TWI639002B - Chromatographic medium - Google Patents

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Abstract

本發明之目的係提供一種充分提升保存穩定性的層析介質。本發明係關於一種層析介質，其係在具有「固定有蛋白質所構成之檢測物質的檢測部」的層析介質之中，該檢測部包含三糖以上之多糖類與鹼性胺基酸。

Description

層析介質
本發明係關於層析介質、免疫層析裝置、免疫層析套組以及免疫色層分析方法。
近年來，不需要進行檢體前處理、且使用免疫層析法進行的免疫化驗，舉例來說，如作為利用抗體所具有的特異反應性檢測試液中之抗原的簡便體外診斷套組，或是攜帶式診斷裝置其重要性正在提高。特別是病毒或細菌等的病原體檢査套組，係一般病院及診所也通用的常見免疫層析裝置。
以往免疫層析裝置最簡單的構造如下：樣本添加部、標記物質保持部、具有檢測部的層析介質(層析介質部)以及吸收通過檢測部之液體的吸收部互相連接。
上述各部件中，層析介質的檢測部之中，固定有抗體等的蛋白質，其與作為檢測對象的被檢測物質結合。此蛋白質，因為溫度條件及濕度條件而發生變質，導致對於檢測對象的檢測感度降低，因而具有無法長時間穩定保存免疫層析裝置的問題。於是，針對抑制層析介質之檢測部中所包含之蛋白質變質，以提高保存穩定性的方法，進行了各種研究。
例如，專利文獻1中揭示一種免疫層析裝置，其藉由將糖或糖衍生物使用於免疫層析裝置的檢測部等的固相，適度地保持裝置內的濕 度，進而具有保存穩定性。
另外，非專利文獻1中，揭示一種免疫層析裝置，其係使層析介質的膜分別單獨含有甘胺酸或離胺酸(lysine)等的胺基酸，以及蔗糖或海藻糖(trehalose)等的糖，藉此提高抗體的保存穩定性，以抑制檢測感度的降低。
【先前技術文獻】
【專利文獻】
【專利文獻1】國際公開第2002/40999號
【非專利文獻】
【非專利文獻1】METHODS 22，53-60(2000)「Development of Rapid One-Step Immunochromatographic Assay」
然而，如上述的先前技術仍不具有足夠的效果，尚有改良的空間。本發明之目的，係提供充分提升保存穩定性的層析介質。
本案發明人，為解決上述課題而詳盡研究的結果，發現在用於免疫層析法的免疫層析裝置中，使層析介質的檢測部含有特定糖類與鹼性胺基酸兩者，藉此可充分抑制固定於檢測部中作為檢測對象的蛋白質的變質，而充分提高保存穩定性，進而防止檢測物質的活性降低；更發現亦可提升檢測物質的活性，進而完成本發明。
亦即，本發明如下所述。
1.一種層析介質，其係用於檢測檢體中之被檢測物質的免疫層析法， 且具有「固定有蛋白質所構成之檢測物質的檢測部」的層析介質，其中該檢測部包含三糖以上的多糖類與鹼性胺基酸。
2.如上述1記載的層析介質，其中檢測部所含的該多糖類，係選自棉子糖(raffinose)、黑曲霉三糖(nigerotriose)、麥芽三糖(maltotriose)、松三糖(melezitose)、麥芽三酮糖(maltotriulose)、蔗果三糖(kestose)、蔗果四糖(nystose)、黑曲霉四糖(nigerotetraose)、水蘇糖(stachyose)及麥芽四糖(maltotetraose)所構成之群組中的至少一種多糖類。
3.如上述1或2記載的層析介質，其中檢測部包含該多糖類5~50nmol。
4.如上述1~3中任一項記載的層析介質，其中檢測部包含該鹼性胺基酸5~50nmol。
