替代，很少或没有生物学活性的先导化合物，如在所述筛选中所发现的，也可用于设计具有生物学活性的化合物的类似物和同源物。

5.18.3化合物

可根据本文所述方法检测和鉴定的化合物可包括但不限于，从任何商业来源获得的化合物，包括Aldrich(1001 West St.Paul Ave.，Milwaukee，WI 53233)，Sigma Chemical(P.O.Box 14508，St.Louis，MO 63178)，FlukaChemie AG(Industriestrasse 25，CH-9471Buchs，Switzerland(FlukaChemical Corp.980South 2nd Street，Ronkonkoma，NY 11779))，EastmanChemical Company，Fine Chemicals(P.O Box 431，Kingsport，TN 37662)，Boehringer Mannhcim GmbH(Sandhofer Strasse 116，D-68298Mannheim)，Takasago(4Volvo Drive，Rockleigh，NJ 07647)，SSTCorporation(635Brighton Road，Clifton，NJ 07012)，Ferro(111West IreneRoad，Zachary，LA 70791)，Riedel-deHaen Aktiengesellschaft(P.O.BoxD-30918，Seelze，Germany)，PPG Industries Inc.，Fine Chemicals(OnePPG Place，34th Floor，Pittsburgh，PA 15272)。另外，可使用本发明的方法筛选任何种类的天然产物，其包括细菌、真菌、植物或动物提取物。

可对来自大的合成或天然化合物文库的化合物进行筛选。目前，多种方法被用于随机和定向合成基于糖、基于肽、和基于核酸的化合物。合成化合物文库是市售的，其来自多个公司，包括Maybridge Chemical Co.(Trevillet，Cornwall，UK)，Comgenex(Princeton，NJ)，Brandon Associates(Merrimack，NH)，和Microsource(New Milford，CT)。稀有化学物质文库是可用的，其来自Aldrich(Milwaukee，WI)。组合文库是可用的且已经制备的。作为替代，以细菌、真菌、植物和动物提取物的形式存在的天然化合物文库是可用的，其来自例如Pan Laboratories(Bothell，WA)或MycoSearch(NC)，或者根据本领域公知的方法是易于生产的。另外，天然和合成文库以及化合物易于通过传统化学、物理学和生物化学方法进行修饰。

此外，可利用多样化的测试化合物文库，其包括小分析测试化合物。使用本发明方法筛选的文库可包含多种类型的化合物。根据本发明方法筛选的文库的实例包括但不限于类肽；随机生物寡聚体；多样体(diversomers)例如乙内酰脲类、苯二氮

类和二肽类；插烯多肽(vinylogous polypeptides)；非肽型拟肽类(nonpeptidalpeptidomimetics)；寡聚氨基甲酸酯类；肽膦酸酯类(peptidylphosphonates)；肽核酸文库；抗体文库；糖文库；以及小分子文库(优选小有机分子文库)。在一些实施方案中，所述被筛选文库中的化合物是核酸或肽分子。在一个非限制性的实施例中，肽分子可存在于噬菌体展示文库中。在其它实施方案中，化合物的种类包括但不限于，肽类似物，其包含含有非天然氨基酸(例如D-氨基酸)的肽，氨基酸的磷类似物，例如α-氨基磷酸和α-氨基磷酸，或者具有非肽连接的氨基酸，核酸类似物，例如硫代磷酸酯类(phosphorothioates)和PNA类，激素，抗原，合成或天然药物，阿片类，多巴胺，5-羟色胺，儿茶酚胺类，凝血酶，乙酰胆碱，***素类，有机分子，信息素类，腺苷，蔗糖，葡萄糖，乳糖和半乳糖。多肽或蛋白质文库也可用于本发明的测定。

在一个具体实施方案中，所述组合文库是小有机分子文库，其包括但不限于，苯二氮

类，异戊二烯类，噻唑烷酮类(thiazolidinones)，metathiazanones，四氢吡咯类(pyrrolidines)，吗啉代化合物，和苯二氮

类.在另一个实施方案中，所述组合文库含有类肽；随机生物寡聚物；苯二氮

类；多样体，比如乙内酰脲类、苯二氮

类和二肽类；插烯多肽；非肽型拟肽类；寡聚氨基甲酸酯类；肽膦酸酯类；肽核酸文库；抗体文库；或糖文库。组合文库自身是市售的。例如，文库可商业获得，其来自例如，Specs and BioSpecs B.V.(Rijswijk，The Netherlands)，ChembridgeCorporation(San Diego，CA)，Contract Service Company(Dolgoprudny，Moscow Region，Russia)，Comgenex USA Inc.(Princeton，NJ)，MaybridgeChemicals Ltd.(Cornwall PL34OHW，United Kingdom)，Asinex(Moscow，Russia)，ComGenex(Princeton，New Jersey)，Ru，Tripos，Inc.(St.Louis，Missouri)，ChemStar，Ltd(Moscow，Russia)，3D Pharmaceuticals(Exton，Pennsylvania)，和Martek Biosciences(Columbia，Maryland).

在一个优选实施方案中，所述文库是预先选择的，使得所述文库的化合物更加适于细胞摄入。例如，基于特定参数选择化合物，所述参数例如但不限于，尺寸、亲脂性、亲水性、和氢键，其增加了化合物进入细胞的容易程度。在另一个实施方案中，通过三维或四维计算机计算程序对所述化合物进行分析。

可对用于根据本发明方法的组合化合物文库进行合成。对于定向产生大量的小有机分子集合或文库的合成方法有很大的兴趣，可对其中所述集合或文库的药学、生物学或其它活性进行筛选。用以创建大的组合文库的所述合成方法是在溶液中或在相中(即在载体上)进行的。固相合成使得控制多步反应更加容易，并驱动反应以高产量完成，因为过量的反应物可方便的加入和在每步反应之后洗去。固相组合合成也有助于改善分离、纯化和筛选。但是，更多的传统溶液相化学比固相化学支持更多的有机反应。

本发明的组合化合物文库可使用美国专利No.6,190,619(Kilcoin等)所述的装置进行合成，其通过参考整体并入本文。美国专利No.6,190,619公开了一种合成装置，其能够支持大量反应容器，以用于多种分离的化合物的平行合成或者用于组合化合物文库。

在一个实施方案中，组合化合物文库可在溶液中合成。美国专利No.6,194,612(Boger等)公开的方法使得化合物用作组合文库溶液相合成的模板，其通过参考整体并入本文。所述模板的设计是使得允许使用液/液或固/液提取将反应产物容易地从未反应的反应物中纯化出来。通过使用所述模板的组合合成产生的组合物将优选为小有机分子。文库中的一些化合物可模拟非肽或肽的作用。相对于组合化合物文库的固相合成，液相合成不需要使用专门的方案，以监控多步固相合成中的各个步骤(Egner et al.，1995，J.Org.Chem.60：2652；Anderson et al.，1995，J.Org.Chem.60：2650；Fitch et al.，1994，J.Org.Chem.59：7955；Look et al.，1994，J.Org.Chem.49：7588；Metzger et al.，1993，Angew.Chem.，Int.Ed.Engl.32：894；Youngquist et al.，1994，Rapid Commun.Mass Spect.8：77；Chu et al.，1995，J.Am.Chem.Soc.117：5419；Brummel et al.，1994，Science 264：399；andStevanovic et al.，1993，Bioorg.Med.Chem.Lett.3：431)。

用于本发明方法的组合化合物文库可在固体支持物上进行合成。在一个实施方案中，分散合成法(split synthesis method)，在合成过程中分离和混合支持物的方案，用于在固体支持物上合成化合物文库(见，例如，Lam et al.，1997，Chem.Rev.97：41-448；Ohlmeyer et al.，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：10922-10926，以及其中所引用的文献)。在最终文库中的每个固体支持物基本上都有一种化合物附在其表面上。其它在固体支持物上合成组合文库的方法将是本领域中技术人员已知的，其中一个产物附在每个支持物上(见，例如Nefzi et al.，1997，Chem.Rev.97：449-472)。

在本发明的一些实施方案中，化合物通过连接子附在固体支持物上。连接子可以是整合在固体支持物上并且是其一部分，或者连接子可以是非整合的，在固体支持物上所合成或在合成后附在其上。连接子不只用于提供化合物连接到固体支持物的连接点，而且根据连接子的性质用于使得不同组的分子在不同条件下从固体支持物上切割下来。例如，连接子可以是，亲电子切割，亲核切割，可光切割的，酶切割的，金属切割的，在还原或氧化条件下切割的。在一个优选实施方案中，所述化合物在高通量筛选之前从固体支持物上被切割下来。

如果所述文库包含化合物的阵列或微阵列，其中每种化合物具有一个地址或标识，所述化合物可进行解析，例如通过将阳性样品交叉指定给在各个测定中应用的初始化合物列表。

如果所述文库是肽或者核酸文库，所述化合物的序列可通过对肽或者核酸的直接测序来测定。这样的方法是本领域技术人员已知的。

许多物理-化学技术可用于化合物的重新表征。这样的技术的实例包括但不限于，质谱、NMR谱、X射线晶体衍射和振动波谱。

5.19将所鉴定的化合物应用于预防、治疗、控制或减轻膀胱癌或其症状

本发明提供了预防、治疗、控制或减轻膀胱癌或其症状的方法，所述方法包括将一种或多种根据本发明方法所鉴定的化合物施用给所需对象。在一个优选实施方案中，所述对象是人类。

在一个实施方案中，本发明提供了预防、治疗、控制或减轻膀胱癌或其症状的方法，所述方法包括预防或治疗有效量的一种或多种根据本发明方法所鉴定的化合物施用给所需对象。在一个具体实施方案中，如果这样的化合物以前曾用于预防、治疗、控制或减轻膀胱癌或其症状，根据本发明方法鉴定的化合物不施用以预防、治疗、控制或减轻膀胱癌或其症状。在另一个实施方案中，如果这样的化合物曾使人想到可用于预防、治疗、控制或减轻膀胱癌或其症状，根据本发明方法鉴定的化合物不施用以预防、治疗、控制或减轻膀胱癌或其症状。在另一个实施方案中，根据本发明方法鉴定的化合物特异性地与本发明仅仅一个生物标记的蛋白质或RNA产物相结合和/或改变其表达水平和/或活性水平。在又一个实施方案中，根据本发明方法鉴定的化合物与本发明任何数量(最高至少2，至少3，至少4，至少5，至少10，至少15，至少20，至少25，至少30，至少35，至少40或更多)生物标记的蛋白质或RNA产物相结合和/或改变其表达水平和/或活性水平。

在一个具体实施方案中，根据本发明方法鉴定的化合物增加或降低膀胱细胞或无限增殖的膀胱癌细胞的同化和/或异化活性。优选地，与未处理的膀胱细胞或无限增殖的膀胱癌细胞相比，这样的化合物使软骨细胞同化和/或异化活性增加或降低大于1倍，更优选，1.5-5倍，最优选，5-100倍。在另一个实施方案中，根据本发明方法鉴定的化合物减轻至少一种与膀胱癌相关的症状和/或改变，其中包括膀胱癌的症状。在一个具体实施方案中，施用以预防、治疗、控制或减轻膀胱癌或其症状的预防或治疗剂是合成化合物或天然产物(例如植物提取物或培养物上清)，或化合物的混合物。

本发明也提供预防、治疗、控制或减轻膀胱癌或其症状的方法，所述方法包括将一种或多种使用上述筛选方法所鉴定的化合物施用给所需对象，以及一种或多种其它治疗(例如预防或治疗剂和手术)。在一个具体实施方案中，当前正在使用的这样的治疗已用于预防、治疗、控制或减轻膀胱癌或其症状(包括但不限于下文部分中所列出的预防或治疗剂)或者已知对其是有用的。本发明组合治疗中的治疗(例如预防或治疗剂)可顺序施用或同时施用。在一个具体实施方案中，本发明的组合治疗包含根据本发明鉴定的化合物和至少一种与所述化合物作用机理相同的其它治疗。在另一个特定实施方案中，本发明的组合治疗包括根据本发明方法鉴定的组合物，以及至少一种与所述化合物作用机理不同的其它治疗(例如，预防或治疗剂)。本发明的组合治疗通过与所述化合物共同起作用而具有附加或增效作用，提高了本发明化合物的预防或治疗效果。本发明的组合治疗降低了与所述治疗(例如预防或治疗剂)相关的副作用。

组合治疗的预防或治疗剂可在相同的药用组合物中施用给对象。作为替代，组合治疗的预防或治疗剂可在分别独立的药用组合物中同时施用给对象。预防或治疗剂可通过相同或不同的施用途径施用给对象。

在一个具体实施方案中，将含有本文所述测定中鉴定的一种或多种化合物的药用组合物施用给对象，优选人类，以预防、治疗、控制或减轻膀胱癌或其症状。根据本发明，所述药用组合物也可包含一种或多种预防或治疗剂。优选的，这样的药剂是目前正在被应用于、已经被应用于或已知可被应用于预防、治疗、控制或减轻膀胱癌或其症状。

根据本发明的方法鉴定的化合物可用作膀胱癌的一线、二线、三线、四线或五线治疗。对于传统膀胱癌治疗耐受的对象，本发明提供治疗、控制或减轻膀胱癌或其症状的方法。所述方法包括施用预防或治疗有效量的根据本发明方法鉴定的化合物给所述对象。

对于现有单一膀胱癌药剂治疗耐受的对象，本发明提供治疗、控制或减轻膀胱癌或其症状的方法，所述方法包括施用预防或治疗有效量的根据本发明方法鉴定的化合物以及预防或治疗有效量的一种或多种其它治疗(例如预防或治疗剂)给所述对象。本发明也提供治疗或控制膀胱癌的方法，其通过将根据本发明方法鉴定的化合物与任意其它治疗(例如手术)组合施用给已证实对其它治疗耐受并且不再使用这些治疗的患者。本发明也对患有膀胱癌且由于之前接受的其它治疗而出现免疫抑制的患者提供治疗或控制的方法。本发明在激素治疗和/或生物治疗/免疫治疗对于接受治疗或控制的对象已被证实或可能被证实毒性过大(即导致不可接受或不可忍受的副作用)的情况下，也提供治疗或控制膀胱癌的替代方法。

5.19.1用于预防、治疗、控制或减轻膀胱癌或其症状的化合物

可用于根据本发明的方法以预防、治疗、控制和/或减轻膀胱癌或其症状的化合物的代表性非限制性例子在下文详细描述。

首先，这样的化合物可包括，例如，可下调本发明生物标记的蛋白质或RNA产物的表达或活性的反义、核酶、或三螺旋化合物。这样的化合物在下文有详细描述。

其次，这样的化合物可包括，例如，可调节本发明生物标记的蛋白质或RNA产物表达或本发明生物标记之蛋白质产物活性的抗体组合物。在一个具体实施方案中，所述抗体组合物下调本发明生物标记的蛋白质或RNA产物的表达，或者本发明生物标记的蛋白质产物的活性。这样的化合物在下文有详细描述。

第三，这样的化合物可包含，例如，本发明生物标记的蛋白产物。本发明包括所选择的肽或肽模拟物用于模拟本发明的生物标记的蛋白质产物，以预防、治疗、控制或减轻膀胱癌或其症状。另外，这样的化合物可包含，例如，可以调节本发明生物标记的蛋白质或RNA产物表达或者本发明生物标记蛋白质产物活性的显性负多肽(dominant-negativepolypeptides)。

所述方法也包括本发明生物标记蛋白质产物的衍生物、类似物、或片段在预防、治疗、控制或减轻膀胱癌或其症状上的应用。特别的，本发明包括将包含这类蛋白质之一个或多个结构域的本发明生物标记蛋白质产物的片段应用到预防、治疗、控制或减轻膀胱癌或其症状。在另一个具体实施方案中，本发明包括将本发明生物标记的蛋白质产物或表达为融合、或嵌合蛋白质产物(包含通过肽键连接到异源蛋白质序列的蛋白质、片段、类似物或衍生物)的这样蛋白质的类似物、衍生物或片段的应用。

在一个具体实施方案中，施用至少1种、至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种、至少15种、至少20种、至少25种、至少30种、至少35种、至少40种、至少45种、至少50种或更多种本发明生物标记的反义寡聚核苷酸以预防、治疗、控制或减轻膀胱癌或其症状。在另一个实施方案中，施用一种或多种本发明生物标记的蛋白质产物或其片段、类似物或衍生物以预防、治疗、控制或减轻膀胱癌或其症状。在其它实施方案中，施用一种或多种与本发明蛋白质产物特异性结合的抗体以预防、治疗、控制或减轻膀胱癌或其症状。在其它实施方案中，施用一种或多种显性负多肽以预防、治疗、控制或减轻膀胱癌或其症状。

反义、核酶、三螺旋组合物

可应用标准技术以产生反义、三螺旋或核酶分子，以用作本文所述方法的一部分。首先，可应用标准技术产生反义核酸分子，即与编码感兴趣多肽的正义核酸互补，例如，与双链cDNA分子的编码链互补或与mRNA序列互补。因此，反义核酸可与正义核酸氢键连接。所述反义核酸可与整个编码链互补或只与其一部分互补，例如，所有或部分蛋白质编码区(或开放读码框)。反义核酸分子可以是编码感兴趣多肽的核酸序列的编码链上的所有或部分非编码区的反义核酸。非编码区域(“5’和3’非翻译区”)是与编码区域相邻的5’和3’区域，并且不翻译成氨基酸。

