发明内容
本发明的目的是针对上述问题,提供一种发酵单位高、能稳定生产、产量高且副产物少的利普司他汀产生菌。
一种毒三素链霉菌ST-5423,分类命名为毒三素链霉菌ST-5423(Streptomyces toxytricini ST-5423),由中国典型培养物保藏中心保藏,保藏号为:CCTCC M2013312,保藏日期为:2013年07月04日。
毒三素链霉菌ST-5423的菌株的菌落特征:基内菌丝发育良好,无色,菌丝细长分枝,直径为0.8~0.9μm;气生菌丝生长丰茂、粉状,孢子丝着生在气生菌丝体上,孢子丝直、柔曲,孢子呈椭圆形至柱形,表面光滑,直径为0.65~1.0×1.0~2.0μm,成熟孢子链孢子个数在10个以上。酵母浸出物淀粉琼脂:气丝白色至肉桂粉色。
根据微生物形态学及国外相关资料的描述,结合毒三素链霉菌ST-5423的菌株的各种培养特征和形态特征,该毒三素链霉菌ST-5423的菌株应属于毒三素链霉菌属,定名为Streptomyces toxytricini ST-5423。
本发明的另一个目的是提供该菌株在制备利普司他汀中的应用。
毒三素链霉菌ST-5423的菌株可应用于发酵制备利普司他汀。该制备方法包括下列步骤:
a. 发酵菌株采用毒三素链霉菌ST-5423的菌株;
b.菌株培养:按常规方法制备的斜面,挖取斜面菌苔块,接入摇瓶进行种子培养得摇瓶种子液;将摇瓶种子液接种于摇瓶发酵培养基中或种子罐中培养;将种子罐培养液接种于发酵罐培养基培养,收集发酵液; 优选在发酵培养过程中无需进行补料,待种子罐菌丝生长良好接入发酵罐后,根据发酵液实际情况从pH、菌浓、搅拌转速、溶氧及菌丝镜检情况等方面来控制发酵过程即可。
c. 发酵产物提取:提取、浓缩、氢化、结晶、制备柱、结晶和干燥。
其中所述的步骤b为:按常规方法制备的斜面,挖取斜面菌苔块接入摇瓶种子培养基,150~250rpm,培养24~48小时,得摇瓶种子液;将摇瓶种子液按种子罐培养基体积0.1~2%的接种量接种于种子罐。搅拌速度80~120rpm,培养24~48h;将种子罐培养液按发酵培养基体积5~15%的量接种于发酵罐培养基,搅拌速度120~200rpm,发酵培养130~240小时,收集发酵液;其中培养温度均为26~28℃。
本发明还公开了培养基:按重量体积比计,摇瓶、种子罐培养过程中的碳源为0.2~5.0%,优选0.5~4.5%,最优选为0.5~3.0%;氮源为0.2~4.0%,优选0.5~3.5%,最优选为0.5~3.0%;无机盐为0.02~2.0%,优选0.02~1.5%,最优选0.02~1.3%;其余为水;
其中碳源选自麦芽糊精、淀粉、可溶性淀粉、淀粉水解糖、糖蜜、糊精、甘油、葡萄糖、土豆浸出粉、土豆糊精、燕麦片的一种或几种;优选麦芽糊精、淀粉、可溶性淀粉、糊精、甘油、葡萄糖、土豆糊精、燕麦片中的一种或几种;最优选麦芽糊精、淀粉、可溶性淀粉、甘油、葡萄糖、土豆糊精中的一种或几种。
其中氮源选自黄豆饼粉、生豆粉、豆粕粉、玉米浆、玉米蛋白、蛋白胨、植物性蛋白胨、肉胨、酵母粉、酵母浸出物、酵母抽提物一种或几种;优选黄豆饼粉、生豆粉、豆粕粉、玉米蛋白、蛋白胨、植物性蛋白胨、酵母浸出物、酵母抽提物中的一种或几种;更优选生豆粉、豆粕粉、酵母抽提物、黄豆饼粉、植物性蛋白胨、酵母浸出物中的一种或几种。
其中无机盐选自K2HPO4、NaCl、NaNO3、ZnSO4、MgSO4、FeSO4、KH2PO4中的一种或几种;优选K2HPO4、ZnSO4、MgSO4、FeSO4、KH2PO4中的一种或几种;最优选ZnSO4、MgSO4、FeSO4、KH2PO4中的一种或几种。
