KR20140019284A - 항-C-Met 항체 및 이의 이용 방법들 - Google Patents

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한-청 우
루에이-민 루
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아카데미아 시니카
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Abstract

c-Met에 결합하는 항체들 뿐만 아니라, 관련된 조성물들과 이의 사용 방법들을 제시한다. 이용 방법들은 암 치료법들 및 진단법들을 포괄한다. 특정 구체예들에서, 항체들은 포유동물 세포 표면 항원 (가령, 암 세포 표면 항원)에 결합한다. 이 항체들은 세포들에 결합할 때 또한 세포내이입될 수 있다. 이 항체들에 의해 표적화될 수 있는 세포들은 암종, 예컨대 폐, 신장, 간, 위, 유방, 그리고 뇌, 등에 있는 암종을 포함한다.

Description

항-C-Met 항체 및 이의 이용 방법들{ANTI-C-MET ANTIBODIES AND METHODS OF USE THEREOF}
본 발명은 항-C-Met 항체 및 이의 이용 방법들에 관한 것이다.
폐암은 미국에서 남녀의 암관련 사망의 주요 원인이다. 2009년 미국에서 대략 219,000건의 새로운 폐암이 진단되었으며, 이 질환으로 인하여 160,000명이 사망한 것으로 추정되었다. 두 가지 공지된 형태의 폐암이 있다:소 세포 폐암 (SCLC) 및 비-소 세포 폐암 (NSCLC)이며, 폐암의 대략 80%가 비-소 세포 폐암이다. NSCLC 환자의 5년 생존율은 약 16 %이다. 외과적 수술에 의한 절제 및 방사능요법과 병용된 화학요법을 상이한 단계의 NSCLC를 치료하는데 적용하여 왔지만, 예후는 좋지 않으며, 첫 치료 후 재발은 10%에 이를 정도로 높다.
간세포 성장 인자인 c-Met는 수용체 티로신 키나제 (RTKs)의 아족(subfamily)에 속한다. 정상적인 생리에서, HGF/c-Met 경로는 세포 증식, 생존, 운동성, 그리고 상처 치유를 포함하는 다양한 생물학적 기능들에 참여한다(Birchmeier et al ., 2003). 그러나, 유전자 증폭, 돌연변이, 및 과다발현을 포함하는 c-Met의 비정상적 활성화가 혈액학적 악성 및 대부분의 충실성 종양들과 관련된 임상 경우들에서 보고되었다. HGF는 직접적으로 내피 세포 증식 및 이동을 자극하기 때문에, c-Met 활성화는 암 세포 증식, 이동 및 침입을 촉발시키고, 종양 혈관 혈관신생을 촉진시키는 것으로 보고되었다.
게다가, 뇌, 결장직장, 위장(gastric), 폐, 두경부(head and neck) 및 위(stomach) 암 환자에서 과다발현된 c-Met가 빈번하게 관찰되었다. 나쁜 임상 결과들은 상승된 c-Met와 분명하게 관련이 있었고, 이는 c-Met의 과다발현이 이들 암 유형들에서 종양 진행에 대한 부정적 예후 인자임을 암시한다.
c-Met에 결합하는 항체들, 뿐만 아니라 관련된 조성물들 및 이용 방법들을 여기에서 개시한다.
이용 방법들은 암 치료법들 및 진단법들을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 특정 구체예들에서, 본 발명의 항체들은 포유동물 세포 표면 항원 (가령, 암 세포 표면 항원)에 결합한다. 이 항체들은 세포들에 결합할 때 또한 세포내이입될 수 있다.
이 항체들에 의해 표적화될 수 있는 세포들은 폐, 신장, 간, 위, 유방, 및 뇌, 등에 있는 이러한 암종을 포함한다.
도 1. c- Met 단백질에 결합된 파아지 -디스플레이된 scFv 의 선별 및 확인. A, 파아지-디스플레이된 인간 고유의(nave) scFv 라이브러리를 이용하여 c-Met-Fc 단백질에 결합된 파아지들을 선별하였다 (바이오패닝). B, 무작위로 선별된 파아지 클론들은 상이한 결합을 나타내도록 ELISA를 통하여 스크리닝하였다. C, ELISA에 의한 두 가지 상이한 역가들을 가진 c-Met-Fc 단백질에 결합된 선별된 파아지 클론들의 비교. D, 파아지 클론들의 비교성 c-Met 세포성 결합 친화력은 c-Met-과다발현시키는 293T 세포들에서 유동세포분석법(flow cytometry)으로 평가하였다. E, 면역형광 착색에 의한 파아지 클론들의 결합 특이성의 결정. 눈금 막대: 50㎛.
도 2. 항-c- Met scFv 에 의해 c- Met 에 결합된 HGF 의 경쟁. A, 파아지-디스플레이된 항-c-Met scFv PC1, PC20 및 PC21은 ELISA에 의해 H1993 세포들 상에서 발현되는 c-Met에 HGF 결합을 억제하는데 이용하였다. B, 경쟁적 ELISA를 이용하여 항-c-Met scFv S1, S20 및 S21에 의해 c-Met 단백질에 결합된 HGF의 약량-의존적 억제. C, 인간 c-Met 단백질의 도메인의 도식적 설명. 인간 IgG1의 Fc 도메인은 c-Met932 및 c-Met567의 카르복실 말단에 융합시켰다. D, ELISA를 이용한 항-c-Met scFvs의 에피토프들의 확인. E, 암 세포들 안에서 HGF로 항-c-Met scFv의 길항 효과의 결정.
도 3. 공촛점 현미경을 이용하여 항-c- Met scFv 내재화( internalization )의 분석. A, H1993 세포들은 4℃ (a 및 b) 또는 37℃(c 및 d)에서 30 분간 항-c-Met scFv S1 및 S20과 함께 별도로 항온처리하였다. 저출력 확대(low-power magnification) 하에서 내재화된 S20은 대부분의 세포들에서 관찰되었다(e). 화살표는 세포들내에서 세포내이입된 scFv를 표시한다. B, S20의 세포들안으로의 내재화는 c-Met-유도된 엔도시토시스(endocytosis)를 통하여 일어났다. c-Met 야생형 (a) 및 녹다운(knockdown) H460 세포들 (MET-KD) (c)은 S20과 함께 37℃에서 30분간 항온처리하였다. 고차 확대 필드에서 세포들로 내재화된 많은 S20이 나타났다(b).
도 4. Ms20 은 인간 폐암 세포주로 리포좀성 독소루비신( Doxorubicin ) 결합 및 내재화를 강화시켰다. A, 폐암 세포주에서 Ms20-LD 및 LD의 내재화 연구, 이들 세포는 37℃에서 4시간 동안 약물과 함께 항온처리하였다. B, 암 세포 표면 상에서 c-Met의 발현 수준은 Ms20-QD를 이용한 유동세포분석법 분석을 통하여 측정하였다. C, 리포좀성 약물에 H1993의 결합. D, 리포좀성 약물 흡입(uptake)의 동역학. E, 표시된 기간 동안 37℃에서 항온처리 후, 공촛점 현미경으로 본 H1993 세포들에 의한 Ms20-LD 및 LD의 흡입. 독소루비신은 Ms20-LD와 함께 2시간 항온처리시 세포질 및 핵질에 분포되었다. Ms20-LD와 함께 항온처리 8시간 후, 독소루비신은 주로 핵 안에 축적되었다. 독소루비신은 LD로 처리한 세포들에서 매우 약하게 탐지할 수 있었다. 하부 패널들은 세포 막(녹색, 허위-색깔)에 병합된 독소루비신 신호(적색)의 영상과 핵 (blue) 착색(청색)의 영상을 보여준다. 눈금 막대, 50μm.
도 5. Ms20 -유도된 리포좀들은 독소루비신-유도된 세포독성 효과를 강화시켰다. A, 다양한 농도의 Ms20-LD 및 LD로 처리된 인간 폐암 세포주의 시험관내(in vitro) 세포독성 분석. B, LD에 비교하여 Ms20-LD의 세포독성에서 강화를 분명하게 하기 위하여, IC50 비율들을 계산하였다. C, 2.5 μg/ml의 Ms20-LD 및 LD로 차례로 0, 24, 48 및 72 시간 동안 처리 후 H1993 세포들의 웨스턴 블랏 분석.
도 6. 인간 폐암 이종이식편(xenograft)에서 항-c- Met scFv 의 종양- 귀소 ( homing ) 능력의 확인. A, 인간 폐암 H460 이종이식편들을 가지고 있는 SCID 마우스에게 PC20 및 대조군 파아지들 (Con-P)을 각각 정맥으로 주사하였다. B, 귀소(homing) 분석에서 면역조직화학적 착색에 의한 PC20의 국소화(localization)의 검사. C, H1993 인간 폐 종양을 가진 SCID 마우스에게 400 pmole의 Ms20-QD (quantum dots) (우측) 또는 QD (좌측)의 정맥 주사후 생체내 영상. NIR 형광 영상들은 주사후 6시간에 수득하였다(상부 패널). 적색 원은 종양 위치들을 표시한다. 종양 영역의 신호 강도는 IVIS 소프트웨어 (하부 패널)로 정량화하였다. D, Ms20-QD 및 QD의 조직 분포는 주사 후 24시간에 측정하였다. 이 마우스들을 희생시키고, 잘라낸 장기들의 NIR 영상들을 획득하였다(상부 패널). 종양 및 장기들의 신호 강도는 IVIS 소프트웨어 (하부 패널)로 측정하였다.
도 7. 인간 폐암 이종이식편들에서 Ms20 - LD 의 치료 효과. A, Ms20-LD, LD, 또는 PBS가 투여된 H460-유도된 폐암을 보유하는 마우스의 종양 용적. B, 각 집단의 체중. C, 치료 종료시 종양 무게. D, C에서 나타낸 분석의 대표적인 영상. E, 종양 조직에서 종양 혈관들의 조사. F, TUNEL 분석을 이용한 종양 영역에서 아폽토시스성(apoptotic) 세포들의 분석. 에러 바(Error bar), SE.*, P < 0.05.
도 8. 가용성 c- Met 932 - Fc 단백질 및 항-c- Met scFv 의 정제. A, 코마시(Comassie) 블루 착색 (좌측 패널) 및 항-c-Met 다클론성 항체를 이용한 웨스턴 블랏 분석 (우측 패널). 레인 1, 총 배양 배지, 레인 2, 단백질 G 컬럼-관통 유동, 및 레인 3, 정제된 가용성 c-Met932-Fc 단백질. B, 가용성 항-c-Met scFvs는 파아지-감염된 대장균(E- coli) HB2151의 주변세포질(periplasmic) 추출물로부터 정제되었다. 웨스턴 블랏(Western blot) 분석에서 가용성 scFvs는 항-E 태그 항체 (하부 패널)에 의해 인지됨을 보여주었다.
도 9. 다양한 인간 암 세포주 및 맥관 내피 세포들 ( HUVECs )에 항-c- Met scFvs 결합의 조사. A, 다양한 인간 암 세포주에 대한 항-c-Met scFv S1 또는 S2의 ELISA 결과들. B, 유동세포분석법에 의해 분석된 HUVECs에 항-c-Met scFvs의 결합.
도 10. 인간 폐암 세포들 상에서 내생성 c- Met 에 특이적으로 결합된 항-c-Met scFvs. A, 웨스턴 블랏 분석에서 렌티바이러스(Lentivirus)로 감염에 의해 H460 세포들 (MET-KD H460 세포들)에서 c-Met의 하향-조절은 c-Met shRNA를 발현시켰다는 것을 보여주었다. B, c-Met 야생형 및 녹다운 H460 세포들에 항-c-Met scFvs 결합의 FACS 분석.
도 11. Ms20 - 콘쥬게이트된 리포좀성 독소루비신 ( Ms20 - LD )의 합성. A, 카르복실 말단에서 Flag 태그, 헥사히스티딘, 그리고 시스테인 잔기를 포함하는 scFv 단백질(Ms20)을 발현시키기 위하여 원핵성 벡터 pFHC-S20의 작제의 도식적 설명. B, Ni+ NTA 세파로즈 및 단백질 A 아가로즈 크로마토그래피를 이용하여 정제된 Ms20의 SDS-PAGE 분석 및 코마시 블루 착색. PPE는 주변세포질 추출물을 나타내고; FL은 관통 유동을 나타낸다. C, 도식 모델은 환원된 Ms20과 말레이미드-PEG-DSPE-병합된 LD와의 콘쥬게이트 과정을 보여준다. D, 세파로즈 4B 겔 여과에 의해 정제한 후, Ms20-콘쥬게이트된 LD의 SDS-PAGE 분석 및 질산은 착색. 레인 3-8: 말레이미드-PEG-DSPE에 콘쥬게이트시킨 후 Ms20 (상부 밴드).
도 12. Ms20 - QD 를 이용한 FACS 분석에 의한 인간 폐암 세포주에서 c- Met 발현의 확인. A, 인간 폐암 세포주는 10 μM Ms20-QD 와 QD와 함께 4℃에서 1시간 동안 항온처리시켰다. FACS 분석을 실시하여 결합 활성을 평가하였다. B, H1993 세포들은 50 nM Ms20-QD와 함께 37에서 30분 동안 항온처리하였다. H1993 세포들에 의한 Ms20-QD의 결합 및 흡입은 공촛점 현미경을 이용하여 검사하였다. 눈금 막대, 50 μm.
정의
다음의 설명에서, 세포 배양 분야에서 통상적으로 이용되는 다수의 용어들을 광범위하게 이용한다. 명세서 및 청구 범위, 그리고 이러한 용어들에 의해 제시되는 범위를 명확하고, 일관된 이해를 돕기 하기 위하여, 다음의 정의들을 제시한다.
여기에서 이용된 것과 같이, "c-Met"는 간세포 성장 인자 (HGF)에 결합할 수 있고, "간세포 성장 인자 수용체" (HGFR) 또는 met 프로토-종양유전자로도 또한 불릴 수 있는, 수용체 티로신 키나제의 구성요소를 지칭한다. 이 용어 "c-Met"는 c-Met 단백질의 임의의 자연적으로-생성되는 아이소형(isoform)을 지칭한다. c-Met의 아미노산 서열들은 공지되어 있으며, 그리고 GenBank Accession Nos. NP_000236.2 및 NP_001120972.1로 찾을 수 있다.
이 용어들 "폴리펩티드", "펩티드", 또는 "단백질"은 여기에서 호환되며, 인접 잔기들의 알파-아미노기와 카르복시 기 사이에 펩티드 결합들에 의해 서로 연결된 일련의 연속된 아미노산 잔기들을 나타낸다. 게다가, 20개의 "표준" 유전학적으로 인코딩이능한 아미노산들에 추가하여 아미노산들은 아미노산 유사체들을 포함한다.
"항체"는 개별적으로 항원-결합 단백질을 포함하는 조성물들, 또는 면역글로블린 유전자들, 또는 면역글로블린 유전자들의 단편들에 의해 유전적으로 인코딩이능한 하나 이상의 폴리펩티드들을 보유하는 다수의 항원-결합 단백질을 포함하는 조제물, 또는 관심 항원에 결합하는 파아지 디스플레이 라이브러리로부터 수득된 또는 유도된 CDRs을 포함하는 조성물들을 포괄한다. 경쇄들은 카파 또는 람다로 분류된다. 중쇄들은 감마, 뮤(mu), 알파, 델타, 또는 입실론으로 분류될 수 있고, 이는 다시 차례로 면역글로블린 분류, IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE으로 정의된다.
항체의 예로 폴리펩티드 쇄들의 두 쌍으로 구성된 사량체의 구조 단위를 가지며, 각 쌍은 하나의 경쇄 및 하나의 중쇄를 가지는 것이다. 각 쇄의 N-말단 부분은 항원 결합을 중개하는 가변 영역으로 특정된다. 이 용어들 가변 경쇄 (VL) 및 가변 중쇄 (VH)는 경쇄들 및 중쇄들을 차례로 지칭한다.
"항체"는 단일 폴리펩티드로 함께 연결된 중쇄 및 경쇄를 포함하는 단일-쇄 항체들을 또한 포괄한다.