反义寡聚核苷酸可以是，例如，长度上高达约5、10、15、20、25、30、35、40、45、或50个或更多的任意数量的核苷酸。本发明的反义核酸可使用化学合成和酶连接反应(使用本领域已知步骤)来构建。例如，反义核酸(如反义寡聚核苷酸)可使用天然存在的核苷酸或多种修饰的核苷酸进行化学合成，所述修饰核苷酸的设计是为增加所述分子的生物稳定性或增加反义与正义核酸形成的双链体的物理稳定性，例如可使用硫代磷酸酯衍生物和吖啶取代的核苷酸。可用于产生反义核酸的修饰核苷酸的例子包括5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)，5-溴尿嘧啶(5-bromouracil)，5-氯尿嘧啶(5-chlorouracil)，5-碘尿嘧啶(5-iodouracil)，次黄嘌呤(hypoxanthine)，黄嘌呤(xanthine)，4-乙酰胞密啶(4-acetylcytosine)，5-(羧甲基)尿嘧啶(5-(carboxyhydroxylmethyl)uracil)，5-羧甲基氨基甲基-2-硫代尿嘧啶核苷(5-carboxymethylaminomethyl-2-thiouridine)，5-羧甲基氨甲基尿嘧啶(5-carboxymethylaminomethyluracil)，二氢尿嘧啶(dihydrouracil)，β-D-半乳糖Q核苷(beta-D-galactosylqueosine)，次黄苷(inosine)，N6-异戊烯基腺嘌呤(N6-isopentenyladenine)，1-甲基鸟嘌呤(1-methylguanine)，1-甲基次黄苷(1-methylinosine)，2，2-二甲基鸟嘌呤(2，2-dimethylguanine)，2-甲基腺嘌呤(2-methyladenine)，2-甲基鸟嘌呤(2-methylguanine)，3-甲基胞嘧啶(3-methylcytosine)，5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine)，N6-腺嘌呤(N6-adenine)，7-甲基鸟嘌呤(7-methylguanine)，5-甲基氨甲基尿嘧啶(5-methylaminomethyluracil)，5-甲氧基氨甲基-2-硫尿嘧啶(5-methoxyaminomethyl-2-thiouracil)，β-D-甘露糖Q核苷(beta-D-mannosylqueosine)，5’-甲氧基羧甲基尿嘧啶(5′-methoxycarboxymethyluracil)，5-甲氧基尿嘧啶(5-methoxyuracil)，2-甲硫基-N6-异戊烯基腺嘌呤(2-methylthio-N6-isopentenyladenine)，尿嘧啶-5-氧基乙酸(v)(uracil-5-oxyacetic acid(v))，怀丁苷(wybutoxosine)，假尿嘧啶(pseudouracil)，Q核苷(queosine)，2-硫胞嘧啶(2-thiocytosine)，5-甲基-2硫尿嘧啶(5-methyl-2-thiouracil)，2-硫尿嘧啶(2-thiouracil)，4-硫尿嘧啶(4-thiouracil)，5-甲基尿嘧啶(5-methyluracil)，尿嘧啶-5-氧基乙酸甲酯(uracil-5-oxyacetic acid methylester)，尿嘧啶-5-氧基乙酸(v)(uracil-5-oxyacetic acid(v))，5-甲基-2-硫尿嘧啶(5-methyl-2-thiouracil)，3-(3-氨基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶(3-(3-amino-3-N-2-carboxypropyl)uracil)，(acp3)w，和2，6-二氨基嘌呤(2，6-diaminopurine)。作为替代，可使用以反义方向(即所***的核酸转录产生的RNA将是感兴趣的目标核酸的反义方向)亚克隆了核酸的表达载体来以生物学方式产生反义核酸。

反义核酸分子施用给对象或在原位产生，使得它们与编码感兴趣多肽的细胞mRNA杂交或结合，由此抑制表达，例如，通过抑制转录和/或翻译。所述杂交可通过传统核苷酸互补以形成稳定双链体完成，或者，例如，在与DNA双链体结合的反义核酸分子的情况下，通过双螺旋大沟中的特异性相互作用。本发明反义核酸分子的施用途径的实例包括在组织处直接注射，例如，关节(比如膝关节、髋关节、肘关节、和指关节)。作为替代，可对反义核酸分子进行修饰以靶向所选择的细胞，然后全身性施用。例如，为了全身性施用，可对反义分子进行修饰，使得它们特异性结合所选择细胞(T细胞或软骨细胞)表面表达的受体或抗原，所述结合例如通过所述反义核酸分子连接到多肽或抗体，所述多肽或抗体与细胞表面受体或抗原结合。所述反义核酸分子也可通过使用载体(例如下文所述的基因治疗载体)递送到细胞。为达到所述反义分子的足够细胞内浓度，反义核酸分子位于其上的载体构建体处于强polII或polIII启动子的控制下是优选的。

感兴趣的反义核酸分子可以是α-端基异构(anomeric)核酸分子。α-端基异构核酸分子与互补RNA形成特异性双链杂交，其中，与通常α-单元相反，链之间相互平行(Gaultier等.，1987，Nucleic Acids Res.15：6625-6641)。反义核酸分子也可包括2’-o-甲基核糖核苷酸(2′-o-methylribonucleotide)(Inoue等.，1987，Nucleic Acids Res.15：6131-6148)或者嵌合RNA-DNA类似物(Inoue等.，1987，FEBS Lett.215：327-330)。

核酶是具有核糖核酸酶活性的催化性RNA分子，其能够切割具有与其互补区域的单链核酸，比如mRNA，并且其也可使用标准技术产生。因此，核酶(例如锤头状核酶(如Haselhoff and Gerlach，1988，Nature334：585-591所述))可用于催化性切割mRNA转录物，并由此抑制所述mRNA编码蛋白质的翻译。具有对于编码感兴趣多肽的核酸分子有特异性的核酶可基于本文公开的cDNA核苷酸序列进行设计。例如，Cech等的美国专利No.4,987,071和Cech等的美国专利No.5,116,742中TetrahymenaL-19IVS RNA的衍生物可被构建，其中活性位点的核苷酸序列与待切割核苷酸序列互补。作为替代，编码感兴趣多肽的mRNA可用于从RNA分子库中选择具有特异性核糖核酸酶活性的催化性RNA。见，例如，Barteland Szostak，1993，Science 261：1411-1418。

三螺旋结构也可使用公知技术生成。例如，感兴趣多肽的表达可被靶向核苷酸序列所抑制，其与形成三螺旋结构的多肽的编码基因的调控区域(例如启动子和/或增强子)互补，所述结构阻止所述基因在靶细胞中的转录。一般地，可见Helene，1991，Anticancer Drug Des.6(6)：569-84；Helene，1992，Ann.NY.Acad.Sci.660：27-36；和Maher，1992，Bioassays14(12)：807-15。

在多种实施方案中，核酸组合物可在碱基部分、糖部分或磷酸骨架进行修饰，以提高例如分子的稳定性、杂交性、或溶解性。例如，核酸的脱氧核糖磷酸骨架可被修饰以生成肽核酸(见Hyrup等.，1996，Bioorganic&Medicinal Chemistry 4(1)：5-23)。如本文所使用的，术语“肽核酸”或“PNA”指核酸模拟物，例如，DNA模拟物，其中脱氧核糖磷酸骨架被假肽骨架所取代，而只有四种核酸碱基被保留下来。PNA的中性骨架已显示出允许在低离子强度条件下DNA和RNA的特异性杂交。PNA寡聚物的合成可用标准固相肽合成方案进行实施，其如Hyrup等.，1996，supra；Perry-O′Keefe等，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：14670-675中所述。

例如，可通过在PNA上附加亲脂性或其它辅助基团，通过形成PNA-DNA嵌合体，或通过脂质体或其它本领域已知的药物递送技术对PNA进行修饰，比如增强它们的稳定性或细胞摄入。例如，PNA-DNA嵌合体可被生成，其结合了PNA和DNA性质的优点。这样的嵌合体允许DNA识别酶，例如，RNAase H和DNA聚合酶，与其DNA部分相互作用，其PNA部分将提供高的亲和力和特异性。PNA-DNA嵌合体可使用合适长度的连接子相连接，其长度按照碱基堆积、核酸碱基之间键的数目，和方向进行选择(Hyrup，1996，如上)。PNA-DNA嵌合体的合成可如Hyrup，1996，如上，和Finn等，1996，Nucleic Acids Res.24(17)：3357-63所述进行实施。例如，可使用标准亚磷酰胺连接化学和经修饰的核苷类似物在固体支持物上对DNA链进行合成。化合物例如5’-(4-甲氧基三苯甲基)氨基-5’-脱氧-胸腺嘧啶亚磷酰胺可用作PNA和DNA的5’端之间的连接(Mag等，1989，Nucleic Acids Res.17：5973-88)。接着，PNA单体以逐个的方式相连接，形成具有5’PNA片段和3’DNA片段的嵌合分子(Finn等，1996，Nucleic Acids Res.24(17)：3357-63)。作为替代，嵌合分子可使用5’DNA片段和3’PNA片段来合成(Peterser等，1975，Bioorganic Med.Chem.Lett.5：1119-11124)。

在其它实施方案中，寡聚核苷酸可包含其它附加基团，比如肽(例如为体内靶向宿主细胞受体的)，或者促进跨细胞膜(见，例如Letsinger等，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：6553-6556；Lemaitre等，1987，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：648-652；国际公开No.WO 88/09810))或跨血脑屏障转运的试剂(见，例如，国际公开No.WO89/10134)。另外，寡聚核苷酸可使用杂交引发的切割剂(见，例如，Krol等，1988，Bio/Techniques6：958-976)或***剂(见，例如，Zon，1988，Pharm.Res.5：539-549)进行修饰。为此目的，寡聚核苷酸可与另一个分子(例如，肽、杂交引发的交联剂、转运剂、杂交引发的切割剂等)相结合。

抗体组合物

在一个实施方案中，将与本发明一个或多个生物标记的一个或多个蛋白质产物特异性结合的抗体施用给对象，优选人类，用以预防、治疗、控制或减轻膀胱癌或其症状。在另一个实施方案中，将与本发明一个或多个生物标记的一个或多个蛋白质产物特异性结合的抗体的任何组合施用给对象，优选人类，用以预防、治疗、控制或减轻膀胱癌或其症状。在一个具体实施方案中，将与本发明一个或多个生物标记的一个或多个蛋白质产物特异性结合的一种或多种抗体施用给对象，优选人类，结合其它类型的治疗用以预防、治疗、控制或减轻膀胱癌或其症状。在一个具体实施方案中，将本领域已知的与本发明一个或多个生物标记的一个或多个蛋白质产物特异性结合的抗体施用给对象，优选人类，单独或结合其它类型的治疗用以预防、治疗、控制或减轻膀胱癌或其症状。在其它实施方案中，不将本领域已知的与本发明一个或多个生物标记的一个或多个蛋白质产物特异性结合的抗体施用给对象，优选人类，单独或结合其它类型的治疗用以预防、治疗、控制或减轻膀胱癌或其症状。

使用多种本领域技术人员已知的递送***，将与本发明一个或多个生物标记的一个或多个蛋白质产物特异性结合的一种或多种抗体施用给对象，优选人类。例如，这样的抗体可通过包装到脂质体、微粒或微囊中施用。见，例如，美国专利No.5,762,904，美国专利No.6,004,534，和国际公开No.WO 99/52563。另外，这样的抗体可通过使用能够表达抗体的重组细胞、或者能够表达所述抗体的逆转录病毒、其它病毒载体或非病毒载体施用。

与本发明一个或多个生物标记的一个或多个蛋白质产物特异性结合的抗体可从任何已知来源获得。或者，与本发明一个或多个生物标记的一个或多个蛋白质产物特异性结合的抗体可通过本领域合成抗体的任何已知方法制得，特别是通过化学合成或优选地，通过重组表达技术。

抗体包括但不限于，多克隆抗体、单克隆抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、人抗体、人源化抗体、骆驼化(camelised)抗体、嵌合抗体、单链Fvs(scFv)(见，例如Bird等(1988)Science 242：423-426；和Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883)、单链抗体、单结构域抗体、Fab片段、F(ab’)片段、二硫键连接的Fvs(sdFv)、抗独特型(anti-Id)抗体(包含，例如，针对本发明抗体的抗独特型抗体)、和以上任意的抗原结合和/或表位结合片段。本文使用的术语“抗体”，指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性片段，即含有抗原结合位点的分子。免疫球蛋白分子可以是任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)，类别(例如，IgG₁、IgG₂、IgG₃、IgG₄、IgA₁、IgA₂)或亚类。免疫球蛋白分子的免疫活性片段的例子包含F(ab)片段(由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段)和F(ab’)₂片段(含有两个在铰链区通过二硫键相连的Fab片段的二价片段)，其可通过使用比如胃蛋白酶或木瓜蛋白酶的酶处理抗体来产生。免疫活性片段也包括但不限于，Fd片段(由VH和CH1结构域组成)、Fv片段(由抗体单臂的VL和VH结构域组成)、dAb片段(由VH结构域组成；Ward等，(1989)Nature 341：544-546)、和分离的互补决定区(CDR)。特异性结合抗原的抗体可通过本领域合成抗体的任何已知方法制得，特别是通过化学合成或优选地，通过重组表达技术。

特异性结合抗原的多克隆抗体可根据本领域公知的多种方法制得。例如，人抗原可施用给多种宿主动物，其包括但不限于，兔、小鼠、大鼠等，以诱导产生含有人抗原特异性多克隆抗体的血清。多种佐剂可用于增加免疫应答，其取决于宿主种类，包括但不限于，弗氏佐剂(完全和不完全)、矿物凝胶例如氢氧化铝、表面活性剂例如溶血卵磷脂、普朗尼克多羟基化合物类(pluronic polyols)、聚阴离子类、肽、油乳剂、钥孔帽贝血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanins)、二硝基酚、和可能有用于人类的佐剂例如BCG(卡介苗)和短棒菌苗(corynebacterium parvum)。这样的佐剂也是本领域公知的。

术语“单特异性抗体”指表现出对于特定靶标(例如表位)的单一结合特异性和亲和性的抗体。这一术语包括单克隆抗体。单克隆抗体可使用本领域已知的许多技术制备，其包含杂交瘤、重组、和噬菌体展示技术，或其组合。见，例如，美国专利No.RE 32,011，4,902,614，4,543,439，4,411,993and 4,196,265；Kennett等(eds.)，Monoclonal Antibodies，Hybridomas：A New Dimension in Biological Analyses，Plenum Press(1980)；和Harlow and Lane(eds.)，Antibodies.A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1988)，其作为参考并入本文。例如，单克隆抗体可使用杂交瘤技术产生，所述技术包含本领域已知的和例如，Harlow等，Antibodies：A Laboratory Manual，(Cold Spring HarborLaboratory Press，2nd ed.1988)；Hammerling，等，in：MonoclonalAntibodies and T-CeIl Hybridomas 563-681(Elsevier，N.Y.，1981)(所述参考文献通过参考以整体并入本文)中教导的。能够通过重组技术产生抗体的其它技术(例如，William D.Huse等，1989，Science，246：1275-1281；L.Sastry等，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86：5728-5732；and MichelleAlting-Mees等，Strategies in Molecular Biology，3：1-9(1990)involving acommercial system available from Stratacyte，La Jolla，Calif所述的技术)也可应用于构建单克隆抗体。本文所使用的术语“单克隆抗体”不限于通过杂交瘤技术产生的抗体。术语“单克隆抗体”指从单个克隆产生的抗体，所述克隆包含任何真核细胞、原核细胞、或噬菌体克隆，而不是指它所产生的方法。

使用杂交瘤技术产生和筛选特异性抗体的方法是本领域常规的且公知的。简言之，可使用本发明标记的蛋白质产物免疫小鼠，一旦检测到免疫应答，例如在小鼠血清中检测到所述蛋白特异性的抗体，收获所述小鼠的脾脏并分离脾细胞。接着通过公知技术将脾细胞与任意合适的骨髓瘤细胞融合，例如来自SP20细胞系的细胞，其可以来源于ATCC。通过有限稀释选择和克隆杂交瘤。另外，RIMMS(多位点重复免疫技术)可用于免疫动物(Kilptrack等，1997，Hybridoma 16：381-9，其通过参考整体并入本文)。然后通过本领域已知的方法测定杂交瘤克隆，以获得分泌能够结合本发明多肽的抗体的细胞。通过使用阳性杂交瘤克隆免疫小鼠，产生通常含有高水平抗体的腹水。

因此，本发明提供通过培养分泌本发明抗体的杂交瘤细胞产生抗体的方法，其中，优选的，所述杂交瘤通过融合脾细胞(其分离自使用本发明生物标记的蛋白质产物免疫的小鼠)和骨髓瘤细胞产生，接着筛选融合所得的杂交瘤，以获得分泌能够结合所述蛋白质或蛋白质片段的抗体的杂交瘤克隆。

识别本发明生物标记的蛋白质产物特异性表位的抗体片段可通过本领域技术人员已知的任何技术产生。例如，本发明的Fab和F(ab’)₂片段可通过免疫球蛋白分子的蛋白水解切割来制得，其使用例如木瓜蛋白酶(产生Fab片段)或胃蛋白酶(产生F(ab’)₂片段)的酶。F(ab’)₂片段含有可变区、轻链恒定区和重链的CH1结构域。另外，本发明抗体也可使用本领域已知的多种噬菌体展示方法产生。

