CN102268466B - 一种发酵生产利普司他汀的方法及其培养基组份 - Google Patents
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Abstract
本发明属于微生物发酵生产领域，提供了一种发酵生产利普司他汀(lipstatin)的方法。该方法以毒三素链霉菌(Streptomyces toxytricini)为出发菌，主要包括斜面菌种的制备、种子液的制备以及发酵工艺控制等步骤。本发明以大豆粉、豆油、甘油为发酵培养基的主要氮源和碳源并通过调控发酵工艺及培养基组份，使利普司他汀的生产成本大大降低，发酵效价提高，解决了现有技术中存在的生产成本高、发酵效价低的缺点。
Description
技术领域
本发明涉及微生物发酵领域，具体为一种发酵生产利普司他汀的方法及其培养基组份。
背景技术
本发明涉及的发酵法生产的利普司他汀是新型减肥药奥利司他的中间体。奥利司他目前是全球唯一的减肥类药品，是长效和强效的特异性胃肠道脂肪酶抑制剂，它通过与胃和小肠腔内胃脂肪酶和胰脂肪酶的活性丝氨酸部位形成共价键使酶失活而发挥治疗作用，失活的酶不能将食物中的脂肪，主要是甘油三酯水解为可吸收的游离脂肪酸和单酰基甘油。未消化的甘油三酯不能被身体吸收，从而减少热量摄入，控制体重。
奥利司他的生产有两种方法，发酵合成法以及全合成法。全合成法生产成本比较高。发酵合成法生产成本比较低，更适合大规模生产。
美国专利US4598089、US2005089978A1涉及到的利普司他汀发酵工艺不采用流加补料以及中间补料的方法，发酵水平比较低。
欧洲专利EP0S03576A2以及国际专利WO2007134836A1、WO 2007078263A2涉及到的发酵工艺部分采用流加亚油酸和氨基酸的工艺，但是发酵水平比较低；欧洲专利EP0803576发酵水平低于1g/L。
国际专利WO2004003212采用了不同的淀粉底物，发酵水平为1.486g/L；国际专利WO03048335发酵水平为1.8g/L。
发明内容
为解决现有技术中发酵水平低、不稳定的问题，本发明提供了一种新的发酵生产利普司他汀的培养基和发酵工艺控制方法和发酵培养基组成成分。
本发明的方法包括毒三素链霉菌(Streptomyces toxytricini)或其衍生物的斜面菌种培养、摇瓶种子液培养、种子液培养和发酵培养。所述毒三素链霉菌(Streptomyces toxytricini)可以是ACCC 41038。具体工艺过程如下：
a.斜面菌种的制备：将冻干的菌种用无菌水稀释后涂布装有固体培养基的斜面上，温度28℃，湿度40～60％，培养8～10天。产孢后加无菌水制成孢子悬浮液。
b.摇瓶种子液制备：将斜面孢子接种摇瓶种子培养基，250rpm，温度28℃，培养20～30小时。
c.种子液的制备：将步骤b中培养好的摇瓶种子接种到储有种子培养基的种子罐中，接种量为种子培养基体积的0.1～0.8％(V/V)，在28℃下通气量0.8VVM～1.0VVM，单位VVM是体积/体积/分钟，罐压0.04～0.07MPa的条件下，培养20～40小时。
d.发酵培养：将步骤c中培养好的菌种接种到储有发酵培养基的发酵罐中，接种种子液的量占发酵培养基和种子液体积的5～10％(V/V)，在温度为28℃，通气量0.6VVM～1.1VVM，罐压0.06～0.08MPa，发酵过程中pH控制在6.5～7.5范围内，发酵过程中补入营养物质，培养160～190小时。
