CN105112298A - 沃格玛木霉产菌丝培养基及其制备方法与应用 - Google Patents
沃格玛木霉产菌丝培养基及其制备方法与应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN105112298A CN105112298A CN201510532474.5A CN201510532474A CN105112298A CN 105112298 A CN105112298 A CN 105112298A CN 201510532474 A CN201510532474 A CN 201510532474A CN 105112298 A CN105112298 A CN 105112298A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- gema
- substratum
- trichoderma
- wood
- voglmayrii
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明提供一种沃格玛木霉产菌丝培养基，培养基的具体成分及含量如下：糊精20–60g，蛋白胨10–30g，酵母粉1–5g，硫酸镁0.5–4.5g，磷酸二氢钾0.6–1g，水1000mL，pH自然。利用本发明的培养基发酵生产沃格玛木霉具有工艺简单，菌体生长速度快，菌丝产量高等优点，同时该培养基中的碳氮源均未引入农副产品，使代谢产物更容易分离提取，既适于该菌的理论研究，也适于工业化发酵生产。
Description
技术领域
本发明涉及微生物培养领域，更具体地，涉及沃格玛木霉产菌丝培养基及其制备方法与应用。
背景技术
木霉属(Trichoderma)真菌种类很多，分布广泛，是一类重要的生物资源，部分种类在许多领域发挥着重要作用，具有良好的经济价值和应用前景，因而备受关注。
2005年，沃格玛木霉(Trichodermavoglmayrii)首次报道于奥地利，2014年本专利申请的发明人首次发现该种在中国分布，并筛选证明了沃格玛木霉P-T8196菌株对多种植物病原真菌(以下简称植病菌)均具有一定的生防潜力。但是，该菌株在PDA、CMD、SNA等多种培养基上生长缓慢，菌落稀疏，缺乏气生菌丝，产孢所需时间长，量少，严重影响和阻碍该菌株生防潜能的发挥和进一步利用。国内外鲜有对该菌人工培养条件的研究报道，适宜该菌生长的培养条件不清楚，因此明确适宜沃格玛木霉生长的培养条件，将为后续生理学、化学和菌株利用等方面的研究奠定基础。
发明内容
本发明提供了沃格玛木霉培养基及其制备方法与应用，解决了沃格玛木霉在其他培养基中生长缓慢、气生菌丝少、产孢少且时间长的问题。
本发明的一个方面，提供一种沃格玛木霉产菌丝培养基，具体成分及含量如下：糊精20–60g，蛋白胨10–30g，酵母粉1–5g，硫酸镁0.5–4.5g，磷酸二氢钾0.6–1g，水1000mL，pH自然。
本发明的另一个方面，提供以上所述培养基的制备方法，包括如下步骤：
将糊精、蛋白胨和酵母粉按照所需终浓度配制溶液；
将硫酸镁和磷酸二氢钾配制成母液；
对上述成分进行灭菌，其中，糊精、蛋白胨和酵母粉配制的溶液采用高压蒸汽灭菌，硫酸镁和磷酸二氢钾采用过滤灭菌；
按照所需终浓度定量，混配均匀。
本发明的再一个方面，提供一种促进沃格玛木霉产菌丝的培养方法，包括如下步骤：
将沃格玛木霉接种于PDA培养基进行活化培养；
然后取活化培养后的沃格玛木霉菌块，接种于PDB培养基中培养，制备接种液；
按1×107/mL孢子的接种量，将沃格玛木霉的接种液接种于以上所述的本发明的培养基中，置于转速160rpm，温度28℃，黑暗条件下培养，6–7天达到发酵终点。
以上所述的培养方法中，活化培养条件为25℃培养3天。
以上所述的培养方法中，接种液的制备条件为在转速160rpm，温度28℃，黑暗条件下培养5天。
本发明提供的培养基组成成分明确，简单，易配制，成本较低，利用该培养基发酵生产沃格玛木霉菌具有工艺简单，菌体生长速度快，菌丝产量高等优点，同时该培养基中的碳氮源均未引入农副产品，使代谢产物更容易分离提取，既适于该菌的理论研究，也适于工业化发酵生产。
