CN105803085B - 一种检测骨关节炎的分子标记物及其用途 - Google Patents

一种检测骨关节炎的分子标记物及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测骨关节炎的分子标记物,所述分子标记物为SCGB1A1基因或该基因的表达蛋白及其片段、类似物和衍生物，所述的SCGB1A1基因或该基因的表达蛋白及其片段、类似物和衍生物在骨关节炎生物学样品中表达上调。本发明还公开了该分子标记物检测骨关节炎相关基因表达水平是否上调的方法。本发明公开了一种与骨关节炎相关的基因SCGB1A1，并进一步证实该SCGB1A1基因或该基因的表达产物在骨关节炎组织中表达上调。利用该基因检测骨关节炎不仅能够快速有效的做到早期检测，而且为基因治疗、药物治疗等临床应用提供了治疗靶点和重要依据。

Description

一种检测骨关节炎的分子标记物及其用途
技术领域
本发明涉及基因工程领域，具体涉及利用与骨关节炎相关基因SCGB1A1作为检测骨关节炎的分子标记物及其用途。
背景技术
骨关节炎(osteoarthritis，OA)是关节软骨随时间逐渐退化的慢性疾病，所述关节软骨覆盖在骨末端，形成关节的关节面。据报道有许多因素使患者易患骨关节炎，包括遗传易感性、肥胖症、意外或运动创伤、手术、药物和重体力需求。骨关节炎被认为是从关节软骨的损伤开始的。最普遍的两种对关节的损伤是运动相关损伤和长期“反复使用”关节损伤。最经常受骨关节炎影响的关节是膝、髋和手。在多数情况下，由于膝和髋必要的承重功能，这些关节中的骨关节炎比手骨关节炎更易导致残疾。随着软骨退化的发展，关节中和关节周围的其他组织(包括骨、肌肉、韧带、半月板和滑膜)中发生次级变化。软骨组织初级衰竭和其他组织次级损伤的净效应是患者发生疼痛、肿胀、虚弱和患病关节丧失机能。这些症状经常发展到具有严重影响的程度，如使患者丧失劳动力或影响生活质量。
关节软骨主要由软骨细胞、II型胶原、蛋白聚糖和水组成。关节软骨没有血或神经分布，软骨细胞是该组织中仅有的细胞类型。软骨细胞负责制造形成软骨基质的II型胶原和蛋白聚糖。其后该基质又具有允许用水使基质饱和的物理化学特性。这种结构-功能关系的净效应是关节软骨具有特殊的耐磨特征，并且关节软骨面之间发生几乎无摩擦的移动。在未患骨关节炎时，关节软骨经常在甚至高需求的身体条件下提供终生的无痛承重和无限制的关节移动。
与所有的活组织一样，关节软骨持续地经历更新过程，其中去除(分解代谢活性)“老”细胞和基质组分并产生(合成代谢活性)“新”细胞和分子。相对于多数组织，关节软骨的合成代谢或分解代谢周转率较低。成熟软骨结构完整性的长期维持依赖于基质合成和降解之间适当的平衡。软骨细胞通过应答于来自其环境中的化学和机械刺激维持基质平衡。软骨细胞对这些刺激合适并有效的应答是软骨动态平衡所必需的。通过合成代谢活性不足或分解代谢活性过剩破坏动态平衡可引起软骨降解和骨关节炎(Adams等，1995，Nature377Suppl：3-174)。多数受到损伤和分解代谢活性提高的组织能够启动增强的合成代谢应答，允许组织复原。不幸的是，关节软骨应答于软骨基质损伤或消耗而上调其合成代谢活性以及提高合成蛋白聚糖和II型胶原的能力非常有限。
现有的骨关节炎治疗方法包括运动、药物、休息和关节保健、手术、疼痛缓解技术、替代治疗和体重控制。治疗骨关节炎中常用的药物包括非甾族抗炎药如阿司匹林、布洛芬等；直接用于皮肤的局部疼痛缓解乳膏、橡胶和喷雾剂等。可进行手术以使骨表面重建、骨复位和置换关节。尽管各种药物疗法已被用于治疗疾病，但是它们对长期控制和预防是无效的。此外，由于骨关节炎隐匿式发生并且发展缓慢，因此骨关节炎经常在疾病发展的晚期才得到鉴定，而不是潜在治疗可能更有效的疾病发展早期。因此预防、改变或治疗骨关节炎疾病过程中的进一步发展严重依赖于鉴定疾病的早期诊断标志物，从而允许早期干涉。
发明内容