其中,发酵培养过程中,按重量体积比计,碳源为1.5~15%,优选2.5~13%,最优选5~11%;氮源为0.5~7.0%,优选0.7~5%,最优选1~3%;无机盐为0.02~2.0 %,优选0.02~1.6%,最优选0.04~1.0%;其余为水;
发酵培养过程中的培养基物料选择如下:
碳源选自麦芽糊精、淀粉、可溶性淀粉、淀粉水解糖、糊精、甘油、菜油、大豆油、葵花籽油、大豆卵磷脂、葡萄糖、土豆浸出粉、土豆糊精、燕麦片中的一种或几种;优选麦芽糊精、淀粉、可溶性淀粉、糊精、甘油、菜油、大豆油、葵花籽油、大豆卵磷脂、葡萄糖、土豆浸出粉、土豆糊精、燕麦片中的一种或几种,最优选淀粉、可溶性淀粉、甘油、菜油、大豆油、葵花籽油、大豆卵磷脂、葡萄糖中的一种或几种。
氮源选自黄豆饼粉、生豆粉、豆粕粉、玉米浆、玉米蛋白、蛋白胨、植物性蛋白胨、肉胨、酵母粉、酵母浸出物、酵母抽提物中的一种或几种;优选黄豆饼粉、生豆粉、豆粕粉、玉米蛋白、蛋白胨、植物性蛋白胨、酵母粉、酵母浸出物、酵母抽提物中一种或几种;更优选为生豆粉、豆粕粉、酵母抽提物、黄豆饼粉、植物性蛋白胨、酵母浸出物中一种或几种。
无机盐选自K2HPO4、NaCl、NaNO3、ZnSO4、MgSO4、FeSO4、KH2PO4中的一种或几种;优选K2HPO4、ZnSO4、MgSO4、FeSO4、KH2PO4中的一种或几种;最优选ZnSO4、MgSO4、FeSO4、KH2PO4中的一种或几种。
经发酵完成放罐后,对发酵产物进行提取,通过氢化、结晶,再进行制备柱纯化后可以获得纯度达98%以上的奥利司他。
本发明所公开的毒三素链霉菌ST-5423是目前用于生产的一种高单位的利普司他汀产生菌,发酵性能优良,可用于大规模生产。发酵过程是利普司他汀(奥利司他)生产的重要环节,其发酵水平与工艺优劣直接相关。本发明提供的发酵工艺经过摇瓶、小试、中试及10吨、30吨生产发酵罐进行试验及生产,其生产能力稳定。经检测,用本发明提供的菌株及发酵培养方法制备的利普司他汀单位可高达9000μg/ml或以上,从而为后续的工业化生产提供了良好的基础。同时本发明的发酵副产物相对较少,并降低了后提取的难度,提取和纯化的工艺相对简单,大大提高了收率和纯度,在工业化生产上更具优势。
菌株保藏情况:保藏于武汉中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC),保藏编号为CCTCC M2013312,分类命名为毒三素链霉菌ST-5423 (Streptomyces toxytricini ST-5423),保藏日期为2013年07月04日。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述,但不能将方案中所涉及的方法及技术参数理解为对本发明的限制。
实施例1:毒三素链霉菌ST-5423的培养特征
将毒三素链霉菌ST-5423的菌株接种于甘油天冬酰氨琼脂、酵母膏麦芽浸出液琼脂等用于观察形态特征的培养基。28℃培养一定的时间5、8、10天,观察并进行描述,结果见表1。
表1、毒三素链霉菌ST-5423的菌株在各种培养基上的菌落特征
培养基 |
生长情况 |
气生菌丝 |
可溶性色素 |
酵母膏麦芽浸出液琼脂 |
丰茂 |
白至肉桂粉色 |
浅黄色 |
无机盐淀粉琼脂 |
丰茂 |
白至肉桂粉色 |
无色 |
燕麦粉琼脂 |
丰茂 |
白至肉桂粉色 |
无色 |