상기에서 명시한 바와 같이, "항체"는 온전한 그대로의(intact) 면역글로블린들 뿐만 아니라 항체들의 항원-결합 단편들을 포괄한다. 따라서, 이 용어 항체는 여기에서 이용된 것과 같이, 항체의 항원-결합 부분을 또한 포함하며, 이는 전체 항체들의 변형에 의해 만들어지거나 또는 재조합 DNA 기술들을 이용하여 새로이 합성될 수 있다. 예로는 Fab, Fab'2, 또는 scFv를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
단일 쇄 Fv "(scFv)" 폴리펩티드는 직접 결합되거나 또는 펩티드-인코딩 링커에 의해 연결된 VH- 및 VL- 인코딩 서열들을 포함하는 공유적으로 링크된 VH::VL 이종이량체이며, 이는 핵산으로부터 발현될 수 있다. 항체 V 영역으로부터 경쇄 및 중쇄 폴리펩티드를 scFv 분자로 전환시키는데 이용가능한 다수의 구조가 있으며, 이는 항원-결합 부위의 구조와 실질적으로 유사한 3차원 구조로 폴드될 것이다. 다이아바디(diabodies)에 추가하여, scFvs는 또한 트리바디(tribodies) 또는 테트라바디(tetrabodies)로 제시될 수도 있다.
비록 다양한 항체 단편들은 온전한 그대로의 항체의 절단(digestion)에 의해 특정되지만, 당분야 기술자는 이러한 단편들은 화학적으로 새로 합성될 수 있거나 또는 재조합 DNA 방법을 이용하여 합성될 수 있다는 것을 인지할 것이다.
이 용어 "항체"는 다클론성 및 단클론성 항체들을 포괄하고, 임의의 분류의 항체들(가령, IgM, IgG, 및 이의 하위부류들)을 더 포괄한다. "항체"는 하이브리드 항체들, 이형항체들, 키메라 항체들, 인간화된(humanized) 항체들, 그리고 항원 결합을 유지하는 기능적 단편들을 또한 포괄한다. 이 항체들은 다른 모이어티들에 콘쥬게이트될 수 있거나, 및/또는 폴리스티렌 플레이트 또는 비드, 테스트 스트립, 그리고 이와 유사한 것과 같은 지지물(가령, 고형 지지물)에 결합될 수 있다.
면역글로블린 경쇄 또는 중쇄 가변 영역은 상보성 결정 영역 또는 CDRs이라고도 불리는 세 가지 초가변 영역들에 의해 차단된 "기본골격(framework)" 영역(FR)으로 구성된다. 기본골격 영역 및 CDRs의 범위는 당업계에 공지되어 있는 데이터베이스에 근거하여 정의할 수 있다. 예를 들면, V Base at www.vbase2.org. 상이한 경쇄 또는 중쇄들의 기본골격 영역들의 서열들은 종내에서 상대적으로 보존된다. 항체의 기본골격 영역, 즉 구성 경쇄 및 중쇄들의 복합된 기본골격 영역들은 CDRs을 위치잡고, 할당하는 역할을 한다. CDRs은 주로 항원의 에피토프에 결합을 담당한다. 본 명세서에 의해 제공되는 모든 CDRs 및 기본골격은 다른 언급이 없는 한 V Base에 따라 특정된다.
"항-c-Met 항체"는 c-Met에 특이적으로 결합하는, 바람직하게는 고친화력으로 결합하는 항체를 지칭한다. c-Met에 특이적 항체는 c-Met의 결합과 관련하여 c-Met에 무관한 기타 항원들에 대해 필적하는 결합을 나타내지 않는다.
항체와 관련하여 사용된 용어 "고친화력"은 10-6 M 미만 또는 이와 대등한, 10-7 M 미만, 10-8 M 미만의 친화력(KD)으로 이의 표적에 특이적으로 결합하는(인지하는) 항체를 말한다. 더 낮은 KD 값은 더 높은 결합 친화력 (가령, 더 강한 결합)에 상응하여, 10-7의 KD 값은 10- 6 의 KD 값보다 더 높은 결합 친화력을 나타낸다.
"항원-결합 부위" 또는 "결합 부분"은 면역반응성 항원 결합에 참여하는 항체 분자(가령, 면역글로블린 분자의 단편 또는 scFv)의 일부를 지칭한다. 항원 결합 부위는 중쇄 (H) 및/또는 경쇄 (L) 들의 N-말단 가변(V) 영역들의 아미노산 잔기들에 의해 형성된다. 중쇄 및 경쇄들의 V 영역내 3가지 매우 다양한 스트레취(stretches)는 "초가변 영역"이라고 하는데, 이는 "기본골격 영역들" 또는 "FRs"로 공지된 더 보존된 측면 스트레취 사이에 끼어있다. 따라서, 이 용어 "FR"은 면역글로블린들에서 초가변 영역들 사이에 그리고 초가변 영역들에 인접하여 자연적으로 발견되는 아미노산 서열들을 말한다. 사량체(tetrameric) 항체 분자에서, 경쇄의 3가지 초가변 영역들과 중쇄의 3가지 초가변 영역들은 3차원 공간에서 항원 결합 표면을 형성하기 위하여 서로 배치된다. 이 표면은 표적 항원의 인지 및 결합을 중재한다. 각 중쇄 및/또는 경쇄의 3 가지 초가변 영역들은 상보성 결정 영역들 또는 CDRs라고 한다.
"에피토프"는 항체가 결합하는 항원 상의 부위(가령, c-Met Sema 또는 PSI 도메인 상의 부위)이다. 에피토프들은 단백질의 폴딩(가령, 3차원 폴딩)에 의해 병치되는 인접 아미노산들 또는 비인접 아미노산들 모두로부터 형성될 수 있다.
"S21 항체" 또는 "클론 21로부터 항체"는 클론 S21 또는 클론 21에 의해 발현되는 항체 또는 다른 방식으로 합성되지만 동일한 CDRs를 보유하고, 임의선택적으로 클론 S21에 의해 발현되는 항체와 동일한 기본골격 영역들을 보유하는 항체를 지칭한다. 유사하게, 항체들 S1 (클론 1) 및 S20 (클론 20), 그리고 이와 유사한 것은 대응하는 클론(들)에 의해 발현되는 항체들 및/또는 다른 방식으로 합성되지만 동일한 CDRs를 보유하고, 임의선택적으로 언급된 항체들과 동일한 기본골격 영역들을 보유하는 항체를 지칭한다. 이들 항체들의 CDRs은 하기 표 1에 나타낸다.
이 용어들 "피험자", "개체" 그리고 "환자"는 호환되며, 치료를 평가하는 및/또는 치료되는 포유류를 지칭한다. 한 구체예에서, 이 포유류는 인간이다. 이 용어들 "피험자", "개체" 그리고 "환자"는 따라서 암 (가령, 폐암, 난소 또는 전립선의 선암, 유방 암종, 등)을 가진 개체들을 포괄한다. 피험자들은 인간일 수 있지만, 다른 포유류들, 구체적으로 인간 질환의 실험실 모델들로 유용한 포유류들, 가령 마우스, 쥐, 등을 또한 포함한다.
여기에서 이용된 것과 같이, 이 용어들 "치료(treatment)", "치료하는(treating)" 그리고 이와 유사한 것은 효과를 얻기 위한 목적으로 과정(가령, 방사능, 외과적 수술에 의한 과정, 등)을 물질의 투여, 또는 실행하는 것을 말한다. 이 효과는 질환 또는 이의 증상들을 완전하게 또는 부분적으로 예방하는 것으로 예방적인 효과일 수 있거나 및/또는 질환 및/또는 이 질환의 증상들을 부분적으로 또는 완전하게 치료하는 효과로, 치료적인 것일 수 있다. 여기에서 이용된 것과 같이, 치료는 포유류, 구체적으로 인간에게서 임의의 증식성 성장의 임의의 처리를 포괄하며, 그리고 다음을 포함한다: (a) 이 질환에 걸리기 쉬운 경향은 있지만, 아직 이 질환이 있는 것으로 진단받지 않은 피험자에서 발생하는 질환 또는 질환의 증상을 예방(가령, 1차 질환과 연관된 또는 1차 질환으로 인한 질환들을 포함); (b) 이 질환을 억제, 가령, 이 질환의 발달을 억류; 및 (c) 이 질환을 완화, 가령, 질환의 회복을 야기시키는 것. 종양 (가령, 암) 치료에서, 치료 물질은 종양 세포들의 전이를 직접적으로 감소시킬 수 있다.
이 용어 "세포 배양" 또는 "배양"은 인위적인, 시험관내(in vitro) 환경에서 세포들을 유지시키는 것을 의미한다. 그러나, 이 용어 "세포 배양"은 포괄적인 용어이며, 개체 세포들의 양성(cultivation) 뿐만 아니라 조직들 또는 장기들의 양성을 포괄하는데 이용될 수 있다는 것을 인지해야 한다.
여기에서 이용된 것과 같이, 이 용어 "종양"은 악성 또는 양성이건 간에 그리고 모든 전암(pre-cancerous) 및 암 세포들, 그리고 조직들의 모든 신형성 세포 성장을 지칭한다.
이 용어들 "암", "신생물(neoplasm)" 및 "종양"은 호환되며, 그리고 자율적인, 조절불가능한 성장을 나타내어, 세포 증식에 대해 유의적인 조절을 상실한 것을 특징으로 하는 비정상적인 성장 표현형을 나타내는 세포들을 지칭한다. 일반적으로, 본 출원에서 탐지, 분석, 분류 또는 치료에 관심 세포들은 전암성 (가령, 양성), 악성, 전-전이성(pre-metastatic), 전이성, 그리고 비-전이성 세포들을 포함한다. 암의 예로는 폐암, 신장 암 (가령, 신장부 암), 위 암, 유방 암, 뇌 암, 폐암, 전립선 암, 간세포성 암, 췌장 암, 경부 암, 난소 암, 간 암, 방광 암, 요로의 암, 갑상선 암, 암종, 흑색종, 두경부 암, 그리고 결장 암을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
이 암의 성질에 따라, 적절한 환자 시료를 수득한다. 여기에서 이용된 것과 같이, 구절 "암 조직 시료"는 암 종양으로부터 수득할 수 있는 임의의 세포들을 지칭한다. 고형 종양들의 경우에, 외과적 수술에 의해 제거된 종양으로부터 전형적으로 조직 시료를 수득할 것이고, 통상적인 기술에 의해 테스트용으로 준비할 수 있다. 대안으로, 체액 시료, 예컨대 림프, 혈액 또는 혈청 시료, 또는 삼출물 유체 시료 예컨대, 암이 있는 장기 삼출물 (가령, 유방으로부터 삼출물)을 수집할 수 있고 분석할 시료로 이용할 수 있다. 백혈병의 경우, 림프세포들 또는 백혈병 세포들을 수득할 것이며, 적절하게 준비할 것이다. 유사하게, 임의의 전이된 암의 경우, 체액 예컨대, 림프성 유체, 혈액, 혈청, 또는 말단으로 감염된 장기 또는 이의 삼출물로부터 세포들을 빼낼 수 있다.
암의 "병리(pathology)"는 환자의 안녕(well-being)을 포함하는 모든 현상을 포함한다. 여기에는 비정상적 또는 조절불가능한 세포 성장, 전이, 이웃 세포들의 정상적인 기능의 간섭, 사이토킨들 또는 다른 분비성 산물들을 비정상적 수준으로 방출, 염증성 또는 면역학적 반응의 억제 또는 악화, 신조직형성, 전-악성(premalignancy), 악성, 주변 또는 멀리있는 조직들 또는 장기들, 예컨대 림프절, 등의 침입을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
여기에서 이용된 용어 "진단(diagnosis)"은 분자 또는 병리학적 상태, 질환 또는 이상의 확인, 예컨대 유방 암, 전립선 암, 또는 다른 유형의 암의 분자 아형(subtype)의 확인을 지칭한다.
여기에서 이용된 용어 "예후(prognosis)"는 신생물형성 질환, 예컨대 폐, 결장, 피부 또는 식도 암의 암-기인성 사망 또는 재발, 전이성 퍼짐을 포함하는 진행, 그리고 약물 저항성의 가능성을 예측하는 것을 지칭한다. 이 용어 "예상(prediction)"은 관찰, 경험 또는 과학적 원인에 근거하여 예시 또는 예측하는 행동을 지칭하는 것으로 여기에서 이용된다. 한 실시예에서, 의사는 외과적 수술에 의한 1차 종양의 제거후 및/또는 암 재발없이 특정 기간동안 화학요법후 환자가 생존할 가능성을 예측할 수 있다.
여기에서 이용된 것과 같이, 이 용어 "상관관계에 있다" 또는 "~와 상관관계있다" 및 이와 유사한 용어들은 두 사건 사이에 통계학적 연관성을 말하는데, 이때 사건들은 숫자, 데이터, 그리고 이와 유사한 것들을 포함한다. 예를 들면, 사건들이 숫자와 관련될 경우, 양성적 관계(직접 상관관계라고도 지칭함)는 하나가 증가될 때 다른 것 또한 증가한다는 것을 의미한다. 음성적 관계(역 관계라고도 함)는 하나가 증가될 때, 다른 것은 감소한다는 것을 의미한다.
이 용어 "단리된(isolated)"은 한 화합물에 자연적으로 수반되는 성분들 또는 또는 일부로부터 이 화합물을 분리시킨다는 것을 의미한다. 단리된은 제조과정 동안 (가령, 화학적 합성, 재조합 발현, 배양 배지, 그리고 이와 유사한 것) 한 화합물(가령, 단백질)과 수반되는 모든 성분들 또는 일부로부터 분리된 이 화합물의 상태를 또한 지칭한다.
"생물학적 시료"는 개체로부터 수득한 다양한 시료 유형을 포괄한다. 이 정의는 혈액 및 생물학적 기원의 기타 액상형 시료들, 고형 조직 시료들, 예컨대 생검 견본 또는 조직 배양 또는 이로부터 유도된 세포들 및 이의 후손들을 포괄한다. 이 정의는 또한 이들을 획득한 후, 임의의 방식으로 예컨대 시약들로 처리; 세척; 또는 특정 세포 집단들, 예컨대 암 세포들에 대해 농축(enrichment)에 의해 조작된 시료들을 포함한다. 이 정의는 또한 특정 유형의 분자들, 가령, 핵산, 폴리펩티드들, 등에 대해 농축시킨 시료들을 포함한다. 이 용어 "생물학적 시료"는 임상 시료를 포괄하며, 그리고 외과적 수술에 의한 절제로부터 수득된 조직, 생검에 의해 수득된 조직, 배양물내 세포들, 세포 상청액들, 세포 용해물들, 조직 시료들, 장기들, 골수, 혈액, 혈장, 혈청, 그리고 이와 유사한 것을 또한 포함한다. 생물학적 시료는 환자의 암 세포로부터 수득한 시료, 가령, 환자의 암세포로부터 수득된 폴리뉴클레오티드들 및/또는 폴리펩티드들을 포함하는 시료(가령, 폴리뉴클레오티드들 및/또는 폴리펩티드들을 포함하는 세포 용해물들 또는 다른 세포 추출물); 및 환자의 암 세포들을 포함하는 시료들을 포함한다. 환자의 암 세포를 포함하는 생물학적 시료는 비-암 세포들을 또한 포함할 수 있다.
특정 구체예들의 설명
c-Met에 특이적으로 결합하는 항체들, 뿐만 아니라 관련된 관련된 조성물들 및 이용 방법들을 여기에서 설명한다. 이용 방법들은 암 치료법들 및 진단법들을 포괄한다.
이 항체들은 클론 1, 20, 또는 21로부터 이 항체의 VH의 CDR중 최소한 하나 또는 둘 또는 세 가지 모두를 포함한다. 이 항체들은 클론 1, 20, 또는 21로부터 이 항체의 VL의 CDR중 최소한 하나 또는 둘 또는 세 가지 모두를 포함한다. 각 VH 또는 VL CDR은 독립적으로 선별될 수 있다. 대안으로, 이 항체들은 클론 1, 20, 또는 21의 항체들과 c-Met에 결합(가령, 이와 동일한 에피토프에 결합하기 위하여)을 위하여 경쟁한다.
본 명세서의 항체는 또한 클론 1, 20, 또는 21의 항체의 모든 VH CDRs 및/또는 VL CDRs을 포함할 수 있다. 이 항체들은 클론 1, 20, 또는 21의 항체의 전장(full-length)의 VH 쇄들을 포함할 수 있다. 이 항체들은 클론 1, 20, 또는 21의 항체의 전장의 VL 쇄들을 포함할 수 있다.
이 항체는 단일 쇄 Fv (scFv), Fab, (Fab')2, (ScFv)2, 그리고 이와 유사한 것일 수 있다. 이 항체는 IgG (가령, IgG2) 또는 임의의 다른 아이소타입(isotype)이거나, 또는 이중특이적 항체일 수 있다.