具体实施方式
以下实施例对本发明的具体实施方式进行更加详细的说明，以便能够更好地理解本发明的方案以及其各个方面的优点。然而，以下描述的具体实施方式和实施例仅是说明的目的，而不是对本发明的限制。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1利用产菌丝培养基发酵生产沃格玛木霉菌丝体
沃格玛木霉产菌丝培养基配方为：糊精50g，蛋白胨21g，酵母粉2.9g，硫酸镁2.3g，磷酸二氢钾0.9g，加水定容至1000mL，pH自然。
对照培养基1(GaoHJ,ChuX,WangYW,ZhouF,ZhaoK,MuZM,LiuQX.2013.MediaoptimizationforlaccaseproductionbyTrichodermaharzianumZF-2usingresponsesurfacemethodology.J.Microbiol.Biotechnol.23:1757–1764.)：葡萄糖20g，硫酸铵1g，磷酸二氢钾0.6g，硫酸镁1g，加水定容至1000mL，pH自然。
对照培养基2：土豆200g，葡萄糖20g，加水定容至1000mL，pH自然。
将沃格玛木霉菌株(Trichodermavoglmayrii)P-T8196(本专利申请的发明人分离并已于2015年8月24日保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCCNo.11207。保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。)接种于马铃薯葡萄糖固体培养基(PDA)上活化，25℃培养3天，然后用打孔器在菌落边缘取直径为5mm的菌块8个，接种于马铃薯葡萄糖培养基(PDB)中，装液量100mL(250mL三角瓶)，置于转速160rpm，温度28℃，黑暗条件下培养5天，制备接种液。
按照1×107/mL孢子的接种量，将沃格玛木霉接种于上述3种培养基中，装液量100mL(250mL三角瓶)，置于转速160rpm，温度28℃，黑暗条件下培养，6天后，用直径为12.5cm的中速定性滤纸(已烘干称重)过滤发酵产物，并用100mL蒸馏水洗涤3次，然后将过滤完毕的滤纸及菌丝体置于80℃培养箱内烘干至菌体恒重。结果显示，本发明培养基、对照培养基1、对照培养基2培养的菌丝体产量分别为26.9g/L、7.08g/L、2.45g/L，差异显著。本发明培养基的菌丝产量明显高于对照培养基1和对照培养基2的菌丝产量。
产物验证：采用CTAB法对发酵所得的沃格玛木霉菌丝体进行基因组DNA提取，对其ITS(核糖体转录间隔区)进行PCR扩增(所用引物为ITS4和ITS5组成的引物对)并测序，将测序结果提交GenBank进行Blast分析。引物序列如下：
ITS4：5'–TCCTCCGCTTATTGATATGC–3'
ITS5：5'–GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG–3'
测序结果详见序列表的序列1(SEQIDNO：1)，分析发现其与GenBank中Trichodermavoglmayrii(沃格玛木霉)的CPK948、CPK1592两个菌株的同源性高达100％，与CPK951、CPK941两个菌株的同源性达99％，可确定利用本发明提供的产菌丝培养基发酵得到的产物为沃格玛木霉的菌丝体。
实施例2利用产菌丝培养基发酵生产沃格玛木霉菌丝体
沃格玛木霉产菌丝培养基配方为：糊精40g，蛋白胨20g，酵母粉3g，硫酸镁1g，磷酸二氢钾0.8g，加水定容至1000mL，pH自然。
对照培养基1(Gaoetal.2013)：葡萄糖20g，硫酸铵1g，磷酸二氢钾0.6g，硫酸镁1g，加水定容至1000mL，pH自然。
对照培养基2：土豆200g，葡萄糖20g，加水定容至1000mL，pH自然。