甘油天门冬素琼脂 |
丰茂 |
白至肉桂粉色 |
浅黄色 |
蛋白胨酵母膏培养基 |
中度 |
白色 |
无色 |
酪氨酸琼脂 |
中度 |
白色 |
无色 |
高氏一号琼脂 |
丰茂 |
白至粉红色 |
无色 |
葡萄糖天门冬素琼脂 |
中度 |
白至粉红色 |
浅黄色 |
蔗糖察式琼脂 |
贫乏 |
白色 |
无色 |
苹果酸钙琼脂 |
贫乏 |
白色 |
无色 |
马铃薯块 |
贫乏 |
白色 |
无色 |
葡萄糖酵母膏琼脂 |
中度 |
浅白至粉色 |
浅黄色 |
实施例2:碳源利用及生理生化特征
生理生化性质采用毒三素链霉菌分类中的标准方法。
利用Biolog(GENⅢ)自动微生物鉴定***对菌株Streptomyces toxytricini ST-5423进行了94种表型测试,包括71种碳源利用情况检测以及23种化学敏感性检测:将菌株接种于BUG+B平板培养基, 28℃恒温培养16h,用无菌棉签将平板上的菌体洗下,与接种液(IF-C)混合,制成菌悬液,用浊度计调整至98%T/FF。用8孔电动加液器将菌悬液分别加在Biolog(GENⅢ)微孔的各孔中,每孔100μl。将微孔鉴定板放在28℃培养箱中,分别在培养12h、24h、48h和72h后将其置于Biolog读数仪上读取结果。
经Biolog读数仪分析代谢指纹,毒三素链霉菌ST-5423可较强利用其中44种碳源,对其它27种碳源利用能力较弱或不能利用。毒三素链霉菌ST-5423( Streptomyces toxytricini ST-5423)对7种化学物质敏感。Biolog***给出48h鉴定结果见表2和表3。
表2菌株ST-5423对Biolog(GENⅢ)板上71种碳源的利用能力
说明:+,阳性;-,阴性。
表3菌株ST-5423对Biolog GEN Ⅲ板上23种化学物质的化学敏感性
说明:+,阳性;-,阴性;B:较弱
实施例3:利普司他汀的生产发酵培养
1.种子菌种培养及保存
固体培养基:葡萄糖 5g,酵母膏 5g,麦芽浸出粉 5g,硫酸镁0.2g,磷酸二氢钾0.5,琼脂 18g,加水1000ml,pH7.0
培养:菌株接种于固体培养基斜面上,28℃培养7~10天。
固体培养结束后,斜面放置4℃冷藏备用。
2.摇瓶种子培养
培养基:淀粉水解糖20g, 甘油60g,土豆浸出粉10g,豆粕粉6g,植物性蛋白胨4g,酵母粉20g,MgSO4 2g,ZnSO4 6g,加水2L, pH7.0。
培养:26℃,28h,200rpm
在菌丝长起,有明显挂壁现象且菌浓约为9%左右,将2L摇瓶种子培养液,接入以下种子罐中。
3.种子罐种子培养
培养基:淀粉水解糖2kg, 甘油6kg,土豆浸出粉 1kg,豆粕粉0.6kg,植物性蛋白胨 0.4g,酵母粉2kg,MgSO4 0.2kg,ZnSO4 0.6kg,加水200L, pH6.0。
装量:700L种子罐内装培养基200L,121℃灭菌30min。
接种量:2L摇瓶种子液
培养:28℃,28h,80rpm
4.发酵罐培养
发酵培养基:淀粉水解糖10kg、甘油40kg,菜油60kg,葡萄糖10kg,大豆卵磷脂10kg,豆粕粉20kg,玉米浆5kg,植物性蛋白胨0.5kg,肉胨0.5 kg,酵母粉4kg,ZnSO4 6kg,MgSO4 10kg,加水1吨,pH7.0
装量:2.5吨发酵罐内装培养基1吨
接种量:120L的种子液
培养温度:28℃,罐压:0.04MPa,空气流量:1:1 vvm,搅拌转速150rpm,培养时间:220h