이 항체들은 예컨대, 항-암 약물, 표지, 혈청 반감기, 엔도시토시스, 등을 개선시키는 모이어티 (가령 PEG)에 콘쥬게이트시킬 수 있다. 이 항체는 제약학적으로 수용가능한 부형제 (가령, 단위 투약량 제형내에) 내에 또한 존재할 수 있다. 본 명세서는 여기에서 설명되는 항체들로부터 선별된 하나 이상의 상이한 항체들 및/또는 이들 항체들로부터 하나 이상의 CDRs을 포함하는 항체들, 및/또는 이들 항체들의 돌연변이체 또는 유도체들을 포함하는 하나 이상의 항체들을 함유하는 조성물들을 또한 제시한다. 이 조성물은 하나 이상의 항체들, 예컨대 클론 1, 20, 또는 21을 함유할 수 있다.
본 명세서의 방법들은 여기에서 설명된 하나 이상의 대상 항체들을 대상 항체들에 의해 결합된 항원을 발현시키는 암을 가진 피험자를 치료하는데 효과량으로 투여하기 위하여 제공되는 것들을 포함한다. 본 명세서에 의해 제시되는 이 항체들은 암의 진단/예후용으로 또한 이용할 수 있다.
여기에서 제시되는 핵산은 여기에서 설명된 하나 이상의 항체들을 인코딩한다. 이러한 핵산을 함유하는 숙주 세포들을 또한 여기에서 제시하며, 뿐만 아니라 대상 항체들을 생산하는 (가령 분비에 의해) 것들도 제시한다. 대상 항체들을 함유하는 조성물들을 제조하기 위한 키트 또는 대상 방법을 실시하기 위한 키트 또한 제시된다.
항체들
바람직한 항체들은 암 세포들의 세포 표면 상에 노출된 막 수용체인 c-Met에의해 고친화력을 가진다. 암 세포들은 예를 들면, 폐암 세포들 (가령 H1993 또는 H441) 그리고 다른 것들로부터 유도된 것들을 포함한다. 대상 항체들은 항원, 가령, 살아있는 포유동물 세포의 표면상에 있는 항원에 결합시 세포 안으로 내재화되는 가령 엔도시토시스, 예컨대 수용체-유도된 엔도시토시스에 의해 항체들을 포함한다.
이 대상 항체들은 c-Met의 에피토프에 결합하는 것을 클론 1, 20, 또는 21의 항체들과 경쟁하는 것들을 포함한다. 또다른 항체와 동일한 에피토프를 인지하는 특정 항체의 능력은 이 항원에 제 2 항체의 결합을 경합적으로 억제하는 이 항체의 능력으로 결정할 수 있다 (가령, 경쟁적 결합 분석들에 의해 결정됨). 클론 1, 20, 또는 21의 항체들과 동일한 에피토프에 결합하는 대상 항체들을 또한 여기에서 고려한다.
임의의 다수의 경쟁적 결합 분석을 이용하여 동일한 항원에 대한 두 개 항체들의 경쟁을 측정할 수 있다. 예를 들면, 이 목적으로 샌드위치 ELISA 분석을 이용할 수 있다. 교차-반응성을 분석하는 수단들은 당업계에 숙련자들에게 잘 공지되어 있다. (가령, Dowbenko et al . (1988) J. Virol . 62: 4703-4711 참고).
경쟁적 결합을 평가하는데 이용되는 임의의 분석을 이용하여 제 1 항체 존재하에서 이 항원에 대한 제 2 항체의 결합을 최소한 30%, 보통 최소한 약 40%, 50%, 60% 또는 75%, 그리고 가끔 최소한 약 90% 감소시킨다면, 항체는 제 2 항체의 결합을 경쟁적으로 억제하는 것으로 간주된다,
이는 고형 지지물에 부착된 (가령 표면 플라스몬 공명을 이용하여) 하나 이상의 단리된 표적 항원 (가령 전장 c-Met 또는 이의 단편)을 제공하고, 표적에 결합하는 항체의 능력 또는 표적에 결합을 위하여 여기에서 설명되는 항체와 경쟁하는 항체의 능력을 분석함으로써 확인할 수 있다.
항-c-Met 항체들 (가령 클론 1 및 20)에 의해 결합되는 에피토프는 c-Met 리간드 (가령 간세포 성장 인자)용 결합 부위에 있다. 간세포 성장 인자의 결합 부위는 c-Met의 인접 아미노산 서열내 대략 잔기 위치 25-567에 있다. 이 에피토프는 SEMA 및 PSI 도메인들 내 이의 위치에 의해 또한 설명될 수 있다.
대안으로, 항-c-Met 항체들 (가령 클론 21)에 의해 결합된 에피토프는 c-Met의 인접 아미노산 서열 내 대략 잔기 위치 567 내지 대략 위치 932에 있다. 이 에피토프는 c-Met의 IgG-유사 도메인내 이의 위치에 의해 또한 설명될 수 있다.
사익에서 시용된 c-Met의 잔기 위치 숫자들은 GenBank Accession No. NP_000236.2 또는 UniProt Accession No. P08581에서 제시하는 서열들에 근거한다.
c-Met와 유사한 에피토프들을 공유하는 항원들은 또한 대상 항체들의 결합 표적들일 수도 있다. c-Met에 결합될 때, 대상 항체는 c-Met 단백질을 발현시키는 세포에 의해 내재화될 수 있다.
항-c-Met 항체들이 친화력을 나타내는 에피토프들은 세포-표면 노출되어 있고, 많은 암 세포들, 구체적으로 세포들의 혈장 막에 용매-접근가능하다. 이 에피토프들은 세포들이 살아있을 때, 대상 항체들에게 접근가능할 수 있다. 예를 들면, 이 에피토프들은 폐, 신장, 간, 위, 유방, 및 뇌, 등으로부터 유도된 암 세포들 상에 존재할 수 있다. 항-c-Met 항체들이 친화력을 나타내는 암 세포들은 c-Met-발현하는 암 세포를 함유하는 임의의 암일 수 있다.
상기에서 명시한 바와 같이, 대상 항체들은 클론 1, 20, 또는 21으로부터 하나 이상의 항체들과 경쟁하는 것들을 포괄한다. 게다가, 이 항체들은 c-Met와 약 1 x 10-6 M의 KD를 보유하는 항체와 필적하는 또는 이 이상의 결합 친화력을 보유할 수 있다. 본 명에서의 항체들의 KD 는 약 1×10-6 M 내지 약 1×10-7 M, 약 1×10-7 M 내지 약 1×10-8, 약 1×10-8 M 내지 약 1×10-9 M 범위일 수 있다. 예를 들면, 본 명에서의 항체들의 KD 는 약 5×10-9 M 내지 약 2×10-8 M 사이 일 수 있다.
대상 항체들의 예로는 동일한 결합 특이성을 보유하고, 각각 독립적으로 하기 표 1에 나타낸 항체들의 VH CDR (가령 클론 21의 VH CDR1)의 아미노산 서열과 최소한 약 80%, 최소한 약 87%, 최소한 약 93%, 최소한 약 94%, 또는 최대 100% 아미노산 서열 동일성을 공유하는, 최소한 2개의 CDRs을 포함하는 것들을 포괄한다. 이 대상 항체는 또한 표 1에 나타낸 각 항체의 임의의 VH CDRs로부터 세가지 CDR 모두를 포함할 수 있고, 대상 항체의 각 VH CDR은 표 1에 나타낸 단일 항체로부터 선택되며, 그리고 각 VH CDR은 독립적으로 표 1에 나타낸 항체들의 VH CDR의 아미노산 서열과 최소한 약 80%, 최소한 약 87%, 최소한 약 93%, 최소한 약 94%, 또는 최대 100% 아미노산 서열 동일성을 공유한다. 예를 들면, 대상 항체의 중쇄는 클론 21의 2개 VH CDRs 또는 3개 VH CDRs 모두를 함유할 수 있다. 대안으로, 이 중쇄는 클론 21의 2개 VH CDRs 또는 3개 VH CDRs 모두를 함유할 수 있다.
경쇄의 경우, 유사하게 대상 항체는 동일한 결합 특이성을 보유하고, 각각 독립적으로 하기 표 1에 나타낸 항체들의 VL CDR (가령 VL CDR1 of 클론 21)의 아미노산 서열과 최소한 약 80%, 최소한 약 87%, 최소한 약 93%, 최소한 약 94%, 또는 최대 100% 아미노산 서열 동일성을 공유하는 최소한 2개의 CDRs을 포함하는 것들을 포괄한다. 이 대상 항체는 또한 표 1에 나타낸 임의의 항체의 세 가지 VL CDRs 모두를 포함할 수 있고, 대상 항체의 각 VL CDR은 표 1에 나타낸 항체들의 VL CDR의 아미노산 서열과 최소한 약 80%, 최소한 약 87%, 최소한 약 93%, 최소한 약 94%, 또는 최대 100% 아미노산 서열 동일성을 공유한다. 예를 들면, 대상 항체의 경쇄는 클론 21의 2개 VL CDRs 또는 3개 VL CDRs 모두를 함유할 수 있다. 대안으로, 이 경쇄는 클론 21의 2개 VL CDRs 또는 3개 VL CDRs 모두를 함유할 수 있다.
임의선택적으로, 항체들은 표 1에서 제공되는 중쇄 또는 경쇄에서 임의의 대응하는 기본골격 서열과 동일한(가령, 100% 동일성), 유사한 또는 상이한 기본골격 서열들(FR)을 함유할 수 있다. 기본골격 서열들이 유사한 경우, 이 기본골격은 하기 표 1에 나타낸 임의의 항체들에서 대응하는 기본골격 서열들에 대해 최소한 약 85%, 최소한 약 86%, 최소한 약 90%, 최소한 약 93%, 최소한 약 96%, 최소한 약 98%, 또는 최대 100% 동일할 수 있다.
따라서 본 명세서의 항체는 표 1에 나타낸 전장 VH 또는 VL 서열에 대해 최소한 80% 동일성, 최소한 85%, 최소한 90%, 최소한 95%, 최대 100% 아미노산 서열 동일성을 보유하는 전장 VH 및/또는 전장 VL 서열을 함유할 수 있다. 예를 들면, 대상 항체는 클론 21의 전장 VH 및/또는 전장 VL를 함유할 수 있다. 대안으로, 이 대상 항체는 클론 20의 전장 VH 및/또는 전장 VL를 함유할 수 있다.
항체 생산 방법들
여기에서 제시하는 정보를 이용하여, 본 명세서의 항-c-Met 항체들은 당업계 숙련자들에게 잘 알려진 표준 기술들을 이용하여 조제된다. 예를 들면, 여기에서 제시하는 폴리펩티드 서열들(가령, 표 1 참고)을 이용하여 이 항체들을 인코딩하는 적절한 핵산 서열들을 결정하고, 그 다음 c-Met에 특이적인 하나 이상의 항체들을 발현시키기 위하여 이 핵산 서열들을 이용할 수 있다. 당업계 숙련자들에게 잘 알려진 표준 방법에 따라 다양한 발현 시스템에 특정 코돈 선호도(preferences)를 반영하도록 이 핵산 서열(들)을 최적화시킬 수 있다.
여기에서 제시하는 서열 정보를 이용하여, 당업계 숙련자들에게 공지된 다수의 표준 방법에 따라 이 핵산을 합성할 수 있다. 올리고뉴클레오티드 합성은 바람직하게는 시판되는 이용가능한 고형 상 올리고뉴클레오티드 합성 기계에서 실시하거나 또는 예를 들면, 고형 상 포스포아미디트 트리에스테르 방법을 이용하여 수작업으로 합성할 수 있다.
대상 항체를 인코딩하는 핵산이 일단 합성되면, 표준 방법들에 따라 이를 증폭 및/또는 클론화시킬 수 있다. 이를 획득하기 위한 분자 클로닝 기술은 당업계에 공지되어 있다. 재조합 핵산의 구축에 적합한 다양한 클로닝 및 시험관내 증폭 방법들이 당업계 숙련자들에게 공지되어 있다.
본 발명의 항체들을 인코딩하는 천연 또는 합성 핵산의 발현은 항체를 인코딩하는 핵산을 프로모터 (구성적 또는 유도성)에 작동가능하도록 링크시키고, 구조체(construct)를 발현 벡터 안으로 통합시켜 실시할 수 있다. 이 벡터들은 원핵생물들, 진핵생물들, 또는 이 둘 모두에서 복제 및 통합에 적합할 것이다. 전형적인 클로닝 벡터들은 전사 및 해독 종료물질들, 개시 서열들, 그리고 이 항체를 인코딩하는 핵산의 발현 조절에 유용한 프로모터들을 함유한다. 이 벡터들은 임의선택적으로 최소한 하나의 독립적인 종료 서열, 진핵생물들 및 원핵생물들 모두에서 카세트의 복제를 허용하는 서열들, 가령, 셔틀(shuttle) 벡터들, 및 원핵성 및 진핵 시스템 모두를 위한 선별 표식들을 함유하는 유전자 발현 카세트를 함유한다.
클론된 핵산의 발현 수준을 높이기 위하여, 전형적으로 전사를 지시하는 강력한 프로모터, 해독 개시용 리보좀 결합 부위, 그리고 전사/해독 종료물질을 함유하는 발현 플라스미드를 구축하는 것이 보통이다. 대장균에서 형질변환된 DNA 벡터들 안에 선별 표식들을 포함시키는 것 또한 유용하다. 이러한 표식들의 예로는 암피실린, 테트라사이클린, 또는 클로람페니콜에 대한 저항성을 특징짓는 유전자들을 포함한다. 항체들을 발현시키기 위한 발현 시스템은 예를 들면, 대장균(E. coli), 바실러스종(Bacillus sp). 그리고 살모넬라(Salmonella)를 이용할 수 있다. 대장균 시스템을 또한 이용할 수 있다.
항체 유전자(들)은 발현 벡터 안으로 서브클론을 또한 시킬 수 있는데, 이는 정제를 실시하기 위하여 항체(가령 scFv)의 C-말단 또는 N-말단에 태그 (가령, 헥사히스티딘)를 추가할 수 있도록 한다. 포유동물 세포들 안에서 유전자들의 형질감염 및 발현시키는 방법들은 당업계에 공지되어 있다. 핵산으로 세포들을 형질변환(Transducing)은 예를 들면, 이 벡터의 숙주 범위내에서 핵산을 함유하는 바이러스 벡터들과 세포들을 항온처리하는 것을 포함할 수 있다. 조직 또는 혈액 시료들로부터 세포주 및 배양된 세포들을 포함하는 본 명세서에서 이용된 세포들의 배양은 당업계에 공지되어 있다.
대상 항체에 대한 핵산이 일단 단리되고, 클론되면, 당업계 숙련자들에게 공지된 재조합적으로 조작된 다양한 세포들 안에서 이 핵산을 발현시킬 수 있다. 이러한 세포들의 예로는 박테리아, 효모, 사상균(filamentous fungi), 곤충 (가령, 바큘로바이러스 벡터들을 이용하는 것들), 그리고 포유동물 세포들을 포함한다.
대상 항체의 단리 및 정제는 당업계에 공지되어 있는 방법들에 따라 실시할 수 있다. 예를 들면, 단백질을 구성적으로 발현시키도록 유전적으로 변형시킨 세포들의 용해물로부터 및/또는 유도시, 또는 합성 반응 혼합물물로부터 면역친화력 정제(또는 단백질 G 또는 A를 이용한 침전)에 의해, 비-특이적으로 결합된 물질들을 제거하기 위하여 세척하고, 특이적으로 결합된 항체를 용출시켜, 이 단백질을 단리시킬 수 있다. 단리된 항체는 투석에 의해 그리고 단백질 정제 방법들에서 정상적으로 이용되는 다른 방법들에 의해 추가 정제시킬 수 있다. 한 구체예에서, 이 항체는 금속 킬레이트 크로마토그래피 방법들을 이용하여 단리시킬 수 있다. 본 명세서의 항체들은 상기에서 논의된 것과 같이 단리를 위하여 변형들을 함유할 수 있다.
대상 항체들은 실질적으로 순수한 또는 단리된 형태 (가령, 다른 폴리펩티드들이 없는)로 조제될 수 있다. 이 단백질은 존재할 수 있는 다른 성분들(가령, 다른 폴리펩티드들 또는 다른 숙주 세포 성분들)에 대해 이 폴리펩티드들이 풍부한 조성물 안에 존재할 수 있다. 이 항체는 조성물 안에서 다른 발현된 단백질들이 실질적으로 없는, 가령, 이 조성물의 90% 미만, 대개 60% 미만 그리고 좀더 통상적으로 50% 미만이 다른 발현된 단백질로 구성되도록, 이 조성물 안에 존재하도록 정제된 항체들이 제공될 수 있다.
