CN103439519A - 25羟-维生素d3定量免疫层析检测试剂卡及其制备方法 - Google Patents

25羟-维生素d3定量免疫层析检测试剂卡及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种25羟维生素D3检测试剂卡及其制备方法，涉及维生素免疫化学试验物质的制备。本发明是在检测试剂卡内检测试纸条的样品垫和吸样垫之间依次设置有含有胶体金标记的25-羟基维生素D3抗体的胶体金垫，分别包被有25-羟基维生素D3-偶联蛋白的T线和抗鼠IgG的C线的NC膜；试剂卡顶面形成对应标示T线和标示C线位置的观察窗，对应样品垫位置形成有稀释液孔和加样孔。使用时结合带有25-羟基维生素D3内置标准曲线的免疫层析结果判读记录仪，对检测结果的进行定量判定，适合血清、血浆、全血样本，检测简便、快速，适合现场检测，经济实用。

Description

25羟-维生素D3定量免疫层析检测试剂卡及其制备方法
技术领域
本发明涉及维生素免疫化学试验物质的制备，具体是一种25羟维生素D3定量免疫层析检测试剂卡及其制备方法。
背景技术
维生素D是环戊烷多氢菲类化合物，可由维生素D原经紫外线270~300nm激活形成。动物皮下7-脱氢胆固醇，酵母细胞中的麦角固醇都是维生素D原，经紫外线激活分别转化为维生素D3及维生素D2。维生素D的最大吸收峰为265nm，从食物中得来的维生素D，与脂肪一起吸收，吸收部位主要在空肠与回肠。胆汁帮助其吸收。脂肪吸收受干扰时，如慢性胰腺炎、脂肪痢及胆道阻塞都会影响吸收。吸收的维生素D与乳糜微粒相结合，由淋巴***运输。当维生素D运到肝脏中，在微粒体中经单氧酶***作用，将其25位羟基化形成25（OH）维生素D3，肝外的其他组织也可吸取维生素D及25（OH）D3，因此组织中维生素D及25（OH）D3及其总量比维生素D血浆中多，如果靶组织需要，可将其释放出来，他们在脂肪组织中最多，释放速度最慢，当体重减轻，脂肪减少时，他们也可释放出来。25-羟基维生素D3在肾线粒体单氧酶作用下（酶***包括细胞色素p450、铁硫蛋白及黄素蛋白），经羧基化，转变为1，25（OH）-D3，这是维生素D的生物作用形式，现将其作为激素看待，其作用方式与其他固醇类激素相似。
维生素D缺乏会导致少儿佝偻病和成年人的软骨病。症状包括骨头和关节疼痛，肌肉萎缩，失眠，紧张以及痢疾腹泻。维生素D主要用于组成和维持骨骼的强壮。它被用来防治儿童的佝偻病和成人的软骨症，关节痛等等。患有骨质疏松症的人通过添加合适的维生素D和镁可以有效的提高钙离子的吸收度。除此以外，维生素D还被用于降低结肠癌、乳腺癌和***癌的机率，对免疫***也有增强作用。
测定血液中25-羟基维生素D3能反应机体的维生素D状况，以为利于后续的干预治疗。由于维生素D是小分子物质，采用免疫学方法检测最佳的方法为竞争抑制法。目前，市场上已有采用化学发光等方法检测25-羟基维生素D3的试剂卡出现，然而，运用胶体金免疫层析技术定量检测25-羟基维生素D3的试剂尚为空白。
发明内容
本发明是为了解决应用免疫层析胶体金法检测人血液中25-羟基维生素D3的技术问题，而提供一种25-羟基维生素D3定量免疫层析检测试剂卡及其制备方法。   
实现本发明的原理如下：利用胶体金标记抗体，在检测试纸条的NC膜上包被配对抗原。检测时当样品中含相应的抗原时，胶体金标记的抗体和样品中相应抗原相结合形成复合物，然后在NC膜上层析，再遇到包被抗原时，不会和包被的抗原结合或仅部分结合，不形成肉眼可见的或仅形成强度减弱的T线，在一定的条件下，T线的强弱和样品中的浓度呈负相关。采用专用的免疫层析结果判读记录仪可以实现定量检测。
本发明是按照以下技术方案实现的。