将沃格玛木霉菌株P-T8196(本专利申请的发明人分离并保存)接种于马铃薯葡萄糖固体培养基(PDA)上活化，25℃培养3天，然后用打孔器在菌落边缘取直径为5mm的菌块8个，接种于马铃薯葡萄糖培养基(PDB)中，装液量100mL(250mL三角瓶)，置于转速160rpm，温度28℃，黑暗条件下培养5天，制备接种液。
按照1×107/mL孢子的接种量，将沃格玛木霉接种于上述3种培养基中，装液量100mL(250mL三角瓶)，置于转速160rpm，温度28℃，黑暗条件下培养，6天后，用直径为12.5cm的中速定性滤纸(已烘干称重)过滤发酵产物，并用100mL蒸馏水洗涤3次，然后将过滤完毕的滤纸及菌丝体置于80℃培养箱内烘干至菌体恒重。结果显示，本发明培养基、对照培养基1、对照培养基2培养的菌丝体产量分别为26.0g/L、7.08g/L、2.45g/L，差异显著。本发明培养基的菌丝产量明显高于对照培养基1和对照培养基2的菌丝产量。
采用CTAB法对发酵所得的沃格玛木霉菌丝体进行基因组DNA提取，对其ITS(核糖体转录间隔区)进行PCR扩增(所用引物为ITS4和ITS5组成的引物对)并测序，将测序结果提交GenBank进行Blast分析。结果表明利用本发明提供的产菌丝培养基发酵得到的产物为沃格玛木霉的菌丝体。
实施例3利用产菌丝培养基发酵生产沃格玛木霉菌丝体
沃格玛木霉产菌丝培养基配方为：糊精60g，蛋白胨20g，酵母粉5g，硫酸镁1g，磷酸二氢钾0.8g，加水定容至1000mL，pH自然。
对照培养基1(Gaoetal.2013)：葡萄糖20g，硫酸铵1g，磷酸二氢钾0.6g，硫酸镁1g，加水定容至1000mL，pH自然。
对照培养基2：土豆200g，葡萄糖20g，加水定容至1000mL，pH自然。
将沃格玛木霉菌株P-T8196(本专利申请的发明人分离并保存)接种于马铃薯葡萄糖固体培养基(PDA)上活化，25℃培养3天，然后用打孔器在菌落边缘取直径为5mm的菌块8个，接种于马铃薯葡萄糖培养基(PDB)中，装液量100mL(250mL三角瓶)，置于转速160rpm，温度28℃，黑暗条件下培养5天，制备接种液。
按照1×107/mL孢子的接种量，将沃格玛木霉接种于上述3种培养基中，装液量100mL(250mL三角瓶)，置于转速160rpm，温度28℃，黑暗条件下培养，6天后，用直径为12.5cm的中速定性滤纸(已烘干称重)过滤发酵产物，并用100mL蒸馏水洗涤3次，然后将过滤完毕的滤纸及菌丝体置于80℃培养箱内烘干至菌体恒重。结果显示，本发明培养基、对照培养基1、对照培养基2培养的菌丝体产量分别为25.3g/L、7.08g/L、2.45g/L，差异显著。本发明培养基的菌丝产量明显高于对照培养基1和对照培养基2的菌丝产量。
采用CTAB法对发酵所得的沃格玛木霉菌丝体进行基因组DNA提取，对其ITS(核糖体转录间隔区)进行PCR扩增(所用引物为ITS4和ITS5组成的引物对)并测序，将测序结果提交GenBank进行Blast分析。结果表明利用本发明提供的产菌丝培养基发酵得到的产物为沃格玛木霉的菌丝体。
实施例4利用产菌丝培养基发酵生产沃格玛木霉菌丝体
沃格玛木霉产菌丝培养基配方为：糊精40g，蛋白胨20g，酵母粉3g，硫酸镁0.5g，磷酸二氢钾1g，加水定容至1000mL，pH自然。
对照培养基1(Gaoetal.2013)：葡萄糖20g，硫酸铵1g，磷酸二氢钾0.6g，硫酸镁1g，加水定容至1000mL，pH自然。
对照培养基2：土豆200g，葡萄糖20g，加水定容至1000mL，pH自然。
将沃格玛木霉菌株P-T8196(本专利申请的发明人分离并保存)接种于马铃薯葡萄糖固体培养基(PDA)上活化，25℃培养3天，然后用打孔器在菌落边缘取直径为5mm的菌块8个，接种于马铃薯葡萄糖培养基(PDB)中，装液量100mL(250mL三角瓶)，置于转速160rpm，温度28℃，黑暗条件下培养5天，制备接种液。
按照1×107/mL孢子的接种量，将沃格玛木霉接种于上述3种培养基中，装液量100mL(250mL三角瓶)，置于转速160rpm，温度28℃，黑暗条件下培养，6天后，用直径为12.5cm的中速定性滤纸(已烘干称重)过滤发酵产物，并用100mL蒸馏水洗涤3次，然后将过滤完毕的滤纸及菌丝体置于80℃培养箱内烘干至菌体恒重。结果显示，本发明培养基、对照培养基1、对照培养基2培养的菌丝体产量分别为25.2g/L、7.08g/L、2.45g/L，差异显著。本发明培养基的菌丝产量明显高于对照培养基1和对照培养基2的菌丝产量。