为了实现骨关节炎的早期发现，早期干预，本发明的目的在于提供一种新的骨关节炎相关基因，以及该基因的表达蛋白及其片段、类似物和衍生物。
本发明的另一目的是骨关节炎相关基因在检测骨关节炎中的用途。
为实现上述目的，本发明首先提供一种检测骨关节炎的分子标记物，所述分子标记物为SCGB1A1基因或该基因的表达蛋白及其片段、类似物和衍生物，所述的SCGB1A1基因或该基因的表达蛋白及其片段、类似物和衍生物在骨关节炎生物学样品中表达上调。
进一步地，本发明提供了一种检测骨关节炎相关基因表达水平是否上调的方法，它包括如下步骤：
(1)检测待测样品中骨关节炎相关基因的表达水平，其中所述骨关节炎相关基因是SCGB1A1基因；
(2)将待测细胞中骨关节炎相关基因的表达水平与对照相比较，从而确定骨关节炎表达水平是否上调。
优选地，步骤(2)中判断上调的标准是骨关节炎相关基因的表达水平比正常人群中骨关节炎相关基因的表达水平高2倍以上。
优选地，步骤(2)中判断上调的标准是骨关节炎相关基因的表达水平比正常人群中骨关节炎相关基因的表达水平高4-50倍。
优选地，步骤(2)中判断上调的标准是骨关节炎相关基因的表达水平比正常人群中骨关节炎相关基因的表达水平高5-30倍。
优选地，所述待测样品为滑膜组织。
优选地，所述检测是通过基因芯片检测法、荧光定量PCR、半定量PCR法、定量PCR法、蛋白质芯片检测法、免疫方法或抗原-抗体检测法进行。
优选地，所述免疫方法为ELISA检测和/或胶体金检测。
优选地，所述ELISA法为使用ELISA检测试剂盒，该试剂盒包括：包被SCGB1A1单克隆抗体的固相载体，酶标抗体，酶的底物，蛋白标准品，阴性对照品，稀释液，洗涤液，酶反应终止液等。所述胶体金法为使用检测试剂盒，所述的抗体可采用市售的SCGB1A1单克隆抗体或多克隆抗体。更优选地，所述的胶体金检测试剂盒是采用胶体金免疫层析技术或胶体金渗滤法。更优选地，所述的胶体金检测试剂盒硝酸纤维素膜上的检测区(T)喷点有抗SCGB1A1抗体、质控区(C)喷点有免疫球蛋白IgG。
进一步地，本发明提供了一种检测个体患有骨关节炎可能性的试剂盒，所述试剂盒包括特异性扩增骨关节炎相关基因DNA的引物和说明书，所述骨关节炎相关基因是SCGB1A1。优选地，所述引物具有SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的引物。
优选的，所述检测试剂盒含有SCGB1A1正向引物SEQ ID NO:1和反向引物SEQ IDNO:2，干粉，Taq酶，dNTP，镁离子，和PCR反应缓冲液。
进一步地，本发明提供了一种检测个体患有骨关节炎可能性的试剂盒，所述试剂盒包括特异性结合于骨关节炎相关基因的表达产物的抗体和说明书。
进一步地，本发明提供了一种检测骨关节炎的试剂盒，所述试剂盒包括检测骨关节炎相关基因的芯片和说明书，所述芯片选自下组：
(1)DNA芯片，所述芯片具有基片和点样于基片上点样区的点样DNA,所述点样DNA包括特异性结合于骨关节炎相关基因转录本的探针，所述骨关节炎相关基因是SCGB1A1；
(2)蛋白质芯片，所述芯片具有基片和点样于基片上点样区的点样蛋白，所述点样蛋白包括特异性结合于骨关节炎相关基因表达产物的抗体，所述骨关节炎相关基因是SCGB1A1。
本发明的有益效果如下：
本发明公开了一种与骨关节炎相关的基因SCGB1A1，并进一步证实该SCGB1A1基因或该基因的表达蛋白及其片段、类似物和衍生物在骨关节炎组织中表达上调。利用该基因检测骨关节炎不仅能够快速有效的做到早期检测，而且为基因治疗、药物治疗等临床应用提供了治疗靶点和重要依据。
附图说明
图1本发明中实施例4中干扰后各组SCGB1A1-mRNA相对表达量。
具体实施方式
发明人利用cDNA微阵列技术筛选骨关节炎和正常人群中表达差异基因，获得了上万个基因的表达图谱。把正常人滑膜组织与骨关节炎患者的滑膜组织的基因表达谱进行对比，通过比较分析发现有3208个基因表达上调，这些基因的表达上调都大于4倍。本发明公开的SCGB1A1基因在50％以上样品中表达上调。