본 명세서는 대상 항체들을 생산하는 세포들을 또한 제시한다. 이 세포들은 시험관내에서 항체(가령 단클론성 항체들, 예컨대 IgG)들을 재생산할 수 있는 하이브리드 세포 또는 "하이브리도마"일 수 있다.
하이브리도마들의 생성을 우회하는 항체분자들의 항원-결합 영역들의 재조합 DNA 버젼을 만드는 기술들이 또한 여기에서 고려된다. 예를 들면, 박테리아 (가령, 박테리오파아지), 효모, 곤충 또는 포유동물 발현계 안으로 DNA를 클론시킨다. 적합한 기술의 한 예는 이 발현된 항체 (가령 Fab 또는 scFv)가 주변세포질 공간(박테리아성 세포 막과 세포 벽 사이)으로 이동하거나 또는 배출되도록 하는 리더(leader) 서열을 보유한 박테리오파아지 람다 벡터 시스템을 이용한다. c-Met에 결합하는 것들의 상당한 수의 기능적 단편들(가령 scFv)을 신속하게 생성시킬 수 있다.
변형
본 명세서는 원하는 가령, 피험자 안에 특정 유형의 조직 및/또는 세포들로 운반하기 위하여, 혈청 반감기를 증가시키기 위하여, 항-암 활성을 보충하기 위하여, 등의 특징을 제공하기 위하여, 변형시킨 항체들 및 핵산을 포괄한다. 본 명세서의 항체들은 변형된 상태로 또는 변형없이 제시될 수 있으며, 그리고 인간 항체들, 인간화된 항체들, 및 키메라 항체들을 포함한다. 대상 항체를 변형시키는 한 가지 방법은 이 항체의 N- 및/또는 C-말단에 하나 이상의 추가 요소들, 예컨대 또다른 단백질 및/또는 약물 또는 운반체 분자를 콘쥬게이트(가령, 링크)시키는 것이다.
콘쥬게이트로 변형된 대상 항체는 원하는 결합 특이성을 유지하면서, 추가적으로 원하는 특징들을 부여하기 위하여 콘쥬게이트의 제 2 분자의 성질들을 활용한다. 예를 들면, 대상 항체는 예컨대 특정 세포 (가령, 뉴우런, 백혈구들, 종양 세포들, 등) 또는 세포성 위치 (가령, 리소좀, 엔도좀, 미토콘드리아 등), 조직 또는 다른 신체의 위치 (가령, 혈액, 신경 조직, 특정 장기들 등)를 표적화함으로써, 용해도, 보관 또는 다른 취급 성질들, 세포 침투성, 반감기, 면역원의 감소, 방출 및/또는 분포 조절을 돕는 제 2 분자에 콘쥬게이트시킬 수 있다. 다른 예들은 분석, 추적 및 이와 유사한 것들을 위한 염료, 형광단(fluorophore) 또는 다른 탐지가능한 표지들 또는 보고용 분자들의 콘쥬게이트을 포함한다. 더욱 구체적으로, 대상 항체는 예컨대, (가령, 환원성 또는 비-환원성 단부에서) N-지방 아실 기들 예컨대, N-올레일, 지방 아민 예컨대, 도데실 아민, 올레일 아민, 그리고 이와 유사한 것을 포함하는 지질 모이어티의 부착에 의해 제 2 분자 예컨대, 펩티드, 폴리펩티드, 염료, 형광단, 핵산, 탄수화물, 항-암 물질, 지질 그리고 이와 유사한 것에 콘쥬게이트될 수 있다.
예를 들면, 이 항체들이 세포들 안으로 내재화할 수 있다는 점에서, 본 발명의 항체 또는 핵산은 세포들 안으로 운반 효율을 증가 또는 감소시키기 위하여 추가 변형될 수 있다. 세포들 안에서 대상 항체들을 발현시키는 핵산을 운반하기 위하여 유전자 운반 방법들을 또한 고려한다. 항체들의 세포성 흡입 (가령 엔도시토시스)의 효과는 펩티드들 또는 단백질들에 링크함으로써 증가 또는 감소될 수 있다. 예를 들면, 엔도시토시스성 기전에 의해 좀더 용이하게 포획될 수 있는 표적 수용체 또는 큰 분자의 리간드, 예컨대 또다른 항체에 주어진 항체를 링크시킬 수 있다. 이 콘쥬게이트의 탑재물(payload)은 엔도시토시스성 소포가 리소좀들과 융합될 대 산 가수분해 또는 효소 활성에 의해 또한 방출될 수 있다. 세포성 흡입을 감소시키기 위하여, 이 콘쥬게이트는 세포의 표면 상에 있는 항체를 유지시키는 리간드를 포함할 수 있는데, 이는 세포성 흡입을 위한 조절물질로 유용하거나, 또는 한 세포 유형에서는 흡입을 감소시키고, 반면 다른 유형들에서는 흡입을 증가시킨다.
콘쥬게이트된 항체의 다른 특징들은 콘쥬게이트안된 항체와 비교하여 콘쥬게이트가 독성을 감소시키는 것을 포함할 수 있다. 또다른 특징은 콘쥬게이트된 항체가 콘쥬게이트안된 항체보다 좀더 효율적으로 한 가지 유형의 세포 또는 장기(가령 암 세포 또는 암 조직)에 표적화될 수 있다는 것이다.
추가적인 예들은 이 항체를 보충, 강화, 증대시키거나 또는 항체와 연관하여 공조 작용을 하는 하나 이상의 분자들과 콘쥬게이트된 항체를 포함한다. 세포 사멸 또는 제거를 추가 실행하도록 이 항체를 암 부위로 운반하기 위하여 부착된 항-암 약물, 가령, 항-증식 모이어티 (가령, VEGF 길항제, 가령, 항-VEGF 항체), 독소 (가령, 독소루비신, 루친, 슈도모나스 외독소 A, 그리고 이와 유사한 것), 방사성 핵종 (가령 붕소 중성자 포획용 90Y, 131I, 177L, 10B, 그리고 이와 유사한 것), 항-암 물질, 및/또는 올리고뉴클레오티드 (가령 siRNA)를 보유할 수 있다.
항체-함유 리포좀. 예를 들면, 항체는 공유적 또는 비-공유적 변형들에 의해 지질 나노입자 (가령, 리포좀) 내에서 조제될 수 있다. 이 항체는 예를 들면, Fc 영역을 통하여 직접적으로 지질 나노입자의 표면에 부착될 수 있다. 이 항체는 링커를 경유하여 지질 나노입자의 표면에 접목된 폴리머의 말단에 공유적으로 또한 부착될 수 있다. 이러한 콘쥬게이트된 지질 나노입자들은 여기에서 면역리포좀들이라고 지칭될 수 있다.
본 발명의 항체(가령 S20)를 인코딩하는 유전자는 C-말단에 만들어진 시스테인에 융합될 수 있다. 그 다음 이 시스테인 융합 단백질은 부위-지향적 콘쥬게이트를 경유하여 리포좀의 외부 표면 상에서 이의 c-말단 시스테인을 통하여 말레이미드-변형된 PEG 쇄들에게 특이적으로 결합될 수 있다. 이 면역리포좀들은 하나 이상의 항-암 물질들, 예컨대 작은 분자, 펩티드, 및/또는 핵산 (가령 siRNAs) 또는 당업계에 공지되어 있는 임의의 것들을 실을 수 있다. 이 리포좀은 항-암 약물들, 예컨대 독소루비신을 함유할 수 있다. 면역리포좀들 안에 대상 항체들은 이 면역리포좀들이 암 세포들의 표면 상에 있는 c-Met에 특이적으로 결합할 수 있도록 하는 모이어티를 표적화하는 작용을 할 것이다. 지질 나노입자들, 예컨대 리포좀들 및 면역리포좀들을 제조 및 로딩(loading) 방법들은 당업계에 공지되어 있다. See, 예를 들면, US 7749485 및 US 20070031484 참고, 이의 내용은 여기에 참고자료로 편입된다.
본 명세서의 항체들은 개선된 약력학 프로파일을 제공하기 위하여 임의선택적으로 변형될 수 있다(가령, 페길화(PEGylation), 과당화(hyperglycosylation), 그리고 이와 유사한 것). 혈청 반감기를 강화시킬 수 있는 변형들이 관심대상이다. 대상 항체는 하나 이상의 폴리(에틸렌 글리콜) (PEG) 모이어티들을 함유하는 것과 같이 "페길화(PEGylated)"될 수 있다. 단백질의 페길화에 적합한 방법들 및 시약들은 당업계에 공지되어 있고, US 특허 제5,849,860호에서 찾아볼 수 있으며, 이의 명세서는 여기에 참고자료로 편입된다.
대상 항체가 원천으로부터 단리된 경우, 대상 단백질은 정제용 모이어티들 예컨대 특이적 결합 쌍들의 구성요소들, 가령, 바이오틴 (바이오틴-아비딘 특이적 결합 쌍의 구성요소), 렉틴, 그리고 이와 유사한 것에 콘쥬게이트될 수 있다. 대상 단백질은 폴리스티렌 플레이트들 또는 비드들, 자성 비드들, 테스트 스트립들, 막, 그리고 이와 유사한 것을 포함하나 이에 한정되지 않는 고형 지지물상에 또한 결합(가령, 고정)될 수 있다.
이 항체들이 분석에서 탐지되도록 하기 위하여, 이 대상 단백질들은 탐지가능한 표지, 가령, 방사능동위원소 (가령, 125I; 35S, 그리고 이와 유사한 것), 탐지가능한 산물을 생성하는 효소(가령, 루시퍼라제, β-갈락토시다제, 서양와사비 과산화효소, 알칼리 포스파타제, 그리고 이와 유사한 것), 형광 단백질, 색원성 단백질, 염료 (가령, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리틴, 그리고 이와 유사한 것); 예컨대 EDTA와 같은 금속 킬레이트 기들을 통하여 단백질에 부착된 형광 방출 금속들, 가령, 152Eu, 또는 란탄계열의 다른 것들; 화학발광성 화합물들, 가령, 루미놀, 이소루미놀, 아크리디니움 염들, 그리고 이와 유사한 것; 생물발광성 화합물들, 가령, 루시퍼린; 형광 단백질들; 및 이와 유사한 것을 또한 함유할 수 있다. 간접 표지들은 대상 단백질에 특이적인 항체들과 특이적 결합 쌍들, 가령, 바이오틴-아비딘, 그리고 이와 유사한 것들을 포함하는데, 여기에서 이 항체는 제 2 항체를 통하여 탐지될 수 있다.
대상 항체를 변형시키기 위하여 이용되는 상기 요소들중 임의의 것은 링커, 가령 유연성 링커를 통하여 항체에 링크될 수 있다. 링커가 있다면, 이 링커 분자들은 항체와 운반체 사이에 어느 정도의 유연성을 허용하도록 항체와 링크된 운반체에게 일반적으로 충분한 길이를 가진다. 이 링커 분자들은 일반적으로 약 6-50개 원자 길이를 가진다. 이 링커 분자들은 예를 들면, 아릴 아세틸렌, 2-10개의 단량체 단위들을 함유하는 에틸렌 글리콜 올리고머들, 디아민, 이산(diacids), 아미노산들, 또는 이의 조합물일 수도 있다.
이 링커들이 펩티드인 경우, 이 링커들은 임의의 적합한 상이한 길이, 예컨대 1개의 아미노산 (가령, Gly) 내지 20개 이상의 아미노산들, 2개 아미노산 내지 15개의 아미노산, 4개의 아미노산 내지 10개의 아미노산, 5개의 아미노산 내지 9개의 아미노산, 6개의 아미노산 내지 8개의 아미노산, 또는 7개의 아미노산 내지 8개의 아미노산을 포함하는, 3개의 아미노산 내지 12개의 아미노산일 수 있거나, 그리고 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 또는 7개의 아미노산일 수 있다.
유연성 링커들은 글리신 폴리머들 (G)n, 글리신-세린 폴리머들 (예를 들면, (GS)n, GSGGSn (서열 번호: 1) 및 GGGSn (서열 번호: 2)를 포함하며, 이때 n은 최소한 1의 정수이다), 글리신-알라닌 폴리머들, 알라닌-세린 폴리머들, 그리고 당업계에 공지되어 있는 다른 유연성 링커들을 포함한다. 글리신 및 글리신-세린 폴리머들을 이용할 수 있는데, 상대적으로 구조를 형성하지 않는(unstructured) 아미노산들이 관심대상이며, 그리고 성분들 간에 중립적인 끈의 역할을 할 수 있다. 유연성 링커들의 예로는 GGSG (서열 번호:3), GGSGG (서열 번호:4), GSGSG (서열 번호: 5), GSGGG (서열 번호: 6), GGGSG (서열 번호: 7), GSSSG (서열 번호: 8), 그리고 이와 유사한 것을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 상기에서 설명된 임의의 요소들에 콘쥬게이트된 펩티드의 모양(design)은 링커가 유연성 링커 뿐만 아니라 다소 유연성이 적은 구조를 부여하는 하나 이상의 부분들을 포함할 수 있도록 완전히 또는 부분적으로 유연한 링커들을 포함할 수 있다는 것을 당업계 숙련자는 인지할 것이다.
조작된( engineered ) 인간 항체. 본 명세서의 항체들은 면역글로블린, 예컨대 인간 IgG의 형태일 수 있다. 예를 들면, 인간 면역글로블린, 가령 온전한 그대로의 IgG 면역글로블린으로 만들기 위하여 본 명세서의 scFV 형태의 항체는 인간 불변(constant) 영역 (가령 Fc 영역)에 링크시킬 수 있다.
Fc 영역. 본 명세서의 c-Met에 결합하는 항체는 Fc 영역을 함유할 수 있다. 이 Fc 영역은 인간 또는 다른 동물들에서 발견되는 자연적으로 발생되는 임의의 아이소형 (가령 임의의 분류의 면역글로블린 또는 면역글로블린의 하위분류로부터 유도된)일 수 있고, 변경된 기능을 가지도록 임의선택적으로 추가 변형될 수 있다. 이 Fc 영역은 인간의 것이 아니고, CDR 및/또는 FR 영역들은 인간의 것인 경우, 이 항체들은 키메라 항체로 설명할 수 있다. 이 Fc 영역은 효과 또는 기능들이 증가되도록, 예컨대 세포-유도된 세포독성을 개시하거나 또는 보체 활성 (가령 C1q 결합 또는 보체 의존적 세포독성)의 활성화, 세포-표면 수용체의 하향조절, 등을 위하여 하나 이상의 아미노산 잔기 위치에서 변형될 수 있다. 본 명세서의 항체들로 이용할 수 있는 Fc 변이체들의 상세한 것들은 예를 들면, US 특허 제7,416,727호, US 특허 제7,371,826호, US 특허 제7,335,742호, US 특허 제7,355,008호, US 특허 제7,521,542호, 및 US 특허 제7,632,497호에서 찾아볼 수 있으며, 이의 각 명세서는 여기에 참고자료로 편입된다.
조성물
대상 조성물들은 항체들 및/또는 이를 인코딩하는 핵산을 제공하는데, 이때 이 항체들은 c-Met를 발현시키는 암 세포들에 결합하고, 이 암 세포들에 의해 내재화된다. 본 명세서의 조성물들은 암을 가진 피험자(가령, 인간)를 치료하는데 용도를 가지며, 그리고 이 질환의 임의 단계에서 치료에 적합할 수 있다.
하나, 둘, 또는 그 이상의 상이한 항체들을 함유하는 조성물들은 제약학적 조성물로 제시될 수 있으며, 이를 필요로 하는 포유류 (가령, 인간)에게 투여될 수 있다.
여기에서 고려되는 조성물들은 본 명세서의 하나, 둘, 셋 또는 그 이상의 상이한 항체(및/또는 이를 인코딩하는 핵산)들을 함유할 수 있다. 예를 들면, 이 조성물은 다음중 하나 이상을 함유할 수 있다: 클론들 1, 2, 및 3. 이 조성물은 이들 항체로부터 하나 이상의 CDRs을 함유하는 항체들, 및/또는 이들 항체의 돌연변이들 또는 유도체들을 함유하는 하나 이상의 항체들을 임의선택적으로 추가로 포함한다.