放罐所得发酵液效价为10226μg/ml。
实施例4:利普司他汀的生产发酵培养
1.摇瓶种子培养
培养基:麦芽糊精 5g, 葡萄糖20g,燕麦片 5g,玉米浆 10g,玉米蛋白 2.5 g,肉胨2.5g,酵母抽提物 15g, K2HPO4 5g,NaCl 5g,MgSO4 5g,加水1L, pH7.0
培养:28℃,24h,250rpm
在菌丝长起,有明显挂壁现象且菌浓约13%左右,将1L摇瓶种子培养液,接入以下种子罐中。
2.种子罐种子培养
种子罐培养:麦芽糊精1kg, 葡萄糖4kg,燕麦片1kg,玉米浆2kg,玉米蛋白0.5kg,肉胨0.5kg,酵母抽提物3kg, K2HPO4 1kg,NaCl1kg,MgSO4 1kg,加水200L, pH7.0
装量:700L种子罐内装培养基200L,121℃灭菌30min。
接种量:1L摇瓶种子液
培养:28℃,32h,120rpm
3.发酵罐培养
发酵培养基:麦芽糊精 20 kg,大豆油 15 kg,葵花籽油 45kg,葡萄糖 20 kg,燕麦片10kg,黄豆饼粉 20 kg,豆粕粉 16kg,植物性蛋白胨 4 kg,酵母浸出物 10kg,ZnSO4 0.4 kg,加水1吨, pH7.2
装量:2.5吨发酵罐内装培养基1吨
接种量:90L的种子液
培养温度:27℃,罐压:0.03MPa,空气流量:1:1 vvm,搅拌转速200rpm,培养时间:200h
放罐时,发酵单位为10020μg/ml。
实施例5:利普司他汀的生产发酵培养
1.摇瓶种子培养
培养基:淀粉120g, 糊精20g,大豆浸出粉60g,生豆粉60g,豆粕粉20g,酵母抽提物80g, K2HPO4 40g,NaNO3 20g,FeSO4 20g,加水4L, pH7.0
培养:28℃,44h,220rpm
在菌丝长起,有明显挂壁现象且菌浓约12%左右,将4L摇瓶种子培养液,接入以下种子罐中。
2.种子罐种子培养
种子罐培养:淀粉 6kg, 糊精 1kg,大豆浸出粉 3kg,生豆粉 3kg,豆粕粉 1kg,酵母抽提物4kg, K2HPO4 2kg,NaNO3 1kg,FeSO4 1kg,加水200L, pH7.0
装量:700L种子罐内装培养基200L,121℃灭菌30min。
接种量:4L摇瓶种子液
培养:28℃,26h,100rpm
3.发酵罐培养
发酵培养基:葡萄糖20kg,甘油40kg,土豆浸出粉 5kg,土豆糊精30kg,燕麦片5kg,大豆油 50kg,生豆粉40kg,玉米浆 5kg,蛋白胨 5kg,肉胨 5kg,酵母浸出物 15kg,K2HPO4 10kg,NaNO3 5kg,CaCO3 5kg,加水1吨, pH7.2
装量:2.5吨发酵罐内装培养基1吨。
接种量:150L的种子液
培养温度:26℃,罐压:0.05MPa,空气流量:1:1 vvm,搅拌转速180rpm,培养时间:240h
放罐时,发酵单位为9606μg/ml。
实施例6:利普司他汀的生产发酵培养
1.摇瓶种子培养
培养基:甘油 45g,黄豆饼粉 30g,植物性蛋白胨 15g,酵母浸出物60g,NaCl 9g,ZnSO4 15g,KH2PO4 15g,加水3L, pH7.0
培养:28℃,38h,250rpm
在菌丝长起,有明显挂壁现象且菌浓约16%左右,将3L摇瓶种子培养液,接入以下种子罐中。
2.种子罐种子培养
种子罐培养:甘油3kg,黄豆饼粉2kg,植物性蛋白胨1kg,酵母浸出物4kg,NaCl 0.6kg,ZnSO4 1kg,KH2PO4 1kg,加水200L, pH7.0
