CN202794189U

CN202794189U - C反应蛋白快速全程定量免疫层析检测试剂盒

Info

Publication number: CN202794189U
Application number: CN 201220399463
Authority: CN
Inventors: 李洲; 杨发青; 王程飞
Original assignee: NEWSCEN COAST BIO-PHARMACEUTICAL Co Ltd
Current assignee: Newscen Coast Bio Pharmaceutical Co ltd
Priority date: 2012-08-07
Filing date: 2012-08-07
Publication date: 2013-03-13
Anticipated expiration: 2022-08-07

Abstract

本实用新型专利公开了一种C反应蛋白快速全程定量免疫层析检测试剂盒，其特征在于试剂盒由试纸卡、比色卡和免疫层析结果判读记录仪组成。试纸卡结构为：在塑料底板(1)一端粘贴上样垫(2)，上样垫的一端紧密压接含有标记抗人C反应蛋白(CRP)特异性抗体的胶体金垫(3)，胶体金垫一端紧密压接硝酸纤维素NC膜(4)，NC膜上包被有相互分离的检测线T(5)和质控线C(6)，T线为和标记抗体配对的CRP抗体，C线为抗鼠IgG抗体，NC膜的另一端连接吸样垫(7)形成试纸，试纸装入塑料卡内形成试纸卡。检测时用免疫层析结果判读记录仪或比色卡对结果进行定量或半定量判定，具有操作简便、快速、适合现场检测和经济实用等优点。

Description

C反应蛋白快速全程定量免疫层析检测试剂盒

技术领域

本实用新型是涉及生物应用技术领域，特别是涉及一种以胶体金免疫层析法制备的C反应蛋白快速全程定量免疫层析检测试剂盒。

背景技术

人类在组织损伤的急性期，肝脏合成的一些血浆蛋白显著增加，这些蛋白质通称为急性时相蛋白，C反应蛋白(CRP)是急性时相蛋白中变化最显著的一种。

CRP在正常人血清中其含量极微；在组织受到损伤、炎症、感染或肿瘤破坏时CRP可以在数小时内急剧上升，CRP被广泛应用于临床疾病的早期诊断及鉴别诊断，其升高可见于：1、组织损伤、感染、肿瘤、心肌梗塞及一系列急慢性炎症性疾病，如风湿性关节炎、全身性血管炎、多肌痛风湿病；2、术后感染及并发症的指标：手术后病人CRP升高，术后7-10天CRP水平应下降，如CRP不降低或再次升高，提示可能并发感染或血栓栓塞；3、可作为细菌性感染和病毒性感染的鉴别诊断：大多数细菌性感染会引起患者血清CRP升高，而病毒性感染则多数不升高。

近年来研究发CRP水平还同未来发生心血管疾病密切相关，大量研究资料表明，动脉粥样化也是一个慢性炎症过程，CRP轻度升高与冠状动脉事件、中风及周围血管病相关，是一项独立的危险因素；高敏CRP(Hs-CRP)水平升高者发生急性脑卒中的几率是正常健康人的2倍，发生心肌梗死的几率是正常者的3倍。2003年欧洲高血压防治指南(ESH/ESC)正式推荐，高血压患者需检测hs-CRP水平。

目前国内用于全自动生化仪的免疫透射比浊法试剂CRP出现了两种：普通CRP有较高的线性但灵敏度不好，高敏CRP有较高的灵敏度但线性较低，用途也有所区别；近几年来，随着检验技术的发展，开始出现了一种全程CRP，这种CRP即能满足较高的灵敏度，又能满足较高的线性，用途更广。但全程CRP检测试剂主要采用化学发光法或乳胶法制备，只适合血清或血浆样本，不适合全血样本。尚未有采用免疫层析胶体金技术制备的全程CRP检测试剂盒。