본 발명의 조성물의 예는 표 1에서 공개된 임의의 항체들을 포함할 수 있다. 이 조성물이 2개 이상의 항체들을 함유할 때, 각 항체는 동일한 또는 상이한 에피토프들에 특이적이거나 또는 상이한 항원들상의 에피토프들에 특이적일 수 있다. 예를 들면, 이 조성물은 c-Met의 에피토프에 특이적인 최소한 하나의 항체와 또다른 세포-표면 항원, 예컨대 EGFR에 특이적인 또다른 항체를 함유할 수 있다. 이 조성물은 이중-특이적, 다중특이적 항체들, 또는 이를 인코딩하는 핵산을 또한 함유할 수 있다.
본 명세서의 항체들은 개별적으로 이용될 수 있고, 및/또는 서로 복합되어 이용될 수 있고(가령, 이중특이적 또는 다중특이적 항체들을 형성하기 위하여), 및/또는 다른 공지의 항-암 물질들 (가령 암 치료용 항체들)과 병용하여 이용될 수 있다. 예를 들면, 조성물, 예컨대 리포좀은 2개 이상의 항체들을 포함할 수 있는데, 이때 이들 항체중 최소한 하나는 본 명세서의 항체다. 상기에서 설명된 것과 같이, 이 리포좀은 대상 항체들과는 다른 하나 이상의 항체들을 함유할 수 있다. 이러한 리포좀은 이중-특이적, 다중특이적, 등등일 수 있고, 그러므로 이 리포좀은대상 항체의 에피토프에 추가하여 추가적인 에피토프에 특이적이다.
복합물들은 단일 제형으로 제공되거나 또는 키트내 별도 제형들로 제공될 수 있고, 이때 별도 제형들은 1 개의 항체 또는 2 개의 항체를 함유할 수 있다. 이러한 키트의 별도 제형들은 투여 전 복합되거나, 또는 별도의 주사로 투여될 수 있다.
대상 제약학적 조성물은 제약학적으로 수용가능한 부형제 안에 제공될 수 있으며, 이는 용액 예컨대, 수성 용액, 대개 염 용액일 수 있거나, 또는 분말 형으로 제공될 수 있다. 대상 조성물은 다른 성분들, 예컨대 제약학적 등급의 만니톨, 락토즈, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 사카린 나트륨, 활석, 셀룰로오스, 포도당, 슈크로즈, 마그네슘, 탄산염, 그리고 이와 유사한 것을 포함할 수 있다. 이 조성물들은 생리학적 조건에 근접하도록 요구될 경우, 제약학적으로 수용가능한 보조 물질들 예컨대 pH 조절 및 완충 물질들, 독성 조절 물질들 그리고 이와 유사한 것, 예를 들면, 아세트산나트륨염, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼륨, 젖산나트륨 그리고 이와 유사한 것을 함유할 수 있다.
대상 항체, 가령, 제약학적으로 수용가능한 염 형태의 항체는 하기에서 설명되는 방법들에 사용하기 위하여 경구(oral), 국소(local), 또는 장관외(parenteral) 투여용으로 제형화될 수 있다. 특정 구체예들에서, 가령, 주사가능한 액체로 항체를 투여될 때, 항체 제형은 제약학적으로 수용가능한 운반체들 및 부형제들로 구성된 즉시 사용가능한(ready-to-use) 투약 형태로 제공되거나, 또는 재구성가능한 보관-안정적인 분말 또는 액체로 제공된다.
본 명세서의 조성물들은 치료요법적으로 유효량의 대상 항체 뿐만 아니라 필요에 따라 임의의 양립가능한 다른 성분들을 포함할 수 있다. 치료요법적으로 유효량이란 동일한 또는 상이한 항체의 일부분으로 또는 조성물들의 형태에서 단일 1회 분량으로 개체에 투여되어 피험자에서 암 세포의 증식 및/또는 전이를 감소시키는데 효과적인 양을 의미한다. 항체의 이러한 치료요법적으로 유효량 및 세포 성장에서 이의 영향은 하나 이상의 다른 치료법들 (가령, 면역요법, 화학요법, 방사능 요법 등)과 병용하여 세포 성장을 협력적 및/또는 공조적으로 억제하는 것을 포함한다. 하기에서 명시한 것과 같이, 치료요법적으로 유효량은 피험자의 상태의 투약 섭생 및 진단 분석(가령, c-Met에 특이적인 항체를 이용하여 세포 표면 에피토프들의 존부를 모니터링) 그리고 이와 유사한 것과 연관하여 조정될 수 있다.
양 및 투약량. 제약학적 제형들 안에 항체의 농도는 약 0.1wt% 미만에서부터, 보통 최소한 약 2wt% 내지 최대 20wt% 내지 50wt% 또는 이 이상까지 다양할 수 있고, 선택된 특정 투여 방식 및 환자의 필요에 따라 유체 용적, 점성 등에 의해 주로 선택할 수 있다. 생성된 조성물들은 용액, 현탁액, 정제, 알약, 캡슐, 분말, 겔, 크림, 로션, 연고, 에어로졸 또는 이와 유사한 형태일 수 있다.
또한, 적합한 투약(dose) 및 투약량(dosage) 섭생은 원하는 성장 억제 또는 면역억제성 반응에 영향을 주는 것으로 공지된 항암 또는 면역억제성 물질들과 비교함으로써 결정될 수 있다. 이러한 투약량은 심각한 부작용 없이, 세포 성장의 최저 투약 억제를 초래하는 투약량을 포함한다. 특정 화합물들의 적합한 투여 및 적절한 투약에서, 본 명세서의 화합물들은 세포내 광범위한 효과, 가령, 세포 성장의 부분적 억제에서부터 본질적으로 완전한 억제를 제공할 수 있다. 투약량 치료는 단일 투약 일정 또는 다중 투약 일정(가령, 경사(ramp) 및 유지 투약을 포함)일 수 있다. 하기에서 나타낸 것과 같이, 대상 조성물은 다른 물질들과 병용하여 투여될 수 있으며, 따라서 투약 및 섭생들은 피험자의 요구에 적합하도록 이 배경에서 다변화될 수 있다.
병용 요법
임의의 다양한 암 치료법들을 대상 항체를 가진 조성물에 병용시킬 수 있다. 예를 들면, 화학요법 치료 또는 생물학적 반응 변경 치료에 이용된 물질들은 항체를 포함하는 제약학적 조성물, 예컨대 면역리포좀들 안에 존재할 수 있다. 대상 항체들과 병용하여 이용할 수 있는 특정 물질들을 하기에서 간략하게 논의한다.
화학요법 물질들은 암 세포들의 증식을 감소시키는 비-펩티드성(가령, 비-단백질성) 화합물들이며, 그리고 세포독성 물질들 및 세포활동억제성(cytostatic) 물질들을 포괄한다. 화학요법 물질들의 예로는 알킬화 물질들, 니트로소 요소, 항대사물질들, 항종양 항생제들, 식물 (가령, 빈카) 알칼로이드들, 핵산, 예컨대 억제 핵산 (가령 siRNA), 및 스테로이드 호르몬들을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
항대사성 물질들은 예를 들면, 엽산 유사체들, 피리미딘 유사체들, 퓨린 유사체들, 그리고 아데노신 디아미네이즈 억제물질들을 포함한다
적합한 천연 산물들 및 이들의 유도체들 (가령, 빈카 알칼로이드들, 항종양 항생제들, 효소들, 림프킨들, 그리고 에피포도필로톡신들)은 항-암 물질들로 이용할 수 있다. 가령 탁산(Taxanes), 예컨대 파클리탁셀 뿐만 아니라 임의의 활성 탁산 유도체 또는 프로-드럭.
기타 항-증식성 세포독성 물질들은 나벨벤, CPT-11, 아나스트라졸, 레트라졸, 카페씨타빈, 레로옥사핀, 사이클로포스파미드, 이포사미드, 그리고 드롤로옥사핀이다. 항증식성 활성을 보유한 미소관 영향 물질들 또한 사용하는데 적합하다. 호르몬 조절물질들 및 스테로이드들(합성 유사체들을 포함)도 사용에 적합하다.
치료 방법
본 명세서의 항체를 투여함으로써, 암 세포들의 증식을 감소시키는 방법이 또한 공개된다. 암에 걸린, 걸린 것으로 의심되는 또는 암이 발달될 위험에 처한 피험자들이 여기에서 설명되는 요법 및 진단에 고려된다.
이 방법은 치료요법적으로 유효량의 항-c-Met 항체를 이를 필요로하는 환자에게 투여하는 것을 포함한다. 이 항체의 투여로 암 세포 증식을 억제, 종양 무게의 감소, 전이의 감소, 및/또는 환자들에서 임상 결과를 개선시킬 수 있다.
본 방법은 포유동물 피험자, 구체적으로 인간에게서 다양한 암 치료법들(암 예방 및 진단후 암 요법을 포함)에 용도를 발견한다. 종양을 가진, 가진 것으로 의심되는, 또는 종양 발달의 위험에 처한 피험자들이 여기에서 설명되는 요법에 고려된다.
관련된 구체예에서, 치료를 받을 피험자는 c-Met를 발현시키는(가령, 과다발현시키는) 세포들을 보유한다. c-Met는 암 세포 표면 상에서 발현되며, 그리고 상응하는 비-암 세포보다 더 높은 수준으로 대개 존재한다. 이 측면은 본 명세서의 방법들에서 유익할 것이며, c-Met를 발현 또는 제시하는 세포들이 본 명세서의 항체를 이용한 치료에 순응할 수 있을 것이다. 이 항체는 피험자에게 투여될 수 있는데, 예를 들면, 이때 요법은 항원의 존재가 탐지 불가능한 시점에서 개시할 수 있고, 따라서 제한하는 의도는 없다. 질환 증후들의 첫 신호 이전에, 있을 수 있는 질환의 첫 신호 시점에, 또는 질환의 진단 전 또는 후에 항체 요법을 개시하는 것 또한 가능하다.
예를 들면, 본 명세서의 방법에 의해 억제시킬 수 있는 암은 선종을 포함하는 암종, 그리고 구체적으로 폐 암종(비-소 세포 및 소 세포)을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 치료될 수 있는 다른 암들은 뇌, 결장직장, 위, 두경부, 위, 신장, 간, 그리고 유방에서 암 성장으로부터 기인된 것들을 포함한다.
암의 유형
이 방법들은 다양한 범위의 암들, 구체적으로 새로운 혈관들의 형성 및 전이성 암들과 관련된 암들을 치료 또는 예방하는데 유용하다. 본 명세서의 방법들을 이용하는 요법에 순응하는 암들의 예는 하기에서 제시한다.
본 명세서의 방법들을 이용하는 요법에 순응하는 암들은 식도 암종, 간세포성 암종, 기저 세포 암종 (피부 암의 형태), 편평 세포 암종 (다양한 조직들), 과도기적 세포 암종 (방광의 악성 신생물)을 포함하는 방광 암종, 기관지 암종, 결장 암종, 결장직장 암종, 위 암종, 폐의 소 세포 암종 및 비-소 세포 암종을 포함하는 폐 암종, 부신피질 암종, 갑상선 암종, 췌장 암종, 유방 암종, 난소 암종, 전립선 암종, 선종, 땀샘 암종, 피지선 암종, 유두 암종, 유두 선종, 낭성종암종, 수질부 암종, 신장 세포 암종, 원위치의 도관 암종 또는 담관 암종, 융모막암종, 정상피종, 배아 암종, 윌름스 종양, 경부 암종, 자궁 암종, 고환 암종, 골원성 암종, 상피 암종, 그리고 비인두 암종을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 명세서에서 공개된 방법들에 의한 요법에 순응하는 육종은 섬유육종, 점액육종, 지질육종, 연골육종, 척색종, 골원성 육종, 골육종, 혈관육종, 내피육종, 림프혈관육종, 림프혈관내피육종, 활막종, 중피종, 유잉 육종, 평활근육종, 횡문근육종, 그리고 기타 연 조직 육종을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 명세서에서 공개된 방법들에 의한 요법에 순응하는 기타 고형 종양들은 신경교종, 성상세포종, 수모세포종, 두개인두종, 상의세포종, 송과체종, 혈관모세포종, 청신경종, 핍지신경교종, 수막종, 흑색종, 신경아종, 그리고 망막아종을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 명세서의 방법들에 따라 치료에 순응하는 기타 암들은 전형적인 수막종 (뇌), 섬(islet) 세포 암종 (췌장), 수질부 암종 (갑상선), 간엽종(내장), 간세포성 암종 (간), 간아세포종(간), 투명 세포 암종 (신장), 그리고 종격 신경 섬유종을 포함한다.
본 명세서의 방법들에 따라 치료에 순응하는 추가 예시적인 암들은 신경외배엽성 그리고 상피 기원의 암을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 신경외배엽 기원의 암의 예로는 Ewings 육종, 척추 종양들, 뇌 종양들, 유아성 천막성 원발성 신경외배엽성 종양, 소관낭포형 암종, 점액성 세관 및 방추 세포 암종, 신경 종양들, 종격 종양들, 신경교종들, 신경아종들, 그리고 청소년 및 청년에서 육종을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 상피 기원의 예로는 소 세포 폐암, 유방, 안구, 결장, 췌장, 신장, 간, 난소, 및 국방부 직할부대 및 기관지 상피의 암을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
기타 암 치료법들과 병용
항-c-Met 항체의 치료 투여는 면역요법, 화학요법 물질들 및 외과수술(가령, 하기에서 더 설명되는 것들과 같이)을 포함하나 이에 한정되지 않는 추가 표준 항암 치료들과 병용하여 또는 병용하지 않는 치료 섭생의 일부로써 투여를 포함할 수 있다.
게다가, 항-c-Met 항체의 치료 투여는 항-암 요법을 하는 피험자의 치료후의 치료가 또한 될 수 있으며, 이때 항-암 요법은 예를 들면, 외과적 수술, 방사능 요법, 화학요법 물질들의 투여, 그리고 이와 유사한 것일 수 있다. 본 명세서의 미소섬유성(fibrillar) 단백질들을 이용한 암 요법은 또한 면역요법과 병용하여 이용될 수 있다. 다른 예들에서, 이 미소섬유성 단백질들은 하나 이상의 화학요법 물질들 (가령, 사이클로포스파미드, 독소루비신, 빈크리스틴 및 프레드니손 (CHOP))과 병용하여 투여될 수 있고, 및/또는 방사능 치료 및/또는 외과적 수술에 의한 중재 (가령, 종양을 제거하기 위하여 전-수술 또는 후-수술)와 복합하여 투여될 수 있다. 이 미소섬유성 단백질들이 외과적 수술에 의한 중재와 연관되어 이용될 때, 암 세포들을 제거하기 위한 수술 전, 수술시 또는 수술 후 미소섬유성 단백질을 투여할 수 있고, 전신적으로 또는 외과적 수술 부위에 국소적으로 투여할 수 있다. 여기에서 설명된 미소섬유성 단백질 단독으로 또는 복합하여 전신으로 (가령, 장관외 투여, 가령, 정맥내 경로에 의해) 또는 국소적으로(가령, 국소 종양 부위에, 가령, 종양내 투여에 의해 (가령, 고형 종양 안으로, 림프종 또는 백혈병의 경우 관련된 림프절 안으로), 고형 종양으로 공급되는 혈관 안으로 투여, 등) 투여할 수 있다.
임의의 다양한 암 치료법들은 여기에서 설명된 미소섬유성 단백질 치료법들과 병용하여 이용될 수 있다. 이러한 암 치료법들은 수술 (가령, 외과적 수술에 의한 암 조직의 제거), 방사능 요법, 골수 이식, 화학요법 치료, 생물학적 반응 변경 치료, 그리고 전술한 것들의 특정 조합을 포함한다.
방사능 요법은 외부에서 제공되는 원천, 예컨대 광선으로부터 전달되는 X-선 또는 감마 선, 또는 작은 방사능활성 원천의 이식을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
화학요법 물질들은 암 세포들의 증식을 감소시키는 비-펩티드성(가령, 비-단백질) 화합물들이며, 그리고 세포독성 물질들 및 세포활동억제성 물질들을 포괄한다. 화학요법 물질들의 예로는 알킬화 물질들, 니트로소 요소, 항대사물질들, 항종양 항생제들, 식물 (빈카) 알칼로이드들, 및 스테로이드 호르몬들을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
세포성 증식을 감소시키는 작용을 하는 물질들은 당업계에 공지되어 있고, 널리 이용된다. 이러한 물질들은 메클로로에타민, 사이클로포스파미드 (CYTOXAN 등록상표), 멜파란 (L-사르코리신), 카르무스틴 (BCNU), 로무스틴 (CCNU), 세무스틴 (메틸-CCNU), 스트렙토조신, 클로로조토신, 우라실 무스타드, 클로로메틴, 이포스파미드, 클로람부칠, 피포브로만, 트리에틸렌멜아민, 트리에틸렌티오포스포라민, 부술판, 다카르바진, 그리고 테모졸로미드를 포함하나 이에 한정되지 않는, 알킬화 물질들, 예컨대 질소 머스타드, 니트로소 요소, 에틸렌이민 유도물질들, 알킬 술폰산염들, 그리고 트리아젠들을 포함한다.