本发明的SCGB1A1基因是在本发明之前的已知基因，其基本信息如下：
Genbank登录号：NM_003357，来源于人类基因组。
本发明还采用RT-PCR方法和MTT方法检测上述基因在骨关节炎患者和正常人群中的表达，并验证了该基因为骨关节炎表达上调基因。
荧光定量PCR法是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度。荧光定量PCR的出现，极大地简化了定量检测的过程，而且真正实现了绝对定量。多种检测***的出现，使实验的选择性更强。自动化操作提高了工作效率，反应快速、重复性好、灵敏度高、特异性强、结果清晰。
MTT法又称MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。它的特点是灵敏度高、经济。
本发明的SCGB1A1基因的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据已公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA作为模板，扩增而得到有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次扩增，然后再将多次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
目前，已经可以完全通过化学合成来编码本发明的蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中的各种DNA分子(如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
本发明蛋白的片段除了可用重组法产生之外，还可用固相技术通过直接合成肽而加以生产(Stewart等人,(1969)Soliod-Phase Peptide Synthesis,WH Freeman Co.,SanFrancisco；Merrifield J.(1963)J.Am Chem.Soc 85:2149-2154)。在体外合成蛋白质可以用手工或自动进行。例如，可以用Applied Biosystems的431A型肽合成仪(Foster City，CA)来自动合成肽。可以分别化学合成本发明蛋白的各片段，然后用化学方法加以连接以产生全长的分子。
本文使用的术语“骨关节炎”指关节炎的特定形式，特别是关节软骨随时间逐渐退化的慢性疾病，所述关节软骨覆盖在形成关节面的骨末端上。
本文使用的术语“表达上调”指对应于所表达基因的序列，其中序列量的测量证明，与从正常个体或从通过骨关节炎分期确定与骨关节炎不同的已鉴定疾病状态的个体中分离的生物学样品中的同一基因相比，所述基因在从患骨关节炎或通过骨关节炎分期确定的骨关节炎已鉴定疾病状态的个体中分离的生物学样品中的表达水平增加。根据本发明，“表达上调”是指通过本发明方法杂交强度测量的至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％或更高的表达增加，例如20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更高或者高于1倍，最高为2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、50倍、100倍或更高。例如，上调序列包括与分离自正常个体的生物学样品相比，在分离自特征为患轻度、中度、显著或重度OA的个体的生物学样品中表达水平增加的序列。上调序列还可包括与其他骨关节炎阶段相比，在分离自特征为患某个骨关节炎阶段的个体的生物学样品中表达水平增加的序列(如显著OA比重度OA)。