在噬菌体展示方法中，功能性抗体结构域展示在噬菌体颗粒的表面，所述颗粒携带有编码它们的多聚核苷酸序列。特别的，编码VH和VL结构域的DNA序列扩增自动物cDNA文库(例如，被感染组织的人或鼠cDNA文库)。编码VH和VL结构域的DNA通过PCR用scFv连接子相互连接，并克隆进入噬菌粒载体。所述载体电穿孔进入E.coli并且E.coli被辅助噬菌体所感染。在这些方法中使用的噬菌体通常是丝状噬菌体，其包含fd和M13，并且VH和VL结构域通常以重组方式与噬菌体基因III或基因VIII相融合。可使用抗原对表达与特定抗原结合的抗原结合结构域的噬菌体进行选择或鉴定，例如使用标记的抗原，或者与固体表面或珠子连接或被其捕获的抗原。可用于生产本发明抗体的噬菌体展示方法的例子包括以下公开的：Brinkman等，1995，J.Immunol.Methods 182：41-50；Ames等，1995，J.Immunol.Methods 184：177-186；Kettleborough等，1994，Eur.J.Immunol.24：952-958；Persic等，1997，Gene 187：9-18；Burton等，1994，Advances in Immunology 57：191-280；PCT申请PCT/GB91/O1 134；国际公开WO 90/02809，WO 91/10737，WO 92/01047，WO 92/18619，WO 93/11236，WO 95/15982，WO 95/20401，和WO97/13844；以及美国专利5,698,426，5,223,409，5,403,484，5,580,717，5,427,908，5,750,753，5,821,047，5,571,698，5,427,908，5,516,637，5,780,225，5,658,727，5,733,743和5,969,108，以上每个作为参考以整体并入本文。

如以上参考文献所述，在噬菌体选择之后，来自噬菌体的抗体编码区域可被分离并用于产生整个抗体，其包含人类抗体，或任何其它所需的抗原结合片段，并且在任何所需的宿主中表达，所述宿主包含哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母、和细菌，例如如下所述。也可利用使用本领域已知方法的重组产生Fab、Fab’和F(ab’)₂片段的技术，比如以下公开的，国际公开WO 92/22324；Mullinax等，1992，BioTechniques 12(6)：864-869；Sawai等，1995，AJRI 34：26-34；and Better等，1988，Science240：1041-1043(所述参考文献通过参考以整体并入本文)。

为产生完整抗体，可使用PCR引物在scFv克隆中扩增VH或VL序列，所述引物包含VH或VL核酸序列、限制性位点、以及用于保护限制性位点的侧翼序列。应用本领域技术人员已知的克隆技术，可将所述PCR扩增的VH结构域克隆进表达VH恒定区(例如人γ4恒定区)的载体，以及将所述PCR扩增的VL结构域克隆进表达VL恒定区(例如人κ或λ恒定区)的载体。优选地，表达VH或VL结构域的载体包含EF-1α启动子、分泌信号、可变结构域克隆位点、恒定结构域、和选择标记(例如新霉素)。所述VH和VL结构域也可克隆进表达必要恒定区的同一个载体。然后，使用本领域技术人员已知的技术，将重链转变载体(heavy chainconversion vectors)和轻链转变载体共转染进入细胞系，以产生稳定或瞬时表达全长抗体(例如IgG)的细胞系。

对于一些应用，包括抗体在人体内的应用和体外检测测定，使用人抗体或嵌合抗体可能是优选的。完全人的抗体对于人类对象的治疗性处理来说，是特别期望的。人抗体可通过本领域已知的多种方法加以制备，其包括上文所述的使用来源于人免疫球蛋白序列的抗体库的噬菌体展示方法。也可参见，美国专利，4,444,887和4,716,111；以及国际公开WO98/46645，WO 98/50433，WO 98/24893，WO98/16654，WO 96/34096，WO96/33735，和WO 91/10741；以上每个通过参考以整体并入本文。

抗体也可通过转基因动物产生。特别的，人抗体可使用转基因小鼠产生，所述转基因小鼠不能表达功能性内源免疫球蛋白，但是其可表达人免疫球蛋白基因。例如，人重链和轻链免疫球蛋白基因复合体可随机导入或通过同源重组导入小鼠胚胎干细胞。或者，除所述人重链和轻链基因之外，人可变区、恒定区、和多样性区(diversity region)可导入小鼠胚胎干细胞。随着通过同源重组的人免疫球蛋白基因座的导入，可使得所述小鼠重链和轻链免疫球蛋白基因分别或同时失去功能。特别的，J_H区的纯合缺失阻止内源抗体的产生。扩增所述修饰的胚胎干细胞并显微注射进入胚泡以产生嵌合小鼠。接着培养嵌合小鼠以产生表达人抗体的纯合后代。使用所选择的抗原(例如本发明多肽的整体或部分)以通常形式免疫所述转基因小鼠。使用传统杂交瘤技术，可从被免疫的转基因小鼠获得抗所述抗原的抗体。在B细胞分化的过程中，转基因小鼠所含的人免疫球蛋白转基因重排，接着经历类型转换和体细胞突变。因此，使用这样的技术，有可能产生可用于治疗的IgG、IgA、IgM和IgE抗体。关于产生人抗体的这一技术的综述，可见，Lonberg and Huszar(1995，Int.Rev.Immunol.13：65-93).对于产生人抗体和人单克隆抗体以及产生这样抗体的方案的技术的详细讨论，可见，例如国际公开WO 98/24893，WO 96/34096，和WO96/33735；以及美国专利5,413,923，5,625,126，5,633,425，5,569,825，5,661,016，5,545,806，5,814,318，和5,939,598，其通过参考以整体并入本文。此外，公司(例如，Abgenix，Inc.(Freemont，CA)and Genpharm(San Jose，CA))也参与提供抗所选抗原的人抗体，其使用与上文描述相似的技术。

例如，美国专利5,849,992描述了在转基因小鼠的乳腺表达抗体的方法。构建转基因使其包含乳特异性启动子和编码感兴趣抗体的核酸以及分泌信号序列。这样的雌性转基因哺乳动物产生的乳包含，分泌于其中的感兴趣抗体。所述抗体可从乳中纯化出来，或者在某些应用中直接使用。

嵌合抗体是所述抗体的不同部分来自不同免疫球蛋白分子的分子。产生嵌合抗体的方法是本领域已知的。见，例如，Morrison，1985，Science229：1202；Oi等，1986，BioTechniques 4：214；Gillies等，1989，J.Immunol.Methods 125：191-202；和美国专利5,807,715，4,816,567，4,816,397，和6,331,415，其通过参考以整体并入本文。

人源化抗体是能够结合预定抗原的抗体或其变体或片段，并且其包含基本上具有人免疫球蛋白氨基酸序列的框架区和基本上具有非人免疫球蛋白氨基酸序列的CDR。人源化抗体基本上包含以下所有、至少一个和通常两个可变结构域(Fab、Fab’、F(ab’)₂Fabc、Fv)，其中所有或基本上所有CDR区对应于非人免疫球蛋白(即供体抗体)，以及所有或基本上所有框架区是人免疫球蛋白的一致序列。优选地，人源化抗体也包含至少一部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，典型的是人免疫球蛋白。通常，所述抗体将含有轻链和至少重链的可变结构域。所述抗体也可包含重链的CH1、铰链、CH2、CH3、和CH4区。所述人源化抗体可选自任何免疫球蛋白类型，包括IgM、IgG、IgD、IgA和IgE，以及任何亚型，包括IgG₁、IgG₂、IgG₃和IgG₄。通常，所述恒定结构域是补体固定的恒定结构域，当预期人源化抗体表现出细胞毒性，类别典型为IgG1。当这样的细胞毒性不是期望的，恒定结构域可以是IgG2类。所述人源化抗体可包含来自多于一个类型或同型的序列，并且选择特定恒定结构域以优化效应子功能是本领域的普通技术。人源化抗体的框架区和CDR区不需要精确对应于母序列，例如，供体CDR或一致框架，所述CDR或框架可通过替换、***或缺失至少一个残基被突变，使得所述CDR或框架残基在该位点不对应于一致抗体或导入抗体。但是，这样的突变将不是普遍的。通常，至少75％的人源化抗体残基将对应于母FR和CDR序列，更经常是90％，最优选是大于95％。人源化抗体可使用多种本领域已知技术进行生产，所述技术包括但不限于，CDR移植(欧洲专利EP 239,400；国际公开WO 91/09967；和美国专利5,225,539，5,530,101，和5,585,089)，镶饰(veneering)或重新表面化(resurfacing)(欧洲专利EP 592,106和EP 519,596；Padlan，1991，Molecular Immunology 28(4/5)：489-498；Studnicka等，1994，ProteinEngineering 7(6)：805-814；和Roguska等，1994，PNAS 91：969-973)，链置换(美国专利5,565,332)，以及以下公开的技术，例如，美国专利6,407,213，美国专利5,766,886，WO 9317105，Tan等，2002，J.Immunol.169：1119-25，Caldas等，2000，Protein Eng.13(5)：353-60，Morea等，2000，Methods 20(3)：267-79，Baca等，1997，J.Biol.Chem.272(16)：10678-84，Roguska等，1996，Protein Eng.9(10)：895～904，Couto等，1995，CancerRes.55(23Supp)：5973s-5977s，Couto等，1995，Cancer Res.55(8)：1717-22，Sandhu JS，1994，Gene 150(2)：409-10，和Pedersen等，1994，J.Mol.Biol.235(3)：959-73。经常的，框架区中的框架残基将被来自CDR供体抗体的相应残基所替换，以改变，优选提高，抗原结合。这些框架替换通过本领域公知技术进行鉴定，例如，通过对所述CDR和框架残基的相互作用建模来鉴定对抗原结合重要的框架残基，以及通过序列比较来鉴定在特定位置的非寻常框架残基。(可见，例如，Queen et al.，美国专利No.5,585,089；和Riechmann et al.，1988，Nature 332：323，其通过参考以整体并入本文。)

单结构域抗体(例如，缺乏轻链的抗体)可通过本领域公知的方法产生。见Riechmann等1999，J.Immuno.231：25-38；Nuttall等，2000，Curr.Pharm.Biotechnol.1(3)：253-263；Muylderman，2001，J.Biotechnol.74(4)：277302；美国专利6,005,079；和国际公开WO 94/04678，WO94/25591，和WO 01/44301，其中每个通过参考以整体并入本文。

此外，特异性结合抗原的抗体可接着应用于产生抗独特型抗体，其使用本领域技术人员公知的技术“模拟”抗原。(可见，例如，Greenspan&Bona，1989，FASEB J.7(5)：437-444；和Nissinoff，1991，J.Immunol.147(8)：2429-2438)。这样的抗体可单独使用，或与其它疗法组合使用，以预防、治疗、控制或减轻膀胱癌或其症状。

本发明包括多聚核苷酸，其包含编码特异性结合抗原的抗体或其片段的核苷酸序列。本发明也包括在高严谨、中或低严谨杂交条件下与编码本发明抗体的多聚核苷酸杂交的多聚核苷酸。

所述多聚核苷酸以及决定所述多聚核苷酸的核苷酸序列可通过本领域已知的任何方法获得。编码已知抗体的核苷酸序列可使用本领域公知的方法确定，即，已知编码特定氨基酸的核苷酸密码子可以这样的方法组装以产生编码所述抗体的核酸。这样的编码所述抗体的多聚核苷酸可以从化学合成的寡聚核苷酸(例如，如Kutmeier等，1994，BioTechniques 17：242所述)组装，其简要的说，包括合成含有编码抗体的部分序列的重叠寡聚核苷酸、片段、或其变体，退火以及连接这些寡聚核苷酸，然后通过PCR扩增连接的寡聚核苷酸。

或者，编码抗体的多核苷酸可从来自合适来源的核酸产生。如果含有编码特定抗体的核酸的克隆不可用，但是所述抗体分子的序列已知，编码免疫球蛋白的核酸可以化学合成或者从合适来源(例如，抗体cDNA文库或产生自任何表达该抗体的组织或细胞的cDNA文库，或分离自上述组织或细胞的核酸，优选多聚A+RNA，所述组织或细胞比如所选的表达本发明抗体的杂交瘤细胞)通过PCR扩增或者克隆获得，所述PCR扩增使用了可与3’和5’末端序列杂交的合成引物，所述克隆使用了对特定基因序列具有特异性的寡聚核苷酸探针，所述基因序列是为鉴定，例如来自编码所述抗体的cDNA文库的cDNA克隆。通过PCR产生的扩增核酸可接着使用本领域公知的任何方法被克隆进可复制克隆载体。

一旦所述抗体的核酸序列被确定，可使用本领域为处理核苷酸序列的公知方法对所述抗体的核酸序列进行处理，所述方法例如重组DNA技术、定点诱变、PCR等(可见，例如，Sambrook等，1990，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，2d Ed.，Cold Spring Harbor Laboratory，ColdSpring Harbor，NY和Ausubel等，eds.，1998，Current Protocols inMolecular Biology，John Wiley&Sons，NY中所述的技术，其通过参考以整体并入本文)，以产生具有不同氨基酸序列的抗体，例如产生氨基酸取代、缺失、和/或***。

一旦已经获得本发明的编码抗体分子、抗体重链或轻链、或其片段(优选，但是不必须，含有重链或轻链可变结构域)的多聚核苷酸，产生所述抗体分子的载体可使用本领域公知的技术通过重组DNA技术产生。

在一个优选实施方案中，在哺乳动物细胞中产生单克隆抗体。优选的用于表达所述克隆抗体或其抗原结合片段的哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO细胞)(包括dhfr-CHO细胞，其描述于Urlaub andChasin(1980，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216-4220)，其使用了DHFR选择标记，例如，如Kaufman and Sharp(1982，Mol.Biol.159：601-621)中所述，淋巴细胞系，例如，NS0骨髓瘤细胞和SP2细胞，COS细胞和来自转基因动物的细胞，例如转基因哺乳动物。例如，所述细胞是哺乳动物上皮细胞。

除了编码各种免疫球蛋白结构域的核酸序列之外，重组表达载体可携带其它序列，比如调控载体在宿主细胞内复制的序列(例如复制起点)和选择标记基因。所述选择标记基因促进对宿主细胞的选择，所述宿主细胞是已经导入所述载体的细胞(可见，例如美国专利4,399,216，4,634,665，和5,179,017)。例如，通常所述选择标记基因表现出对药物的抗性，例如G418、潮霉素或甲氨蝶呤，其施加在所述载体所导入的宿主细胞上。优选的选择标记基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(用于甲氨蝶呤选择/扩增的dhfr^-宿主细胞)和neo基因(用于G418选择)。

在本发明的抗体或者其抗原结合部分的重组表达的典型***中，通过磷酸钙介导的转染，将编码抗体重链和抗体轻链的表达载体导入dhfr^-CHO细胞。在重组表达载体中，抗体重链和轻链基因可操作地连接了增强子/启动子调控元件(例如，来源于SV40，CMV，腺病毒等，比如CMV增强子/AdMLP启动子调控元件或SV40增强子/AdMLP启动子调控元件)来驱动所述基因的高水平转录。所述重组表达载体也携带DHFR基因，其允许使用甲氨蝶呤选择/扩增来选择已转染了所述载体的CHO细胞。培养所选择的转化宿主细胞以允许抗体重链和轻链表达，并且从培养基中回收完整的抗体。标准分子生物学技术用于制备重组表达载体、转染宿主细胞、选择转化体、培养宿主细胞以及从培养基中回收抗体。例如，一些抗体可使用蛋白A或蛋白G通过亲和色谱来进行分离。

对于包含Fc结构域的抗体，抗体生产***优选合成Fc区被糖基化的抗体。例如IgG分子的Fc结构域在CH2结构域的297号天冬酰胺上被糖基化。此天冬酰胺是双触角型寡糖修饰的位点。已证明，此糖基化是Fcγ受体和补体C1q介导的效应子功能必需的(Burton and Woof，1992，Adv.Immunol.51：l-84；Jefferis等，1998，Immunol.Rev.163：59-76)。在一个优选实施方案中，Fc结构域在哺乳动物表达***中产生，所述***适当地使对应于297号天冬酰胺的残基糖基化。所述Fc结构域也可包含其它真核翻译后修饰。

一旦重组表达产生抗体分子，可通过任何本领域已知的纯化免疫球蛋白分子的方法对抗体分子进行纯化，例如，通过色谱(例如，离子交换、亲和特别是在蛋白A之后通过与特定抗原的亲和、以及体积排阻色谱)、离心、溶解性差异、或任何其它纯化蛋白质的标准技术。此外，所述抗体或其片段可与本领域已知的异源多肽序列融合以方便纯化。