5.如上述1~4中任一項記載的層析介質，其中檢測部所含的該多糖類與該鹼性胺基酸的莫耳比為1：10~10：1。
6.如上述1~5中任一項記載的層析介質，其中檢測部包含選自精胺酸、離胺酸、鳥胺酸以及組胺酸所構成之群組中的至少一種鹼性胺基酸。
7.如上述1~6中任一項記載的層析介質，其中檢測部包含離胺酸。
8.如上述1~7中任一項記載的層析介質，其中被檢測物質為糖蛋白質。
9.如上述8記載的層析介質，其中該糖蛋白質為HbA1c。
10.一種免疫層析裝置，其特徵為包含如上述1~9中任一項記載的層析介質。
11.一種免疫層析套組，其特徵為包含如上述10記載的免疫層析裝置及檢體稀釋液。
12.一種免疫色層分析方法，其特徵係使用如上述11記載的免疫層析套 組，並依序實施下述步驟(1)~(4)：(1)添加步驟，將檢體與檢體稀釋液一起添加至樣本添加部；(2)辨識步驟，藉由保持於標記物質保持部中的標記物質，辨識該檢體所含的被檢測物質；(3)展開步驟，使該檢體及標記物質作為移動相在層析介質中展開；(4)檢測步驟，以檢測部檢測經展開之移動相中的被檢測物質。
根據本發明，提供一種層析介質，其可充分抑制固定於檢測部作為檢測對象的蛋白質的變質，而可充分提高保存穩定性，並且防止檢測物質的活性降低。另外，亦可提升檢測物質的活性。
1‧‧‧樣本添加部
2‧‧‧標記物質保持部
3‧‧‧層析介質
4‧‧‧檢測部
5‧‧‧吸收部
6‧‧‧底墊
第一圖係用以說明免疫層析裝置之構造的剖面圖。
第二圖係顯示在實施例1、2及比較例1、2中檢測部之顯色值的相對活性的圖表。
第三圖係顯示實施例3~6及比較例3~10中，加濕(humidification)二天後檢測部之顯色值的相對活性的圖表。
以下說明用以實施本發明的形態。
再者，本說明書中，「固定」係指為了避免抗體等移動而配置於膜等載體；「保持」係指抗體等可移動地被配置於膜等載體之中或表面。
本發明之層析介質，其具有固定有蛋白質所構成之檢測物質的檢測部，其特徵為：該檢測部中含有三糖以上的多糖類與鹼性胺基酸。
檢測部係形成於層析介質上。亦即，作為與被檢測物質結合的檢測物質的蛋白質會被固定於任意的位置。
本發明之層析介質，藉由其檢測部上含有三糖以上的多糖類，作為檢測部中的檢測物質的蛋白質即被認為具有耐濕性，因而可抑制蛋白質的變質，提高保存穩定性，進而可防止檢測物質的活性降低。
另外，在多糖類中，藉著三糖以上的糖類於一分子內具有多個可與氫鍵結之羥基，故相較於單糖或雙糖，可得到較高的效果。
本發明之層析介質中，藉由使該檢測部含有三糖以上的多糖類，可提高檢測物質之保存穩定性的作用機制尚未確定，但發明人認為這是因為三糖以上的多糖類會維持檢測物質之蛋白質的氫鍵網狀結構，故當鍵結的水因為乾燥而從檢測物質之蛋白質解離時，會防止蛋白質的立體構造被破壞，而可防止蛋白質變質，進而提高保存穩定性，防止活性降低。
多糖類只要是三糖以上，並無特別限定。例如，可列舉如下的三糖或四糖。
作為三糖，例如，可列舉：棉子糖、黑曲霉三糖、麥芽三糖、松三糖、麥芽三酮糖以及蔗果三糖等。
作為四糖，例如，可列舉：蔗果四糖、黑曲霉四糖、水蘇糖以及麥芽四糖等。
本發明中，於多糖類之中較佳為三糖或四糖。其中，較佳為棉子糖、黑曲霉三糖、麥芽三糖、松三糖、麥芽三酮糖、蔗果三糖、蔗果四糖、黑曲霉四糖、水蘇糖及麥芽四糖所構成之群組中的至少一種多糖類。更佳為三糖，而三糖之中再佳為棉子糖。
這是因為，藉由使用上述的糖類，可抑制被檢測物質與檢測物質的反應阻礙，適當維持檢測物質之蛋白質的氫鍵網狀結構，而提高保存穩定性，防止活性降低。三糖以上的多糖類大多是非還原糖，不會因為加水分解而導致官能基轉變為氫鍵結性弱的醛基或酮基，故可維持穩固的氫鍵網狀結構。