항대사물질 물질들은 시타라빈 (CYTOSAR-U), 시토신 아라비노시드, 플루오로우라실 (5-FU), 플루우리딘 (FudR), 6-티오구아닌, 6-멀캅토퓨린 (6-MP), 펜토스타틴, 5-플루오로우라실 (5-FU), 메토트레세이트, 10-프라파르길-5,8-디데아자폴레이트(PDDF, CB3717), 5,8-디데아자테트라하이드로폴린산 (DDATHF), 루코보린, 플루다라빈 포스페이트, 펜도스타틴, 그리고 겜시타빈을 포함하나 이에 한정되지 않는, 엽산 유사체들, 피리미딘 유사체들, 퓨린 유사체들, 그리고 아데노신 디아미네이즈 억제물질들을 포함한다.
적합한 천연 산물들 및 이들의 유도물질들(가령, 빈카 알칼로이드들, 항종양 항생제들, 효소들, 림포킨들 그리고 에피포도필로톡신)은 Ara-C, 파클리탁셀(TAXOL®), 도쎄탁셀(TAXOTERE®), 데옥시코포르미신, 미토마이신-C, L-아스파라기나제, 아자티오프린; 브레퀴나르; 알칼로이드들, 가령 빈크리스틴, 빈블라스틴, 비노렐빈, 빈데신, 등; 포도필로톡신, 가령 에토포시드, 테니포시드, 등; 항생제들, 가령 안트라사이클린, 다우노루비신 하이드로클로라이드(다우노마이신, 루비도마이신, 쎄루비딘), 이다루비신, 독소루비신, 에피루비신 및 몰포리노 유도물질들, 등; 페녹시존 비스시클로펩티드들, 가령 닥티노마이신; 염기성 당펩티드들, 가령 블레오마이신; 안트로퀴논 글리코시드, 가령 플리카마이신(미트라마이신); 안트라세네디온, 가령 미토산트론; 아지리노피롤로 인돌디온, 가령 미토마이신; 마크로사이클 면역억제물질, 가령 사이클로스포린, FK-506 (타크로리무스, 프로그라프), 라파마이신, 등; 및 이와 유사한 것을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
기타 항-증식성 세포독성 물질들은 나벨벤, CPT-11, 아나스트라졸, 레트라졸, 카페씨타빈, 레로옥사핀, 사이클로포스파미드, 이포사미드, 및 드롤로옥사핀이다.
항증식성 활성을 가진 미소관 영향 물질들 또한 사용에 적합하며, 그리고 알로콜치신(NSC 406042), Halichondrin B (NSC 609395), 콜치신 (NSC 757), 콜치신 유도물질들 (가령, NSC 33410), 돌스타틴 10 (NSC 376128), 메이탄신(NSC 153858), 리조신 (NSC 332598), 파클리탁셀(TAXOL®), TAXOL® 유도물질들, 도쎄탁셀 (TAXOTERE®), 티오콜치신 (NSC 361792), 트리틸 시스테린, 빈블라스틴 설페이트, 빈크리스틴 설페이트, 에포티론 A, 에포티론 B를 포함하나 이에 한정되지 않는 천연 및 합성 에포티론, 디스코데르모리드; 에스트라무스틴, 노코다졸, 그리고 이와 유사한 것을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
사용에 적합한 호르몬 조절물질들 및 스테로이드들 (합성 유사체들을 포함)은 부신피질스테로이드들, 가령 프레드니손, 덱사메타손, 등; 에스트로겐 및 프레게스틴, 가령 하이드록시프로게스테론 카프로에이트, 메드록시프로게스테온 아세테이트, 메게스트롤 아세테이트, 에스트라디올, 클로미펜, 탐옥시펜; 등; 및 부신피질 억제물질들, 가령 아미노글루테티미드; 17α-에티닐에스트라디올; 디에틸스틸베스트롤, 테스토스페론, 플루옥시메스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 테스톨락톤, 메틸프레디니솔론, 메틸-테스토스테론, 프레디니솔론, 트리암씨노론, 클로로트리아니젠, 하이드록시프로게스테론, 아미노글루테티이미드, 에스트라무스틴, 메드록시프로게스테론 아세테이트, 루프로리드, 플루타마이드 (Drogenil), 토레미펜 (Fareston), 그리고 ZOLADEX을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 에스트로겐은 증식 및 분화를 촉진하고, 따라서, 에스트로겐 수용체에 결합하는 화합물들은 이 활성을 차단시키는데 이용된다. 피질스테로이드들은 T 세포 증식을 억제시킬 수 있다.
다른 화학요법 물질들은 금속 복합물들, 가령 시스플라틴 (cis-DDP), 카르보플라틴, 등; 우레아, 가령 하이드록시우레아; 및 하이드라진, 가령 N-메틸하이드라진; 에피도필로톡신; 토포이소어라제 억제형; 프로카르바진; 미토산트론; 루코보린; 테가푸르(tegafur); 등을 포함한다. 관심 대상의 다른 항-증식성 물질들은 면역억제물질들, 가령 미코페놀산, 탈리도미드, 데스옥시스페르구알린, 아자스포린, 레플루노미드, 미조리빈, 아자스피란(SKF 105685); IRESSA (ZD 1839, 4-(3-클로로-4-플루오로페닐-7-메톡시-6-(3-(4-몰포리닐)프로폭시)퀴나졸린); 등을 포함한다.
탁산(Taxanes)은 파클리탁셀, 뿐만 아니라 활성 탁산 유도물질 또는 프로-드럭을 포함한다. 파클리탁셀(paclitaxel) (유사체들, 제형들, 및 유도물질들 예컨대, 예를 들면, 도쎄탁셀, TAXOL, TAXOTERE (도쎄탁셀의 제형), 파클리탁셀의 10-데사쎄틸 유사체들 및 파클리탁셀의 3'N-데스벤조일-3'N-t-부톡시카르보닐 유사체들을 포함하는 것으로 이해해야 한다)은 당분야 숙련자들에게 공지된 기술들을 이용하여 바로 조제할 수 있다.
파클리탁셀은 통상의 화학적으로 이용가능한 파클리탁셀 형을 지칭할 뿐만 아니라, 유사체들 및 유도물질들 (가령, TAXOTERETM 도쎄탁셀, 상기에서 명시한 바와 같이) 그리고 파클리탁셀 콘쥬게이트들 (가령, 파클리탁셀-PEG, 파클리탁셀-덱스트란, 또는 파클리탁셀-크실로즈)를 지칭하는 것으로 이해해야 한다.
본 명세서의 방법에 따라 일부 개체들의 치료에서, 비-악성 세포들의 구출(rescue) 물질과 병용한 고 투약 섭생을 이용하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 치료에서, 비-악성 세포들을 구출할 수 있는 임의의 물질, 예컨대 씨트로보룸 인자, 엽산 유도물질들, 또는 루코보린을 이용할 수 있다. 이러한 구출 물질들은 당업계 숙련자들에게 잘 공지되어 있다. 구출 물질들은 세포성 기능을 조절하기 위하여 본 발명의 화합물들의 능력을 간섭하지 않는 것들을 포함한다.
투여 경로
항-c-Met 항체의 투여는 종양 안으로, 정맥내, 피내(intradermal), 피하, 경구 (가령, 흡입), 경피 (가령, 국소), 경점막, 복막내, 동맥내, 그리고 직장 투여를 포함하는 신체의 상이한 부분으로 다양한 방법을 통하여 이루어진다. 이 조성물의 투여용 다른 적합한 경로들은 정제, 고형, 분말형, 액체, 에어로졸 형태로 경구, 볼을 통하여, 코로, 비인두로, 장관외, 장으로, 위로, 국소적으로, 경피로, 피하로, 근육으로, 종양 안으로 병소내 주사, 종양에 인접하여 병소내 주사, 정맥내 주입, 및 동맥내 주입을 포함한다. 투여는 추가된 부형제와 함께, 또는 추가된 부형제 없이 국소적으로 또는 전신으로 실시될 수 있다. 투여는 또한 피험자의 종양부위 또는 종양 부위 부근에 서방(slow release) 방식을 통하여 실시될 수도 있다.
본 명세서의 제형을 피험자 또는 숙주, 가령, 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 다양한 적합한 방법들이 이용가능하며, 그리고 하나 이상의 경로를 이용하여 특정 제형을 투여할 수 있지만, 특정 경로가 또다른 경로보다 더 즉각적이며 더 효과적인 반응을 제공할 수 있음을 당업계 숙련자는 인지할 것이다.
구절 "치료요법적으로 유효량"은 임의의 의학적 치료에 적용가능한 합당한 이익/위험 비율에서 어느 정도의 원하는 효과를 나타내는 양을 지칭한다. 이 유효량은 치료되는 질환 또는 상태, 투여되는 특정 표적화된 구조체들, 피험자의 체격, 또는 질환 또는 상태의 중증도와 같은 인자들에 따라 다양하게 변화될 수 있다. 당업계 숙련자는 과도한 실험없이 특정 화합물의 유효량을 실험적으로 결정할 수 있다.
예시적인 이행에 따라, 이 단백질은 하기에서 상세하게 설명되는 조성물의 일부분으로 투여될 수 있다. 이 조성물은 분말, 크림, 겔, 고약, 연고, 용액, 정제, 캡슐, 스프레이, 및 패취를 포함하는 다양한 형태일 수 있다. 비이클 및 운반체들은 이 조성물을 환자에게 운반하는데 이용될 수 있다. 이러한 운반체들 가용화 물질들, 희석제, 그리고 분산 매질을 포함한다. 이들 운반체는 생체양립가능한, 제약학적으로 수용가능하며, 그리고 미소섬유성 단백질. 부형제들, 어쥬번트들의 치료 특징을 변경하지 않으며, 그리고 이 조성물에 다른 성분들이 또한 함유될 수 있다.
투약량
방법들에 있어서, 항-c-Met 항체의 유효량을 이를 필요로 하는 피험자에게 투여한다. 투여되는 양은 투여 목적, 치료받는 개체의 건강 및 신체 상채, 나이, 치료받는 개체의 분류군(taxonomic group)(가령, 인간, 인간이외의 영장류, 영장류, 등), 원하는 반응 수준, 항-c-Met 항체 조성물의 제형, 치료 임상의의 의학적 상태의 판단, 그리고 기타 관련 인자들에 따라 변화된다. 유효량은 통상적인 실험을 통하여 결정될 수 있는 상대적으로 광범위한 범위내에 속할 것으로 예상한다. 예를 들면, 암 전이를 억제하는데 이용되는 항-c-Met 항체의 양은 이 피험자에게 비가역적 독성을 일으키는 양보다 많지 않다(가령, 최대 내성 1회 투약분량). 다른 경우들에서, 이 양은 독성 임계치 부근 또는 이하지만, 여전히 면역효과적 농도 범위내에 있거나, 또는 임계치 1회 투약분량 만큼 적다.
개별 투약분량은 전형적으로 피험자에게서 측정가능한 효과를 얻는데 요구되는 양보다 적지 않고, 항-c-Met 항체의 부차적 결과의 이의 흡수, 분포, 대사 및 이의 배출(ADME)에 대한 약동학 및 약리학에 근거하고, 따라서 피험자 안에서 이 조성물의 성향에 근거하여 결정될 수 있다. 여기에는 투여 경로 뿐만 아니라 투약량의 고려도 포함되는데, 이는 국소 (주로 국소 효과를 위한 작용이 바람직한 경우 직접적으로 제공), 장내 (소화계의 일부에 유지될 때 전신 또는 국소 효과를 위한 소화계를 통하여 제공됨), 또는 장관외 (전신 또는 국소 효과를 위하여 소화계이외의 경로를 통하여 제공됨) 이용을 위하여 조정할 수 있다. 예를 들면, 항-c-Met 항체의 투여는 대개 정맥내, 근육내, 종양 안으로, 또는 이의 조합을 통하여 주사에 의해 일반적으로 이루어진다.
항-c-Met 항체는 주입 또는 국소 주사에 의해 투여될 수 있는데, 가령, 약 75 mg/h 내지 약 375 mg/h, 약 100 mg/h 내지 약 350 mg/h, 약 150 mg/h 내지 약 350 mg/h, 약 200 mg/h 내지 약 300 mg/h, 약 225 mg/h 내지 약 275mg/h를 포함하는, 약 50 mg/h 내지 약 400 mg/h의 속도로 주입될 수 있다. 주입의 예시적인 속도는 예를 들면, 약 1mg/m2/일 내지 약 9 mg/m2/일, 약 2mg/m2/일 내지 약 8 mg/m2/일, 약 3mg/m2/일 내지 약 7 mg/m2/일, 약 4mg/m2/일 내지 약 6 mg/m2/일, 약 4.5mg/m2/일 내지 약 5.5 mg/m2/일을 포함하는, 약 0.5mg/m2/일 내지 약 10 mg/m2/일의 원하는 치료 1회 투여 분량을 얻을 수 있다. 투여 (가령, 주입에 의한)는 원하는 기간, 가령, 약 1 일 내지 약 5 일의 기간에 걸쳐 반복적으로 또는 몇 일에 한 번씩, 예를 들면, 약 5 일, 약 1 개월, 약 2 개월, 등등에 걸쳐 반복적으로 실시할 수 있다. 암 세포를 제거하기 위하여, 다른 치료 중재, 예컨대 외과적 수술에 의한 중재 전, 후, 또는 중재 시점에 또한 투여될 수 있다. 항-c-Met 항체는 병용 요법의 일부로 또한 투여될 수 있는데, 이때 면역요법, 암 화학요법 또는 방사능 요법중 최소한 하나를 피험자에게 제공한다(하기에서 더 상세하게 설명되는 것과 같이).
피험자 안에서 항-c-Met 항체 및 이의 상응하는 생물학적 활성의 처분(disposition)은 관심 표적에 존재하는 항-c-Met 항체의 분획에 대해 일반적으로 나타낸다. 예를 들면, 일단 투여된 항-c-Met 항체는 암 세포들 및 암 조직에서 물질을 농축시키는 당콘쥬게이트 또는 다른 생물학적 표적과 함께 축적될 수 있다. 따라서, 시간의 경과에 따라 관심 표적내 축적시키도록 하기 위하여, 항-c-Met 항체를 투여하는 투약 섭생은 더 낮은 개별 투약을 허용하기 위한 전략의 일부일 수 있다. 이는 예를 들면, 생체내에서 좀더 서서히 제거되는 항-c-Met 항체의 투약분량이 시험관내(in vitro) 분석으로부터 계산된 효과 농도와 비교하여 더 낮을 수 있다는 것을 또한 의미할 수 있다(가령, 시험관내 유효량은 mM 농도에 근사치이지만, 생체내에서는 mM 미만의 농도가 된다).
예로써, 투약 또는 투약 섭생의 유효량은 세포 이동을 억제하기 위한 주어진 항-c-Met 항체의 IC50 으로부터 계측할 수 있다. "IC50"은 시험관내에서 50% 억제에 요구되는 약물의 농도를 의미한다. 대안으로, 주어진 항-c-Met 항체 농도에 대한 EC50으로부터 이 유효량을 계측할 수 있다. "EC50"은 생체내에서 최대 효과의 50%를 수득하기 위하여 요구되는 혈장 농도를 의미한다. 관련된 구체예들에서, ED50 (효과적인 투약량)에 근거하여 투약량을 또한 결정할 수 있다.
일반적으로, 본 명세서의 항-c-Met 항체에 있어서, 유효량은 대개는 계산된 IC50보다는 200×를 넘지 않는다. 전형적으로, 투여되는 항-c-Met 항체의 양은 계산된 IC50의 약 200× 미만, 약 150× 미만, 약 100× 미만이며, 그리고 많은 구체예들에서, 약 75× 미만, 약 60×, 50×, 45×, 40×, 35×, 30×, 25×, 20×, 15×, 10× 미만이며, 심지어 약 8X 또는 2× 미만이다. 한 구체예에서, 이 유효량은 계산된 IC50의 약 1× 내지 50×이며, 그리고 일부의 경우 계산된 IC50의 약 2× 내지 40×, 약 3× 내지 30× 또는 약 4× 내지 20× 이다. 다른 구체예들에서, 이 유효량은 계산된 IC50와 동일하며, 그리고 특정 구체예들에서 이 유효량은 계산된 IC50보다 더 많은 양이다.