步骤a中所用培养基成分和含量为：葡萄糖2～8g/L，麦芽提取物2～8g/L，酵母提取物4～10g/L，琼脂10～20g/L，pH为6.9～7.4；步骤b中所用培养基成分和含量为：甘油10g/L，麦芽提取物10g/L，酵母提取物5g/L，脱脂豆粉20g/L，pH为6.0～6.5；步骤c中所用液体培养基成分和含量为：甘油10g/L，麦芽提取物10g/L，酵母提取物5g/L，脱脂豆粉20g/L，pH为6.0～6.5。步骤d中所用液体培养基成分和含量为：甘油10～20g/L，脱脂豆粉20～40g/L，豆油10～20g/L，消泡剂2～5g/L，发酵初始pH为6.7～7.0。
在步骤d发酵过程中，在接种后至30小时左右，即发酵培养基中的甘油消耗殆尽后，开始流加补料亚油酸和亮氨酸溶液(亮氨酸溶液浓度70g/L，pH为11)，补料流加速度为0.2～0.5g/L/h，单位g/L/h是克/升/小时，在发酵接种后至115h，补料速度进行调整，补料流加速度为0.2～0.5g/L/h。同时，在发酵过程中，在接种后至70小时左右，一次性补入灭菌的酵母提取物以及甘油，使培养基中酵母提取物以及甘油基质浓度在5～10g/L的水平。
本发明发酵罐发酵培养基中使用脱脂豆粉为主要氮源，甘油和豆油为主要碳源，发酵培养基中无须添加无机盐。在发酵表达利普司他汀阶段连续补料亚油酸和氨基酸的基础上，在发酵的特定阶段一次性补加一定量的甘油和酵母提取物，避免了现有技术中的高粘度、溶氧不好控制的情况，提高了发酵过程中表达的稳定性，提高了发酵效价，降低了发酵成本。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但本发明不仅限于以下实施例。
实施例1
斜面培养：
按如下比例配制培养基：葡萄糖2g/L，麦芽提取物8g/L，酵母提取物10g/L，琼脂15g/L，pH为7.1。配制培养基300毫升，加热琼脂融化后搅拌均匀装入10支大试管中，灭菌，做成斜面备用。将冻干的毒三素链霉菌菌种用无菌水5毫升溶解，取4毫升均匀涂布在10支斜面上，温度28℃，湿度40～60％，培养10天，产生大量孢子。加无菌水制成孢子悬浮液。
摇瓶种子液制备：
按如下比例配制培养基：甘油10g/L，麦芽提取物10g/L，酵母提取物5g/L，脱脂豆粉20g/L，pH为6.0。配制培养基200毫升，装500mL三角瓶4瓶(每瓶装液量50mL)，灭菌，备用。将孢子悬浮液2mL接种到摇瓶中。温度28℃，培养30小时。
种子罐培养：
采用15升罐进行种子培养。按如下比例配制种子罐所用液体培养基(按实消后10升配制)：甘油10g/L，麦芽提取物10g/L，酵母提取物5g/L，脱脂豆粉20g/L，pH为6.0。实消后体积为10升，当温度降至28℃时，将80mL种子液(0.8％)接种到种子罐中，在温度为28℃的条件下，搅拌转速400～450转/分，通气量0.8VVM(体积/体积/分钟)，罐压0.04MPa的条件下，培养20小时。
发酵罐培养：
采用50升发酵罐进行培养。按如下比例配制液体培养基：甘油10g/L，脱脂豆粉20g/L，豆油10g/L，消泡剂2g/L，pH为7.0。实消后体积为33.25升，待温度降至28℃时，培养好的种子罐菌种接种到发酵罐中，接种量为5％(1.75升)，在温度为28℃的条件下，整个过程中通过调节罐压、转速、通气量控制溶氧在30～40％内。搅拌转速为300～540转/分，通气量0.6VVM～1.1VVM(体积/体积/分钟)，罐压0.06～0.08MP。在发酵接种后至27小时，甘油被利用完，开始进入利普司他汀合成阶段。此时开始补料亚油酸和亮氨酸溶液，补料流速为亚油酸0.3g/L/h，亮氨酸溶液(浓度为70g/L，PH：11)0.3g/L/h，发酵接种后至115h，补料速度调整为亚油酸0.35g/L/h，亮氨酸溶液(浓度70g/L，pH：11)0.35g/L/h。发酵接种后至70小时，补入灭菌后的酵母提取物、甘油分别350克。培养过程中，用20％NaOH、20％H2SO4控制PH在6.5～7.5范围内。培养180小时，发酵效价为6.7g/L。
实施例2
斜面培养：