基因治疗技术

基因治疗指通过向对象施用表达的或可表达的核酸实施的治疗。根据本发明可使用本领域可用于基因治疗的任何方法。典型的方法如下所述。

在一个具体实施方案中，通过基因治疗的方法，施用本发明一个或多个生物标记的一个或多个反义寡聚核苷酸，以预防、治疗、控制或减轻膀胱癌或其症状。在另一些实施方案中，通过基因治疗的方法，施用包含一个或多个抗体编码核酸的一个或多个核酸分子，以预防、治疗、控制或减轻膀胱癌或其症状，所述抗体特异性结合一个或多个本发明标记的一个或多个蛋白质产物。在另一些实施方案中，通过基因治疗的方法，施用包含本发明一个或多个生物标记的一个或多个蛋白质产物或其类似物、衍生物或片段的编码核酸的一个或多个核酸分子，以预防、治疗、控制或减轻膀胱癌或其症状。在另一些实施方案中，通过基因治疗的方法，施用包含一个或多个显性负多肽编码核酸的一个或多个核酸分子，以预防、治疗、控制或减轻膀胱癌或其症状，所述显性负多肽是本发明一个或多个生物标记的一个或多个蛋白质产物的显性负多肽。

对于基因治疗方法的一般综述，可见Goldspiel等，1993，ClinicalPharmacy 12：488-505；Wu and Wu，1991，Biotherapy 3：87-95；Tolstoshev，1993，Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32：573-596；Mulligan，1993，Science260：926-932；和Morgan and Anderson，1993，Ann.Rev.Biochem.62：191-217；May，1993，TIBTECH 11(5)：155-215).可用的本领域普遍已知的重组DNA技术的方法如下所述Ausubel等(eds.)，1993，CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，NY；和Kriegler，1990，Gene Transfer and Expression，A Laboratory Manual，Stockton Press，NY。

在一个方面中，本发明的组合物包含编码一个或多个抗体的核酸序列，所述抗体特异性结合本发明一个或多个生物标记的一个或多个蛋白质产物，所述核酸序列是在合适宿主中表达一个或多个抗体的表达载体的一部分。特别的，这样的核酸序列具有可操作连接到抗体的启动子，所述启动子是可诱导的或组成型的，并且，优选是组织特异性的。

在另一个方面中，本发明的组合物包含编码显性负多肽的核酸序列，所述显性负多肽是本发明一个或多个生物标记的一个或多个蛋白质产物的显性负多肽，所述核酸序列是在合适宿主中表达显性负多肽的表达载体的一部分。特别的，这样的核酸序列具有可操作连接到显性负多肽的启动子，所述启动子是可诱导的或组成型的，并且，任选地是组织特异性的。在另一个具体实施方案中，核酸分子，其中显性负编码序列和任何其它所需序列侧翼与促使在基因组中所需位点发生同源重组的区域相接，因此提供了显性负核酸的染色体内表达(Koller and Smithies，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：8932-8935；Zijlstra等，1989，Nature 342：435-438)。

递送所述核酸进入患者可以是直接递送，在这种情况下患者直接接触到核酸或携带核酸的载体，或者间接递送，在这种情况下，首先用所述核酸在体外转化细胞，接着将细胞植入患者。已知这两种方法分别为体内或离体基因治疗。

在一个具体实施方案中，所述核酸序列直接体内施用，在体内其表达产生编码产物。这可通过本领域已知的多种方法中的任何方法完成，例如，通过将其构建作为适当的核酸表达载体的一部分并且施用其使得它们变为细胞内的，例如通过使用缺陷或减毒逆转录病毒或者其它病毒载体(见美国专利4,980,286)，或者通过直接注射裸DNA，或者通过使用微粒轰击(例如，基因枪；Biolistic，Dupont)，或者由脂质或细胞表面受体或转染试剂所包被，封装在脂质体、微粒、或微囊中，或者通过将它们连接到已知进入细胞核的肽而施用，通过将它连接到受到受体介导胞吞作用的配体而施用(见，例如，Wu and Wu，1987，J.Biol.Chem.262：4429-4432)(其用于靶向特异性表达所述受体的细胞类型)，等等。在另一个实施方案中，核酸-配体复合物可被形成，其中所述配体包含融合病毒肽以破裂内涵体，使得所述核酸避免溶酶体降解。在另一个实施方案中，通过靶向到特异性受体，所述核酸可体内靶向细胞特异性摄入和表达(见，例如，国际公开WO 92/06180，1992年4月16日(Wu等)；WO 92/22635，1992年12月23日(Wilson等)；WO92/20316，1992年11月26日(Findeis等)；WO 93/14188，1993年7月22日(Clarke等)，WO 93/20221，1993年10月14日(Young))。或者，所述核酸可在细胞内导入并且为了表达通过同源重组合并整合入宿主细胞DNA(Koller and Smithies，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：8932-8935；Zijlstra等，1989，Nature 342：435-438)。

例如，可应用逆转录病毒。这些逆转录病毒载体已经过修饰删除了包装病毒基因组和整合到宿主DNA不需要的逆转录病毒序列。编码用于基因治疗的感兴趣抗体或感兴趣蛋白质或其片段的核酸序列被克隆进一个或多个载体，其使得基因递送进入患者。关于逆转录病毒更详细的描述可见于Boesen等，1994，Biotherapy 6：291-302，其描述了应用于将mdr1基因递送到造血干细胞中的逆转录病毒载体，其目的是使得干细胞更能抵抗化学治疗。其它参考文献举例说明了逆转录病毒在基因治疗中的应用：Clowes等，1994，J.Clin.Invest 93：644-651；Kiem等，1994，Blood83：1467-1473；Salmons和Gunzberg，1993，Human Gene Therapy4：129-141；和Grossman和Wilson，1993，Curr.Opin.in Genetics andDevel.3：110-114。

腺病毒是另外的用于基因治疗的病毒载体。腺病毒是特别有吸引力的用于递送基因到呼吸上皮细胞的载体。腺病毒自然感染呼吸上皮细胞造成轻微疾病。基于腺病毒的递送***的其它靶标有肝脏、中枢神经***、内皮细胞、和肌肉。腺病毒具有能够感染非***细胞的优点。Kozarsky andWilson，1993，Current Opinion in Genetics and Development 3：499-503给出了基于腺病毒的基因治疗的综述。Bout等，1994，Human Gene Therapy5：3-10证明了腺病毒载体在传递基因到恒河猴呼吸上皮细胞的应用。腺病毒用于基因治疗的其它例子可在Rosenfeld等，1991，Science252：431-434；Rosenfeld等，1992，Cell 68：143-155；Mastrangeli等，1993，J.Clin.Invest.91：225-234；PCT公开WO94/12649；and Wang，等，1995，GeneTherapy 2：775-783中找到。在一个优选实施方案中，使用腺病毒载体。

腺伴随病毒(AAV)也已经计划用于基因治疗(Walsh等，1993，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.204：289-300；美国专利5,436,146)。

基因治疗的另一个方法包括将基因转移到组织培养中的细胞，其通过例如电穿孔、脂质体转染、磷酸钙介导转染、或病毒转染的方法。通常，转移方法包括将选择标记转移到所述细胞。接着选择这些细胞以分离已经带有并且正在表达所转移基因的细胞。然后将这些细胞递送给患者。

在这个实施方案中，将所述核酸导入到细胞中，然后体内施用所得重组细胞。这样的导入可通过本领域任何已知的方法实施，其包括但不限于转染、电穿孔、显微注射、含有所述核酸序列的病毒或噬菌体载体转染、细胞融合、染色体介导基因转移、微细胞介导基因转移、原生质体融合等。用于导入外源基因到细胞中的多种技术是本领域已知的(见，例如，Loefflerand Behr，1993，Meth.Enzymol.217：599-618；Cohen等，1993，Meth.Enzymol.217：618-644；Cline，1985，Pharmac.Ther.29：69-92)并且可根据本发明进行应用，只要受体细胞必要的发育和生理功能不被破坏。所述技术应提供所述核酸稳定转移到所述细胞，使得所述核酸可被细胞表达，并且优选可遗传且可被后代细胞表达。

所得重组细胞可通过多种本领域已知方法递送到患者。重组血细胞(例如，造血干细胞或祖细胞)和/或软骨细胞优选静脉内施用。预计使用细胞的量取决于所需效果、患者状态等，并且可被本领域技术人员所确定。

为了基因治疗目的而可导入核酸的细胞包含任何需要的、可用的细胞类型，并且包括但不限于上皮细胞、内皮细胞、角化细胞、软骨细胞、成纤维细胞、肌细胞、肝细胞、血细胞(例如T淋巴细胞、B淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、巨核细胞、颗粒细胞)、多种干细胞或祖细胞(特别是造血干细胞或祖细胞，例如从骨髓、脐带血、外周血、胎儿肝脏获得的)等。

在一个优选实施方案中，用于基因治疗的细胞是患者自体来源的。

在一个重组细胞用于基因治疗的实施方案中，编码感兴趣抗体、或感兴趣蛋白质或其片段的核酸序列被导入细胞，使得它们可被细胞或者细胞的后代表达，接着所述重组细胞被体内施用以达到治疗效果。在一个具体实施方案中，使用干细胞或祖细胞。根据本发明的此实施方案，任何可被分离并体外维持的干细胞和/或祖细胞可以被应用(见，例如，国际公开WO94/08598，1994年4月28日；Stemple和Anderson，1992，Cell 71：973-985；Rheinwald，1980，Meth.Cell Bio.21A：229；和Pittelkow和Scott，1986，Mayo Clinic Proc.61：771)。

可用于控制编码感兴趣抗体、感兴趣蛋白质或其片段的核酸序列表达的启动子可以是组成型的、可诱导的或组织特异性的。非限制性实例包括SV40早期启动子区(Bernoist和Chambon，1981，Nature 290：304-310)，所述启动子含有劳斯肉瘤病毒的3’长末端重复区(Yamamoto，et al.，1980，Cell 22：787-797)，疱疹胸腺嘧啶激酶启动子(Wagner et al.，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：1441-1445)，金属硫蛋白基因调控序列(Brinster etal.，1982，Nature 296：39-42)；原核表达载体例如β-内酰胺酶启动子(Villa-Kamaroff et al.，1978，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75：3727-3731)，或tac启动子(DeBoer et al.，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80：21-25)，也可见“Useful proteins from recombinant bacteria”in Scientific American，1980，242：74-94；植物表达载体包含胭脂碱合成酶启动子区(Herrera-Estrella et al.，Nature 303：209-213)或花椰菜花叶病毒35S RNA启动子(Gardner et al.，1981，Nucl.Acids Res.9：2871)，和光合酶二磷酸核酮糖羧化酶的启动子(Herrera-Estrella et al.，1984，Nature 310：115-120)；来自酵母或其它真菌的启动子元件，例如Gal4启动子，ADC(乙醇脱氢酶)启动子，PGK(磷酸甘油激酶)启动子，碱性磷酸酶启动子，和下述动物转录调控区，其表现出组织特异性并且已经用于转基因动物：弹性蛋白酶I基因调控区，其在胰腺腺泡细胞中有活性(Swift et al.，1984，Cell38：639-646；Ornitz et al.，1986，Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.50：399-409；MacDonald，1987，Hepatology 7：425-515)；胰岛素基因调控区，其中胰腺β细胞中有活性(Hanahan，1985，Nature 315：115-122)，免疫球蛋白基因调控区，其在淋巴细胞中有活性(Grosschedl et al.，1984，Cell38：647-658；Adames et al.，1985，Nature 318：533-538；Alexander et al.，1987，MoI.Cell.Biol.7：1436-1444)，小鼠乳腺癌病毒调控区，其在睾丸、乳腺、淋巴和肥大细胞中有活性(Leder et al.，1986，Cell 45：485-495)，白蛋白基因调控区，其在肝脏中有活性(Pinkert et al.，1987，Genes and Devel.1：268-276)，甲胎蛋白基因调控区，其在肝脏中有活性(Krumlauf et al.，1985，MoI.Cell.Biol.5：1639-1648；Hammer et al.，1987，Science 235：53-58；α1-抗胰蛋白酶基因调控区，其中肝脏有活性(Kelsey et al.，1987，Genesand Devel.1：161-171)，β珠蛋白基因调控区，其在骨髓细胞有活性(Mogram et al.，1985，Nature 315：338-340；Kollias et al.，1986，Cell46：89-94；髓磷脂碱性蛋白调控区，其在脑中的少突胶质细胞有活性(Readhead et al.，1987，Cell 48：703-712)；肌球蛋白轻链-2基因调控区，其在骨骼肌中有活性(Sani，1985，Nature 314：283-286)，和促性腺释放激素基因调控区，其在下丘脑有活性(Mason et al.，1986，Science234：1372-1378)。

在一个具体实施方案中，出于基因治疗目的，待导入核酸包含可诱导启动子，其可操作的连接到编码区，使得所述核酸的表达是可控的，其通过控制适当转录诱导物的存在与否来控制表达。

5.20药用组合物

使用本发明方法鉴定的生物活性化合物或其药用可接受盐可施用给患有膀胱癌的患者，优选哺乳动物，更优选人类。在一个具体实施方案中，化合物或其药用可接受盐可施用给患有晚期膀胱癌和/或早期膀胱癌的患者，优选哺乳动物，更优选人类。在另一个实施方案中，化合物或其药用可接受盐可作为对膀胱癌的预防措施施用给患者，优选哺乳动物，更优选人类。根据这些实施方案，所述患者可以是儿童、成年或老年，其中“儿童”是年龄在24个月到18岁之间的对象，“成年”是年龄在18岁以上的对象，而“老年”是年龄在65岁以上的对象。

当施用给患者时，所述化合物或其药用可接受盐优选作为组合物的组分施用，所述组合物任选的包含药用可接受载体。所述组合物可经口施用，或通过其它任何方便的途径，例如，通过输注(infusion)或快速推注(bolus injection)，通过经上皮或经皮肤粘膜(例如口腔粘膜、直肠、和肠粘膜等)吸收，并且可与另一种生物活性剂共同施用。施用可以是全身性的或局部的。多种递送***是已知的，例如，封装在脂质体、微粒、微囊、胶囊等中，并且所述***可用于施用所述化合物和其药用可接受盐。

施用方法包括但不限于皮内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外、经口、舌下、鼻内、脑内、***内、经皮肤、经直肠、通过吸入、或局部的(特别是耳、鼻、眼、或皮肤)。施用的模式留给执业医师判断。在大多数情况下，施用会导致化合物或其药用可接受盐释放到血液中。

在一个具体实施方案中，局部施用所述化合物或其药用可接受盐可以是期望的。例如，但不作为限制，这可通过手术过程中的局部输注、局部施用(例如，与手术后的创伤敷料相结合)，通过注射，通过导管，通过栓剂，或者通过植入完成，所述植入是多孔材料、无孔材料、或凝胶状材料，其包含膜(例如sialastic膜)或纤维。

在某些实施方案中，可预期通过任何适当途径，导入所述化合物或其药用可接受盐到中枢神经***，所述途径包含脑室内、鞘内(intrathecal)和硬膜外注射。脑室内注射可通过脑室内导管实施，例如与储库(reservoir)(比如Ommaya储库)相连。

也可使用肺部施用，例如通过吸入器或喷雾器，并且使用烟雾剂的配方，或者通过氟碳化合物或合成的肺表面活性剂进行灌注。在某些实施方案中，所述化合物和其药用可接受盐可制成栓剂，其使用传统的粘合剂和载体(例如甘油三酯)。

在另一个实施方案中，所述化合物和其药用可接受盐可在储库中递送，特别是脂质体(见Langer，1990，Science 249：1527-1533；Treat et al.，inLiposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer，Lopez-Berestein and Fidler(eds.)，Liss，New York，pp.353-365(1989)；Lopez-Berestein，同上.，pp.317-327；一般地可参见上文)。

在又一个实施方案中，所述化合物和其药用可接受盐可在控释***中递送(见，例如，Goodson，in Medical Applications of Controlled Release，如上，vol.2，pp.115-138(1984))。可使用综述Langer，1990，Science249：1527-1533中所讨论的其它控释***。在一个实施方案中，可使用泵(见Langer，如上；Sefton，1987，CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14：201；Buchwald et al.，1980，Surgery 88：507；Saudek et al.，1989，N.Engl.J.Med.321：574)。在另一个实施方案中，可使用聚合物材料(见MedicalApplications of Controlled Release，Langer and Wise(eds.)，CRC Pres.，Boca Raton，Florida(1974)；Controlled Drug Bioavailability，Drug ProductDesign and Performance，Smolen and Ball(eds.)，Wiley，New York(1984)；Ranger and Peppas，1983，J.Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.23：61；也可见Levy et al.，1985，Science 228：190；During et al.，1989，Ann.Neurol.25：351；Howard et al.，1989，J.Neurosurg.71：105)。在又一个实施方案中，控释***可被置于化合物或其药用可接受盐的靶RNA附近，因此只需要全身性剂量的一小部分即可。

本文所述的化合物可被掺入适于施用的药用组合物。这样的组合物通常包含所述活性化合物和药用可接受载体。本文所用的术语“药用可接受载体”意思包括任何和所有的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗和延迟吸收剂等，其与药物施用相容。这样的介质和制剂用于药用活性物质的应用是本领域公知的。除了任何传统的与所述活性化合物不相容的介质或制剂之外，都可考虑其应用于组合物。补充活性化合物也可掺入所述组合物。

本发明包括制备用于调节感兴趣多肽或核酸的表达或活性的药用组合物的方法。这样的方法包括配制药用可接受载体和调节感兴趣的多肽或核酸的表达或活性的药剂。这样的组合物还可包含其它一些活性物质。因此，本发明还包括制备药用组合物的方法，其通过配制药用可接受载体和调节感兴趣多肽或核酸的表达或活性的药剂以及一种或多种其它的活性化合物。