免疫层析胶体金技术是新型的诊断技术，基本原理如下：利用胶体金标记一种抗原或抗体，在试剂的NC膜上包被相应的配对抗原或抗体，检测时当样品中含相应的特异性抗体或抗原时，胶体金标记颗粒和样品中配体相结合形成复合物，然后在NC膜上层析，再被包被抗原或抗体捕获，形成肉眼可见的检测T线，在一定的条件下，T线的强弱和样品中的浓度呈正相关或负相关，从而实现检测。具有操作简便、反应快速、敏感性高、特异性强、适合现场检测和经济实用等优点。

发明内容

本实用新型的目的是提供C反应蛋白快速全程定量免疫层析检测试剂盒，具有全程定量或半定量检测能力，操作简便、反应快速、敏感性高、特异性强、适合现场检测和经济实用等优点。

C反应蛋白快速全程定量免疫层析检测试剂盒，其特征在于试剂盒由试纸卡、比色卡和免疫层析结果判读记录仪构成。

所述试纸卡结构为：在塑料底板(1)一端粘贴上样垫(2)，上样垫的一端紧密压接含有标记抗人C反应蛋白特异性抗体的胶体金垫(3)，胶体金垫一端紧密压接硝酸纤维素NC膜(4)，NC膜上包被有相互分离的检测线T(5)和质控线C(6)，检测线为和标记抗体配对的CRP抗体，质控线为抗鼠IgG抗体，硝酸纤维素膜的另一端连接吸样垫(7)形成试纸，试纸装入塑料卡内形成试纸卡。

所述试纸卡的抗体为高敏CRP配对抗体，分别识别CRP识别不同表位，抗体可以为纯化的单克隆抗体或多克隆抗体。

所述试纸卡的NC膜为孔径8-12微米的多孔样结构膜，上样垫为玻璃纤维膜或无纺布，吸样垫由吸水滤纸构成。

所述比色卡是白色背景上印有系列不同深浅红色线条的纸板，用于对检测结果的对比判定。不同深浅的红色线条共6条，分别对应1、3、10、20、50、200mg/L的CRP浓度。

所述免疫层析结果判读记录仪是一种光学检测***，用于对检测结果的定量判定，对CRP的检测范围为0-200mg/L。

所述试纸卡，NC膜抗体的包被过程为：以0.01M pH7.2磷酸盐缓冲液(PBS)将CRP抗体配制成0.6-2mg/ml的溶液，将抗鼠IgG配制成1-2mg/ml的溶液，用喷膜仪在NC膜上部和下部以1-1.5ul/cm的参数进行分别划线，包被C、T线，划线后将NC膜在干燥间，温度20-25℃，湿度小于30％，干燥2-5小时。

所述试纸卡，胶体金垫制备过程为：以氯金酸-柠檬酸三钠还原法制备直径为30-50nm的胶体金溶液，制备完成后取100ml胶体金液放在烧杯内，用0.2M K₂CO₃调至pH8.0，按100ml胶体金溶液加入0.5-2mg和包被CRP配对的另一株CRP抗体，室温搅拌2小时，加入终浓度为0.5％牛血清白蛋白，0.5％聚乙二醇20000封闭20min，12000r/m离心30分钟，弃上清，用胶体金工作液复溶至50ml，按1ml溶液铺20cm²的比例均匀地铺在玻璃纤维膜或无纺布上，再置干燥间，温度20-25℃，湿度小于30％，干燥2-5小时，制成胶体金垫。

所述试纸卡的装配过程为：在干燥室内，温度20-25℃，湿度小于40％，取塑料底板，将已包被的NC膜放置在塑料底板的中部粘贴，将胶体金垫裁切成合适的宽度，在NC膜T线一侧搭接胶体金垫，搭胶体金垫的1/5粘贴，在胶体金垫另一侧搭接粘贴上样垫，搭胶体金垫的1/3粘贴；在NC膜C线一侧搭接吸样垫，搭吸样垫的1/10粘贴；最后用裁剪机将贴好的塑料板切成3-5mm宽的试纸条，再装入塑料卡内，形成试剂试纸卡。