按如下比例配制培养基：葡萄糖8g/L，麦芽提取物4g/L，酵母提取物4g/L，琼脂14g/L，pH为7.4。配制培养基300毫升，加热琼脂融化后搅拌均匀装入10支大试管中，灭菌，做成斜面备用。将冻干的毒三素链霉菌菌种用无菌水5毫升溶解，取4毫升均匀涂布在10支斜面上，温度28℃，湿度40～60％，培养8天，产生大量孢子。加无菌水制成孢子悬浮液。
摇瓶种子液制备：
按如下比例配制培养基：甘油10g/L，麦芽提取物10g/L，酵母提取物5g/L，脱脂豆粉20g/L，pH为6.0。配制培养基200毫升，装500mL三角瓶4瓶(每瓶装液量50mL)，灭菌，备用。将孢子悬浮液2mL接种到摇瓶中。温度28℃，培养20小时。
种子罐培养：
采用15升罐进行种子培养。按如下比例配制种子罐所用液体培养基(按实消后10升配制)：甘油10g/L，麦芽提取物10g/L，酵母提取物5g/L，脱脂豆粉20g/L，pH为6.0。实消后体积为10升，当温度降至28℃时，将20mL种子液(0.2％)接种到种子罐中，在温度为28℃的条件下，搅拌转速400～450转/分，通气量1.0VVM(体积/体积/分钟)，罐压0.07MPa的条件下，培养40小时。
发酵罐培养：
采用50升发酵罐进行培养。按如下比例配制液体培养基：甘油15g/L，脱脂豆粉30g/L，豆油10g/L，消泡剂2g/L，pH为6.7。实消后体积为32.20升，待温度降至28℃时，培养好的种子罐菌种接种到发酵罐中，接种量为8％(2.80升)，在温度为28℃的条件下，整个过程中通过调节罐压、转速、通气量控制溶氧在30～40％内。搅拌转速为300～540转/分，通气量0.6VVM～1.1VVM(体积/体积/分钟)，罐压0.06～0.08MPa。在发酵接种后至29小时，甘油被利用完，开始进入利普司他汀合成阶段。此时开始补料亚油酸和亮氨酸溶液，补料流速为亚油酸0.2g/L/h，亮氨酸溶液(浓度为70g/L，PH：11)0.2g/L/h，发酵接种后至115h，补料速度调整为亚油酸0.5g/L/h，亮氨酸溶液(浓度70g/L，pH：11)0.5g/L/h。发酵接种后至70小时，补入灭菌后的酵母提取物230克、甘油200克。培养过程中，用20％NaOH、20％H2SO4控制PH在6.5～7.5范围内。培养190小时，发酵效价为6.6g/L。
实施例3
斜面培养：
按如下比例配制培养基：葡萄糖8g/L，麦芽提取物2g/L，酵母提取物4g/L，琼脂12g/L，pH为7.2。配制培养基300毫升，加热琼脂融化后搅拌均匀装入10支大试管中，灭菌，做成斜面备用。将冻干的毒三素链霉菌菌种用无菌水5毫升溶解，取4毫升均匀涂布在10支斜面上，温度28℃，湿度40～60％，培养10天，产生大量孢子。加无菌水制成孢子悬浮液。
摇瓶种子液制备：
按如下比例配制培养基：甘油10g/L，麦芽提取物10g/L，酵母提取物5g/L，脱脂豆粉20g/L，pH为6.0。配制培养基200毫升，装500mL三角瓶4瓶(每瓶装液量50mL)，灭菌，备用。将孢子悬浮液2mL接种到摇瓶中。温度28℃，培养27小时。
种子罐培养：
采用15升罐进行种子培养。按如下比例配制种子罐所用液体培养基(按实消后10升配制)：甘油10g/L，麦芽提取物10g/L，酵母提取物5g/L，脱脂豆粉20g/L，pH为6.0。实消后体积为10升，当温度降至28℃时，将50mL种子液(0.5％)接种到种子罐中，在温度为28℃的条件下，搅拌转速400～450转/分，通气量0.8VVM(体积/体积/分钟)，罐压0.05MPa的条件下，培养28小时。
发酵罐培养：