一种25-羟基维生素D3定量免疫层析检测试剂卡，包括依次形成有稀释液孔、加样孔和观察窗的盒盖，盒体内底部形成的检测试纸条架一端形成有端护栏，另一端形成有侧护栏，盒盖底面形成的插突起与盒体的插孔柱插接结合；以及沿检测试纸条架长度方向平铺的检测试纸条，检测试纸条的塑料基板两端分别设置的样品垫和吸样垫，而样品垫和吸样垫之间依次设置有胶体金标记25-羟基维生素D3抗体的胶体金垫，分别包被有25-羟基维生素D3-偶联蛋白的T线和抗鼠IgG的C线的NC膜。
一种25-羟基维生素D3定量免疫层析检测试剂卡的制备方法，包括依次形成有稀释液孔、加样孔和观察窗的盒盖，盒体内底部形成的检测试纸条架一端形成有端护栏，另一端形成有侧护栏，盒盖底面形成的插突起与盒体的插孔柱插接结合；以及沿检测试纸条架长度方向平铺的检测试纸条，检测试纸条的塑料基板两端分别设置有样品垫和吸样垫，而样品垫和吸样垫之间依次设置有含有胶体金标记的25-羟基维生素D3抗体的胶体金垫，分别包被有25-羟基维生素D3-偶联蛋白的T线和抗鼠IgG的C线的NC膜；
所述样品垫和吸样垫之间依次设置有含有胶体金标记的25-羟基维生素D3抗体的胶体金垫，分别包被有25-羟基维生素D3-偶联蛋白的T线和抗鼠IgG的C线的NC膜，其中：
a.含有胶体金标记的25-羟基维生素D3抗体的胶体金垫的制备过程为：金颗粒直径为30～50nm的胶体金溶液10ml，于烧杯内用0.2M K2CO3调至pH7.5～8.5，加入25～75μg 25-羟基维生素D3抗体，室温搅拌30min，加入终浓度为0.5%牛血清白蛋白，5% PEG 20000 封闭20min，12000g离心20分钟，弃上清，用胶体金溶液复溶至80ml，按1ml溶液铺20cm2的比例均匀地铺在玻璃纤维膜或无纺布上，再置干燥间干燥3～5小时，制成胶体金垫；
b.所述NC膜抗体的包被过程为：以0.01M pH 7.4 磷酸盐缓冲液将25-羟基维生素D3-偶联蛋白配制成0.8～1.6mg/ml的溶液，在NC膜上用喷膜仪以1～1.5μl/cm的量包被T线；另将抗鼠IgG配制成1～3mg/ml的溶液，用喷膜仪以上述相同参数包被C线，划线后将NC膜干燥3～5小时，制成包被25-羟基维生素D3-偶联蛋白的T线和包被抗鼠IgG的C线的NC膜；
c.在相对湿度小于30%的条件下，取塑料基板12，将已包被的NC膜粘贴在基板的中部，在NC膜的T线一侧粘贴胶体金垫，在胶体金垫另一侧粘贴样品垫；在NC膜的C线一侧粘贴吸样垫；邻接接口相互叠压1～2mm，粘贴好的大板切成3～5mm宽的检测试纸条备用。
这样设计的本发明，使用时结合带有25-羟基维生素D3内置标准曲线的免疫层析结果判读记录仪，实现对25-羟基维生素D3浓度的快速定量检测，检测范围宽，适合血清、血浆、全血样本，并适合临床上单人份检测。具有操作简便、反应快速、敏感性高、特异性强、适合现场检测和经济实用等优点。
附图说明
图1是本发明盒盖顶面立体结构示意图；
图2是本发明盒盖底面立体结构示意图；
图3是本发明盒体的立体结构示意图；
图4是本发明检测试纸条的立体结构示意图。
图中：1.稀释液孔              2.加样孔
3.观察窗                4.盒盖  
5.盒体                  6. 检测试纸条架  
7.端护栏                8.侧护栏  
9.插突起                10.插孔柱
11.检测试纸条               12.基板  
13.样本垫               14.吸样垫  
15.胶体金垫             16.T线
17.C线                  18.NC膜
19.十字架。
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明进行详细的说明。