本發明之層析介質的檢測部中可含有上述一種糖類，亦可混合含有2種以上。
檢測部中的多糖類含量，係每一層析介質例如為5~50nmol，較佳為10~40nmol，更佳為20~30nmol。這是因為，藉由使其在上述範圍中，可充分地提高保存穩定性，防止活性降低，而能夠更抑制被檢測物質與檢測物質的反應阻礙。
另外，本發明之層析介質，在該檢測部中，配合上述多糖類同時含有鹼性胺基酸，藉此可使作為檢測部中的檢測物質的蛋白質具有耐濕性，因而可抑制蛋白質變質，提高保存穩定性，而可防止檢測物質之活性降低。另外，因為係鹼性胺基酸，而可得到高於其他胺基酸的效果。
本發明之層析介質中，藉由使該檢測部含有鹼性胺基酸，而可提高檢測物質之保存穩定性的作用機制雖尚未確定，但發明人認為，係因為鹼性胺基酸會與作為檢測物質的蛋白質微弱地相互作用，而可抑制蛋白質彼此的聚合凝集，進而可防止檢測物質之活性降低。
鹼性胺基酸的種類未特別限定，例如，可列舉：精胺酸、離胺酸、鳥胺酸以及組胺酸等。從提高保存穩定性、更防止活性降低的觀點來看，使用離胺酸及精胺酸較佳，使用離胺酸最佳。本發明之層析介質的 檢測部中，可含有上述一種鹼性胺基酸，亦可混合含有兩種以上。
檢測部中的鹼性胺基酸的含量，係每一層析介質例如具有5~50nmol，較佳為10~40nmol，更佳為15~30nmol。這是因為，藉由使其在上述範圍中，可更防止檢測物質之活性降低。
本發明之層析介質中，檢測部包含三糖以上之多糖類與鹼性胺基酸兩者，相較於分別單獨含有的情況，明顯可提升檢測物質的保存穩定性。
上述作用機制雖尚未確定，但推測如下：藉由使檢測部含有三糖以上的多糖類與鹼性胺基酸兩者，多糖類會形成氫鍵的網狀結構，並且保持正確的立體構造，且鹼性胺基酸與抗體微弱地相互作用，而可抑制抗體彼此凝集，進而長期保持活性。
另外推測，在藉由檢測物質檢測被檢測物質時，鹼性胺基酸不會損及藉多糖類帶來的保存穩定性之效果，且鹼性胺基酸可適當解開多糖類與檢測物質的聚集，故亦可抑制被檢測物質與檢測物質的反應活性降低。
檢測部中所含的上述多糖類與鹼性胺基酸的比例，在質量(莫耳)比之下，一般為1：10~10：1，較佳為1：4~4：1，更佳為4：5~5：4。藉由使其為上述範圍，可使因為包含多糖類與鹼性胺基酸兩者所得到的加乘效果更為有效。
固定於本發明之層析介質的檢測部中做為檢測物質的蛋白質，只要是與檢測對象特異結合的蛋白質，則無特別限定，例如，可列舉：抗體、抗原及荷爾蒙等。
作為抗體，例如，可列舉：多株抗體或單株抗體及其片段等。單株抗體及多株抗體或其片段，可使用習知可取得者，亦可藉由習知方法調製。
抗體的固定量，係每一層析介質例如為0.1~1μg，較佳為0.2~0.6μg，更佳為0.3~0.4μg。
本發明之層析介質，可作為免疫層析裝置的展開部位使用。層析介質，係呈現毛細現象的微細多孔性物質所構成之非活性膜。從與免疫層析法中所使用的檢測試藥、固定化試藥或被檢測物質等不具有反應性的觀點來看，再從提升本發明之效果的觀點來看，較佳為例如，硝化纖維素製的膜(以下有時稱為「硝化纖維素膜」)或乙酸纖維素製的膜(以下有時稱為「乙酸纖維素膜」)，更佳為硝化纖維素膜。再者，亦可使用纖維素類膜、尼龍膜及多孔質塑膠布類(聚乙烯、聚丙烯)。
作為硝化纖維素膜，只要主體中包含硝化纖維素即可，可使用純品或硝化纖維素混合品等以硝化纖維素為主材料的膜。
硝化纖維素膜，可更包含促進毛細現象的物質。作為上述物質，較佳為可降低膜面的表面張力而使其具有親水性的物質。
例如，較佳為具有各種合成界面活性劑或醇類等的兩性(amphipathic)作用的物質，且對於層析介質上的被檢測物質之移動沒有影響、對於金膠體等的標記物質的顯色沒有影響的物質。