采用CTAB法对发酵所得的沃格玛木霉菌丝体进行基因组DNA提取，对其ITS(核糖体转录间隔区)进行PCR扩增(所用引物为ITS4和ITS5组成的引物对)并测序，将测序结果提交GenBank进行Blast分析。结果表明利用本发明提供的产菌丝培养基发酵得到的产物为沃格玛木霉的菌丝体。
实施例5利用产菌丝培养基发酵生产沃格玛木霉菌丝体
沃格玛木霉产菌丝培养基配方为：糊精60g，蛋白胨20g，酵母粉3g，硫酸镁0.5g，磷酸二氢钾0.8g，加水定容至1000mL，pH自然。
对照培养基1(Gaoetal.2013)：葡萄糖20g，硫酸铵1g，磷酸二氢钾0.6g，硫酸镁1g，加水定容至1000mL，pH自然。
对照培养基2：土豆200g，葡萄糖20g，加水定容至1000mL，pH自然。
将沃格玛木霉菌株P-T8196(本专利申请的发明人分离并保存)接种于马铃薯葡萄糖固体培养基(PDA)上活化，25℃培养3天，然后用打孔器在菌落边缘取直径为5mm的菌块8个，接种于马铃薯葡萄糖培养基(PDB)中，装液量100mL(250mL三角瓶)，置于转速160rpm，温度28℃，黑暗条件下培养5天，制备接种液。
按照1×107/mL孢子的接种量，将沃格玛木霉接种于上述3种培养基中，装液量100mL(250mL三角瓶)，置于转速160rpm，温度28℃，黑暗条件下培养，6天后，用直径为12.5cm的中速定性滤纸(已烘干称重)过滤发酵产物，并用100mL蒸馏水洗涤3次，然后将过滤完毕的滤纸及菌丝体置于80℃培养箱内烘干至菌体恒重。结果显示，本发明培养基、对照培养基1、对照培养基2培养的菌丝体产量分别为25.1g/L、7.08g/L、2.45g/L，差异显著。本发明培养基的菌丝产量明显高于对照培养基1和对照培养基2的菌丝产量。
采用CTAB法对发酵所得的沃格玛木霉菌丝体进行基因组DNA提取，对其ITS(核糖体转录间隔区)进行PCR扩增(所用引物为ITS4和ITS5组成的引物对)并测序，将测序结果提交GenBank进行Blast分析。结果表明利用本发明提供的产菌丝培养基发酵得到的产物为沃格玛木霉的菌丝体。
最后应说明的是：对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。
Claims (6)
1.一种沃格玛木霉产菌丝培养基，其特征在于，培养基的具体成分及含量如下：糊精20–60g，蛋白胨10–30g，酵母粉1–5g，硫酸镁0.5–4.5g，磷酸二氢钾0.6–1g，水1000mL，pH自然。
2.权利要求1所述的培养基的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
将糊精、蛋白胨和酵母粉按照所需终浓度配制溶液；
将硫酸镁和磷酸二氢钾配制成母液；
对上述成分进行灭菌，按照所需终浓度定量，混配均匀。
3.如权利要求2所述的培养基的制备方法，其特征在于，所述糊精、蛋白胨和酵母粉配制的溶液采用高压蒸汽灭菌，硫酸镁和磷酸二氢钾采用过滤灭菌。
4.一种促进沃格玛木霉产菌丝的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
将沃格玛木霉接种于PDA培养基进行活化培养；
然后取活化培养后的沃格玛木霉菌块，接种于PDB培养基中培养，制备接种液；
按1×107/mL孢子的接种量，将沃格玛木霉的接种液接种于权利要求1所述的培养基中，置于转速160rpm，温度28℃，黑暗条件下培养。
5.如权利要求4所述的培养方法，其特征在于，所述活化培养条件为在25℃培养3天。