一种25-羟基维生素D3定量免疫层析检测试剂卡，包括依次形成有稀释液孔1、加样孔2和观察窗3的长方形盒盖4，长方形盒体5内底部形成的检测试纸条架6一端形成有“[”形端护栏7，另一端形成有相向的板状侧护栏8，盒盖4底面形成的插突起9与盒体5的插孔柱10，插接结合；以及沿检测试纸条架6长度方向平铺的检测试纸条11，检测试纸条11的塑料基板12两端分别设置的样品垫13和吸样垫14，而在样品垫13和吸样垫14之间依次设置有含有胶体金标记法的25-羟基维生素D3抗体的胶体金垫15，分别包被有25-羟基维生素D3-偶联蛋白的T线16和抗鼠IgG的C线17的NC膜18。
从而形成对应标示T线和标示C线位置的观察窗，对应样品垫位置形成有稀释液孔和加样孔。
一种25-羟基维生素D3定量免疫层析检测试剂卡的制备方法，包括依次形成有稀释液孔1、加样孔2和观察窗3的长方形盒盖4，长方形盒体5内底部形成的检测试纸条架6一端形成有“[”形端护栏7，另一端形成有相向的板状侧护栏8，盒盖4底面形成的插突起9与盒体5的插孔柱10，插接结合；以及沿检测试纸条架6长度方向平铺的检测试纸条11，检测试纸条11的塑料基板12两端分别设置的样品垫13和吸样垫14，而在样品垫13和吸样垫14之间依次设置有含有胶体金标记的25-羟基维生素D3抗体的胶体金垫15，分别包被有25-羟基维生素D3-偶联蛋白的T线16和抗鼠IgG的C线17的NC膜18。
所述样品垫13和吸样垫14之间依次设置有胶体金标记25-羟基维生素D3抗体的胶体金垫15，分别包被有25-羟基维生素D3-偶联蛋白的T线16和抗鼠IgG的C线17的NC膜18，其中：
a.胶体金标记25-羟基维生素D3抗体的胶体金垫15的制备过程为：金颗粒直径为30～50nm的胶体金溶液10ml，于烧杯内用0.2M K2CO3调至pH7.5～8.5，加入25～50μg25-羟基维生素D3抗体，室温搅拌30min，加入终浓度为0.5%牛血清白蛋白，5% PEG 20000 封闭20min，12000g离心20分钟，弃上清，用胶体金溶液复溶至80ml，按1ml溶液铺20cm2的比例均匀地铺在玻璃纤维膜或无纺布上，再置干燥间干燥3～5小时，制成胶体金垫15；
b.所述NC膜18抗体的包被过程为：以0.01M pH 7.4 磷酸盐缓冲液（PBS）将25-羟基维生素D3-偶联蛋白配制成0.8～1.6mg/ml的溶液，在NC膜18上用喷膜仪以1～1.5μl/cm的量包被T线16；另将抗鼠IgG配制成1～3mg/ml的溶液，用喷膜仪以上述相同参数包被C线17，划线后将NC膜18干燥3～5小时，制成包被25-羟基维生素D3-偶联蛋白的T线16和包被抗鼠IgG的C线17的NC膜18；
c.在相对湿度小于30%的条件下，取塑料基板12，将已包被的NC膜18粘贴在塑料基板12的中部，在NC膜18的T线16一侧粘贴胶体金垫15，在胶体金垫15另一侧粘贴样品垫13；在NC膜18的C线一侧粘贴吸样垫14；邻接接口相互叠压1～2mm，粘贴好的大板切成3～5mm宽的检测试纸条11备用。
1.主要材料
1.1 25-羟基维生素D3抗体、25-羟基维生素D3-偶联蛋白，标准品：芬兰MEDIX有限公司产品；
羊抗鼠IgG抗体：用小鼠IgG免疫山羊自制；氯金酸：Sigma公司产品；
硝酸纤维素（NC）膜，Sartorius公司产品。
牛血清白蛋白（BSA），聚乙二醇PEG20000。其它试剂均为市售常用分析纯试剂。
1.2 临床样本　由天津朗赛生物科技有限公司在相关医院获得，共150份，其中血清、血浆和全血样本各50份，25-羟基维生素D3含量分布区间为4～100μg/L之间的定值样本。 
1.3免疫层析结果结判读记录仪：型号：NS5001，天津中新科炬生物制药有限公司产品。
2.方法