所述试剂盒，检测方法为：1)将检测试剂及样本平衡至室温，取出试纸卡，平放；2)精确吸取10μl血清、血浆样本，样本为全血时吸取20ul样本，加入洁净的离心管中，再加入500ul样本稀释液(生理盐水或PBS)，充分混匀；3)用移液枪吸取10ul稀释后的样本加入到样本孔中，再立即在下部的缓冲液孔中加入100μL样本稀释液，15-20分钟内用免疫层析结果判读记录仪或比色卡(半)定量判定结果；4)仪器判定时，设置好仪器相关参数后将试纸卡放入仓内进行检测，仪器将显示出样品浓度的定量测定结果；5)用比色卡判定结果时，将试纸卡T线的颜色和比色卡上标准线的颜色深浅进行对比，半定量判定样品的浓度区间。

本实用新型的有益效果是：提供一种利用免疫层析胶体金技术制备的C反应蛋白快速全程定量免疫层析检测试剂盒，定量检测范围宽，包含高敏和普通CRP测定试剂盒的测定区间，同时适合血清、血浆和全血样本，并适合临床上单人份检测。具有操作简便、反应快速、敏感性高、特异性强、适合现场检测和经济实用等优点。

附图说明：

图1是C反应蛋白快速全程定量免疫层析检测试剂盒的试纸卡

附图符号说明：

1：塑料底板；2：上样垫；3：胶体金垫；4：NC膜；

5：检测线T；6：质控线C；7：吸样垫

具体实施方式

实施例：C反应蛋白快速全程定量免疫层析检测试剂盒制备及检测

1主要材料

1.1CRP特异性配对抗体、CRP标准品：芬兰MEDIX限公司产品；鼠抗人IgG抗体：美国Arista公司产品；氯金酸：Sigma公司产品；硝酸纤维素(NC)膜：Millipore公司产品；牛血清白蛋白(BSA)，聚乙二醇PEG20000，水解酪蛋白：Sigma产品。其它常用试剂均为分析纯试剂。

1.2临床样本由公司在相关医院获得，共200份，其中血清样本100份，血浆和全血样本各50份，CRP含量分布区间为0.1-300mg/L之间的定值血清。

1.3免疫层析结果结判读记录仪：型号：NS001，天津中新科炬生物制药有限公司产品。

2方法

2.1CRP抗体胶体金标记氯金酸一柠檬酸三钠还原法制备直径为30-40nm的胶体金溶液，制备完成后取三份胶体金，分别用0.2M K₂CO₃将溶液调到pH7.5、pH8.0和pH8.5。然后将溶液置于磁力搅拌器上缓慢搅拌，按每100ml溶液加入0.5mg、1mg、1.5mg将标记用CRP抗体缓慢滴加到胶体金溶液中，继续搅拌2小时，再加入到终浓度为0.5％的PEG2000和0.5％的BSA进行封闭20min，标记结束后以12000r/m离心，弃上清，沉淀按50％原体积复溶至不同配比的胶体金工作液中(pH8.0，含BSA，羊血清，蔗糖和表面活性剂)。然后将标记胶体金溶液按1ml溶液铺20cm²的比例加样于无纺布上，在温度20-25℃，相对湿度在＜30％的干燥间干燥2-5小时，制成胶体金垫。

2.2NC膜包被用0.01M pH7.2PBS将包被CRP抗体稀释成0.6mg/ml、1mg/ml、1.5mg/ml，鼠抗人IgG分别稀释成1mg/ml、2mg/ml，然后用喷膜仪在NC膜上按1.2ul/cm进行分别划线包被，包被完成后将NC膜在在温度20-25℃，相对湿度在＜30％的干燥间干燥2-5小时。

2.3试纸卡组装在干燥室内，温度20-25℃，湿度小于40％，取塑底板，将已包被的NC膜放置在塑料底板的中部粘贴，将胶体金垫裁切成合适的宽度，在NC膜T线一侧搭接胶体金垫，搭胶体金垫的1/5粘贴，在胶体金垫另一侧搭接粘贴上样垫，搭胶体金垫的1/3粘贴；在NC膜C线一侧搭接吸样垫，搭吸样垫的1/10粘贴；最后用裁剪机将贴好塑料板切成3-5mm宽的试纸条，再装入塑料卡内，形成试纸卡。