硝化纖維素膜為多孔性，呈現毛細現象。該毛細現象的指標，可藉由測量吸水速度(吸水時間：capillary flow time)來確認。吸水速度對於檢測感度與檢査時間有所影響。
上述的硝化纖維素膜及乙酸纖維素膜所代表的層析介質的形態及大小並無特別限制，只要適用於實際操作並且於反應結果的觀察之中即可。
另外，為了防止非特異性吸附導致分析的精準度降低，亦可因應需求，藉由習知的方法，對於本發明之層析介質進行阻斷(blocking)處理。
一般而言，阻斷處理中，較佳係使用牛血清蛋白、脫脂牛奶、乳酪素或膠原蛋白等的蛋白質。在該阻斷處理後，可因應需求，例如，使用聚乙烯乙二醇山梨糖醇月桂酸(例如，Tween20：和光純藥公司製)、聚氧基乙烯辛基苯基醚(例如，TritonX-100：和光純藥公司製)或十二烷基硫酸鈉(例如，SDS：和光純藥公司製)等的界面活性劑中的一種或是組合2種以上，以進行洗淨。
另外，本發明之層析介質中的檢測部係形成於層析介質上。亦即，與被檢測物質特異結合的上述蛋白質可被固定於任意的位置。
作為包含被檢測物質的檢體，雖未特別限制，但例如，可列舉活體樣本，即全血、血清、血漿、尿、唾液、痰、鼻腔或咽喉擦拭液、髓液、羊水、乳頭分泌液、淚、汗、來自皮膚的滲出液、來自組織、細胞及糞便的萃取液等，除此之外，亦可列舉牛乳、蛋、小麥、豆類、牛肉、豬肉、雞肉及包含該等的食品等的萃取液等。
作為被檢測物質，具體而言，例如，可列舉：癌症胎兒性抗原(CEA)、HER2蛋白、***特異抗原(PSA)、CA19-9、α-胎兒蛋白(AFP)、免疫抑制酸性蛋白(IPA)、CA15-3、CA125、動情激素受體、黃體素受體、 糞便潛血、旋光素(Troponin)I、旋光素T、CK-MB、CRP、人類絨毛膜***(hCG)、黃體形成激素(LH)、促濾泡激素(FSH)、梅毒抗體、流感病毒、人體血紅素、披衣菌屬(chlamydia)抗原、A群β鏈球菌抗原、HBs抗體、HBs抗原、輪狀病毒、腺病毒、蛋白乃至糖化蛋白及糖化血紅素等的糖蛋白質等，但並不限定於此等物質。
其中，作為被檢測物質，較佳為糖蛋白質，更佳為糖化血紅素，特佳為HbA1c。必須要認知，HbA1c抗體在血紅素與葡萄糖結合之狀態及未結合的狀態下具有些微的差異，因而必須要嚴格地保持該立體構造，故被檢測物質為HbA1c的情況下，本發明之效果特別有效。
作為本發明之免疫層析裝置的一實施形態，如第一圖所示，除了上述層析介質及檢測部之外，一般係由樣本添加部、標記物質保持部、吸收部及底墊所構成。上述各部位設置的順序，依照樣本展開的順序，依序為樣本添加部(1)、標記物質保持部(2)、層析介質(亦稱為層析介質部)(3)、檢測部(4)、吸收部(5)。
樣本添加部(1)，在免疫層析裝置中，係添加檢體樣本的部位。樣本添加部(1)，可由多孔質片所構成，該多孔質片具有可迅速吸收樣本，且樣本可在其中快速移動的性質。作為多孔質片，例如，可列舉：纖維素濾紙、玻璃纖維、聚胺甲酸酯、聚乙酸酯、乙酸纖維素、尼龍及綿布等。
標記物質保持部(2)中，包含後述的標記物質，其預先與「和被檢測物質結合的抗體」結合。在被檢測物質移動經過標記物質保持部中時，與抗體結合而被標記化。標記物質保持部(2)，例如，可由玻璃纖維不 織布或纖維素膜等所構成。
層析介質(3)及檢測部(4)，係使用上述本發明之層析介質。
吸收部(5)因應需求設置於層析介質部(3)的末端，用以吸收通過檢測部(4)的檢體及展開液等的液體。本發明之免疫層析裝置中，吸收部(5)可使用例如，玻璃纖維、紙漿、纖維素纖維等，或使該等不織布含有具有丙烯酸聚合物等的高分子、氧化乙烯基等的親水性藥劑者等。較佳為玻璃纖維。藉由以玻璃纖維構成吸收部(5)，可大幅降低試液的回流。