2.1  25-羟基维生素D3抗体胶体金标记，　氯金酸－柠檬酸三钠还原法制备金颗粒直径为30～50nm的胶体金溶液，取三份胶体金溶液，分别用0.2M K2CO3将溶液调到pH7.0、pH7.5和pH8.0。然后将溶液置于磁力搅拌器上缓慢搅拌，按每10ml溶液加入25μg，或50μg，或75μg将标记用25-羟基维生素D3抗体缓慢滴加到胶体金溶液中，继续搅拌30min，再加入到终浓度为0.5%的BSA和5% PEG 20000进行封闭20min，标记结束后以12000g离心，弃上清，沉淀按80%原体积复溶至3种不同配方的胶体金工作液中任意一种，配方1：100mM TRIS.Cl，pH7.6，含1%BSA、5%蔗糖，1% Triton X100；或配方2：20mM TRIS.Cl，pH7.0，含0.5%BSA、5%蔗糖，0.5% Triton X100；或配方3：20mM TRIS.Cl，pH6.5，含0.2%BSA、5%蔗糖，0.2% Triton X100。然后将标记胶体金溶液按1ml溶液铺20cm2的比例加样于无纺布上，在温度20～25℃，相对湿度在＜30%的干燥间干燥3～5小时，制成胶体金垫15。
2.2　NC膜18的长度2～2.5cm，包被时用0.01M pH7.4 的磷酸盐缓冲液（PBS）将用于包被的25-羟基维生素D3-偶联蛋白稀释成0.8mg/ml或1mg/ml、或1.5mg/ml，羊抗鼠IgG分别稀释成1mg/ml、2mg/ml，然后用喷膜仪在NC膜上按1.4μl/cm进行分别划线包被，包被完成后将NC膜18在温度20～25℃、相对湿度在＜30%的干燥间干燥3～5小时。
2.3　试剂卡组装　在相对湿度小于30%的条件下，将已包被的NC膜18粘贴在塑料基板12的中部，在NC膜18的T线16一侧粘贴胶体金垫15，在胶体金垫15另一侧粘贴样品垫13；在NC膜18的C线17一侧粘贴吸样垫14；各粘贴部分接口相互叠压1～2mm，粘贴好的大板切成3～5mm宽的检测试纸条11。将检测试纸条11平放在盒体5内的检测试纸条架6上，一端由端护栏7限位，另一端有侧护栏8限位。然后盖上盒盖4，盒盖4底面的插突起9与盒体5内的插孔柱10插接结合，压紧，内设检测试纸条11的盒体5与盒盖4结为一体，完成装配。
2.4检测试纸条工艺参数调试　将不同浓度标记、包被的组合进行配对，制备小样，利用25-羟基维生素D3标准品对上述组合进行测试，寻找最佳组合。本发明中的样品垫13、胶体金垫15、NC膜18和吸样垫14从塑料基板12一端依次排列至另一端。
检测试纸条11长度为7～9cm，样品垫2长度2.5～3.5cm；胶体金垫15长度为0.6～1cm；NC膜18为孔径8～12微米的多孔样结构膜，长度2～2.5cm，吸样垫14为吸水滤纸，长度为2～2.5cm；宽度均为3～5mm，样品垫13为玻璃纤维膜或无纺布。
25-羟基维生素D3抗体为专一识别25-羟基维生素D3的抗体，与人体其它正常蛋白没有交叉反应。偶联蛋白为BSA，OVA，KLH等大分子蛋白，NC膜18为孔径8～12微米的多孔样结构膜。
2.5仪器曲线参数设置  确定好检测试纸条工艺参数后，分别用0、10、20、40、75、100ng/ml的25-羟基维生素D3标准品对检测试剂卡进行测试，不同浓度的标准品显示出不同强度色带，将相应强度的色带数字化后，计算出标准曲线，输入免疫层析结果判读记录仪中，完成仪器曲线参数设置，用于对检测结果的定量判定，检测范围为10～100ng/mL。
2.6　检测方法　
1）仪器设置，预将25-羟基维生素D3内置标准曲线导入到免疫层析结果判读记录仪内，设置好相关参数；
2）将本试验制备的试剂及样本平衡至室温，取出检测卡，平放；
3）精确吸取20μl血清或血浆样本，样本为全血时吸取30μl样本，加入到检测试剂卡的加样孔2；
4）再吸取100μl稀释液加入到检测试剂卡的稀释液孔1中，计时，15～20分钟内用免疫层析结果判读记录仪定量判定结果。
2.7　临床样本检测　试剂制备完成后，按检测方法对所有临床样本进行检测，并分析检测结果。
3　结果
3.1　检测试纸条参数确定　根据小样的检测结果，确定了检测试剂卡的最佳标记pH值为7.5；25-羟基维生素D3抗体最佳标记量为25μg/10ml胶体金溶液；最佳的胶体金工作液为配方2：20mM TRIS.Cl，pH7.0，含0.5%BSA、5%蔗糖，0.5% Triton X100；最佳包被25-羟基维生素D3-偶联蛋白浓度为1mg/mL。但以上参数在制备不同批次产品时可能需要适当调整。