本文使用的术语“蛋白质类物质”(如蛋白质、多肽、肽和抗体)的上下文中使用的术语“类似物”指这样的蛋白质类物质：其与第二种蛋白质类物质具有相似或相同的功能，但不一定包含与所述第二种蛋白质类物质相似或相同的氨基酸序列或具有与第二种蛋白质类物质相似或相同的结构。具有相似的氨基酸序列的蛋白质类物质指满足以下至少一项的第二种蛋白质类物质：
(a)具有与第二种蛋白质类物质的氨基酸序列至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％一致性的氨基酸序列的蛋白质类物质；
(b)由核苷酸序列编码的蛋白质类物质，所述核苷酸序列在严谨条件下与编码第二种蛋白质类物质的至少5个连续氨基酸残基、至少10个连续氨基酸残基、至少15个连续氨基酸残基、至少20个连续氨基酸残基、至少25个连续氨基酸残基、至少40个连续氢基酸残基、至少50个连续氨基酸残基、至少60个连续氨基酸残基、至少70个连续氨基酸残基、至少80个连续氨基酸残基、至少90个连续氨基酸残基、至少100个连续氨基酸残基、至少125个连续氨基酸残基或至少150个连续氨基酸残基的核苷酸序列杂交；
和(c)由核苷酸序列编码的蛋白质类物质，所述核苷酸序列与编码第二种蛋白质类物质的核苷酸序列有至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％一致性。与第二种蛋白质类物质结构相似的蛋白质类物质指具有与第二种蛋白质类物质相似的二级、三级或四级结构的蛋白质类物质。
本文使用的术语“蛋白质”、“多肽”和“蛋白质类物质”可互换使用，指通过肽键连接在一起的氨基酸链，任选地可包含天然或非天然氨基酸。任选地，蛋白质或多肽可包含除氨基酸以外的其他分子。所述链可以为任何长度。在一个具体实施方案中，蛋白质由通过肽键连接在一起的少于200个、少于175个、少于150个、少于125个、少于100个、少于50个、少于45个、少于40个、少于35个、少于30个、少于25个、少于20个、少于15个、少于10个或少于5个氨基酸组成。在另一实施方案中，蛋白质由通过肽键连接在一起的至少200个、至少250个、至少300个、至少350个、至少400个、至少450个、至少500个或更多氨基酸组成。
本文使用的术语“生物学样品”包括但不限于血、血清、唾液、尿、滑液、软骨、滑膜组织等样品。优选地，患者样品为滑膜组织。
本文使用的术语“表达水平”指通过本领域技术人员已知和本文所述的方法测定的给定核酸或蛋白质的可测量。涉及本发明生物标志物对应的RNA、hnRNA、mRNA或mRNA剪接变体时，表达水平可以通过杂交或更多定量测量来测定，例如包括使用SYBR绿、TaqMan和分子信标技术的定量实时RT PCR。
本文使用的“对照”指未显示任何OA症状(包括关节痛)并且未诊断为关节损伤或OA的个体或个体组。优选地，所述对照个体未使用影响OA的药物，并且未诊断为患有任何其他疾病。更优选地，对照个体具有与测试样本相比相似的性别、年龄和体重指标(BMI)。根据本发明，“对照”还指分离自正常个体的样品，包括分离自正常个体的总RNA或mRNA。取自对照个体的样品可包括分离自滑膜组织的RNA，其中RNA分离自滑膜组织，所述滑膜组织分离自组织移除时未诊断为OA并且未显示任何OA症状的个体。在本发明的一个实施方案中，为半月板损伤及交叉韧带损伤进行关节镜手术治疗的患者。