底墊(6)為基材。藉由在單面塗布粘著劑，或是貼附黏著貼片，使得單面具有黏著性，而樣本添加部(1)、標記物質保持部(2)、層析介質部(3)及吸收部(5)部分或完全密合地設置於該黏著面上。底墊(6)，只要藉由黏著劑而相對於試液為非穿透性、非透濕性，則作為基材無特別限定。
另外，本發明可與檢體稀釋液與上述免疫層析裝置組合，而作為免疫層析套組。
檢體稀釋液雖亦可另外作為展開液使用，但一般係使用水作為溶劑，其中亦可添加緩衝液、鹽及非離子界面活性劑，用以促進抗原抗體反應或抑制非特異反應，更可添加例如蛋白質、高分子化合物(PVP等)、離子性界面活性劑或聚陰離子或是抗菌劑、螫合劑等之中的1種或2種以上。
作為展開液使用的情況下，可預先混合檢體與展開液，再將其供給、添加至樣本添加部上，而使其展開；亦可先將檢體供給、添加至樣本添加部上之後，再將展開液供給、添加至樣本添加部上以使其展開。
本發明之免疫色層分析方法，係依序實施以下步驟(1)~(4)，使用上述免疫層析套組，檢測檢體所含的被檢測物質。
(1)添加步驟，將檢體與檢體稀釋液一起添加至樣本添加部；(2)辨識步驟，藉由標記物質保持部中所保持的標記物質，辨識該檢體所含的被檢測物質；(3)展開步驟，使該檢體及標記物質作為移動相在層析介質中展開；(4)檢測步驟，以檢測部檢測經展開的移動相中的被檢測物質。
以下說明各步驟。
(1)將檢體與檢體稀釋液一起添加至樣本添加部的步驟
步驟(1)中，第一步較佳係以檢體稀釋液將檢體的濃度調整或稀釋至不使測定精準度降低，且可順利移動通過層析介質中的程度，而成為檢體含有液。第二步係以既定量(一般為0.1~2ml)將上述檢體含有液添加至樣本添加部(1)上。若添加檢體含有液，則檢體含有液在樣本添加部(1)中開始移動。
(2)藉由標記物質保持部中所保持的標記物質辨識檢體所含的被檢測物質的步驟
步驟(2)，係使步驟(1)中添加至樣本添加部的檢體含有液，朝向標記物質保持部(2)移動，藉由標記物質保持部中所保持的標記物質，辨識檢體中之被檢測物質的步驟。
標記物質將抗體標記化。免疫層析法中檢測試藥的標記，一般雖亦使用酵素等，但較佳係使用不溶性載體作為標記物質，因為其適用於以目視判定被檢測物質的存在。藉由將抗體敏化(sensitization)為不溶性載體，可調製經標記化的檢測試藥。再者，將抗體敏化為不溶性載體的手段，可依照習知的方法。
作為標記物質的不溶性載體，可使用金、銀或白金等的金屬 粒子、氧化鐵等的金屬氧化物粒子、硫等的非金屬粒子及合成高分子所構成的乳膠粒子或其他。
不溶性載體，係適用於以目視判定被檢測物質之存在的標記物質，為了容易以目視判定，較佳係具有顏色。金屬粒子及金屬氧化物粒子，其本體會與粒徑對應呈現特定自然色，而可將該色彩作為標記使用。
作為標記物質的不溶性載體，從檢測簡便、不易凝集且不易發生非特異顯色的觀點來看，特佳為金粒子。金粒子的平均粒徑例如為10nm~250nm，較佳為35nm~120nm。可藉由穿透式電子顯微鏡(TEM：日本電子(股)製，JEM-2010)，使用經拍攝的投影影像，隨機對於100個粒子測量粒子的投影面積的圓的等效直徑，再從其平均值算出平均粒徑。
(3)使檢體及標記物質作為移動相在層析介質中展開的步驟
步驟(3)，係在上述步驟(2)中，於標記物質保持部中，標記物質辨識出被檢測物質之後，使檢體及標記物質作為移動相通過層析介質上的步驟。
(4)以檢測部檢測經展開之移動相中的被檢測物質的步驟
步驟(4)係如下所述的步驟：作為移動相通過層析介質上的檢體中的被檢測物質，因為其與作為檢測物質的蛋白質的特異結合反應，而進行「被固定於檢測部中之蛋白質與標記試藥夾成三明治狀」的態樣的特異反應結合，進而使檢測部著色。