装量:700L种子罐内装培养基200L,121℃灭菌30min。
接种量:3L摇瓶种子液
培养:28℃,24h,90rpm
3.发酵罐培养
发酵培养基:麦芽糊精 5kg,淀粉 5kg,甘油 10kg,菜油 28kg,大豆卵磷脂 5 kg,黄豆饼粉 5kg,玉米蛋白 2 kg,酵母抽提物 3 kg,NaCl 4kg,FeSO4 5kg,CaCO3 1kg,加水1吨, pH7.2
装量:2.5吨发酵罐内装培养基1吨。
接种量:100L的种子液
培养温度:28℃,罐压:0.03MPa,空气流量:1:1 vvm,搅拌转速200rpm,培养时间:180h
放罐时,发酵单位为10264μg/ml。
实施例7:利普司他汀的生产发酵培养
1.摇瓶种子培养
培养基:可溶性淀粉2.4g, 糊精0.6g,酵母浸出粉3g,FeSO4 0.3g,KH2PO4 0.3g,加水600ml, pH7.0
培养:27℃,32h,180rpm
在菌丝长起,有明显挂壁现象且菌浓约13%左右,将400ml摇瓶种子培养液,接入以下种子罐中。
2.种子罐种子培养
种子罐培养:可溶性淀粉1.2 kg, 糊精0.3 kg,酵母浸出粉1.5kg,FeSO4 150g,KH2PO4 150g,加水300L, pH7.0
装量:700L种子罐内装培养基300L,121℃灭菌30min。
接种量:600ml摇瓶种子液
培养:28℃,32h,80rpm
3.发酵罐培养
发酵培养基:可溶性淀粉15kg,糊精15kg,葵花籽油45kg,豆粕粉15kg,FeSO4 6kg,加水3吨,pH7.2
装量:10吨发酵罐内装培养基3吨
接种量:240L的种子液
培养温度:27℃,罐压:0.05MPa,空气流量:1:1 vvm,搅拌转速160rpm,培养时间:150h
按照上述发酵条件和工艺,在10吨发酵罐进行3批发酵生产,放罐时,发酵单位为9980μg/ml、9060μg/ml、10242μg/ml。
实施例8:利普司他汀的生产发酵培养
1.摇瓶种子培养
培养基:麦芽糊精0.2g,淀粉0.6g,黄豆饼粉0.6g,蛋白胨0.2g,K2HPO4 0.08g,加水400ml,pH 7.0
接种量:挖取0.5×0.5cm2斜面菌苔块接入400ml摇瓶种子培养基中。
培养:28℃,48h
摇床转速:150rpm
在菌丝长起,有明显挂壁现象且菌浓为15%左右,将400ml摇瓶种子培养液,接入以下种子罐中。
2.种子罐种子培养
培养基:麦芽糊精200g,淀粉600g,黄豆饼粉600g,蛋白胨200g,K2HPO4 80g,加水400L,pH 7.0
装量:700L种子罐内装培养基400L,121℃灭菌30min。
接种量:400ml摇瓶种子液
培养:28℃,48h
搅拌转速:100rpm
3.发酵培养
培养基:麦芽糊精24kg,大豆油80kg,大豆卵磷脂16kg,生豆粉40kg,豆粕粉8kg,酵母提取物8kg,K2HPO4 1.6kg,加水8吨,pH 7.0
装量:30吨发酵罐内装培养基8吨
接种量:400L的种子液
培养温度:28℃,罐压:0.03MPa,空气流量:1:1 vvm,搅拌转速:120rpm,培养时间: 130h。
按照上述发酵条件和工艺,在30吨发酵罐进行3批发酵生产,发酵单位分别为10860μg/ml 、9860μg/ml和10420μg/ml。
以上所述的实施中所获得的发酵液单位高,杂质少,发酵液经板框过滤取滤液,通过氢化、结晶,再进行制备柱纯化,即可获得纯度在98%以上的奥利司他。