本文使用的术语“引物”指存在于纯化的限制性消化物中或合成产生的寡核苷酸，置于诱导合成与核酸链互补的引物延伸产物的条件下时，即存在核苷酸和诱导剂(如DNA聚合酶)以及适当的温度和pH时，所述寡核苷酸能作为合成的起始点。引物可以为单链或双链，并且必须具有足够的长度，以在诱导剂存在下引发所需延伸产物的合成。引物的确切长度会取决于许多因素，包括温度、引物来源和使用的方法。例如，就诊断应用而言，取决于靶序列的复杂性，寡核苷酸引物一般含有15-25或更多的核苷酸，尽管也可以含有更少的核苷酸。引物合适长度的确定中涉及的因素为本领域普通技术人员所公知。一般而言，根据本领域熟知的标准方法设计和选择本发明的引物，参阅Dieffenbach，C.W.，Lowe，T.M.J.，Dveksler，G.S.(1995)General Concepts for PCR Primer Design.《PCR Primer，ALaboratory Manual》(Dieffenbach，CW和Dveksler，G.S.编辑)Cold Spring HarborLaboratory Press，New York，133-155。
实施例1建立基因差异表达谱
1、材料
选取骨关节炎患者滑膜组织及对照滑膜组织，骨关节炎患者符合膝关节OA诊断标准，进行膝关节人工关节置换术患者；对照为半月板损伤及交叉韧带损伤进行关节镜手术治疗的患者。
2、RNA提取
采用Reagent(invitrogen，货号15596-018)进行样本RNA提取，实验操作按产品说明书进行。
RNA提取后用Nanodrop2000紫外分光光度计测量RNA纯度及浓度，冻存于-70℃。RNA质量判定标准：RNA样本的OD260/OD280值为1.7-2.2之间；总RNA电泳图谱有清晰的28S、18S条带；70℃水浴保温1小时后的电泳图谱与水浴保温前的图谱无明显差异。
总RNA经变性甲醛琼脂糖电泳检查无降价后，用于mRNA的制备。一次反应用200ug总RNA分离制备mRNA，mRNA的分离采用Oligotex mRNA min kit(Qiagen,Hilden,Germany)试剂盒。
3、cDNA微列阵
采用LifeGrid 1.0微列阵膜购自Incyte Genimic公司，该膜含有约8千4百个cDNA的PCR产物和27个对照，按照双点模式，印在一个12*22cm的尼龙膜上。来自骨关节炎和正常组织的mRNA分别在a-33P dCTP存在的条件下，用逆转录生成33P-标记的cDNA探针。标记掺入百分比不小于40％。每个cDNA探针与微列阵杂交的条件见LifeGrid 1.0微列阵说明书。杂交过夜后的膜，室温晾干，由磷屏仪(Phosphor image)曝光并扫描，扫描结果即杂交信号的计算机分析解读由Incyte公司完成。
4、结果
根据Incyte公司提供的计算机分析结果，获得了骨关节炎和正常人组织中表达差异基因，获得了8400个基因的表达图谱。把正常人滑膜组织与骨关节炎患者的滑膜组织的基因表达谱进行对比，去除在骨关节炎和正常人组织中都表达缺失的基因，去除相同cDNA两个点差异大于2.5倍和一个点不到背景2倍的基因。最后，通过比较分析发现有3208个基因表达上调，这些基因的表达上调都大于4倍。本发明公开的SCGB1A1基因在50％以上样品中表达上调。
实施例2骨关节炎患者及对照滑膜组织SCGB1A1基因表达情况
一、材料和方法
1、材料
选取39例骨关节炎患者滑膜组织及8例对照滑膜组织，对其进行分组及编号。病例组均符合膝关节OA诊断标准，进行膝关节人工关节置换术患者；对照组为半月板损伤及交叉韧带损伤进行关节镜手术治疗的患者。
2、方法
2.1骨关节炎患者及对照的滑膜组织总RNA的提取
同实施例1
2.2逆转录合成cDNA
采用III Reverse Transcriptase(invitrogen，货号18080-044)进行cDNA反转录，实验操作按产品说明书进行。获得的cDNA保存放-20℃冰箱备用。
2.3 Real-Time PCR
2.3.1仪器及分析方法
用ABI 7500型荧光定量PCR仪，采用2-△△CT法进行数据的相对定量分析。
2.3.2引物设计
采用在线引物设计软件，基因序列参照NCBI:NG_021331.1(SCGB1A1)，内参选GAPDH，引物设计后由invitrogen公司合成。具体引物序列如下：
表1引物序列
操作过程如下：
表2 Real Time反应体系+
组分 加入量