不存在被檢測物質的情況下，在樣本的水分中溶解的標記試藥，即使通過層析介質上的檢測部，亦不會發生特異結合反應，故檢測部不會著色。
本發明中，因為檢測部包含三糖以上的多糖類與鹼性胺基酸，而可充 分抑制固定於檢測部作為檢測對象的蛋白質的變質，保存穩定性夠高，而可防止檢測物質的活性降低。
最後，檢體含有液的水分往吸收部(5)移動。
【實施例】
以下，雖藉由實施例及比較例以說明本發明，但本發明並不被下述實施例所限制。
[實施例1]
1.免疫層析套組的製作
(1)層析介質及檢測部的製作
使用硝化纖維素所構成之片材(Millipore公司製，商品名稱：HF75，300mm×25mm)，作為層析介質中所用的膜。
接著，以包含異丙醇5質量%的磷酸緩衝液(pH7.4)，稀釋抗HbA1c單株抗體(第一抗體)，以使其濃度成為1.0mg/ml，再將此溶液150μL以1mm的寬度塗布300mm於經乾燥的膜上之檢測部(檢測線)。再者，該溶液，係準備具有8mmol/mL(每一層析介質為20nmol)的離胺酸及10mmol/mL(每一層析介質成為25nmol的濃度)之棉子糖濃度的溶液。
另外，為了確認金奈米粒子標記試藥是否展開以及其展開速度，在檢測部的下游，將下述液體塗布於控制部位(控制線)：以磷酸緩衝液(pH7.4)稀釋，且會與金奈米粒子標記物質、或作為被檢測物質的動物肉蛋白質等具有廣泛親和性的山羊的抗血清。之後，以50℃乾燥30分鐘，於室溫下乾燥一晚，以製作層析介質及檢測部。
(2)樣本添加部的製作
使用玻璃纖維所構成之不織布(Millipore公司製：300mm×30mm)，作為樣本添加部。
(3)標記物質保持部的製作
在金膠體懸浮液(田中貴金屬工業公司製：LC40nm)0.5ml中，加入0.1ml的以磷酸緩衝液(pH7.4)將濃度稀釋成0.05mg/ml的抗HbA1c單株抗體(第二抗體)，於室溫下靜置10分鐘。
接著，加入0.1ml的包含牛血清蛋白(BSA)1質量%的磷酸緩衝液(pH7.4)，更於室溫下靜置10分鐘。之後，充分攪拌後以8000×g離心15分鐘，在去除上清液之後，加入0.1ml的包含1質量%BSA之磷酸緩衝液(pH7.4)。以上述順序製作標記物質溶液。
在上述製作的標記物質溶液300μL中，加入300μL的10質量%海藻糖水溶液與1.8mL的蒸餾水，再將其均勻添加至15mm×300mm的玻璃纖維墊(Millipore公司製)之後，於真空乾燥機中使其乾燥，以製作標記物質保持部。
(4)免疫層析裝置的製作
接著，使用上述製作的層析介質及檢測部、樣本添加部、標記物質保持部，製作如第一圖所示的免疫層析裝置。在底墊所構成之基材上，依序貼合樣本添加部、標記物質保持部、具有檢測部的層析介質、用以吸收經展開的樣本以及標記物質之作為吸收部的玻璃纖維製不織布。接著，以裁切機裁切成寬度5mm的態樣，而作為免疫層析裝置。
(5)檢體稀釋液
調製50mM的HEPES緩衝液(pH7.5)，作為對檢體進行稀釋處理的試藥；該HEPES緩衝液，包含1質量%的非離子界面活性劑(日油股份有限公司 製，商品名稱：MN811與NACALAI TESQUE公司製，商品名稱：NP-40的1：1混合物)、80mM的氯化鈣、20mM的胍鹽酸鹽、0.4重量%的聚乙烯基吡咯烷酮(平均分子量36萬)。
2.測定