6.如权利要求4所述的培养方法，其特征在于，所述制备接种液条件为在转速160rpm，温度28℃，黑暗条件下培养5天。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510532474.5A CN105112298A (zh) | 2015-08-26 | 2015-08-26 | 沃格玛木霉产菌丝培养基及其制备方法与应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510532474.5A CN105112298A (zh) | 2015-08-26 | 2015-08-26 | 沃格玛木霉产菌丝培养基及其制备方法与应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN105112298A true CN105112298A (zh) | 2015-12-02 |
Family
ID=54660416
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201510532474.5A Pending CN105112298A (zh) | 2015-08-26 | 2015-08-26 | 沃格玛木霉产菌丝培养基及其制备方法与应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN105112298A (zh) |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101096641A (zh) * | 2007-06-13 | 2008-01-02 | 杭州中美华东制药有限公司 | 一种用于生产冬虫夏草菌丝体的培养基 |
| CN101481662A (zh) * | 2008-01-08 | 2009-07-15 | 杭州华东医药集团生物工程研究所有限公司 | 一种链霉菌及其应用 |
| CN101792722A (zh) * | 2009-02-04 | 2010-08-04 | 杭州华东医药集团生物工程研究所有限公司 | 一种链霉菌及其应用 |
| CN101851648A (zh) * | 2010-04-09 | 2010-10-06 | 福建省微生物研究所 | 利用巨大芽孢杆菌制备去甲基雷帕霉素的方法 |
| CN101899410A (zh) * | 2010-07-13 | 2010-12-01 | 杭州华东医药集团生物工程研究所有限公司 | 一种小链霉菌及其在达托霉素制备中的应用 |
| CN103468603A (zh) * | 2013-07-17 | 2013-12-25 | 杭州华东医药集团生物工程研究所有限公司 | 一种毒三素链霉菌及其在制备利普司他汀中的应用 |
| CN103966289A (zh) * | 2013-02-01 | 2014-08-06 | 沈阳药科大学 | 一种制备malforminC的方法 |
-
2015
- 2015-08-26 CN CN201510532474.5A patent/CN105112298A/zh active Pending
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101096641A (zh) * | 2007-06-13 | 2008-01-02 | 杭州中美华东制药有限公司 | 一种用于生产冬虫夏草菌丝体的培养基 |
| CN101481662A (zh) * | 2008-01-08 | 2009-07-15 | 杭州华东医药集团生物工程研究所有限公司 | 一种链霉菌及其应用 |
| CN101792722A (zh) * | 2009-02-04 | 2010-08-04 | 杭州华东医药集团生物工程研究所有限公司 | 一种链霉菌及其应用 |
| CN101851648A (zh) * | 2010-04-09 | 2010-10-06 | 福建省微生物研究所 | 利用巨大芽孢杆菌制备去甲基雷帕霉素的方法 |
| CN101899410A (zh) * | 2010-07-13 | 2010-12-01 | 杭州华东医药集团生物工程研究所有限公司 | 一种小链霉菌及其在达托霉素制备中的应用 |