유효량은 계산된 EC50보다 100× 이상 되지 않을 수 있다. 예를 들면, 투여되는 항-c-Met 항체의 양은 계산된 EC50의 약 100× 미만, 약 50× 미만, 약 40×, 35×, 30×, 또는 25× 미만이며, 많은 구체예들에서, 약 20× 미만, 약 15× 미만, 그리고 심지어 약 10×, 9X, 9X, 7X, 6X, 5×, 4×, 3×, 2× 또는 1× 미만이다. 이 유효량은 계산된 EC50의 약 1× 내지 30×일 수 있고, 일부 경우 계산된 EC50의 약 1× 내지 20×, 또는 약 1× 내지 10×일 수 있다. 이 유효량은 계산된 EC50과 또한 동일하거나 또는 이 보다 많을 수 있다. IC50은 시험관내에서 세포 이동/침입을 억제시키는 것으로 계산될 수 있다. 하기 실시예에서 설명되는 것과 같이, 또는 당업계에 공지되어 방법들에 의해 이 과정을 실시할 수 있다.
투약 및/또는 투약 섭생의 유효량은 분석으로부터, 안전성 및 증대 및 투약 범위 시험, 개별 임상의-환자 관계, 뿐만 아니라 시험관내 및 생체 분석들로부터 실험적으로 결정할 수 있다
진단 방법들
본 명세서는 피험자의 생물학적 시료 또는 피험자로부터 단리된 시료에서 c-Met (가령 전장 또는 단편)를 탐지하는 방법을 제시한다. 이 방법들은 진단 및 예후 목적 모두에 유용하다. 대상 방법은 일반적으로 본 명세서의 항체를 세포를 함유하는 시료에 접촉시키고; 및 시료내 세포에 항체의 결합을 탐지하는 것을 포함한다. 세포는 시험관내에 있을 수 있으며, 이때 이 세포는 암 세포들을 보유한 것으로 의심되는 피험자, 암 치료를 겪은 피험자, 또는 치료에 대한 민감성에 대해 테스트를 받은 피험자로부터 수득한 생물학적 시료 안에 있다. 이 세포는 생체내에 있을 수 있으며, 가령, 이 세포는 암 세포들을 보유한 것으로 의심되는 피험자, 암 치료를 겪은 피험자, 또는 치료에 대한 민감성에 대해 테스트를 받은 피험자 안에 있다
면역진단 기술들을 통하여 암 세포들을 가진 또는 가진 것으로 의심되는 피험자의 생물학적 시료에서 c-Met를 발현시키는 세포들을 탐지하는데 항체들을 이용할 수 있다. 이러한 진단법들은 하기에서 공개된 치료법에 순응하는 환자들을 확인하고 및/또는 요법에 대한 반응을 모니터하는데 유용할 것이다.
적합한 면역진단 기술들은 시험관내 및 생체내 (영상) 방법들 모두를 포함하지만 필수적으로 이에 한정되지 않는다. 예를 들면, 항-c-Met 항체들은 탐지가능하도록 표지되고, c-Met의 세포 표면 발현을 특징으로 하는 암을 가진 것으로 의심되는 피험자에게 투여될 수 있고, 당업계에서 이용가능한 영상화 방법들을 이용하여 결합된 탐지가능하도록 표지된 항체를 탐지할 수 있다.
여기에서 이용된 것과 같이, 구절 "생체내 영상화(in vivo imaging)"는 온전하게 살아있는 포유류에서 항체(가령 탐지가능하도록 표지된 클론 21)의 존재를 탐지하는 방법들을 지칭한다. 광학적으로 탐지가능한 단백질들 예컨대 형광 항체들 및 루시퍼라제-콘쥬게이트된 항체들은 생체내 영상화를 통하여 탐지될 수 있다. 살아있는 동물내에서 형광 단백질들의 생체내 영상화는 가령, Hoffman , Cell Death and Differentiation 2002, 9:786-789에서 설명된다. 생체내 영상화를 이용하여 포유류의 2-D 및 3-D 이미지를 제공할 수 있다. 전하-결합 소자 카메라, CMOS, 또는 3D 단층촬영기를 이용하여 생체내 영상화를 실시할 수 있다. 예를 들면, Burdette JE Journal of Mol . Endocrin ., 40: 253-261, 2008,는 컴퓨터 단층법, 자기 공명 영상화, 초음파검사, 양전자 방출 단층 촬영, 단일광자 방출 단층촬영(SPECT), 등의 이용에 대해 검토하였다. 상기에서 설명된 것과 같이 많은 생체내 영상화 방법들로부터 얻은 정보는 피험자에서 암 세포들에 대한 정보를 제공할 수 있다.
이 방법들이 시험관내에서 실시되는 경우, 생물학적 시료는 임의의 시료일 수 있고, 이때 혈액 시료들 (전혈, 혈청, 등을 포함), 조직들, 온전한 세포들 (가령, 온전한 그대로의 세포들), 및 조직 또는 세포 추출물들을 포함하나 이에 한정되지 않는 시료들 안에 암 세포들이 존재할 수 있다. 예를 들면, 이 분석은 살아있는 세포들 또는 조직학적 조직 시료내 세포들에서 c-Met의 탐지를 포함할 수 있다.
구체적으로, 살아있는 세포의 세포외 표면 상에서 탐지할 수 있다. 예를 들면, 이 조직 시료는 고정시킬 수 있고(가령, 포르말린 처리에 의해) 그리고 지지물 (가령, 파라핀)에 빅힌 상태로 제공되거나 또는 냉동된 고정안된 조직으로 제공될 수 있다.
분석은 다양한 형태, 예컨대 경쟁, 직접 반응, 또는 샌드위치 유형 분석들을 취할 수 있다. 분석의 예로는 웨스턴 블랏; 응집 테스트; 효소-표지된 그리고 중개된 면역분석, 예컨대 효소-링크된 면역흡착 분석 (ELISAs); 바이오틴/아비딘 유형 분석; 방사능면역분석; 면역전기이동; 면역침전, 그리고 이와 유사한 것을 포함한다. 반응들은 항체에 콘쥬게이트 탐지가능한 표지들을 일반적으로 포함한다. 표지들은 형광, 화학발광성, 방사능활성, 효소 및/또는 염료 분자인 것들을 포함하고, 또는 시료 안에 항원과 이와 반응한 항체 또는 항체들의 복합물 형성을 탐지하는 다른 방법들을 포함한다.
고형 지지물을 이용할 때, 이 고형 지지물은 항체가 이 지지물에 충분히 고정되도록 적합한 결합 조건하에서 고형상 성분과 우선적으로 반응한다. 일부 경우에, 지지물에 대한 고정은 더 나은 결합 성질을 가진, 또는 항체 결합 활성 또는 특이성의 유의적인 상실없이 지지물 상에 항체를 고정하기 위하여 제공되는 단백질에 항체를 우선 커플링시켜 강화시킬 수 있다. 적합한 커플링 단백질들은 마크로분자들, 예컨대 소의 혈청 알부민 (BSA)을 포함하는 혈청 알부민, 키홀 림페트 헤모시아닌, 면역글로블린 분자, 티로글로블린, 오브알부민, 그리고 당업계 숙련자들에게 공지된 기타 단백질들을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 지지물에 항체를 결합시키는데 이용할 수 있는 다른 분자들은 항체를 고정시키는데 이용되는 이 분자가 항원에 항체가 특이적으로 결합하는 능력에 부정적인 영향을 주지 않는 조건으로, 다당류, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 폴리머 아미노산들, 아미노산 코폴리머들, 그리고 이와 유사한 것을 포함한다. 이러한 분자들 및 이 항체들에 이들 분자를 커플링 시키는 방법들은 당업계에 공지되어 있다.
ELISA 방법을 이용할 수 있는데, 이때 미량적정 플레이트의 웰은 대상 항체로 피복된다. 그 다음 c-Met를 함유하는 또는 함유하는 것으로 의심되는 생물학적 시료를 피복된 웰에 첨가한다. 항체 결합이 허용되도록 충분한 항온처리 기간 후, 이 플레이트(들)을 세척하여 결합안된 모이어티들과 추가된 탐지가능하도록 표지된 제 2 결합 분자를 제거할 수 있다. 제 2 결합 분자는 임의의 포획된 항원과의 반응이 허용되며, 플레이트를 세척하고, 제 2 결합 분자의 존부(存否)는 당업계에 공지되어 있는 방법들을 이용하여 탐지한다.
바람직한 경우, 생물학적 시료로부터 결합된 c-Met의 존부는 항체 리간드에 대항하는 항체를 포함하는 제 2 결합자를 이용하여 용이하게 탐지할 수 있다. 예를 들면, 다수의 항-소 면역글로블린 (Ig) 분자들이 당업계에 공지되어 있고, 이들은 당업계 숙련자들에게 공지되어 있는 방법들을 이용하여 탐지가능한 효소 표지, 예컨대 양고추냉이 과산화효소, 알칼리 포스파타제 또는 우레아제에 바로 콘쥬게이트시킬 수 있다. 그 다음 적절한 효소 기질을 이용하여 탐지가능한 신호를 생성시킬 수 있다. 기타 관련된 구체예에서, 경쟁적-유형 ELISA 기술은 당업계 숙련자들에게 공지된 방법들을 이용하여 실시될 수 있다.
분석은 또한 용액에서 실시할 수 있는데, 이 항체들 및 항원들은 침전 조건하에서 복합체를 형성한다. 항체-피복된 입자들은 적합한 결합 조건하에서 표적 항원을 함유하는 것으로 의심되는 생물학적 시료와 접촉되어, 미립자-항체-항원 복합체 응집물을 형성하고, 이는 침전되고, 세척 및/또는 원심분리를 이용하여 시료로부터 분리시킬 수 있다. 다수의 표준 방법들 예컨대, 상기에서 설명된 면역진단 방법들을 이용하여 반응 혼합물을 분석하여 항체-항원 복합체의 존부를 판단할 수 있다.
대안으로, 살아있는 세포들 내에서 세포성 흡입에 대한 분석은 암 세포들을 양성적으로 확인하는 또다른 진단 기술일 수 있다. 대상 항체들은 c-Met를 발현시키는 세포들에 의해 특이적으로 내재화되기 때문에, 이 세포들은 이 항체들의 내재화를 허용할 수 있고, 내재화되지 않은 임의의 항체들은 씻겨나간다(가령, 산 세척). 내재화된 항체들은 세포들 안에 함유된 항체들의 표지를 통하여 탐지될 수 있다 (가령 FACS, 분광계, 방사능동위원소 카운터, 등).
여기에서 설명된 진단 분석을 이용하여 피험자가 항체-기본 요법을 이용한 요법에 다소 적응성이 있는 암에 걸려있는지를 판단하고, 뿐만 아니라 피험자에서 치료 과정을 모니터할 수 있다. 다른 복합 치료법들의 과정을 평가하는데 또한 이용할 수 있다. 따라서, 이 진단 분석은 임상의가 요법 및 치료 섭생을 선택할 수 있도록 정보를 제공할 수 있다.
본 명세서의 항체들을 포함하는 상기 설명된 분석 물질들은 상기에서 설명된 것과 같이 면역 분석을 실행하도록 적절한 지침 및 기타 필수 시약들과 함께 키트로 제공될 수 있다. 이 키트는 이용되는 특정 면역분석에 따라, 적합한 표지들 및 기타 포장된 시약들 및 재료들(가령 세척 완충액 및 이와 유사한 것)을 또한 포함할 수 있다. 이들 키트를 이용하여 표준 면역분석, 예컨대 상기에서 설명된 것들을 실시할 수 있다.
키트 및 시스템
상기에서 설명된 것과 같이, 이 방법들을 실시하는데 용도를 갖는 키트 및 시스템들이 또한 제시된다. 예를 들면, 키트들 및 시스템들은 여기에서 설명된 하나 이상의 조성물들, 예컨대 항-c-Met 항체 (가령 클론 20 또는 클론 21), 이를 인코딩하는 핵산(특히 상기에서 설명된 임의의 대상 항체들의 중쇄 및/또는 경쇄의 CDR을 인코딩하는 핵산) 또는 이를 포함하는 세포들을 포함할 수 있다. 키트의 기타 임의선택적 성분들은 대상 항체를 투여하기 위한, 및/또는 진단 분석을 실행하기 위한 완충액 등을 포함한다. 키트의 재조합 핵산은 핵산의 불변 영역들에게 결찰을 용이하게 실시하기 위한 제한효소 절단 부위, 다중 클로닝 부위들, 프라이머 부위들, 등을 또한 포함할 수 있다. 키트의 다양한 성분들은 별도의 용기 안에 존재하거나 또는 특정 양립가능한 성분들은 원하는 경우 단일 용기에 사전-병용시킬 수 있다.
이 방법들을 실행하기 위한 키트들 및 시스템들은 여기에서 설명된 항체 조성물들을 포함하는 하나 이상의 제약학적 제형들을 포함할 수 있다. 그것으로서, 이 키트들은 하나 이상의 단위 투약량으로 존재하는 단일 제약학적 조성물을 포함할 수 있다. 이 키트들은 2개 이상의 별도 제약학적 조성물들을 또한 포함할 수 있다.
상기 성분들에 추가적으로, 이 키트들은 방법들을 실시하기 위한 지침들을 추가로 포함할 수 있다. 이러한 지침은 다양한 형태로 키트들 안에 존재할 수 있는데, 이중 하나 이상은 키트 안에 또는 키트 위에 있을 수 있다. 이들 지침이 제공되는 한 가지 형태는 적합한 매질 또는 기질에 인쇄된 정보로 제공되는데, 가령 키트의 포장내 또는 포장 위, 포장 삽입물에 정보가 인쇄된 종이(들)로 제공된다. 또다른 수단은 정보가 기록된 컴퓨터 판독가능한 매체, 가령, 디스켓, CD, 등일 수 있다. 제시될 수 있는 또다른 수단은 떨어진 장소에서 정보에 접근하기 위하여 인터넷을 통하여 이용할 수 있는 웹사이트 주소가 된다. 임의의 편의적인 수단들이 키트들 안에 존재할 수 있다.
세포성 증식성 질환을 앓고 있는 숙주를 치료하는데 이용하기 위하여 키트가 제공될 수 있다. 이 키트는 c-Met에 특이적인 항체를 포함하는 제약학적 조성물과, 피험자에게서 암 세포의 성장을 억제시킴으로써 암을 앓고 있는 숙주를 치료하는 방법에 이 제약학적 조성물의 효과적인 이용을 위한 지침들을 포함한다. 이러한 지침들은 적절한 취급 성질들, 투여 섭생 및 방법, 그리고 이와 유사한 것을 포함할 수 있을 뿐만 아니라, c-Met-연합된 질환에 대해 피험자를 임의선택적으로 스크리닝하는 지침들을 추가로 포함할 수 있다. 이러한 측면은 암의 유형 및 성장에 대하여 치료 시기 및 기간을 포함하는, 본 명세서의 항체를 이용한 치료에 대해 피험자의 잠재적인 반응을 측정하는데 있어서 키트 사용자에게 도움을 줄 수 있다. 따라서 또다른 구체예에서, 이 키트는 암 세포의 세포외부에서 접근가능한 표면 상에 c-Met의 에피토프를 탐지하기 위한 항체 또는 또다른 시약을 추가로 포함할 수 있다. 또다른 구체예에서, 이 키트는 탐지가능한 표지, 예컨대 형광단을 가진 콘쥬게이트를 포함하는 항체를 포함한다.
여기에서 이용된 것과 같이, 용어 "시스템" 은 여기에서 설명된 항체들과 방법들을 실행하기 위한 목적으로 함께 가져온 단일 또는 별도의 조성물 내에 존재하는 하나 이상의 제 2 치료 물질들의 집합을 지칭한다. 예를 들면, 함께 가져와서 피험자에게 함께 투여되는 c-Met에 특이적인 별도로 수득된 항체와 화학요법 투약 형태는 본 명세서에 다른 시스템이다.
다음의 실시예들은 대상 발명을 어떻게 만들고 이용하는 지에 대한 완벽한 개시 및 설명을 당업계 숙련자들에게 제공하기 위하여 제시된 것이지만 본 발명의 청구범위를 이에 한정시키려는 의도는 없다.