將上述製作的免疫層析裝置放入加濕器，在濕度95%、溫度37℃的狀態下，放置如表1所記載的時間。之後，藉由分別穿刺健康成人男性及糖尿病男性患者的指尖以採取血液，再以乳膠凝集法分別測定HbA0及HbA1c之濃度，接著將各血液樣本混合至HbA1c的濃度6.5%以製作HbA1c檢體，再以上述檢體稀釋液稀釋100倍以製作檢體樣本。將該檢體樣本150μL，載置於免疫層析裝置的樣本添加部上並使其展開，再藉由密度計(Hamamatsu Photonics公司製，以下相同)測定檢測部的著色程度(顯色值)。結果顯示於表1及第二圖。表中，相對活性係表示將未放入加濕器者(經過時間0)所測定的顯色值作為100%時，顯色值的比例。再者，使用與各實施例、比較例對應的HbA1c之濃度為0%而僅由HbA0所構成之檢體(陰性檢體)，測定顯色值，但皆顯示為未滿5mAbs的測定值，確認沒有偽陽性(False positive)。
[實施例2]
使用「抗流感抗體」代替第一抗體及第二抗體的「抗HbA1c單株抗體」，並將檢體樣本變更為流感抗原之外，重複進行實施例1。藉由密度計測定檢測部的著色程度(顯色值)。結果顯示於表1及第二圖。
[比較例1]
檢測部中，使用「蔗糖」代替「離胺酸及棉子糖」，除此之外，重複進行實施例1。再者，檢測部的製作中，使用具有10mmol/mL(每一 層析介質成為20nmol的濃度)之蔗糖濃度的溶液，藉由密度計測定檢測部的著色程度(顯色值)。結果顯示於表2及第二圖。
[比較例2]
檢測部中，使用「蔗糖」代替「離胺酸及棉子糖」之外，重複進行實施例2。再者，在檢測部的製作中，使用具有10mmol/mL(每一層析介質成為20nmol的濃度)之蔗糖濃度的溶液，藉由密度計測定檢測部的著色程度(顯色值)。結果顯示於表2及第二圖。
表1及第二圖中，實施例1及2因為檢測部具有鹼性胺基酸之離胺酸及三糖之棉子糖，故在濕度95%，溫度37℃的環境下放置一定時間時，抑制了檢測物質的活性降低。另外，使用HbA1c作為被檢測物質的實施例1中，得到檢測物質的活性提升的結果。
另一方面，表2及第二圖中，在僅含有雙糖的蔗糖的比較例1及2中，檢測物質之活性降低。
[實施例3]
將實施例1中所使用的免疫層析裝置，於溫度：24-26℃，濕度：40-70%的加濕環境下放置兩天。檢體係使用與實施例1相同的HbA1c，分別藉由密度計測定免疫層析裝置中的檢測部在放置前的著色程度(顯色值)與免疫層析裝置中的檢測部在放置兩天後的著色程度(顯色值)。結果顯示於表3及第三圖。表3中，相對活性係表示免疫層析裝置在放置前所測定的顯色值為100%時，免疫層析裝置在放置兩天後所測定的顯色值的比例。
[實施例4]
在實施例3中，如表3所示地變更塗布於免疫層析裝置之檢測 部的離胺酸與棉子糖的量之外，重複進行實施例3。結果顯示於表3及第三圖。
[實施例5]
在實施例3中，對免疫層析裝置的檢測部，以表3所示的量塗布精胺酸與棉子糖之外，重複進行實施例3。結果顯示於表3及第三圖。
[實施例6]
在實施例3中，對免疫層析裝置的檢測部，以表3所示的量塗布離胺酸與麥芽四糖之外，重複進行實施例3。結果顯示於表3及第三圖。
[比較例3]
在實施例3中，對免疫層析裝置之檢測部以表3所示的量塗布甘胺酸之外，重複進行實施例3。結果顯示於表3及第三圖。
[比較例4]
在實施例3中，對免疫層析裝置之檢測部以表3所示的量塗布精胺酸之外，重複進行實施例3。結果顯示於表3及第三圖。
[比較例5]
在實施例3中，對免疫層析裝置之檢測部以表3所示的量塗布離胺酸之外，重複進行實施例3。結果顯示於表3及第三圖。
[比較例6]
在實施例3中，對免疫層析裝置之檢測部以表3所示的量塗布甘露醇之外，重複進行實施例3。結果顯示於表3及第三圖。
[比較例7]
在實施例3中，對免疫層析裝置之檢測部以表3所示的量塗布 蔗糖之外，重複進行實施例3。結果顯示於表3及第三圖。
[比較例8]
在實施例3中，對免疫層析裝置之檢測部以表3所示的量塗布棉子糖之外，重複進行實施例3。結果顯示於表3及第三圖。