2×mix 10μL
上游引物(10uM) 0.5μL
下游引物(10uM) 0.5μL
模板 2μL
加入灭菌蒸馏水 至25μL
(一)反应体系：用PowerGreen PCR Master Mix(invitrogen，货号4367659)进行扩增，实验操作按产品说明书进行。
扩增程序为：95°5min，(95℃15sec，61℃45sec)×35个循环。
(二)引物筛选
将各样本cDNA混合后，以此为模板进行5倍梯度稀释，稀释后样品各取2μL作模板，分别用目的基因引物和内参基因引物进行扩增，同时在60-95℃进行融解曲线分析，根据扩增效率高和溶解曲线单峰原则进行引物筛选。(三)样品Real Time-PCR检测
将各样品cDNA 10倍稀释后取2μL作模板，分别用目的基因引物和内参基因引物进行扩增。同时在60-95℃进行溶解曲线分析。
二、实验结果
实时定量PCR扩增曲线拐点清楚，扩增曲线整体平行性好，表明各反应管的扩增效率相近，极限平而无上扬现在，曲线指数期斜率较大，说明扩增效率较高；样本扩增产物溶解曲线都是单峰，说明扩增产物只有一条，为特异性扩增；根据qRT-PCR的相对定量公式：2-ΔCt×100％，比较SCGB1A1基因在骨关节炎组织和对照组织中的表达水平。结果显示：qRT-PCR扩增结果稳定，其中SCGB1A1基因在骨关节炎组织中的表达水平为对照组织的近4倍，以上结果验证了SCGB1A1基因在骨关节炎患者中表达上调的结果。
实施例3软骨细胞的分离和培养
一、实验方法
(1)将创伤性截肢取下的无菌膝关节软骨标本后立即置于PBS无菌培养皿中，去除关节软骨周围的所有软组织，得膝关节的全层软骨片；
(2)以无菌手术刀将软骨修剪成约3mm×lmm×lmm大小的组织块，剪碎软骨组织，之后将这些软骨碎块用含青霉素钠/庆大霉素双抗液的PBS缓冲液冲洗数次后，放入盛有DMEM/F 12培养基的无菌培养皿中；
(3)将这些修剪的软骨碎块移入离心管中，低温下以1000转/分的速度离心约5分钟；
(4)将上清液弃去之后加入5ml的0.25％胰蛋白酶，在37℃温搅拌器上消化30-50分钟，然后轻轻吹打弃去上清液，D-Hanks液冲洗3-5次；
(5)加入5mL的0.15％的II型胶原酶，放入恒温摇箱中，37℃下摇荡消化6小时，每3个小时收一次细胞；
(6)200目筛网过滤消化后的细胞悬液，低温离心5分钟(约2800转/分)后再次弃去上清液，然后在DMEM/F 12培养液中洗涤3次，加入含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基，用吸管轻轻吹打，使细胞悬液分布均匀，从而得到含有软骨细胞的细胞悬液；
(7)将细胞以1×108/L接种于25CM2培养瓶内(5mL/瓶)，置于37℃恒温，5％CO2饱和湿度培养箱内培养，更换培养液的频率为每两天1次，利用倒置相差显微镜进行观察和照相，只要软骨细胞汇合成片且贴壁率达到85％-90％后就可以开始传代；
(8)在传代开始前，先洗净培养液，随后用HANKS液轻洗细胞2-3次；
(9)在培养瓶内加入0.05％的胰蛋白酶1mL，待其在瓶底均匀分布后将其吸尽，然后再次加入0.05％的胰蛋白酶消化液，以覆盖瓶底为限，之后将其放在37℃恒温培养箱内2-3分钟；
(10)用倒置显微镜进行观察，当细胞开始回缩，细胞间隙开始增大时，则表明软骨细胞开始游离；
(11)加入HANKS液终止培养瓶中的消化作用，轻吹瓶底软骨细胞，往往需要反复多次才能使贴壁的软骨细胞完全脱落；
(12)以1200rpm的速度对细胞悬液进行离心，10分钟后将上清液弃去；
(13)制成细胞悬液并计数，然后按照1:3的比例进行传代培养。
二、实验结果