3.2　临床样本检测　对150份临床定值样本检测，20份低于10ng/ml的样本检测结果均报告低于10ng/ml，130份在线性范围内的样品检测值和样本原值的差异CV小于20%，大于25%的离群值只有5份，比例为4%；可能是因为方法学不同造成的。R2>0.95。检测结果表明制备的检测试剂卡性能良好，适合用于临床检测，特别是满足了客户对快速现场检测的需要。

Claims (2)

1.一种25-羟基维生素D3定量免疫层析检测试剂卡，包括依次形成有稀释液孔（1）、加样孔（2）和观察窗（3）的盒盖（4），盒体（5）内底部形成的检测试纸条架（6）一端形成有端护栏（7），另一端形成有侧护栏（8），盒盖（4）底面形成的插突起（9）与盒体（5）的插孔柱（10）插接结合；以及沿检测试纸条架（6）长度方向平铺的检测试纸条（11），检测试纸条（11）的塑料基板（12）两端分别设置的样品垫（13）和吸样垫（14），其特征在于：样品垫（13）和吸样垫（14）之间依次设置有：含有胶体金标记的25-羟基维生素D3抗体的胶体金垫（15），分别包被有25-羟基维生素D3偶联蛋白的T线（16）和抗鼠IgG的C线（17）的NC膜（18）。
2.权利要求1所述25-羟基维生素D3定量免疫层析检测试剂卡的制备方法，包括依次形成有稀释液孔（1）、加样孔（2）和观察窗（3）的盒盖（4），盒体（5）内底部形成的检测试纸条架（6）一端形成有端护栏（7），另一端形成有侧护栏（8），盒盖（4）底面形成的插突起（9）与盒体（5）的插孔柱（10）插接结合；以及沿检测试纸条架（6）长度方向平铺的检测试纸条（11），检测试纸条（11）的塑料基板（12）两端分别设置有样品垫（13）和吸样垫（14），其特征在于：样品垫（13）和吸样垫（14）之间依次设置有：含有胶体金标记的25-羟基维生素D3抗体的胶体金垫（15），分别包被有25-羟基维生素D3偶联蛋白的T线（16）和抗鼠IgG的C线（17）的NC膜（18）；
所述样品垫（13）和吸样垫（14）之间依次设置有含有胶体金标记25-羟基维生素D3抗体的胶体金垫（15），分别包被有25-羟基维生素D3偶联蛋白的T线（16）和抗鼠IgG的C线（17）的NC膜（18），其中：
a.含有胶体金标记的25-羟基维生素D3抗体的胶体金垫（15）的制备过程为：金颗粒直径为30～50nm的胶体金溶液10ml，于烧杯内用0.2M K2CO3调至pH7.5～8.5，加入25～75μg 25-羟基维生素D3抗体，室温搅拌30min，加入终浓度为0.5%牛血清白蛋白，5% PEG 20000 封闭20min，12000g离心20分钟，弃上清，用胶体金溶液复溶至80ml，按1ml溶液铺20cm2的比例均匀地铺在玻璃纤维膜或无纺布上，置干燥间干燥3～5小时，制成胶体金垫（15）；
b.所述NC膜（18）抗体的包被过程为：以0.01M pH 7.4 磷酸盐缓冲液将25-羟基维生素D3-偶联蛋白配制成0.8～1.6mg/ml的溶液，在NC膜（18）上用喷膜仪以1～1.5μl/cm的量包被T线（16）；另将抗鼠IgG配制成1～3mg/ml的溶液，用喷膜仪以上述相同参数包被C线（17），划线后将NC膜（18）干燥3～5小时，制成包被25-羟基维生素D3-偶联蛋白的T线（16）和包被抗鼠IgG的C线（17）的NC膜（18）；
c.在相对湿度小于30%的条件下，取塑料基板12，将已包被的NC膜（18）粘贴在塑料基板（12）的中部，在NC膜（18）的T线（16）一侧粘贴胶体金垫（15），在胶体金垫（15）另一侧粘贴样品垫（13）；在NC膜（18）的C线（17）一侧粘贴吸样垫（14）；邻接接口相互叠压1～2mm，粘贴好的大板切成3～5mm宽的检测试纸条（11）备用。
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