| CN103966289A (zh) * | 2013-02-01 | 2014-08-06 | 沈阳药科大学 | 一种制备malforminC的方法 |
| CN103468603A (zh) * | 2013-07-17 | 2013-12-25 | 杭州华东医药集团生物工程研究所有限公司 | 一种毒三素链霉菌及其在制备利普司他汀中的应用 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 朱兆香等: "木霉属12个中国新记录种和3个新组合", 《菌物学报》 * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN101240259B (zh) | 新构建的高产富马酸基因工程菌及其生产富马酸的方法 | |
| CN103468585B (zh) | 一株红曲菌株及其在制备功能性红曲中的应用 | |
| Zeng et al. | Non-sterilized fermentative co-production of poly (γ-glutamic acid) and fibrinolytic enzyme by a thermophilic Bacillus subtilis GXA-28 | |
| CN102154194B (zh) | 中试规模木霉高产厚垣孢子液体发酵制备方法 | |
| CN103416223B (zh) | 一种提高北冬虫夏草发酵液中虫草素产量的方法 | |
| CN102630490B (zh) | 一种提高虫草素含量的蛹虫草菌丝体的人工培养方法 | |
| CN102796673A (zh) | 一株阿魏酸酯酶生产菌株及应用该菌株生产阿魏酸酯酶的方法 | |
| CN102703363A (zh) | 一株甲基营养性芽孢杆菌utm401及其应用 | |
| CN103820337A (zh) | 一种用于发酵生产核糖核酸的酿酒酵母菌及其应用 | |
| US9689017B2 (en) | Method of semi-solid state fermentation for producing surfactin from a mutant strain of Bacillus subtilis subsp | |
| CN101338291B (zh) | 一种制备冠菌素的方法及其专用菌株 | |
| CN104108964B (zh) | 一种全营养微生物生防有机肥的制备方法与应用 | |
| CN105441334B (zh) | 产灰树花多糖的菌株及其应用 | |
| CN102399738A (zh) | 一株产丁二酸基因工程菌及其发酵生产丁二酸的方法 | |
| CN102226163B (zh) | 一株丙酮丁醇梭杆菌菌株及其应用 | |
| CN109136100B (zh) | 一株塔宾曲霉菌株及在发酵青砖茶上的应用 | |
| CN105567584A (zh) | 一种能拆分（＋/-）γ-内酰胺得到（+）γ-内酰胺的芽孢杆菌及其筛选和应用 | |
| CN105505798A (zh) | 一种产麦角甾醇内生真菌及其应用 | |
| CN105112298A (zh) | 沃格玛木霉产菌丝培养基及其制备方法与应用 | |
| CN114456980A (zh) | 一种γ-聚谷氨酸高产菌株及应用 | |
| CN102492634A (zh) | 一株耐高温酵母菌及其应用 | |
| CN101177670B (zh) | 产辅酶q10新菌株-鞘氨醇单胞菌zute03及其应用 | |
| CN105274013B (zh) | 汉逊德巴利酵母及其在处理高浓度硫酸铵的工业废水中的应用 | |
| CN105647812A (zh) | 一株裂褶菌菌株及其在普洱茶生产中的应用 | |
| CN112746026A (zh) | 一株维斯假丝酵母及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20151202 |