正常软骨细胞一般在24小时左右开始贴壁生长，48小时以后贴壁细胞可以达到90％左右，一般情况下4至7天可长满瓶底，贴壁的软骨细胞具有丰富的胞浆，呈多角形扁平状，可有多个突起，胞体中央为圆形或椭圆形的胞核，可见2至3个核仁，有些区域的软骨细胞呈集落生长。培养至第三代时，软骨细胞开始去分化，并且这种去分化的趋势会随着代数的增加而增强，到***时逐渐出现纤维细胞样的变化，具体体现在:形态呈长梭形；边缘突起多且细长；胞浆增多但细胞核偏离中央且核仁肥大。
实施例4 RNAi干扰SCGB1A1表达及对软骨细胞的影响
一、材料
(一)细胞来源
实施例3培养的软骨细胞。
(二)siRNA设计与合成
依据在线设计软件siDirect version 2.0(http://design.rnai.jp/)，根据基因序列参照NCBI:NM_003357(SCGB1A1)，设计相应的siRNA，具体序列见表3。设计后送往合成公司合成。
表3 siRNA序列列表
二、实验方法
(一)RNA干扰抑制软骨细胞SCGB1A1基因的表达
细胞分组及转染
1.细胞分组
C组：空白对照组；C1组：转染脂质体组；C2组：转染非特异性的siRNA组；S1，S2，S3组：转染特异性的siRNA组。
2.转染
按照LipofectamineTM2000 Transfection Reagent提供的步骤进行。
(1)软骨细胞同步化：转染前一天，取第一代软骨细胞进行试验，将其加入至5％FBS高糖DMEM培养基内，继续在37℃5％CO2内进行培养，从而使所有软骨细胞处于同步状态，减少试验干扰；
(2)5×104细胞接种在6孔板上，这些用于初期接种的细胞数量，应能在24小时内使细胞汇合达到70％；
(3)准备siRNA-LipofectamineTM 2000复合物:
a.以250u1Opti-MEM稀释5ul LipofectamineTM 2000，轻轻混匀，室温下孵育5分钟。
b.实验各组分别取7.5u1siRNA加入250u1Opti-MEM I中进行稀释，并轻轻摇动将其混匀；
c.孵育5分钟后，将稀释的siRNA和LipofectamineTM 2000混合后在室温下孵育20分钟。
(4)在培养板中的每个孔中都加入细胞、培养基及siRNA-LipofectamineTM 2000复合物。然后轻轻摇动培养板，使他们充分混合；
(5)放置在37℃，CO2培养箱内孵育48小时，在荧光显微镜下观察细胞转染数量，检测转染效率；
(6)转染效率为荧光镜与光镜视野中的细胞数量的比值，细胞的转染效率均达到90％以上，方可以进行后续的实验。计算公式如下：
转染效率＝发荧光细胞的数量/相同视野下的细胞数量×100％
3.应用Real-time PCR方法检测转染前后SCGB1A1基因表达的变化
(1)标准曲线的构建：选取在50mI培养瓶中正常培养的软骨细胞1瓶，提取RNA，测定RNA浓度和纯度，进行逆转录反应，将反应生成的DNA模板十倍稀释，得到相当于104-100copies/ul的DNA模板，分别加入SCGB1A1基因引物和内参引物，配制25u1反应体系，使用Real-time PCR扩增仪，进行PCR扩增反应。得到SCGB1A1和内参的标准曲线。
(2)Real-time PCR方法检测转染前后SCGB1A1基因表达的变化：提取各组细胞的RNA，测定RNA浓度和纯度，进行逆转录反应，每组DNA模板同时进SCGB1A1和内参的Real-time PCR反应，实验重复三次。
(3)对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。
三、实验结果
分别3条SCGB1A1基因的siRNA及对照siRNA转染第一代软骨细胞，结果显示在大量软骨细胞内发现绿色荧光，证明软骨细胞内已经得到了siRNA的转染，然后在荧光镜和光镜下观察软骨细胞数量，进行转染效率的检测，结果显示转染率均达到90％以上。Real-timePCR结果显示，转染非特异性的siRNA组对软骨细胞中SCGB1A1基因表达无明显抑制作用，和空白对照组无统计学差异，转染的3个SCGB1A1基因siRNA组都对软骨细胞中SCGB1A1基因表达起到一定抑制作用抑制率为44％，其中SCGB1A1-siRNA2和SCGB1A1-siRNA3抑制效果最明显，抑制率达70％和82％，具体见图1。