本发明的药用组合物被配制成与其预期的施用途径相适应。施用途径的实例包含胃肠外，例如，静脉内、皮层内、皮下、经口(例如吸入)、透皮肤的(局部)、透粘膜的、和直肠施用。静脉内施用是优选的。用于胃肠外、皮内或皮下施用的溶液或混悬液可包含以下成分：无菌稀释剂(例如注射用水、盐溶液、不挥发油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂)；抗菌剂(例如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯)；抗氧化剂(例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠)；螯合剂(例如乙二胺四乙酸)；缓冲剂(例如醋酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐)以及用于改变渗透压的物质(例如氯化钠或葡萄糖)。使用酸或碱调节pH，例如盐酸或氢氧化钠。胃肠外制备物可封装在玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶中。

适于注射用途的药用组合物包含无菌水溶液(水溶的)或分散体系以及用于即时制备无菌注射溶液或分散体系的无菌粉末。用于静脉内施用时，合适的载体包含生理盐水、抑菌水、Cremophor EL^TM(BASF；Parsippany，NJ)或磷酸盐缓冲液(PBS)。在所有的情况下，所述组合物必须是无菌的并且应该是流体，其流体程度是使得方便注射器使用的。它必须在制造和保存条件下是稳定的，并且必须防止微生物(例如细菌和真菌)的污染。所述载体可以是溶剂或分散介质，其包括，例如，水、乙醇、多羟基化合物(例如甘油、丙二醇、和液体聚乙二醇等)、及其合适的混合物。可以保持合适的流动性，例如，通过使用包衣(例如卵磷脂)，通过在分散体系的情况下维持所需的颗粒大小，以及通过使用表面活性剂。防止微生物的作用可以通过多种抗细菌和抗真菌剂(例如对羟基苯甲酸类、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等)来完成。在许多情况下，它将优选在组合物中包含等渗剂(isotonic agent)，例如，糖类，多元醇类(例如甘露醇、山梨醇)，氯化钠。通过在组合物中包含延迟吸收的物质(例如单硬脂酸铝)可以带来注射用组合物的延长吸收。

无菌注射溶液可通过以下步骤制备：将所需量的活性化合物(例如多肽或抗体)加入合适溶剂中，所述溶剂包含上文列举的一种成分或成分组合，随后根据需要过滤灭菌。通常，通过将活性化合物加入到无菌载体中来制备分散体系，所述无菌载体含有基本分散介质和所需的上文所列举的其它成分。在用于制备无菌注射溶液的无菌粉末的情况下，优选制备方法是真空干燥和冷冻干燥，其得到来自于之前过滤灭菌溶液的活性成分以及任何其它所需成分的粉末。

经口的组合物通常包含惰性稀释剂或可食用载体。它们可包装在明胶胶囊或压制成片剂。为了经口治疗性施用的目的，所述活性化合物可与赋形剂混合，并以片剂、锭剂、或胶囊的形式使用。经口的组合物也可使用流体载体来制备，其用于漱口，其中流体载体中的所述化合物是经口施用、漱口，然后吐出或咽下。

药用相容粘合剂，和/或辅助材料可作为所述组合物的一部分包括在内。片剂、丸剂、胶囊、锭剂等可含有下述任何成分，或者性质相似的化合物：粘合剂(例如微晶纤维素、黄蓍胶或明胶)；赋形剂(例如淀粉或乳糖)，崩解剂(例如藻酸、Primogel或玉米淀粉)；润滑剂(例如硬脂酸镁或Sterotes)；助流剂(例如胶体二氧化硅)；甜味剂(例如蔗糖或糖精)；或者芳香剂(例如薄荷、水杨酸甲酯、或柠檬香精)。

对于通过吸入施用，所述化合物以气溶胶喷雾的形式递送，其来自压力容器或分配器，其含有合适的抛射剂，例如气体(比如二氧化碳)，或喷雾器。

全身性施用也可通过透粘膜的或透皮肤的方式。对于透粘膜或透皮肤施用，在配方中使用适于待穿透的载体的渗透剂。这样的渗透剂通常是本领域已知的，包括，例如，对于透粘膜施用来说，去污剂、胆酸盐、和梭链孢酸衍生物。穿过粘膜施用可通过使用鼻喷雾或栓剂完成。对于透皮肤施用，所述活性化合物如本领域通常已知的，被配制成软膏剂(ointment)、油膏(salve)、凝胶、或霜剂。

所述化合物也可被配制成栓剂形式(例如，使用传统的栓剂基质(例如可可脂或其它甘油酯))或用于直肠递送的灌肠剂形式。

在一个实施方案中，所述活性化合物与载体一起制备，所述载体将保护所述化合物免受身体的快速排出，例如控释配方，其包含植入和微囊递送***。可使用生物可降解、生物相容聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐类、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯类、和聚乳酸。制备这样配方的方法对本领域技术人员来说将是明显的。所述材料也可从Alza Corporation和Nova Pharmaceuticals，Inc.购得。脂质体混悬液(包含靶向被感染细胞的脂质体以及抗病毒抗原的单克隆抗体)也可用作药用可接受载体。这些可通过本领域技术人员已知的方法制备，如美国专利4,522,811中所述。

配制以剂量单位形式存在的经口或胃肠外的组合物是特别有利的，其方便施用且具有剂量的均一性。本文所用的剂量单位形式指物理上分离的单位，其适用作对待治疗对象的单位剂量；每个单位含有预定量的经计算可产生预期疗效的活性化合物，其联合了所需药用载体。本发明剂量单位形式的规格是根据并直接依赖于所述活性化合物的独特特征和所要达到的特定疗效，以及本领域中对混合用于个体治疗的这类活性化合物的固有限制。

对于抗体，优选剂量是0.1mg/kg体重到100mg/kg体重(更优选0.1到20mg/kg，0.1到10mg/kg，或者0.1到1.0mg/kg)。如果所述抗体是在脑中起作用的，通常50mg/kg到100mg/kg的剂量是合适的。通常，部分人抗体和完整人抗体在人体内具有相对于其它抗体较长的半衰期。因此，较低的剂量和较低的施用频率经常是可能的。修饰(例如脂化)可用于稳定抗体和增加摄入和组织穿透性(例如，进入脑中)。Cruikshank等(1997，J.Acquired Immune Deficiency Syndromes and HumanRetrovirology 14：193)描述了脂化抗体的方法。

在一个具体实施方案中，蛋白质或多肽的有效量(即有效剂量)范围为约0.001到30mg/kg体重，优选约0.01到25mg/kg体重，更优选约0.1到20mg/kg体重，甚至更优选约0.1到1.0mg/kg体重、1到10mg/kg体重、2到9mg/kg体重、3到8mg/kg体重、4到7mg/kg体重、或者5到6mg/kg体重。

技术人员将理解某些因素可能影响有效治疗对象所必需的剂量，其包括但不限于疾病或病症的严重程度、先前治疗、整体健康状况和/或对象年龄、以及存在的其它疾病。另外，使用治疗有效量的蛋白质、多肽、或抗体对对象的治疗可包括单一治疗，或者优选，可包括一系列治疗。

除了上文所描述的那些化合物之外，本发明包含调节感兴趣核酸或多肽的表达或活性的小分子的应用。小分子的非限制性实例包含肽、拟肽、氨基酸、氨基酸类似物、多聚核苷酸、多聚核苷酸类似物、核苷酸、核苷酸类似物、具有小于约10,000g/mol分子量、具有小于约5,000g/mol分子量、具有小于约1,000g/mol分子量、具有小于约500g/mol分子量的有机或无机化合物(即包含异有机(heteroorganic)和有机金属化合物)、以及这些化合物的盐、酯、和其它药用可接受形式。

可理解，小分子物质的合适剂量取决于许多因素，其在普通医师、兽医、或研究人员的知识范围内。小分子的剂量将根据，例如，对象或待治疗样本的特征、大小、和情况而发生变化，另外将根据施用所述组合物的途径而发生变化，如果可行，以及将根据医师期望小分子对本发明核酸或多肽所起的作用而发生变化。典型剂量包含每千克对象或样本体重毫克或微克量的小分子(例如，约1微克每千克到约500毫克每千克，约100微克每千克到约5毫克每千克，或者约1微克每千克到约50微克每千克)。此外，可理解小分子的合适剂量取决于小分子对于待调节表达或活性的效力。这样的合适剂量可使用本文描述的测定来确定。当对对象(例如，人)施用这些小分子的一种或多种，以调节本发明多肽或核酸的表达或活性时，医师、兽医、或研究人员可，例如，首先给出相对低剂量的处方，接着增加剂量直至获得合适的反应。另外，可理解，对于任何特定动物对象的特定剂量水平将取决于多种因素，其包括所使用特定化合物的活性、所述对象的年龄、体重、整体健康状况、性别、和饮食，施用时间、施用途径、***速率，任何药物组合，以及待调节的表达或活性程度。

所述药用组合物可与使用说明一起包含在容器、包装、或分配器中。

5.21试剂盒

本发明提供用于测量本发明生物标记的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少45个、至少50个、所有或任何组合的蛋白质和RNA产物的表达的试剂盒。这样的试剂盒包含测量这些蛋白质和RNA产物的表达所必需的材料和试剂。在一个具体实施方案中，所述试剂盒可另外包含一种或多种在多种方法中所使用的另外的试剂，例如：(1)用于稳定和/或从血液或组织中纯化RNA的试剂(2)用于产生测试核酸的引物；(3)dNTP和/或rNTP(预先混合的或分开的)，任选的与一种或多种特定标记的dNTP和/或rNTP(例如生物素标记的或者带有Cy3或Cy5标签的dNTP)一起；(4)合成后标记试剂，例如荧光染料的化学活性衍生物；(5)酶，例如逆转录酶、DNA聚合酶等；(6)多种缓冲剂，例如，反应、杂交和洗涤缓冲剂；(7)标记了探针的纯化试剂和组分，例如离心柱等；以及(8)蛋白纯化试剂；(9)信号产生和检测试剂，例如链亲合素-碱性磷酸酶缀合物、化学荧光或化学发光底物等。在一个具体实施方案中，所述试剂盒包含预先标记的分离自样品(例如，血液或软骨细胞或滑液)的质控对照蛋白和或RNA，其用作对照。

在一些实施方案中，所述试剂盒是RT-PCR或qRT-PCR试剂盒。在其它一些实施方案中，所述试剂盒是核酸阵列和蛋白质阵列。根据本发明的这样的试剂盒将至少包含具有本发明相关蛋白质或核酸成员的阵列及其包装方法。作为替代，本发明的所述蛋白质或核酸成员可预包装在阵列上。

在一些实施方案中，所述试剂盒是定量RT-PCR试剂盒。在一个实施方案中，定量RT-PCR试剂盒包含：(a)用于扩增本发明生物标记组合中每个的引物；(b)缓冲剂和酶(其包含逆转录酶)；(c)一种或多种热稳定聚合酶；和(d)

Green。在另一个实施方案中，本发明的试剂盒还包含(a)参考对照RNA和(b)掺入对照RNA。

本发明提供用于(a)诊断个体患有膀胱癌和/或早期膀胱癌的试剂盒。例如，在本发明的特定实施方案中，试剂盒包含上游和下游引物，其中正向和反向引物设计为定量表达所有物种的对应于每个根据本发明鉴定的生物标记的mRNA，所述生物标记用于确定个体是否患有膀胱癌和/或早期膀胱癌。在某些实施方案中，至少所述引物之一是设计为跨过外显子连接。

本发明提供用于检测、诊断、监控和预测膀胱癌的试剂盒，其基于在样品中，本发明生物标记的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少45个、至少50个、所有或任何组合的蛋白质或RNA产物的表达。在某些实施方案中，这样的试剂盒不包含用于测定本发明生物标记中已经由现有技术表明与膀胱癌相关的生物标记的蛋白质或RNA产物表达的材料和试剂。在另一些实施方案中，这样的试剂盒包含用于测定本发明生物标记中已经由现有技术表明与膀胱癌相关的生物标记以及除本发明生物标记之外至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少45个或更多基因的蛋白质或RNA产物表达的材料和试剂。

本发明提供用于监控对象正在接受的一种或多种治疗疗效的试剂盒，其基于在样品中，最高至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少45个、至少50个、所有或任何组合的任何数量的本发明生物标记的蛋白质或RNA产物的表达。在某些实施方案中，这样的试剂盒不包含用于测定本发明生物标记中已经由现有技术表明与膀胱癌相关的生物标记的蛋白质或RNA产物表达的材料和试剂。在另一些实施方案中，这样的试剂盒包含用于测定本发明生物标记中已经由现有技术表明与膀胱癌相关的生物标记以及除本发明生物标记之外最高至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少45个或更多种任意数量基因的蛋白质或RNA产物表达的材料和试剂。

本发明提供用于确定对象是否响应治疗的试剂盒，其基于在样本中，最高至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少45个、至少50个、所有或任何组合的任何数量的本发明生物标记的蛋白质和RNA产物的表达。在某些实施方案中，这样的试剂盒不包含用于测定本发明生物标记中已经由现有技术表明与膀胱癌相关的生物标记的蛋白质或RNA产物表达的材料和试剂。在另一些实施方案中，这样的试剂盒包含用于测定本发明生物标记中已经由现有技术表明与膀胱癌相关的生物标记以及除本发明生物标记之外最高至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少45个或更多种任意数量基因的蛋白质或RNA产物表达的材料和试剂。

本发明提供用于测定在样本中，最高至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少45个、至少50个、所有或任何组合的任何数量的本发明生物标记的RNA产物的表达的试剂盒。在一个具体实施方案中，这样的试剂盒包含测定本发明生物标记RNA产物表达所必需的材料和试剂。例如，可生产用于膀胱癌的微阵列或RT-PCR试剂盒，其只含有对于测量最高至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少45个、至少50个、所有或任何组合的任意数量本发明生物标记物的RNA产物水平所必需的试剂和材料。作为替代，在一些实施方案中，所述试剂盒可包含不限于测定最高1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、所有或任何组合的任意数量本发明生物标记物的RNA产物水平所必需的试剂和材料。例如，除了对于测量最高至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少45个、至少50个、所有或任何组合的任意数量本发明生物标记物的RNA产物水平所必需的试剂和材料之外，微阵列试剂盒可含有测量与膀胱癌不必然相关或不指示膀胱癌的RNA产物水平必需的试剂和材料。在一个具体实施方案中，微阵列或RT-PCR试剂盒含有用于测定最高至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少45个、至少50个、所有或任何组合的任何数量的本发明生物标记的RNA产物水平所必需的试剂和材料，以及最高1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个、100个、125个、150个、175个、200个、225个、250个、300个、350个、400个、450个或更多的任何数量的本发明生物标记以外基因的RNA产物水平所必需的试剂和材料，或者1-10、1-100、1-150、1-200、1-300、1-400、1-500、1-1000、25-100、25-200、25-300、25-400、25-500、25-1000、100-150、100-200、100-300、100-400、100-500、100-1000、500-1000本发明标记以外基因的RNA产物水平所必需的试剂和材料。

对于核酸微阵列试剂盒，所述试剂盒一般包含连接在固体支持表面的探针。可使用可检测标记来标记所述探针。在一个具体实施方案中，所述探针是最高1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、所有或任何组合的任意数量本发明生物标记之RNA产物的外显子、内含子、外显子连接处、外显子-内含子连接处特异性的。所述微阵列试剂盒可包含实施测定和方法的说明，以解释和分析实施测定所得到的数据。在一个具体实施方案中，所述试剂盒包含用于诊断膀胱癌的说明。所述试剂盒也可包含杂交试剂和/或用于检测探针杂交到靶核酸序列时产生的信号所必需的试剂。一般地，用于微阵列试剂盒的材料和试剂在一个或多个容器中。所述试剂盒的每个组分通常位于其各自合适的容器中。

对于RT-PCR试剂盒，所述试剂盒一般包含预先选择的对最高1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、所有或任何组合的任意数量本发明生物标记物的特定RNA产物(例如外显子、内含子、外显子连接、外显子-内含子连接)有特异性的引物。所述RT-PCR试剂盒也可包含适于逆转录和/或扩增核酸(例如聚合酶比如Taq)的酶，和脱氧核苷酸以及逆转录和扩增反应混合物需要的缓冲剂。所述RT-PCR试剂盒也可包含最高1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、所有或任何组合的任意数量本发明生物标记物的RNA产物的特异性探针。可使用可检测标记(例如荧光标记)来标记或不标记所述探针。RT-PCR试剂盒的每个成分一般位于其自己的合适容器中。因此，这些试剂盒一般包含适于每种试剂、酶、引物和探针各自的独特容器。另外，所述RT-PCR试剂盒可包含用于实施测定和方法的说明，以用于解释和分析实施测定所得到的数据。在一个具体实施方案中，所述试剂盒含有用于诊断膀胱癌的说明。

在一个具体实施方案中，所述试剂盒是实时RT-PCR试剂盒。这样的试剂盒可包含96孔板以及SYBR Green检测必需的试剂和材料。所述试剂盒可包含试剂和材料使得β肌动蛋白可用于使结果标准化(normalize)。所述试剂盒也可包含对照，例如水、磷酸缓冲盐溶液、和噬菌体MS2RNA。另外，所述试剂盒可包含用于实施测定和方法的说明，以用于解释和分析实施测定所得到的数据。在一个具体实施方案中，所述说明规定，最高1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、所有或任何组合的任意数量本发明生物标记物的RNA产物水平应该在两个浓度下测定，所述两个浓度应相差，例如，5倍到10倍。