采用50升发酵罐进行培养。按如下比例配制液体培养基：甘油15g/L，脱脂豆粉20g/L，豆油10g/L，消泡剂2g/L，pH为7.0。实消后体积为31.50升，待温度降至28℃时，培养好的种子罐菌种接种到发酵罐中，接种量为10％(3.50升)，在温度为28℃的条件下，整个过程中通过调节罐压、转速、通气量控制溶氧在30～40％内。搅拌转速为300～540转/分，通气量0.6VVM～1.1VVM(体积/体积/分钟)，罐压0.06～0.08MPa。在发酵接种后至29小时，甘油被利用完，开始进入利普司他汀合成阶段。此时开始补料亚油酸和亮氨酸溶液，补料流速为亚油酸0.32g/L/h，亮氨酸溶液(浓度为70g/L，PH：11)0.30g/L/h，发酵接种后至115h，补料速度调整为亚油酸0.38g/L/h，亮氨酸溶液(浓度70g/L，pH：11)0.36g/L/h。发酵接种后至70小时，补入灭菌后的酵母提取物、甘油分别210克。培养过程中，用20％NaOH、20％H2SO4控制PH在6.5～7.5范围内。培养160小时，发酵效价为6.9g/L。
实施例4
斜面培养：
按如下比例配制培养基：葡萄糖6g/L，麦芽提取物6g/L，酵母提取物6g/L，琼脂20g/L，pH为7.0。配制培养基300毫升，加热琼脂融化后搅拌均匀装入10支大试管中，灭菌，做成斜面备用。将冻干的毒三素链霉菌菌种用无菌水5毫升溶解，取4毫升均匀涂布在10支斜面上，温度28℃，湿度40～60％，培养10天，产生大量孢子。加无菌水制成孢子悬浮液。
摇瓶种子液制备：
按如下比例配制培养基：甘油10g/L，麦芽提取物10g/L，酵母提取物5g/L，脱脂豆粉20g/L，pH为6.0。配制培养基200毫升，装500mL三角瓶4瓶(每瓶装液量50mL)，灭菌，备用。将孢子悬浮液2mL接种到摇瓶中。温度28℃，培养27小时。
种子罐培养：
采用15升罐进行种子培养。按如下比例配制种子罐所用液体培养基(按实消后10升配制)：甘油10g/L，麦芽提取物10g/L，酵母提取物5g/L，脱脂豆粉20g/L，pH为6.0。实消后体积为10升，当温度降至28℃时，将50mL种子液(0.5％)接种到种子罐中，在温度为28℃的条件下，搅拌转速400～450转/分，通气量0.8VVM(体积/体积/分钟)，罐压0.05MPa的条件下，培养28小时。
发酵罐培养：
采用50升发酵罐进行培养。按如下比例配制液体培养基：甘油15g/L，脱脂豆粉30g/L，豆油15g/L，消泡剂5g/L，pH为6.8。实消后体积为31.50升，待温度降至28℃时，培养好的种子罐菌种接种到发酵罐中，接种量为10％(3.50升)，在温度为28℃的条件下，整个过程中通过调节罐压、转速、通气量控制溶氧在30～40％内。搅拌转速为300～540转/分，通气量0.6VVM～1.1VVM(体积/体积/分钟)，罐压0.06～0.08MPa。在发酵接种后至27小时，甘油被利用完，开始进入利普司他汀合成阶段。此时开始补料亚油酸和亮氨酸溶液，补料流速为亚油酸0.3g/L/h，亮氨酸溶液(浓度为70g/L，PH：11)0.3g/L/h，发酵接种后至115h，补料速度调整为亚油酸0.35g/L/h，亮氨酸溶液(浓度70g/L，pH：11)0.35g/L/h。发酵接种后至70小时，补入灭菌后的酵母提取物、甘油分别200克。培养过程中，用20％NaOH、20％H2SO4控制PH在6.5～7.5范围内。培养175小时，发酵效价为6.9g/L。
实施例5
斜面培养：
按如下比例配制培养基：葡萄糖5g/L，麦芽提取物5g/L，酵母提取物6g/L，琼脂15g/L，pH为6.9。配制培养基300毫升，加热琼脂融化后搅拌均匀装入10支大试管中，灭菌，做成斜面备用。将冻干的毒三素链霉菌菌种用无菌水5毫升溶解，取4毫升均匀涂布在10支斜面上，温度28℃，湿度40～60％，培养10天，产生大量孢子。加无菌水制成孢子悬浮液。
摇瓶种子液制备：