[比較例9]
在實施例3中，對免疫層析裝置之檢測部以表3所示的量塗布麥芽四糖之外，重複進行實施例3。結果顯示於表3及第三圖。
[比較例10]
在實施例3中，對免疫層析裝置之檢測部以表3所示的量塗布甘胺酸與棉子糖之外，重複進行實施例3。結果顯示於表3及第三圖。
表3及第三圖中，於實施例3~6中，因為檢測部含有鹼性胺基酸之離胺酸或精胺酸，以及三糖以上的多糖類(棉子糖、麥芽四糖)，故可抑制放兩天時檢測物質之活性降低。特別是在檢測部含有離胺酸及棉子糖兩者的實施例3及4中，大幅度抑制檢測物質之活性降低。
另一方面，僅含有中性胺基酸之甘胺酸的比較例3、僅含有鹼性胺基酸之精胺酸及離胺酸的比較例4及5、僅含有單糖之甘露醇及雙糖之蔗糖的 比較例6及7、僅含有三糖之棉子糖及四糖之麥芽四糖的比較例8及9之中，檢測物質之活性顯著降低。另外，在含有中性胺基酸之甘胺酸與三糖之棉子糖的比較例10之中，檢測物質之活性亦顯著降低。
根據以上結果得知，藉由使檢測部含有鹼性胺基酸及三糖以上的多糖類兩者，可大幅度抑制檢測物質之活性降低。
雖使用特定態樣詳細說明本發明，但該領域具通常知識者應知悉，只要不偏離本發明之意圖與範圍即可進行各種變更及變化。再者，本申請案係根據2016年1月22提出申請的日本專利出願(特願2016-010795)，並將其整體內容引用至此。

Claims (12)

  1. 一種層析介質，其係用於檢測檢體中之被檢測物質的免疫層析法，其係具有固定有蛋白質所構成之檢測物質的檢測部的層析介質，其中該檢測部包含三糖或四糖的多糖類與鹼性胺基酸。
  2. 如申請專利範圍第1項之層析介質，其中檢測部所含的該多糖類，係選自棉子糖(raffinose)、黑曲霉三糖(nigerotriose)、麥芽三糖(maltotriose)、松三糖(melezitose)、麥芽三酮糖(maltotriulose)、蔗果三糖(kestose)、蔗果四糖(nystose)、黑曲霉四糖(nigerotetraose)、水蘇糖(stachyose)及麥芽四糖(maltotetraose)所構成之群組中的至少一種多糖類。
  3. 如申請專利範圍第1或2項之層析介質，其中檢測部包含該多糖類5~50nmol。
  4. 如申請專利範圍第1或2項之層析介質，其中檢測部包含該鹼性胺基酸5~50nmol。
  5. 如申請專利範圍第1或2項之層析介質，其中檢測部所含的該多糖類與該鹼性胺基酸的莫耳比為1：10~10：1。
  6. 如申請專利範圍第1或2項之層析介質，其中檢測部包含選自精胺酸、離胺酸、鳥胺酸，及組胺酸所構成之群組中任一種鹼性胺基酸。
  7. 如申請專利範圍第1或2項之層析介質，其中檢測部包含離胺酸。
  8. 如申請專利範圍第1或2項之層析介質，其中被檢測物質為糖蛋白質。
  9. 如申請專利範圍第8項之層析介質，其中該糖蛋白質為HbA1c。
  10. 一種免疫層析裝置，包含如申請專利範圍第1至9中任一項之層 析介質。
  11. 一種免疫層析套組，包含如申請專利範圍第10項之免疫層析裝置及檢體稀釋液。
  12. 一種免疫色層分析方法，使用如申請專利範圍第11項之免疫層析套組，並依序實施下述步驟(1)~(4)：(1)添加步驟，將檢體與檢體稀釋液一起添加至樣本添加部；(2)辨識步驟，藉由標記物質保持部中所保持的標記物質，辨識該檢體所含的被檢測物質；(3)展開步驟，使該檢體及標記物質作為移動相在層析介質中展開；(4)檢測步驟，以檢測部檢測經展開之移動相中的被檢測物質。
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