对于基于抗体的试剂盒，所述试剂盒可包含，例如：(1)结合感兴趣蛋白质(例如，最高1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、所有或任何组合的任意数量本发明生物标记物的蛋白质产物)的第一抗体；和，任选的，(2)结合所述蛋白质或第一抗体的第二不同抗体，其连接了可检测标记(例如，荧光标记、放射性同位素或酶)。基于抗体的试剂盒也可包含实施免疫沉淀的珠子。基于抗体的试剂盒的每个组分一般位于其自己的合适容器中。因此，这些试剂盒一般包含适于每种抗体的独特容器。另外，所述基于抗体的试剂盒可包含用于实施测定和方法的说明，以用于解释和分析实施测定所得到的数据。在一个具体实施方案中，所述试剂盒含有用于诊断膀胱癌的说明。

6.实施例

下文的实施例是非限制性的，并且只是本发明多个方面和特性中的代表。

实施例1

微阵列构建

按照如下步骤构建根据本发明一个方面的阵列。

在用于扩增的同一96孔管中，使用4ul(1/10体积)的3M醋酸钠(pH5.2)和100ul(2.5倍体积)的乙醇沉淀来自OA软骨cDNA文库的cDNA克隆的PCR产物(～40ul)，并在-20℃保存过夜。接着将它们以3300rpm的转速4℃离心1个小时。用50ul冰冷的70％乙醇洗所得沉淀，再次离心30分钟。接着将所述沉淀空气干燥，并完全重悬在50％二甲亚砜(DMSO)或20ul 3×SSC中过夜。接着使用自动化GMS417或427阵列仪(Affymetrix，CA)将所述样品单一或者双份放置于γ氨基丙基硅烷(Gamma Amino Propyl Silane)(Corning CMT-GAPS或CMT-GAP2，目录号40003，40004)或者聚赖氨酸包被的玻片(Sigma目录号P0425)。微阵列上DNA点的边界使用钻石划线器标出。本发明提供阵列，其中10-20,000个PCR产物被点在固体支持物上来制备阵列。

通过将玻片浸于温暖的无颗粒双蒸水培养皿中大约一分钟来再水化所述阵列(所述点将略微膨大，但是不会相互接触)，然后在70-80℃翻转加热器中快速干燥3秒钟。接着将DNA紫外交联到玻片上(Stratagene，Stratalinker，65mJ-设置显示为“650”，其为650×100uJ)或者80℃烘焙二至四个小时。所述阵列置于玻片架上。准备空的玻片室并灌入下述溶液：3.0克的琥珀酸酐(Aldrich)溶解于189ml的1-甲基-2-吡咯烷酮(快速加入试剂是至关重要的)；当最后一片琥珀酸酐溶解后立刻加入21.0ml 0.2M硼酸钠混合，然后将所述溶液倒入玻片室。所述玻片架快速且均匀的***玻片室中，上下剧烈振荡数秒，使得玻片始终不离开溶液，然后在轨道式振摇器上混合15-20分钟。接着，将所述玻片架轻轻放入95℃的双蒸水2分钟，然后放入95％乙醇5次。接着，通过使多余的乙醇滴在纸巾上将所述玻片空气干燥。然后将所述阵列保存在室温玻片盒中待用。

实施例2

从未分级全血中分离RNA

(a)裂解血液

将十毫升外周全血收集到EDTA真空采血管(vacutainer tube)(Becton Dickinson，Franklin Lakes，N.J.)并在冰上保存至对其进行处理(在6小时内)。离心后，血液标本分成血浆、血沉棕黄层和红细胞层。除去血浆并以3∶1体积比加入低渗缓冲液(1.6mM EDTA，10mM KHCO₃，153mM NH₄Cl，pH7.4)用来裂解红细胞。离心混合物得到细胞沉淀，根据制造商的说明溶解沉淀并均匀分散于1.0ml的

试剂(InvitrogenCorp.，Carlsbad，CA)和0.2ml氯仿中。离心之后，以1∶1比例加入异丙醇到水相，使其在-20℃沉淀。接下来的离心得到RNA沉淀，将其重悬于水中，以用于实验。如制造商所指定的，RNA的品质在Agilent 2000Bioanalyzer RNA 6000Nano Chips上评估，RNA的量通过Beckman-Coulter DU640分光光度计中260nm处的吸光度来确定。

(b)离心裂解的血液

获得10ml全血置于真空采血管中并在4℃以2,000rpm(800g)离心5分钟，然后除去血浆层。以3份裂解缓冲液1份血液的比例加入裂解缓冲液到血液样品中(裂解缓冲液(1L)0.6g EDTA；1.0g KHCO2，8.2g NH4Cl，调pH到7.4(使用NaOH))。混合样品并置于冰上5-10分钟至透明。将裂解的样品在4℃以1000rpm离心10分钟，吸出上清。在5ml裂解缓冲液中重悬沉淀，在4℃以1000rpm再次离心10分钟。使用TRIzol(GIBCO/BRL)以每10ml原始血液样品约6ml TRIzol的比例均匀分散沉淀的细胞并充分混匀。样品在室温放置5分钟。每1ml TRIzol使用1.2ml氯仿提取RNA。样品在4℃以12,000×g离心5分钟，收集上层。以每1ml TRIzol 0.5ml异丙醇的比例加入异丙醇到上层。样品在-20℃放置过夜或者在-20℃放置一小时。根据已知方法沉淀RNA，空气干燥RNA沉淀，然后在DEPC处理的双蒸水中重悬沉淀。也可将RNA样品保存在75％乙醇中，在其中对于在室温下运输来说样品是稳定的。

(c)从无血清全血中

获得10ml全血置于真空采血管中并在4℃以2,000rpm(800g)离心5分钟，然后除去血浆层。使用TRIzol(GIBCO/BRL)以每10ml原始血液样品约6mlTRIzol的比例均匀分散沉淀的细胞并充分混匀。样品在室温放置5分钟。每1ml TRIzol使用1.2ml氯仿提取RNA。样品在4℃以12,000×g离心5分钟，收集上层。以每1ml TRIzol 0.5ml异丙醇的比例加入异丙醇到上层。样品在-20℃放置过夜或者在-20℃放置一小时。根据已知方法沉淀RNA，空气干燥RNA沉淀，然后在DEPC处理的双蒸水中重悬沉淀。也可将RNA样品保存在75％乙醇中，在其中对于在室温下运输来说样品是稳定的。

(d)使用PAXGENE^TM从全血中

收集2.5ml全血，置于PAXgene血液RNA管中，并根据PAXgene^TM血液RNA试剂盒方案说明进行处理。简言之，血液在PAXgene^TM管中保存至少2小时之后，离心所述血液样本并弃去上清。加入360ul所提供的缓冲液BR1到所剩的样品中，并将样品移入离心柱，然后离心，然后经过多次洗涤步骤进行洗涤，最后洗脱并保存。

(e)使用PAXGENE^TM从全血中，随后减少珠蛋白

随后处理如上文(d)中所述自PAXgene^TM分离的RNA，以选择性的除去珠蛋白mRNA，其如

技术说明中题为“珠蛋白减少方案”所述。α1、α2和β珠蛋白特异性的寡聚核苷酸与寡聚核苷酸杂交缓冲液和RNAse H(其用于特异性靶向降解珠蛋白mRNA)以及来自Affymetrix的cRNA清除柱(其用于除去珠蛋白mRNA)一起孵育。

实施例3

制备和杂交靶核酸

从mRNA制备荧光DNA探针

制备RNA的荧光标记靶核酸样品，以分析本发明阵列。

通过加热到70℃维持10分钟，然后在冰上冷却，将1μg寡聚dT引物与10μg分离自诊断为膀胱癌患者的未分级全血的总RNA退火，其总体积为10μl。执业医师做出患者膀胱癌阳性或阴性的诊断。阳性结肠病理诊断之后是对离体组织的组织学检查。通过在42℃孵育样品40分钟逆转录所述mRNA，其体积为25μl，含有终浓度为50mM Tris-HCl(pH8.3)，75mM KCl，3mM MgCl₂，25mM DTT，25mM未标记dNTP，400单位的Superscript II(200U/μl，Gibco BRL)，和15mM Cy3或Cy5(Amersham)。添加2.5μl 500mM的EDTA和5μl 1M的NaOH终止反应，在65℃孵育10分钟。通过添加12.5μl 1M的TrisHCl(pH7.6)中和反应混合物。

标记的靶核酸样本通过在Centricon-30微型浓缩器(Amicon)中通过离心来纯化。

在100℃加热2分钟使标记的核酸变性，然后在37℃孵育20-30分钟，接着将其置于22mm×22mm盖玻片之下的核酸阵列上。在通过3×SSC的小储液器维持湿度的定制玻片室中，65℃杂交14到18小时。通过将其浸入含0.1％SDS的2X SSC并摇动2-5分钟来清洗所述阵列，接着是1XSSC，然后0.1X SSC。最后，通过玻片架上离心2分钟干燥所述阵列，所述离心是在Beckman GS-6台式离心机中在Microplus架上以650rpm离心2分钟。

标记总RNA(5μg)以及其它来自患有或未患膀胱癌个体的类似制备的样品，并在Affymetrix U133Plus 2.0GeneChips(Affymetrix；SantaClara，CA)上杂交，杂交是根据制造商的说明进行的。简言之，在Affymetrix GCOS软件(1.1.1版)中测量杂交信号，其中使用测量因子，通过调节每个阵列的总体截尾平均(global trimmed mean)信号强度值到500来确定测量因子，并且导入到GeneSpring 7.2版(Silicon Genetics；Redwood City，CA)。接着将信号强度居中(centered)至每个芯片的50％，并且对于每个单独的基因，居中至全样品组的强度中值。在每个样品组的至少80％中，只有被GCOS软件认为存在或处于边界的基因才被用于进一步分析。使用1)非参数的Wilcoxon-Mann-Whitney非参数检验(P＜0.05)，2)参数检验(P＜0.05)，和3)非监督分析法(unsupervisedanalysis method)(14)鉴定差异表达的基因。在非监督分析中，信号强度滤过的基因用于，在至少15％样品中，选择表达水平至少有2倍变化(上或下)的基因。对每个比较实施层级聚类分析(hierarchical cluster analysis)以评定相关性分析，其使用每个鉴定的基因组中样品间Spearman相关性作为相似度的度量，其在GeneSpring 6.0版中使用了平均质心关联(average centroid linkage)。在表1中给出了比较患有膀胱癌的个体和未患膀胱癌的个体的实验所得结果。在表4中给出了比较患有早期膀胱癌的个体和未患膀胱癌的个体的实验所得结果。在表11中给出了比较患有膀胱癌的个体和患有睾丸癌或肾细胞瘤的个体的实验所得结果。下文表10显示表1中所鉴定的基因中选择作为膀胱癌生物标记的基因。这些基因是特别有用的，因为它们证实了具有显著p值的显著倍数改变。

实施例4

实时定量RT PCR

来自表1中使用Affymetrix U133Plus 2.0GeneChips鉴定的以及下文表13中所提到的选择的基因使用实时定量RT PCR(QRT-PCR)进行定量。表13提供了所选择生物标记的列表。表14提供了表13所提到的生物标记的产物的列表。使用表15所提到引物的实时定量RT-PCR的结果总结在表16中表示。使用Qiagen的

Green试剂盒(产品号204143)和/或使用Applied Biosystems PCR试剂盒(目录号4334973)完成QRT-PCR。使用Prism 7500仪器(Applied Biosystems)实时检测扩增子。

首先使用Applied Biosystems的High-Capacity cDNA Archive Kit(产品号4322171)并按照其中使用的方案实施逆转录。

更具体地，如前文所述纯化的RNA与逆转录缓冲液、dNTP、随机引物和逆转录酶一起在25℃孵育10分钟，接着在37℃孵育两个小时，所得的混合物用作定量PCR的起始产物。

逆转录所得的cDNA与所提供的QuantiTect

green PCRMaster Mix一起孵育，不改变镁离子浓度。不加入尿嘧啶-N-糖基化酶。加入5μM本发明基因特异性的上游引物和下游引物，孵育反应体系，并使用ABI PRISM 7700/ABI GeneAmp 5700/iCycler/DNA Engine Opticon按照标准方案监控。使用“PrimerQuest”设计候选生物标记的上游和下游引物。在http://biotools.idtdna.com/primerquest(Integrated DNATechnologies，Coralville，LA)可找到工具。确定每个所述基因相对于管家基因(β肌动蛋白)的ΔCt测量值。热解离的熔链温度[Tm]，以及在琼脂糖凝胶上进行的检验提供确认特定PCR扩增以及确认在每个反应中完全没有引物二聚体的形成。对于各个靶基因分析，每个基因与β肌动蛋白管家基因间Ct值的改变如下进行计算：ΔCt＝Ct(靶基因)-Ct(管家基因)。

QRT PCR也可实施在表1中公开的其余生物标记的RNA产物上，至表3提及的产物，其使用，例如Qiagen的

green试剂盒(产品号204143)。

可使用一个步骤(逆转录与PCR合并)或两个步骤(首先逆转录，然后PCR)。在两步骤方案的情况下，首先使用Applied Biosystems的High-Capacity cDNAArchive Kit(产品号4322171)实施逆转录，其按照其中所用的方案。

更具体地，如前文所述纯化的RNA与逆转录缓冲液、dNTP、随机引物和逆转录酶一起在25℃孵育10分钟，接着在37℃孵育两个小时，所得的混合物用作定量PCR的起始产物。

逆转录所得的cDNA与所提供的QuantiTect

green PCRMaster Mix一起孵育，不改变镁离子浓度。尿嘧啶-N-糖基化酶是任选的。加入5μM本发明基因特异性的正向引物和反向引物，孵育反应体系，并使用ABI PRISM 7700/ABI GeneAmp 5700/iCycler/DNA Engine Opticon按照标准方案监控。

表13

表1中生物标记的选择。表格给出了Hugo基因名(基因符号)、Entrez基因ID(以前的基因座链接(locus link))和基因说明。

基因符号	基因ID	注释
			CHD2	1106	人染色质结构域解螺旋酶DNA结合蛋白质2(CHD2)，mRNA
CSPG6	9126	人硫酸软骨素蛋白聚糖6(bamacan)(CSPG6)，mRNA
			CTSD	1509	人组织蛋白酶D(溶酶体天冬氨酸蛋白酶)(CTSD)，mRNA
FREB	84824	B细胞中表达的人Fc受体同源物(FREB)，mRNA

GAS7	8522	人生长停顿特异性蛋白7(GAS7)，转录变体b，mRNA
			GAS7	8522	人生长停顿特异性蛋白7(GAS7)，转录变体c，mRNA
HIST1H1C	3006	人组蛋白1H1c(HIST1H1C)，mRNA
			IGFBP7	3490	人***结合蛋白7(IGFBP7)，mRNA
IRAK3	11213	人白介素-1受体相关激酶3(IRAK3)，mRNA
			IREB2	3658	人铁应答元件结合蛋白2(IREB2)，mRNA
MLH3	27030	人mutL同源物3(大肠杆菌)(MLH3)，mRNA
			MTHFS	10588	人5，10-次甲基四氢叶酸合成酶(5-甲酰四氢叶酸环连接酶)(MTHFS)，mRNA
NELL2	4753	人NEL样蛋白2(鸡)(NELL2)，mRNA
			PLDN	26258	人***素同源物(小鼠)(PLDN)，mRNA
RPS24	6229	人核糖体蛋白S24(RPS24)，转录变体1，mRNA
			RPS24	6229	人核糖体蛋白S24(RPS24)，转录变体2，mRNA
SNTB2	6645	人肌养结合蛋白，β2(肌养蛋白结合蛋白A1，59kDa，基本组分2)(SNTB2)，转录变体1，mRNA
			SNTB2	6645	人肌养结合蛋白，β2(肌养蛋白结合蛋白A1，59kDa，基本组分2)(SNTB2)，转录变体2，mRNA
SNX16	64089	人分选连接蛋白16(SNX16)，转录变体1，mRNA
			SNX16	64089	人分选连接蛋白16(SNX16)，转录变体2，mRNA
SNX16	64089	人分选连接蛋白16(SNX16)，转录变体3，mRNA
			TNFRSF7	939	人肿瘤坏死因子受体超家族，成员7(TNFRSF7)，mRNA
ZAK	51776	人的含不育α基序和亮氨酸拉链的激酶AZK(ZAK)，mRNA

表14

表13中提及的生物标记的产物。列出的是Entrez基因ID和有关来自Genbank的参考序列的人RNA登记号和人蛋白质登记号。

基因符号	基因ID	RNA登记号	蛋白登记号
				CHD2	1106	NM_001271	NP_001262
CSPG6	9126	NM_005445	NP_005436
				CTSD	1509	NM_001909	NP_001900
FREB	84824	NM_032738	NP_116127
				GAS7	8522	NM_003644	NP_003635
GAS7	8522	NM_201432	NP_958836
				GAS7	8522	NM_201433	NP_958839
HIST1H1C	3006	NM_005319	NP_005310
				IGFBP7	3490	NM_001553	NP_001544
IRAK3	11213	NM_007199	NP_009130
				IREB2	3658	NM_004136	NP_004127
MLH3	27030	NM_014381	NP_055196
				MTHFS	10588	NM_006441	NP_006432
NELL2	4753	NM_006159	NP_006150
				PLDN	26258	NM_012388	NP_036520
RPS24	6229	NM_001026	NP_001017
				RPS24	6229	NM_033022	NP_148982
SNTB2	6645	NM_006750	NP_006741
				SNTB2	6645	NM_130845	NP_570896
SNX16	64089	NM_022133	NP_071416
				SNX16	64089	NM_152836	NP_690049
SNX16	64089	NM_152837	NP_690050
				TNFRSF7	939	NM_001242	NP_001233
ZAK	51776	NM_016653	NP_057737
				ZAK	51776	NM_133646	NP_598407