2.4试纸工艺参数调试将浓度不同标记、包被的试剂进行组合配对，制备小样，利用CRP标准品对试剂进行测试，寻找最佳组合。

2.5比色卡制备和仪器曲线参数设置确定好试纸工艺参数后，分别用1、3、10、20、50、200mg/L的CRP标准品对试纸进行测定，不同浓度的标准品显示出不同强度色带，将相应强度的色带印刷到比色卡上，完成比色卡制备；将相应强度的色带数字化后输入免疫层析结果判读记录仪中，完成仪器曲线参数设置。

2.6检测方法1)将检测试剂及样本平衡至室温，取出试纸卡，平放；2)精确吸取10μl血清、血浆样本，样本为全血时吸取20ul样本，加入洁净的离心管中，再加入500ul样本稀释液(PBS)，充分混匀；3)用移液枪吸取10ul稀释后的样本加入到样本孔中，再立即在下部的缓冲液孔中加入100μL样本稀释液(PBS)，15-20分钟内用免疫层析结果判读记录仪或比色卡(半)定量判定结果；4)仪器判定时，设置好仪器相关参数后将试纸卡放入仓内进行检测，仪器将显示出样品浓度的定量测定结果；5)用比色卡判定结果时，将试纸卡T线的颜色和比色卡上标准线的颜色深浅进行对比，半定量判定样品的浓度区间。

2.7临床样本检测试剂制备完成后，按检测方法对所有临床样本进行检测，并分析检测结果。

3结果

3.1试纸参数确定根据小样的检测结果，确定了试纸的最佳标记pH值为8.0；CRP抗体最佳标记量为1mg/100ml胶体金溶液；最佳的胶体金工作液为20mM硼酸盐缓冲液，pH8.0，含0.5％BSA、10％羊血清，2％蔗糖，0.2％Tween20；最佳包CRP抗体浓度为1.5mg/ml。检测结果的最佳判定时间为15-20分钟。但以上参数在制备不同批次产品时可能需要适当调整。

3.2临床样本检测对200份临床定值样本检测，用仪器定量判定结果时，在检测范围内的195份样品平均偏差值均小于15％，最大偏差小于20％，R2＞0.97，一致性系数＞0.88。用比色卡判定结果时，区间判定结果和样本值的符合率为95.3％，一致性系数＞0.85。检测结果表明制备的检测试剂盒性能良好，适合用于临床检测，满足不同客户不同检测场合的差异化需要。

Claims

1.一种C反应蛋白快速全程定量免疫层析检测试剂盒，其特征在于试剂盒由试纸卡、比色卡和免疫层析结果判读记录仪构成。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于试纸卡结构为：在塑料底板(1)一端粘贴上样垫(2)，上样垫的一端紧密压接含有标记抗人C反应蛋白(CRP)特异性抗体的胶体金垫(3)，胶体金垫一端紧密压接硝酸纤维素NC膜(4)，NC膜上包被有相互分离的检测线T(5)和质控线C(6)，检测线为和标记抗体配对的CRP抗体，质控线为抗鼠IgG抗体，硝酸纤维素膜的另一端连接吸样垫(7)形成试纸，试纸装入塑料卡内形成试纸卡。

3.根据权利要求1和2所述的试剂盒，其特征在于所述试纸卡的抗体为高敏CRR配对抗体，分别识别CRP识别不同表位，抗体可以为纯化的单克隆抗体或多克隆抗体。

4.根据权利要求1和2所述的试剂盒，其特征在于所述试纸卡的NC膜为孔径8-12微米的多孔样结构膜，上样垫为玻璃纤维膜或无纺布，吸样垫由吸水滤纸构成。

5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述比色卡是白色背景上印有系列不同深浅红色线条的纸板，用于对检测结果的对比判定。不同深浅的红色线条共6条，分别对应1、3、10、20、50、200mg/L的CRP浓度。

6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于免疫层析结果判读记录仪是一种光学检测***，用于对检测结果的定量判定，对CRP的检测范围为0-200mg/L。