按如下比例配制培养基：甘油10g/L，麦芽提取物10g/L，酵母提取物5g/L，脱脂豆粉20g/L，pH为6.5。配制培养基200毫升，装500mL三角瓶4瓶(每瓶装液量50mL)，灭菌，备用。将孢子悬浮液2mL接种到摇瓶中。温度28℃，培养27小时。
种子罐培养：
采用15升罐进行种子培养。按如下比例配制种子罐所用液体培养基(按实消后10升配制)：甘油10g/L，麦芽提取物10g/L，酵母提取物5g/L，脱脂豆粉20g/L，pH为6.5。实消后体积为10升，当温度降至28℃时，将50mL种子液(0.5％)接种到种子罐中，在温度为28℃的条件下，搅拌转速400～450转/分，通气量0.9VVM(体积/体积/分钟)，罐压0.06MPa的条件下，培养28小时。
发酵罐培养：
采用50升发酵罐进行培养。按如下比例配制液体培养基：甘油20g/L，脱脂豆粉40g/L，豆油20g/L，消泡剂2g/L，pH为6.7。实消后体积为31.85升，待温度降至28℃时，培养好的种子罐菌种接种到发酵罐中，接种量为9％(3.15升)，在温度为28℃的条件下，整个过程中通过调节罐压、转速、通气量控制溶氧在30～40％内。搅拌转速为300～540转/分，通气量0.6VVM～1.1VVM(体积/体积/分钟)，罐压0.06～0.08MPa。在发酵接种后至32小时，甘油被利用完，开始进入利普司他汀合成阶段。此时开始补料亚油酸和亮氨酸溶液，补料流速为亚油酸0.35g/L/h，亮氨酸溶液(浓度为70g/L，PH：11)0.35g/L/h，发酵接种后至115h，补料速度调整为亚油酸0.35g/L/h，亮氨酸溶液(浓度70g/L，pH：11)0.35g/L/h。发酵接种后至70小时，补入灭菌后的酵母提取物、甘油分别240克。培养过程中，用20％NaOH、20％H2SO4控制PH在6.5～7.5范围内。培养183小时，发酵效价为7.5g/L。
实施例6
斜面培养：
按如下比例配制培养基：葡萄糖4g/L，麦芽提取物4g/L，酵母提取物6g/L，琼脂10g/L，pH为6.9。配制培养基300毫升，加热琼脂融化后搅拌均匀装入10支大试管中，灭菌，做成斜面备用。将冻干的毒三素链霉菌菌种用无菌水5毫升溶解，取4毫升均匀涂布在10支斜面上，温度28℃，湿度40～60％，培养10天，产生大量孢子。加无菌水制成孢子悬浮液。
摇瓶种子液制备：
按如下比例配制培养基：甘油10g/L，麦芽提取物10g/L，酵母提取物5g/L，脱脂豆粉20g/L，pH为6.2。配制培养基200毫升，装500mL三角瓶4瓶(每瓶装液量50mL)，灭菌，备用。将孢子悬浮液2mL接种到摇瓶中。温度28℃，培养27小时。
种子罐培养：
采用15升罐进行种子培养。按如下比例配制种子罐所用液体培养基(按实消后10升配制)：甘油10g/L，麦芽提取物10g/L，酵母提取物5g/L，脱脂豆粉20g/L，pH为6.0。实消后体积为10升，当温度降至28℃时，将50mL种子液(0.5％)接种到种子罐中，在温度为28℃的条件下，搅拌转速400～450转/分，通气量0.8VVM(体积/体积/分钟)，罐压0.05MPa的条件下，培养28小时。
发酵罐培养：
采用50升发酵罐进行培养。按如下比例配制液体培养基：甘油15g/L，脱脂豆粉40g/L，豆油20g/L，消泡剂2g/L，pH为7.0。实消后体积为31.50升，待温度降至28℃时，培养好的种子罐菌种接种到发酵罐中，接种量为10％(3.50升)，在温度为28℃的条件下，整个过程中通过调节罐压、转速、通气量控制溶氧在30～40％内。搅拌转速为300～540转/分，通气量0.6VVM～1.1VVM(体积/体积/分钟)，罐压0.06～0.08MPa在发酵接种后至30小时，甘油被利用完，开始进入利普司他汀合成阶段，此时开始补料亚油酸和亮氨酸溶液，补料流速为亚油酸0.32g/L/h，亮氨酸溶液(浓度为70g/L，PH：11)0.32g/L/h，发酵接种后至115h，补料速度调整为亚油酸0.35g/L/h，亮氨酸溶液(浓度70g/L，pH：11)0.35g/L/h。发酵接种后至70小时，补入灭菌后的酵母提取物、甘油分别280克。培养过程中，用20％NaOH、20％H2SO4控制PH在6.5～7.5范围内。培养180小时，发酵效价为7.9g/L。