表15

用于表13中提及生物标记的实时定量RT-PCR的引物。显示了所述引物扩增的参考序列以及5’和3’引物和扩增子大小。

表16

对20个膀胱癌患者和14个没有膀胱癌个体的表13中提及生物标记的实时定量RT-PCR结果比较的总结。

表17

抗表13中提及的本发明生物标记的蛋白质产物的市售抗体。

实施例5

也可使用Qiagen的QuantiTect^TM Probe RT-PCR***(产品号204343)与感兴趣基因对应的

双标记探针和引物实施QRT PCR。所述探针和引物可从Applied BiosystemsAssays-On-Demand^TM订购。

双标记探针含有荧光基团和淬灭分子。所述淬灭分子与荧光报告基团的接近阻止了报告基团发出荧光，但是在PCR延伸步骤中，Taq DNA聚合酶的5’-3’核酸外切酶活性释放了荧光基团，使其发出荧光。如此，荧光的量与产生的PCR产物相关。根据本发明用于表13公开的所选择生物标记的产物的

探针的实例在表18中显示。

实施例6

实时RT-PCR结果的统计分析

对分离自分类为患有膀胱癌个体(或其阶段)或未患膀胱癌个体的血液样本的实时PCR分析是使用已知方法的统计分析，以获得相应的本发明生物标记在训练群体中的丰度水平。

选择患膀胱癌个体和未患膀胱癌个体的群体。选择相似的个体分布，例如表型如年龄、性别、体重指数(BMI)。使用KW组间单因素方差分析确定样本的选择，使得比较可基于年龄和BMI作出，其可被本领域技术人员所理解。

实施例7

使用图1中所述生物标记的产物，对比正常个体的基因表达谱，分析患膀 胱癌个体的血液样本的基因表达谱

此实施例给出所要求权利的发明在鉴定本发明各个生物标记上的用途，所述鉴定是通过与来自健康患者的血液样品相比较，检测来自患膀胱癌患者的血液样本中差异基因表达来完成的。

血液样本取自临床诊断为本文所定义膀胱癌的患者；本文所定义未患膀胱癌的患者以及一个或多个测试患者。接着，分析本发明生物标记组合的基因表达谱，测试个体基因表达谱与两种对照的基因表达谱进行比较。

来自裂解全血的总RNA取自每个患者，其首先用

试剂(GIBCO)进行分离，然后生成针对每个血液样品的荧光标记的探针，变性并杂交到

U1332.0版微阵列上，其含有对应于表1中所述每个基因的寡核苷酸。检测与所述阵列的特异性杂交接着通过GMS扫描仪418的扫描和Scanalyzer软件(Michael Eisen，Stanford University)对实验数据的处理进行测定，然后用GeneSpring软件(SiliconGenetics，CA)进行分析。通过统计分析确定在血液样本中对应于所述生物标记的RNA产物在所述两种对照群体和所述测试个体之间的差异表达，所述统计分析使用了Wilcox Mann Whitney秩和检验(Glantz SA.Primerof Biostatistics.5^th ed.New York，USA：McGraw-Hill Medical PublishingDivision，2002)。

实施例8

将logistic回归应用到本发明的组合，以鉴定用于区分膀胱癌或膀胱癌的阶 段与非膀胱癌的分类器和组合

使用实时定量RT-PCR(QRT-PCR)确定对应于表10，和/或表13中生物标记的RNA产物水平的数据，其在参考(训练群体)上使用了Qiagen的QuantiTect^TM

Green PCR试剂盒。在一种情况下，所述参考群体由患膀胱癌(无论膀胱癌的阶段)的个体和未患膀胱癌的个体组成。在另一种情况下，所述参考群体由患某阶段膀胱癌(例如早期膀胱癌)的个体和未患膀胱癌的个体组成(以鉴定用于筛选/诊断早期膀胱癌的组合)。参考数据组由参考群体中每个个体的每个基因的ΔCt值(即比较表10生物标记的RNA产物的Ct与管家基因的Ct)组成，其可使用一群个体的QRT-PCR产生的数据建立，所述一群个体中一些患有膀胱癌，一些未患膀胱癌。注意，所述管家基因，如其名字所提示的，是在患膀胱癌与未患膀胱癌个体之间不发生统计学上显著变化的基因。我们注意到，无论GAPDH还是β肌动蛋白都可作为管家基因使用，因此另一个管家基因应该应用，例如RPLP0，B2M，RPS18等。Logistic回归模型可应用于每个可能的十基因组合，其使用所产生的ΔCt值。因此产生所得的如下方程1之形式的分类器。

X＝Logit(P)＝ln(P/(1-P))＝b₀+b₁ΔCt₁+b₂ΔCt₂+...+b_nΔCt_n(Eq1)

其中P＝患者样本诊断为“患病”(例如患有膀胱癌)的可能性。如所指的，X＝Logit(p)可定义如下：

如果X≥阈值，则Y＝1(诊断＝“患病”例如患有膀胱癌)，如果X＜阈值，则Y＝0(诊断＝“对照”)。如所理解的，选择所述阈值以设置所需的特异性或敏感性。所得ROC面积和保持的敏感性或特异性被确定，因此提供了对所述诊断是真阳性还是假阳性结果的相似的测量。

交叉验证

用上述方法鉴定有用的生物标记组合以及对这些组合有特异性的分类器之后，可使用训练组对结果进行交叉验证，其使用一种或多种已知方法。例如，可使用WEKA(http://www.cs.waikato.ac.nz/～ml/weka/index.html)交叉验证所得的分类器(22)。在一个实施方案中，可使用两种不同的交叉验证配置。例如，WEKA MetaAnalysis函数可用于构建训练数据组和每个新数据组的100个bootstrap重复，其是使用简单logistic模型分析的。接着，可通过10倍交叉验证分析每个所得的logistic方程(分类器)并且平均化所有方程的结果(“bootstrap aggregating”)。

预测(盲)检验

为了进一步确认和选择一种或多种所得的分类器，可检验一组盲临床样本。使用由对照和患膀胱癌对象组成的检验组。优选的，没有盲检验组个体用于创建参考数据组。可使用一种或多种所得的分类器评价每个盲样本的测量值并交叉验证，所述分类器是由训练组所定义的。另外，也可应用使用了两种或多种所得分类器的投票方案。例如，可使用由初始计算结果、二进制逻辑门、和“委员会机器”投票组成的算法。初始计算结果：对于每个方程(I＝1到N)可计算logit函数X_i，所述方程相对于参考数据组给出ROC面积＞例如，0.6，0.7，0.8或0.9。逻辑门：如果X_i＜j的阈值(此处j代表方程编号)，则对于j号方程盲样本得分为S_i＝-1。如果X_i≥j的阈值，则对于j号方程盲样本得分为S_i＝+1。委员会机器的投票(23)：然后根据来自10个或更多的用于诊断的logit方程的得分作出投票。根据定义，投票＝∑S_i。如果投票≤0则样本被称为“无***癌”，而如果投票＞0则样本被称为“患病或患膀胱癌”。

实施例9

将所选择生物标记的两基因“比”用作数学模型，从而产生出用于区分膀胱 癌与非膀胱癌的分类器

为了避免必须鉴定管家基因，采取了直接比较两个表达的基因差异表达的策略，令人惊奇的，证实它比使用管家基因更加有利。双基因比在区分疾病组上的应用之前已经有被描述过(16，17)，其使用了来自组织的cDNA阵列数据(而不是来自血液)。所述技术减少了生物因素和技术因素造成的个体间变化，并且也独立于用于获得数据的表达测量平台。双基因方法的其它优点包含所述方法相对独立于输入的样品量，使得不需要使用管家基因作为加载对照，并且所述方法只需要少量的RNA。最后，应用上调基因与下调基因的比，扩增了信号，因此使测定更敏感。

如表10中所示，5个生物标记在膀胱癌患者与对照患者之间被鉴定为上调，5个生物标记被鉴定为下调。在此实施例中，两个生物标记的组合(一个上调，一个下调(其中上调指相比于未患膀胱癌的患者，基因在膀胱癌患者中具有较高水平的表达，而下调指相比于未患膀胱癌的患者，基因在膀胱癌患者中具有较低水平的表达))被选择输入logistic回归，以确定来自表10所列生物标记的不同对组合的诊断能力。在最大相似logistic回归中评价了多个组合，以确定对“膀胱癌”和“对照”的区分能力(ROC面积＞0.5)。

表18.实时RT-PCR结果给出了多个具有分类能力以区分膀胱癌和非膀胱癌样本的两基因组合

在使用组成的训练群测试的所述对中，IGFBP7和CHD2之间的ΔCt比在区分膀胱癌患者(n＝20)与正常患者(n＝14)中表现最佳。所述对的得分如下：AUC为0.907，敏感性80.0％(95％CI 56.3-94.1％)，特异性92.9％(95％CI 66.1-98.8％)。IGFBP7和NELL2之间的ΔCt比排在第二最佳，其AUC为0.879，敏感性90.0％(95％CI 68.3-98.5％)，特异性85.7％(95％CI 57.2-97.8％)。接着，在又一个由更多个体组成的训练群中测试此比值，即导致在此群中的测定敏感性为83％，正确预测了40个膀胱癌中的34个。6个膀胱癌患者中的3个被所述测定错误预测为未患膀胱癌的是被切除了表层膀胱癌的患者。这提示，所述测定可能用于确定患者预后。所述测定的特异性为93％，27个健康对照中只有2个被错误预测为患有膀胱癌。

实施例9

将所选择生物标记的两基因“比”用作数学模型，从而产生出用于区分膀胱 癌与非膀胱癌的分类器

选择来自表13之标记的子集以更无遗漏地鉴定基因比值的有用组合，这些基因用于使用生物标记以筛选和/或诊断患有膀胱癌的患者。选择由20个患有膀胱癌的个体和14个未患膀胱癌的个体组成的参考训练群。参考数据组对应于所选择生物标记SNX16，CSPG6，IGFBP7，和CTSD和TNFRSF7，NELL2，和CHD2的RNA产物的ΔCt比。因此使用实时定量RT-PCR(QRT-PCR)和Qiagen的QuantiTect^TM

green PCR试剂盒确定CHD2/CTSD，CHD2/SNX16，CHD2/CSPG6，CHD2/IGFBP7，CHD2/TNFRSF7，CHD2/NELL2，NELL2/SNX16，NELL2/CSPG6，NELL2/IGFBP7，NELL2/CTSD，NELL2/TNFRSF7，TNFRSF7/SNX16，TNFRSF7/CSPG6，TNFRSF7/IGFBP7、TNFRSF7/CSTD、CTSD/SNX16、CTSD/CSPG6、CTSD/IGFBP7、IGFBP7/SNX16、IGFBP7/CSPG6和CSPG/SNX16的ΔCt比，其中在单个96孔板中测定每对的Ct，以便更好地比较Ct值。(注意使用多路复用和带不同颜色荧光基团的TaqMan探针可获得相似的结果，其将被本领域技术人员所理解)以此方式来鉴定生物标记对，允许输入一项值以代表所述基因对的表达水平，其作为logistic回归中的单一项。因此，可创建一个比值、两个比值、三个比值、四个比值、五个比值、六个比值、或者所有比值的组合，使得所得logistic回归方程(分类器)的通式为

X＝Logit(P)＝ln(P/(1-P))＝b₀+b₁ΔCt₁+b₂ΔCt₂+...+b_nΔCt_n    (Eq1)

其中P＝患者样本诊断为“患病”(例如患有膀胱癌)的可能性，单个比值组合的形式如下：

X＝Logit(P)＝ln(P/(1-P))＝b₀+b₁ΔCt₁(Eq2)其中ΔCt₁是对应于任何一个上述比值的数据。

或者两个比值组合的形式如下：

X＝Logit(P)＝ln(P/(1-P))＝b₀+b₁ΔCt₁+ΔCt₂(Eq3)其中ΔCt₁是对应于任何一个上述比值的数据，ΔCt₂也是对应于任何一个上述比值的数据。

相似地，测试了所有三比值组合，四比值组合，和五比值组合。

每个ROC面积＞0.5、大于0.55、大于0.6、大于0.65、大于0.7、大于0.75、大于0.8、大于0.85、大于0.9、大于0.95的所得分类器可用于诊断或筛选患有或未患膀胱癌的测试个体。图1-4显示由单比值、两比值、三比值和四比值得到的分类器的图形结果。

使用40个患膀胱癌个体和27个对照个体的扩展训练群的四比值代表性分类器在表19中显示，表20显示三比值代表性分类器，表21显示两比值代表性分类器，下文表22显示单比值代表性分类器。

参考文献

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在本申请中所引用的所有参考文献、专利和专利申请(包含公开的专利申请)的内容通过参考并入本文。

等同物

本领域技术人员只使用常规实验就将明白、或能够确定，许多本发明特定实施方案的等同物。这些等同物也包括在以下权利要求范围内。

序列表

<110>申请人：基因信息公司

刘宗正

韩晓雁

汤玛斯-耶格

赵承恩

郑润

<120>发明名称：膀胱癌生物标记及其用途

<130>文档编号：204231/2148

<140>本申请号：PCT/US06/16816

<141>本申请日：2006-06-05

<150>在先申请号：60/676,921

<151>在先申请日：2005-05-02

<150>在先申请号：60/729,056

<151>在先申请日：2005-10-21

<160>序列数：780

<170>软件：PatentIn version 3.3

<210>SEQ ID NO 1

<211>长度：22

<212>类型：DNA

<213>生物：人工序列

<220>特征：

<223>其它信息：正向引物，用于登记号：NM_015129，NM_145799，

NM_145800，NM_145802

<400>序列：1

aggacagcta caagcctatc gt                                22

<210>SEQ ID NO 2

<211>长度：22

<212>类型：DNA

<213>生物：人工序列

<220>特征：

<223>其它信息：反向引物，用于登记号：NM_015129，NM_145799，

NM_145800，和NM_145802

<400>序列：2

acaagcagac atggattcgg ga                               22

<210>SEQ ID NO 3

<211>长度：20

<212>类型：DNA

<213>生物：人工序列

<220>特征：

<223>其它信息：正向引物，用于登记号：NM_001271

<400>序列：3

tgacaagaag ccaaagcgca                                  20

<210>SEQ ID NO 4

<211>长度：22

<212>类型：DNA

<213>生物：人工序列

<220>特征：

<223>其它信息：反向引物，用于登记号：NM_001271

<400>序列：4

tatgcactcc agccgttcaa ga                               22

<210>SEQ ID NO 5

<211>长度：22

<212>类型：DNA

<213>生物：人工序列

<220>特征：

<223>其它信息：正向引物，用于登记号：NM_005445

<400>序列：5

actcgtgcca aacttgatga gc                              22

<210>SEQ ID NO 6

<211>长度：22

<212>类型：DNA

<213>生物：人工序列

<220>特征：

<223>其它信息：反向引物，用于登记号：NM_005445

<400>序列：6

acttggcgtt cgatatcctc ca                             22

<210>SEQ ID NO 7

<211>长度：22

<212>类型：DNA

<213>生物：人工序列

<220>特征：

<223>其它信息：正向引物，用于登记号：NM_001909

<400>序列：7

tgtggaggac ctgattgcca aa                                    22

<210>SEQ ID NO 8

<211>长度：22

<212>类型：DNA

<213>生物：人工序列

<220>特征：

<223>其它信息：反向引物，用于登记号：NM_001909

<400>序列：8

actgggcgtc catgtagttc tt                                    22

<210>SEQ ID NO 9

<211>长度：21

<212>类型：DNA

<213>生物：人工序列

<220>特征：

<223>其它信息：正向引物，用于登记号：NM_032738

<400>序列：9

agccactgag gacaaccaag t                                     21

<210>SEQ ID NO 10

<211>长度：22

<212>类型：DNA

<213>生物：人工序列

<220>特征：

<223>其它信息：反向引物，用于登记号：NM_032738

<400>序列：10

aggagctgga ttcaatgtgg ga                                   22

<210>SEQ ID NO 11

<211>长度：22

<212>类型：DNA

<213>生物：人工序列

<220>特征：

<223>其它信息：正向引物，用于登记号：NM_003644，NM_005890，

NM_201432和NM_201433

<400>序列：11

agttgctgga gaagcctgga at                                   22

<210>SEQ ID NO 12

<211>长度：21

<212>类型：DNA

<213>生物：人工序列

<220>特征：

<223>其它信息：反向引物，用于NM_003644，NM_005890，NM_201432，AND

NM_201433

<400>序列：12

ttcccaggtg gtctcattgg t                                     21

<210>SEQ ID NO 13

<211>长度：20

<212>类型：DNA

<213>生物：人工序列

<220>特征：

<223>其它信息：正向引物，用于NM_005319

<400>序列：13

tctggtgcaa acgaaaggca                                       20

<210>SEQ ID NO 14

<211>长度：22

<212>类型：DNA

<213>生物：人工序列

<220>特征：

<223>其它信息：反向引物，用于登记号：NM_005319

<400>序列：14

tggcttctta ggtttggttc cg                                    22

<210>SEQ ID NO 15

<211>长度：21

<212>类型：DNA

<213>生物：人工序列

<220>特征：

<223>其它信息：正向引物，用于登记号：NM_001553

<400>序列：15

tgcgagcaag gtccttccat a                        21

<210>SEQ ID NO 16

<211>长度：22

<212>类型：DNA

<213>生物：人工序列

<220>特征：

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<400>序列：16

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<223>其它信息：引物，用于登记号：NM_201433