实施例5 MTT法检测软骨细胞的增殖情况
一、MTT法实验步骤
1.在96孔板中，按照每孔加入约1×104细胞，然后在37℃5％CO2的条件下培养24小时；
2.按照实验分组(空白对照组、软骨细胞加非特异性的siRNA组、软骨细胞加SCGB1A1-siRNA3组，每组6个重复)继续培养直至适合检测；
3.接着在37℃，5％CO2及100％湿度的条件下继续孵育适当时间；
4.同时用Dilution Buffer将5×MTT稀释成1×MTT；
5.在每孔中加入50u11×MTT，并在37℃条件下孵育4小时；
6.吸出上清液后，在每孔中还需加入150u1DMSO，并将其放置在平板摇床上进行摇匀；
7.将酶标仪波长设定为570nm，检测每个孔的光密度。
8.细胞增殖率的计算：细胞增殖率％＝(受试孔OD值/对照细胞OD值)×100％，其中受试孔OD值＝测试孔的OD值-本底OD值(没有细胞但有MTT的完全培养基)，对照细胞OD值为正常培养细胞孔的OD值。
三、实验结果
分别在0、12、24、48和72小时节点上取样，相对软骨细胞对照组，软骨细胞加非特异性的siRNA组细胞增殖无显著差异，软骨细胞加SCGB1A1-siRNA3组在0-24小时细胞增殖不明显，但是随着时间的增加，在48、72小时节点上软骨细胞增殖率显著增加，差异具有统计学意义(P<0.05)，结果见表4所示。
表4各组软骨细胞的增殖率(％)
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (5)

1.检测SCGB1A1基因或该基因编码的蛋白的表达水平的试剂在制备检测骨关节炎的试剂盒中应用，其特征在于，所述的SCGB1A1基因或该基因编码的蛋白为所述试剂盒的检测靶标，所述的SCGB1A1基因或该基因编码的蛋白在骨关节炎生物学样品中表达上调，所述的SCGB1A1基因或该基因编码的蛋白为人类SCGB1A1基因或该基因编码的蛋白。
2.检测SCGB1A1基因表达水平的引物在制备检测骨关节炎的试剂盒中应用，其特征在于，所述试剂盒包括特异性扩增SCGB1A1基因逆转录得到的cDNA的引物和说明书，所述的SCGB1A1基因或该基因编码的蛋白在骨关节炎生物学样品中表达上调，所述的SCGB1A1基因或该基因编码的蛋白为人类SCGB1A1基因或该基因编码的蛋白。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述引物的序列如SEQ ID NO:1和SEQ IDNO:2所示。
4.检测SCGB1A1基因表达水平的抗体在制备检测骨关节炎的试剂盒中应用，其特征在于，所述试剂盒包括特异性结合于骨SCGB1A1基因的表达产物的抗体和说明书，所述的SCGB1A1基因或该基因编码的蛋白在骨关节炎生物学样品中表达上调，所述的SCGB1A1基因或该基因编码的蛋白为人类SCGB1A1基因或该基因编码的蛋白。
5.检测SCGB1A1基因表达水平的芯片在制备检测骨关节炎的试剂盒中应用，其特征在于，所述试剂盒包括SCGB1A1基因的芯片和说明书，所述的SCGB1A1基因或该基因编码的蛋白在骨关节炎生物学样品中表达上调，所述的SCGB1A1基因或该基因编码的蛋白为人类SCGB1A1基因或该基因编码的蛋白，所述芯片选自下组：
(1)cDNA芯片，所述芯片具有基片和点样于基片上点样区的点样cDNA，所述点样cDNA包括特异性结合于SCGB1A1基因转录本的探针；
(2)蛋白质芯片，所述芯片具有基片和点样于基片上点样区的点样蛋白，所述点样蛋白包括特异性结合于SCGB1A1基因表达产物的抗体。
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