对比例1
斜面培养：
按如下比例配制培养基：葡萄糖4g/L，麦芽提取物4g/L，酵母提取物6g/L，琼脂10g/L，pH为6.9。配制培养基300毫升，加热琼脂融化后搅拌均匀装入10支大试管中，灭菌，做成斜面备用。将冻干的毒三素链霉菌菌种用无菌水5毫升溶解，取4毫升均匀涂布在10支斜面上，温度28℃，湿度40～60％，培养10天，产生大量孢子。加无菌水制成孢子悬浮液。
摇瓶种子液制备：
按如下比例配制培养基：甘油10g/L，麦芽提取物10g/L，酵母提取物5g/L，脱脂豆粉20g/L，pH为6.2。配制培养基200毫升，装500mL三角瓶4瓶(每瓶装液量50mL)，灭菌，备用。将孢子悬浮液2mL接种到摇瓶中。温度28℃，培养27小时。
种子罐培养：
采用15升罐进行种子培养。按如下比例配制种子罐所用液体培养基(按实消后10升配制)：甘油10g/L，麦芽提取物10g/L，酵母提取物5g/L，脱脂豆粉20g/L，pH为6.0。实消后体积为10升，当温度降至28℃时，将50mL种子液(0.5％)接种到种子罐中，在温度为28℃的条件下，搅拌转速400～450转/分，通气量0.8VVM(体积/体积/分钟)，罐压0.05MPa的条件下，培养28小时。
发酵罐培养：
采用50升发酵罐进行培养。按如下比例配制液体培养基：甘油45g/L，豆粉11g/L，豆油11g/L，消泡剂0.55ml，碳酸钙2.2g/L，亚油酸2.2g/L，硫酸亚铁0.09g/L，硫酸锌0.045g/L，四水氯化锰0.13g/L，七水硫酸镁0.13g/L，pH为6.5。实消后体积为31.50升，待温度降至28℃时，培养好的种子罐菌种接种到发酵罐中，接种量为10％(3.50升)，在温度为28℃的条件下，整个过程中通过调节罐压、转速、通气量控制溶氧在30～40％内。搅拌转速为300～540转/分，通气量0.6VVM～1.1VVM(体积/体积/分钟)，罐压0.06～0.08MPa在发酵接种后至32小时，甘油被利用完，开始进入利普司他汀合成阶段，此时开始补料亚油酸和亮氨酸溶液，补料流速为亚油酸0.32g/L/h，亮氨酸溶液(浓度为70g/L，PH：11)0.32g/L/h，发酵接种后至115h，补料速度调整为亚油酸0.35g/L/h，亮氨酸溶液(浓度70g/L，pH：11)0.35g/L/h。发酵接种后至70小时，补入灭菌后的酵母提取物、甘油分别280克。培养过程中，用20％NaOH、20％H2SO4控制PH在6.5～7.5范围内。培养180小时，发酵效价为6.0g/L。
对比例2
斜面培养：
按如下比例配制培养基：葡萄糖4g/L，麦芽提取物6g/L，酵母提取物6g/L，琼脂10g/L，pH为7.0。配制培养基300毫升，加热琼脂融化后搅拌均匀装入10支大试管中，灭菌，做成斜面备用。将冻干的毒三素链霉菌菌种用无菌水5毫升溶解，取4毫升均匀涂布在10支斜面上，温度28℃，湿度40～60％，培养10天，产生大量孢子。加无菌水制成孢子悬浮液。
摇瓶种子液制备：
按如下比例配制培养基：甘油10g/L，麦芽提取物10g/L，酵母提取物5g/L，脱脂豆粉20g/L，pH为6.0。配制培养基200毫升，装500mL三角瓶4瓶(每瓶装液量50mL)，灭菌，备用。将孢子悬浮液2mL接种到摇瓶中。温度28℃，培养27小时。
种子罐培养：