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catgtaaggc atcaaccact g                                21

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ggggtcacta tggagttcaa agg                            23

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IP0710943P.序列表(官)

<212>类型：DNA

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tgcatccaat tcccaaggac agg                            23

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cctctaagta aggaagatgc tgga                          24

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<213>生物：人工序列

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gcatccaatt cccaaggaca gg                            22

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<213>生物：人工序列

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<223>其它信息：探针，用于登记号：NM_001553

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cctctaagta aggaagatgc tgga                          24

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<223>其它信息：探针，用于登记号：NM_001553

<400>序列：269

cctctaagta aggaagatgc tgga                          24

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<220>特征：

<223>其它信息：探针，用于登记号：NM_001553

<400>序列：270

cctctaagta aggaagatgc tgga                          24

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<223>其它信息：引物，用于登记号：NM_007199

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ctgccaagct cttctgtttg                               20

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<223>其它信息：引物，用于登记号：NM_007199

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tcggtcatct gtggcagtat a                             21

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<213>生物：人工序列

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<220>特征：

<223>其它信息：引物，用于登记号：NM_007199

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agccattcac tacctgcaca a                        21

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<213>生物：人工序列

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<223>其它信息：引物，用于登记号：NM_007199

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ttcaaccatg ctcggtca                            18

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<212>类型：DNA

<213>生物：人工序列

<220>特征：

<223>其它信息：引物，用于登记号：NM_007199

<400>序列：276

gcgggcaaag ttaagacca                           19

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<211>长度：21

<212>类型：DNA

<213>生物：人工序列

<220>特征：

<223>其它信息：引物，用于登记号：NM_007199

<400>序列：277

accatcggtg accttttaca g                        21

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<211>长度：19

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<220>特征：

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<400>序列：278

gccaagctct tctgtttgg                          19

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<211>长度：20

<212>类型：DNA

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<220>特征：

<223>其它信息：引物，用于登记号：NM_007199

<400>序列：279

gccattcact acctgcacaa                        20

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<211>长度：19

<212>类型：DNA

<213>生物：人工序列

<220>特征：

<223>其它信息：引物，用于登记号：NM_007199

<400>序列：280

aaccatgctc ggtcatctg                         19

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<211>长度：23

<212>类型：DNA

<213>生物：人工序列

<220>特征：

<223>其它信息：引物，用于登记号：NM_007199

<400>序列：281

gagaaggaca cctgaaggac ttt                    23

<210>SEQ ID NO 282

<211>长度：20

<212>类型：DNA

<213>生物：人工序列

<220>特征：

<223>其它信息：引物，用于登记号：NM_007199

<400>序列：282

tgctgctgct ggtcatattt                            20

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<211>长度：20

<212>类型：DNA

<213>生物：人工序列

<220>特征：

<223>其它信息：引物，用于登记号：NM_007199

<400>序列：283

tttactgctg ctgctggtca                          20

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<211>长度：24

<212>类型：DNA

<213>生物：人工序列

<220>特征：

<223>其它信息：引物，用于登记号：NM_007199

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<211>长度：19

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<213>生物：人工序列

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<223>其它信息：引物，用于登记号：NM_007199

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tgtttactgc tgctgctgg                         19

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<211>长度：22

<212>类型：DNA

<213>生物：人工序列

<220>特征：

<223>其它信息：引物，用于登记号：NM_007199

<400>序列：286

ccaggaatag aggagaagga ca                    22

<210>SEQ ID NO 287

<211>长度：20

<212>类型：DNA

<213>生物：人工序列

<220>特征：

<223>其它信息：引物，用于登记号：NM_007199

<400>序列：287

ttatccacgg tgacattggc                      20

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<211>长度：24

<212>类型：DNA

<213>生物：人工序列

<220>特征：

<223>其它信息：引物，用于登记号：NM_007199

<400>序列：288

tggtacattc tccaggaata gagg                24

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<211>长度：23

<212>类型：DNA

<213>生物：人工序列

<220>特征：

<223>其它信息：引物，用于登记号：NM_007199

<400>序列：289

caactctgat gttctaggtg gga                 23

<210>SEQ ID NO 290

<211>长度：21

<212>类型：DNA

<213>生物：人工序列

<220>特征：

<223>其它信息：引物，用于登记号：NM_007199

<400>序列：290

atgtttactg ctgctgctgg t                        21

<210>SEQ ID NO 291

<211>长度：22

<212>类型：DNA

<213>生物：人工序列

<220>特征：

<223>其它信息：探针，用于登记号：NM_007199

<400>序列：291

cgggcaaagt taagaccatc aa                       22

<210>SEQ ID NO 292

<211>长度：20

<212>类型：DNA

<213>生物：人工序列

<220>特征：

<223>其它信息：探针，用于登记号：NM_007199

<400>序列：292

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<211>长度：20

<212>类型：DNA

<213>生物：人工序列

<220>特征：

<223>其它信息：探针，用于登记号：NM_007199

<400>序列：293

acttccggtc ccacctagaa                          20

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<211>长度：22

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<213>生物：人工序列

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gctcggtcat ctgtggcagt at                       22

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<211>长度：20

<212>类型：DNA

<213>生物：人工序列

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acttccggtc ccacctagaa                          20

<210>SEQ ID NO 296

<211>长度：22

<212>类型：DNA

<213>生物：人工序列

<220>特征：

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agcgtagcgg agtttctctg                                        20

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cactctggtg caaacgaaag                                    20

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gccaagccca aggttaaaa                                    19

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agccttagca gcacttttgg                                    20

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ctttcgtttg caccagagtg                                    20

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ccaggctctt gagaccaagt                                    20

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<400>序列：765

ccccaactgg cttcttaggt                                            20

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<400>序列：766

agccttagca gcacttttgg                                            20

<210>SEQ ID NO 767

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<213>生物：人工序列

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<400>序列：767

ttcttcgctt tcttcggtgt                                           20

<210>SEQ ID NO 768

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<213>生物：人工序列

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<400>序列：768

tcttcgcttt cttcggtgtt                                           20

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<400>序列：769

ccccaactgg cttcttaggt                                           20

<210>SEQ ID NO 770

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<400>序列：770

ttcttcgctt tcttcggtgt                                          20

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<400>序列：771

gtaaccaaga aagtggctaa gagc                                     24

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<400>序列：772

gtaaccaaga aagtggctaa gagc                                    24

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<211>长度：22

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<213>生物：人工序列

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<400>序列：773

ggagaaaaac aacagccgta tc                                          22

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<211>长度：22

<212>类型：DNA

<213>生物：人工序列

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<400>序列：774

ggagaaaaac aacagccgta tc                                          22

<210>SEQ ID NO 775

<211>长度：20

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<213>生物：人工序列

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<400>序列：775

aagcccaagg ttaaaaaggc                                             20

<210>SEQ ID NO 776

<211>长度：24

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<213>生物：人工序列

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<400>序列：776

gtaaccaaga aagtggctaa gagc                                        24

<210>SEQ ID NO 777

<211>长度：21

<212>类型：DNA

<213>生物：人工序列

<220>特征：

<223>其它信息：探针，用于登记号：NM_005319

<400>序列：777

aaacctaaga agccagttgg g                                           21

<210>SEQ ID NO 778

<211>长度：21

<212>类型：DNA

<213>生物：人工序列

<220>特征：

<223>其它信息：探针，用于登记号：NM_005319

<400>序列：778

aaacctaaga agccagttgg g                                          21

<210>SEQ ID NO 779

<211>长度：20

<212>类型：DNA

<213>生物：人工序列

<220>特征：

<223>其它信息：探针，用于登记号：NM_005319

<400>序列：779

aagcccaagg ttaaaaaggc                                            20

<210>SEQ ID NO 780

<211>长度：21

<212>类型：DNA

<213>生物：人工序列

<220>特征：

<223>其它信息：探针，用于登记号：NM_005319

<400>序列：780

aaacctaaga agccagttgg g                                         21

Claims (32)

1.筛选检验对象中膀胱癌或者膀胱癌阶段的方法，其包括：

(a)确定在所述对象的分离血样中第一生物标记的RNA产物的水平，所述第一生物标记选自列于表13的生物标记的组；和第二生物标记的RNA产物的水平，所述第二生物标记选自所述的生物标记的组；和

(b)对于所述第一和第二生物标记之每一个，将所述的RNA产物水平与由所述生物标记编码的并在一个或多个对照对象的分离血样中检测到的RNA的对照水平进行比较，其中对于每个所述生物标记，对步骤(a)所述RNA产物水平和所述对照水平之间统计学显著性差异的确定指示所述检验对象中的膀胱癌、或者所述膀胱癌阶段。

2.筛选检验对象中膀胱癌或者膀胱癌阶段的方法，其包括：

(a)确定在所述对象的分离血样中由生物标记编码的RNA产物水平，所述生物标记选自列于表13的生物标记的组；和

(b)将所述水平与对照水平进行比较，所述对照水平是由所述生物标记编码的并在一个或多个对照对象的分离血样中发现的RNA产物的水平，其中对步骤(a)所述水平与所述对照水平之间差异的确定指示所述检验对象中的膀胱癌、或者所述膀胱癌阶段。

3.根据权利要求1或2任一项的方法，其中所述生物标记的组限于SNX16、CSPG6、IGFBP7、CTSD和TNFRSF7、NELL2和CHD2。

4.根据权利要求1或2任一项的方法，其中所述分离血样由全血组成。

5.根据权利要求1或2任一项的方法，其中所述分离血样由血滴组成。

6.根据权利要求1的方法，其中通过首先从所述检验对象的所述血样中分离RNA来实施步骤(a)的对于每个所述生物标记的所述RNA水平的所述确定。

7.根据权利要求1的方法，其中应用实时定量RT-PCR(QRT-PCR)来实施步骤(a)的对于每个所述生物标记的所述RNA水平的所述确定。

8.根据权利要求1的方法，其中通过将由每个所述生物标记编码的所述RNA产物与包含与每个所述生物标记的所述RNA产物互补的至少一种探针的阵列进行杂交来实施步骤(a)的对于每个所述生物标记的所述RNA水平的所述确定。

9.根据权利要求1的方法，其中通过将源于所述RNA产物的cDNA、PCR产物或者EST与包含与每个所述生物标记的所述cDNA、PCR产物或者EST互补的至少一种探针的阵列进行杂交来实施步骤(a)的对于每个所述生物标记的所述RNA水平的所述确定。

10.根据权利要求1的方法，其中所述对照水平是源于所述一个或多个没有膀胱癌的个体。

11.筛选检验对象中膀胱癌或者膀胱癌阶段的方法，其包括：

(a)确定在所述对象的分离血样中第一生物标记的蛋白质产物的水平，所述第一生物标记选自列于表13的生物标记的组；和第二生物标记的蛋白质产物的水平，所述第二生物标记选自所述的生物标记的组；和

(b)对于所述第一和第二生物标记之每一个，将所述的蛋白质产物水平与由所述生物标记编码的并在一个或多个对照对象的分离血样中检测到的蛋白质产物的对照水平进行比较，其中对于每个所述生物标记，对步骤(a)所述蛋白质产物水平和所述对照水平之间统计学显著性差异的确定指示所述检验对象中的膀胱癌、或者所述膀胱癌阶段。

12.筛选检验对象中膀胱癌或者膀胱癌阶段的方法，其包括：

(a)确定在所述对象的分离血样中由生物标记编码的蛋白质产物水平，所述生物标记选自列于表13的生物标记的组；和

(b)将所述水平与对照水平进行比较，所述对照水平是由所述生物标记编码的并在一个或多个对照对象的分离血样中发现的蛋白质产物的水平，其中对步骤(a)所述水平与所述对照水平之间差异的确定指示所述检验对象中的膀胱癌、或者所述膀胱癌阶段。

13.包含两种或更多种分离蛋白质之集合的组合物，所述分离蛋白质选择性结合至少两种独特生物标记的蛋白质产物，其中每个所述独特生物标记选自表13所列的生物标记的组。

14.包含两组或更多组生物标记特异性引物之集合的组合物，其中每个组选择性扩增与独特生物标记互补的双链DNA，其中每个所述独特生物标记选自表13所列的生物标记的组。

15.包含三组或更多组生物标记特异性引物之集合的组合物，其中每个组选择性扩增与独特生物标记互补的双链DNA，并且每个所述独特生物标记选自表13所列的生物标记的组。

16.包含四组或更多组生物标记特异性引物之集合的组合物，其中每个组选择性扩增与独特生物标记互补的双链DNA，并且每个所述独特生物标记选自表13所列的生物标记的组。

17.包含五组或更多组生物标记特异性引物之集合的组合物，其中每个组选择性扩增与独特生物标记互补的双链DNA，并且每个所述独特生物标记选自表13所列的生物标记的组。

18.包含两组或更多组生物标记特异性引物之集合的组合物，其中每个组选择性扩增与独特生物标记互补的双链DNA，并且每个所述独特生物标记选自由SNX16、CSPG6、IGFBP7、和CTSD和TNFRSF7、NELL2和CHD2组成的生物标记的组。

19.包含三组或更多组生物标记特异性引物之集合的组合物，其中每个组选择性扩增与独特生物标记互补的双链DNA，并且每个所述独特生物标记选自由SNX16、CSPG6、IGFBP7、和CTSD和TNFRSF7、NELL2和CHD2组成的生物标记的组。

20.包含两种或更多种分离蛋白质之集合的组合物，所述分离蛋白质选择性结合至少两种独特生物标记的蛋白质产物，其中每个独特生物标记选自由SNX16、CSPG6、IGFBP7、和CTSD和TNFRSF7、NELL2和CHD2组成的生物标记的组。

21.权利要求20的组合物，其中所述分离蛋白质是抗体。

22.权利要求13所述组合物的用途，其用于选择性结合在分离的生物学样品中至少两种不同蛋白质的存在，其中每种所述蛋白质由独特生物标记所编码，每种所述独特生物标记选自表13所列的生物标记。

23.权利要求14所述组合物的用途，其用于选择性扩增在分离的生物学样品中与至少两种独特生物标记互补的双链DNA，并且每种所述独特生物标记选自表13所列的生物标记。

24.权利要求15所述组合物的用途，其用于选择性扩增在分离的生物学样品中与至少三种独特生物标记互补的双链DNA，并且每种所述独特生物标记选自表13所列的生物标记。

25.权利要求16所述组合物的用途，其用于选择性扩增在分离的生物学样品中与至少四种独特生物标记互补的双链DNA，并且每种所述独特生物标记选自表13所列的生物标记。

26.权利要求17所述组合物的用途，其用于选择性扩增在分离的生物学样品中与至少五种独特生物标记互补的双链DNA，并且每种所述独特生物标记选自表13所列的生物标记。

27.权利要求18所述组合物的用途，其用于选择性扩增在分离的生物学样品中与至少两种独特生物标记互补的双链DNA，并且每种所述独特生物标记选自由SNX16、CSPG6、IGFBP7、和CTSD和TNFRSF7、NELL2和CHD2组成的生物标记的组。

28.权利要求19所述组合物的用途，其用于选择性扩增在分离的生物学样品中与至少三种独特生物标记互补的双链DNA，并且每种所述独特生物标记选自由SNX16、CSPG6、IGFBP7、和CTSD和TNFRSF7、NELL2和CHD2组成的生物标记的组。

29.权利要求13、14、15、16、17、18或19中任一项所述组合物的用途，其用于在分离自检验对象的血样中筛选膀胱癌或者膀胱癌阶段。

30.用于实施权利要求1所述方法的试剂盒，其包含至少两组生物标记特异性引物，其中每组生物标记特异性引物产生与独特生物标记互补的双链DNA，每种独特生物标记选自所述的生物标记组；

(b)具有逆转录酶活性的酶；

(c)具有热稳定DNA聚合酶活性的酶，和

(d)标记工具；

其中应用每个所述引物组来检测检验对象中所述独特生物标记的定量表达水平。

31.用于实施权利要求1所述方法的试剂盒，其包含至少两组生物标记特异性引物，其中每组生物标记特异性引物产生与独特生物标记互补的双链DNA，每种独特生物标记选自由SNX16、CSPG6、IGFBP7、CTSD、TNFRSF7、NELL2和CHD2组成的生物标记的组；

(b)具有逆转录酶活性的酶；

(c)具有热稳定DNA聚合酶活性的酶，和

(d)标记工具；

其中应用每个所述引物组来检测检验对象中所述独特生物标记的定量表达水平。

32.一种试剂盒，其包含：

(a)权利要求14、15、16、17、18或19中任一项所述的组合物；

(b)具有逆转录酶活性的酶；

(c)具有热稳定DNA聚合酶活性的酶，和

(d)标记工具；

其中应用每个所述的生物标记特异性引物组来检测检验对象中所述独特生物标记的定量表达水平。

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