采用15升罐进行种子培养。按如下比例配制种子罐所用液体培养基(按实消后10升配制)：甘油10g/L，麦芽提取物10g/L，酵母提取物5g/L，脱脂豆粉20g/L，pH为6.0。实消后体积为10升，当温度降至28℃时，将50mL种子液(0.5％)接种到种子罐中，在温度为28℃的条件下，搅拌转速400～450转/分，通气量0.8VVM(体积/体积/分钟)，罐压0.05MPa的条件下，培养28小时。
发酵罐培养：
采用50升发酵罐进行培养。按如下比例配制液体培养基(按实消并移种后35升配制)：甘油15g/L，脱脂豆粉40g/L，豆油15g/L，消泡剂2g/L，pH为6.9。实消后体积为31.5升，待温度降至28℃时，培养好的种子罐菌种接种到发酵罐中，接种量为10％(3.5升)，在温度为28℃的条件下，整个过程中通过调节罐压转速通气量控制溶氧在30～40％内。搅拌转速为300～540转/分，通气量0.6VVM～1.1VVM(体积/体积/分钟)，罐压0.06～0.08MPa，发酵过程中用20％NaOH、20％H2SO4控制PH在6.5～7.5范围内。在发酵接种后至30小时，甘油被利用完，开始进入利普司他汀合成阶段，此时开始补料亚油酸和亮氨酸溶液，补料流速为亚油酸0.6g/L/h，亮氨酸溶液(浓度为70g/L，PH：11)0.6g/L/h。培养190小时，发酵效价为5.3g/L。
Claims (3)
1.一种发酵生产利普司他汀的方法，包括毒三素链霉菌ACCC41038的斜面菌种的制备、摇瓶种子液的制备、种子液的制备以及发酵培养，其特征在于包括以下步骤：
a．斜面菌种的制备：将冻干的菌种用无菌水稀释后涂布装有固体培养基的斜面上，温度28℃，湿度40～60％，培养8～10天，产孢后加无菌水制成孢子悬浮液；
b．摇瓶种子液制备：将斜面孢子接种摇瓶种子培养基，250rpm，温度28℃，培养20～30小时；
c．种子液的制备：将步骤b中培养好的摇瓶种子接种到储有种子培养基的种子罐中，接种量为种子培养基体积的0.1～0.8%，在28℃下通气量0.8VVM～1.0VVM，单位VVM是体积/体积/分钟，罐压0.04～0.07MPa的条件下，培养20～40小时；其中种子培养基成分和含量为：甘油10g/L，麦芽提取物10g/L，酵母提取物5g/L，脱脂豆粉 20g/L，pH为6.0～6.5；
d．发酵培养：将步骤c中培养好的菌种接种到储有发酵培养基的发酵罐中，接种种子液的量占发酵培养基和种子液体积的5～10％，在温度为28℃，通气量0.6VVM～1.1VVM，罐压0.06～0.08MPa，发酵过程中pH控制在6.5～7.5范围内，培养160～190小时,在发酵接种后至30小时左右，在发酵培养基中的甘油消耗殆尽后，开始流加补入亚油酸和亮氨酸溶液，其中亮氨酸溶液的浓度为70g/L，pH为11，二者的补料流速均为0.2～0.5g/L/h，单位g/L/h是克/升/小时；在发酵接种后至115小时，补料速度进行调整，补料速度在0.2～0.5g/L/h；在接种后至70小时，一次性补入灭菌的酵母提取物以及甘油，使培养基中酵母提取物以及甘油基质浓度在5～10g/L的水平；其中发酵培养基成分和含量为：甘油10～20g/L，脱脂豆粉20～40g/L，豆油 10～20g/L，消泡剂2～5g/L，pH为6.7～7.0。
2.根据权利要求1所述的发酵生产利普司他汀的方法，其特征在于所述的步骤a中固体培养基的成分和含量为：葡萄糖2～8g/L，麦芽提取物2～8g/L，酵母提取物4～10g/L，琼脂10～20g/L，pH为6.9～7.4。
3.根据权利要求1所述的发酵生产利普司他汀的方法，其特征在于所述的步骤b中摇瓶种子培养基成分和含量为：甘油10g/L，麦芽提取物10g/L，酵母提取物5g/L，脱脂豆粉 20g/L，pH为6.0～6.5。
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