실험 방법
세포주 및 배양. H1993, H460, H441, A549 및 CL1-5를 포함하는 PC3 (전립선 암) 인간 폐암 세포주는 5% CO2를 함유하는 가습 대기하에서, 37℃에서 10% FBS (Invitrogen)를 함유하는 RPMI 1640에서 성장시켰다. SAS (경구 암), HCT116 (결장 암), Mahlavu (간 암), NPC-TW04 (비인두 암) (Lee et al . (2004) Cancer Res 64:8002-8008), PaCa (췌장 암), U2OS (골육종) 및 293T는 10% FBS와 함께 DMEM에서 성장시켰다. A498 (신장 세포 암종)은 MEM에서 배양하였다. MDA-MB231 (유방 암)은 10% CO2 대기하에서 50% DMEM이 혼합된 F12 배지에서 배양하였다. CL1-5는 Chu et al . (1997) Am J Respir Cell Mol Biol 17:353-360에 의해 확립되었다. Mahlavu는 Dr . Hsiao M ( GRC , Academia Sinica , Taiwan )으로부터 기증받았다. 기타 세포주는 American Type Culture Collection으로부터 구하였다. 인간의 배꼽 정맥 내피 세포들 (HUVECs) 및 인간의 정상 코 점막 (NNM) 세포들의 준비는 기존 연구에서 설명하고 있다(Lee et al . (2007) Cancer Res 67:10958-10965; Lee et al . (2004) Cancer Res 64:8002-8008).
파아지 -디스플레이된 인간 고유의 scFv 라이브러리의 구축. 간단하게 설명하자면, 올리고 dT 프라이머에 의해 Superscript III 역 전사효소(Invitrogen)를 이용하여 인간의 비장세포 조직의 7개 개별 시료들의 mRNA 혼합물로부터 cDNA를 합성하였다. VH 및 VL 유전자들은 특이적 프라이머들와 함께 PfuUltra 중합효소 (EMD Biosciences)를 이용하여 PCR을 통하여 증폭시켰다(Marks et al ., 1991). PCR 산물들은 아가로즈 겔로부터 단리시키고, 핵산 정제 키트(Qiagene)를 이용하여 정제하였다. VH 및 VL 유전자 인코딩 영역들은 차례로 5'(SfiI) 및 3' (NotI) 말단에서 각각 특이적 제한 효소 부위를 담고 있는 프라이머들을 이용하여 PCR에 의해 (GGGGS)3 아미노산 잔기들을 인코딩하는 DNA 단편으로 어셈블리하였다. 어셈블리된 산물들은 SfiI 및 NotI (NEB)에 의해 제한효소 절단시키고, 이어서 pCANTAB-5E 파아지미드 벡터 (GE Healthcare) 안으로 결찰시켰다. 인간 scFv 유전자를 담고있는 pCANTAB-5E 벡터들을 컴피턴트(competent) TG1 대장균 세포들 안으로 전기천공(electroporate)시켰다. 전기천공후, TG1 대장균 세포들을 회수하였고, 100 μg/ml의 암피실린 및 2% 포도당을 함유하는 2YT 배지 (BD) (2YT-AG)에서 항온처리를 지속하였다. M13KO7 파아지에 의해 TG1 세포들이 구출되었고, 그 다음 scFv를 나타내는 파아지 미립자들이 이 배양 배지에 생산되었다.
라이브러리 바이오패닝(biopanning)에 의한 파아지 -디스플레이된 항-c- Met scFv 의 선별. 특이적 항-c-Met scFv를 나타내는 파아지들의 선별은 단백질 G Dynabeads (Invitrogen)에 의해 실행하였다. c-Met-Fc 재조합 단백질 (R&D)은 실온에서 1시간 동안 단백질 G Dynabeads와 항온처리하였다. scFv 라이브러리 (2×109 개 구성요소들)는 단백질 G Dynabeads에서 비-특이적 결합으로 빠지게 되었고, 후속적으로 4℃에서 1시간 동안 c-Met-Fc 고정된 Dynabeads와 함께 항온처리하였다. PBST로 4회 세척하여 결합안된 파아지들을 제거하였다. c-Met-Fc에 결합된 파아지들은 대장균 TG1 세포들과 함께 37℃에서 30분 동안 감염에 의해 회수되었다. 감염된 세포들의 일부는 역가를 결정하기 위하여 연속적으로 희석되었고, 다른 것들은 M13KO7 헬퍼 파아지 (NEB)에 의해 구출되었다. 구출된 파아지들의 역가를 측정한 후, 바이오패닝의 다음 과정을 실시하였다. 바이오패닝의 4번째와 5번째 과정에서, ELISA 스크리닝을 위한 배양에 파아지 클론들을 무작위로 선택하였다.
c- Met 를 과다발현시키는 293T 세포들에 대한 선별된 파아지 클론의 결합 특이성을 평가. 면역형광 착색 분석을 위하여, 293T 세포들을 커버슬립 상에서 80% 합류되도록 성장시켰다. 세포들에게 pEF-c-Met 발현 벡터의 형질감염은 제조업자의 지침에 따라 Lipofectamin 2000 (Invitrogen)을 이용하여 실시하였다. 형질감염후 48시간 시점에서, 이 세포들은 4℃에서 30분 동안 1×1010 파아지 역가로 선별된 항-c-Met 파아지 또는 대조군 파아지와 함께 항온처리하였다. 세포들을 PBS로 2회 세척시킨 후, 4% 파라포름알데히드로 고정시키고, 0.1% TritonX-100으로 투과시키고(permeabilize) 그리고 3% BSA로 차단시켰다. 이 세포들을 토끼 항-myc 항체 (Sigma-Aldrich) 및 마우스 항-M13 파아지 항체로 프로브시키고, 이어서 차례로 로다민-표지된 염소 항-토끼 IgG 및 FITC-표지된 항-마우스 IgG를 이용하여 착색시켰다. 핵은 DAPI로 착색시켰다. 역 형광 현미경(Axiovert 200M, Zeiss)을 이용하여 형광 영상을 확보하였다.
유동세포분석법 분석을 위하여, 상기에서 설명한 것과 같이, 293T 세포들을 80% 합류되도록 성장시키고, pEF-c-Met 발현 벡터로 형질감염시켰다. 48시간 후, 형질감염된 세포들은 0.05% Trypsin-EDTA로 수거하였고, FACS 완충액(1% 태아 소 혈청을 함유하는 PBS)에서 4℃에서, 1 시간동안 1×1010 파아지 역가로 선별된 파아지 또는 대조군 파아지와 함께 항온처리하였다. FACS 완충액으로 세포들을 세척시킨 후, 마우스 항-M13 파아지 Ab와 함께 1시간 동안 4℃에서 항온처리하였고, 이어서 R-피코에리트린-콘쥬게이트된 염소 항-마우스 IgG (Jackson ImmunoResearch)와 함께 30분 동안 4℃에서 항온처리하였다. FACSCantoII (BD)를 이용하여 분석을 실행하였고, 이들의 결합 친화력을 정량적으로 비교하기 위하여 FACSDiva 소프트웨어 (BD)를 이용하여 방출 형광 강도를 측정하였다.
가용성 scFv 의 발현 및 정제. 항-c-Met scFv 파아지 클론 1, 20 및 21은 대장균 균주 HB2151에 개별적으로 감염시키고, 박테리아의 주변세포질(periplasmic) 추출물을 준비하였다. 제조업자의 지침에 따라 단백질 L 아가로즈 컬럼(Thermo Scientific)을 이용하여 주변세포질 추출물에서 가용성 scFv를 정제하였다. 정제된 scFvs를 PBS와 함께 완벽하게 투석시켰고, 환원 SDS-PAGE에 이어서, 코마시 블루 착색 및 항-E 태그 Ab (GE Healthcare)로 프로빙시켜 웨스턴 블랏 분석으로 분석하였다.
인간 c- Met 유전자를 인코딩하는 포유동물 발현 벡터의 구축. 인간의 전체 c-Met cDNA (NM_001127500.1)는 특이적 프라이머들에 의한 Superscript III 역 전사효소들을 이용하여 HepG2 세포들의 총 RNA로부터 합성하였고, 그 다음 PCR 주형으로 이용하였다. 전장 c-Met를 인코딩하는 DNA는 PfuUltra 효소를 이용하여 PCR로 증촉시켰고, myc-태그 에피토프 pEF 벡터 (Invitrogen)에 틀내(in frame) 결찰시켜 pEF-c-Met-myc를 만들었다. DNA 단편들 인코딩 c-Met의 아미노산 잔기들 1 내지 932와 1 내지 567을 인코딩하는 DNA 단편들을 PCR을 이용하여 증폭시켰고, pEF 벡터에 클론시켜, 차례로 pEF-c-MetF932 및pEF-c-MetF567을 만들었다. 인간 IgG1 Fc의 코딩 영역은 인간 비장세포 cDNA 라이브러리로부터 수득하였고, c-MetF9932 및 c-MetF567의 카르복실 말단에 틀내 클로닝시켜, 차례로 pEF-c-MetF932-Fc 및 pEF-c-MetF567-Fc를 만들었다.
c- Met - 절두된 재조합 단백질의 생산 및 정제. c-MetF932-Fc 및 c-MetF567-Fc 융합 단백질은 차례로 pEF-c-MetF932-Fc 또는 c-MetF567-Fc와 함께 Lipofectamin 2000을 이용하여 일시적으로 형질감염된 293T 세포들의 배양 상청액으로부터 준비하였다. 형질감염후 72시간 시점에, 여과된 상청액들을 1 ml의 단백질 G 아가로즈 컬럼(GE healthcare)에 제공하였다. PBS로 세척한 후, 결합된 단백질들은 0.1 M의 글리신-HCl pH 2.8으로 용출시키고, 이어서 1 M의 Tris-HCl pH 9.1로 중화시켰다. 용출제(용출제)는 PBS로 충분히 희석시켰고, Amicon Ultra-4 Centrifugal 필터 (cut-off 10kDa; Millipore)을 이용하여 농축시켰다.
공촛점 현미경으로 확인한 항-c- Met scFv 의 내재화. H1993, H460, 및 c-Met-녹다운 H460 세포들을 커버슬립 상에 접종시켰고, 80% 합류되도록 성장시켰다. 이 세포들을 항-c-Met scFv S1 또는 S20와 함께 4℃ 및 37℃에서 30분 동안 항온처리 하였다. PBS로 2회 세척한 후, 이 세포들을 4% 파라포름알데히드로 고정시켰고, 3% BSA를 추가하여 차단시켰다. 이 세포들을 항-Flag 항체 (Sigma-Aldrich)로 착색시키고, 그 다음 FITC-표지된 염소 항-마우스 IgG (Jackson ImmuneResearch) 및 DAPI (Invitrogen)으로 프로브시켰다. 모든 형광 영상은 공촛점 현미경 (TCS-SP5, Leica)으로 얻었다.
항-c- Met scFv20 - cys ( Ms20 )의 생산을 위한 원핵성 발현 벡터의 구축. 원핵성 발현 벡터, pFHC는 pCANTAB-5E로부터 NotI - EcoRI 효소 절단을 통하여 E 태그 및 pIII DNA 단편을 제거하고 그리고 NotI -EcoRI 부위를 통하여 FLAG 태그, 헥사히스티딘 및 시스테인 잔기를 인코딩하는 합성된 DNA 단편을 삽입하여 만들었다. pCANTAB-5E-S20으로부터 잘라낸 항-c-Met S20 유전자를 NcoI - NotI 부위를 통하여 pFHC 벡터에 결찰시켰다. 구축된 벡터를 대장균 BL21 (Novagen)으로 형질전환시켜 카르복실 말단에 헥사히스티딘 및 시스테인을 함유하는 scFv를 발현시켰다.
항-c- Met scFv20 - cys ( Ms20 )의 발현 및 정제. 대장균 BL21의 단일 콜로니를 100 μg/ml의 암피실린 (TB-A)을 함유하는 Terrific Broth (TB; MDBio, Taiwan) 에 접종시키고, 30℃에서 하룻밤 동안 배양시켰다. 하룻밤 배양물의 1/50 용적 희석액을 2.5 리터의 새로운 TB-A에서 30℃에서 성장시켰다(OD600이 0.5에 도달할 때까지). IPTG를 최종 농도가 0.4 mM이 되도록 추가하고, TB-A에서 0.4 M 슈크로즈를 바로 용해시킴으로써 유도를 시작하였다. 250 rpm에서 진탕(shaking)시키면서, 30℃에서 16시간 동안 배양을 지속하였다.
20,000g×에서 30분 동안 원심분리에 의해 상청액을 제거하였고, 그 다음 박테리아 펠렛을 200 ml의 차가운 TES 완충액(10 mM Tris, 20 % 슈크로즈 및 1 mM EDTA pH 8.0; EMD Biosciences)에 재현탁시키고, 부드럽게 교반시키면서 4℃에서 1시간 동안 항온처리하였다. 22,000g×에서, 30분 동안 원심분리에 의해 삼투 쇼크 분획을 수거하였다. 얼음으로 냉각된 5 mM의 MgSO4에서, 부드럽게 교반시키면서 1시간 동안 펠렛을 항온처리하여 주변세포질 추출물을 수득하였다.
삼투 쇼크 분획(Osmotic shock fraction) 및 주변세포질 추출물은 Ms20의 최대 회수를 위하여 병용시켰고, 복합된 시료에 NaCl을 최종 농도가 0.5 M가 되도록 그리고 이미다졸을 최종 농도가 0.5 mM이 되도록 추가하였다. 5 ml의 Ni+-NTA 세파로즈 컬럼(GE Healthcare)은 15 ml의 결합 완충액 (20 mM Tris, 0.5 M NaCl 및 5 mM 이미다졸 pH 7.9)로 평형을 이루게 하고, 이어서 시료를 로딩하였다. 결합된 Ms20은 용출 완충액 (20 mM Tris, 0.5 M NaCl 및 1 M 이미다졸 pH 7.9)으로 용출시켰다. 용출제는 두 번 변화를 위하여 4℃에서 PBS에 대해 철저하게 투석시켰다. 투석 후, 단백질 A 아가로즈 컬럼(2ml) (GE Healthcare)을 이용하여 시료를 다시 정제하였다. 다시 정제된 Ms20는 2번의 변화를 위하여 HEPES 완충액 (20 mM HEPES, 150 mM NaCl 및 1 mM EDTA, pH 7.0)에 대해 투석시켰고, 그 다음 10 kDa-컷오프 튜브 (Amicon Ultra, Millipore)를 이용하여 농축시켰다.
결합 동역학의 측정. 항-c-Met scFv의 친화력 및 동역학은 BIAcore X (GE healthcare)에서 SRP에 의해 측정하였다. BIAcore 유동쎌에서, 30 μg/ml의 c-MetF932-Fc 단백질은 제조업자의 지시에 따라 EDC- 및 NHS-활성화된 CM5 센서 칩 상에 연결시키고, 이어서 에탄올아민으로 차단시켰다. 5 내지 200 nM 범위의 scFv 농도를 이용하여 30 μl/min의 연속 유속하에서 차례로 3분과 5분 동안 연합된 그리고 해리된 상들을 모니터하였다. 재생 완충액 (0.2 M NaCl, 10 mM 글리신, pH 2.7)의 주사에 의해 재생을 실행하였다. 결합 상수를 결정하기 위하여, BIAevaluation 소프트웨어 (GE healthcare)를 이용하여 시료 1:1 상호작용 모델에 센소그램(sensorgrams)을 전체적으로 맞추었다.
경쟁 결합 분석. scFv의 억제 효과를 모니터하기 위하여, c-MetF932-Fc 단백질을 96-웰 플레이트에 피복시키고, 비-특이적 결합자는 3% BSA/PBS로 차단시켰다. 1 nM 인간 HGF (R&D)와 다양한 농도의 항-c-Met scFv 또는 정상적인 마우스 IgG를 웰에게 제공하였다. c-Met에 결합된 HGF의 양은 염소 항-인간 HGF (R&D)를 이용하고, 이어서 HRP-표지된 마우스 항-염소 IgG (Jackson ImmuneResearch) 및 OPD 기질(Sigma) + H2O2의 항온처리에 의해 측정하였다. 마이크로플레이트 판독기를 이용하여 490nm에서 흡수도를 측정하였다. 다음의 식을 이용하여 억제 비율을 계산하였다. : [(경쟁자없이 결합된 HGF의 흡수도) - (경쟁자와 함께 결합된 HGF의 흡수도)]/ (경쟁자없이 결합된 HGF의 흡수도)× 100%.
Ms20 를 표적하는 리포좀성 독소루비신 ( Ms20 - LD )의 구축. 정제된 Ms20이 콘쥬게이트용 환원된 티올 기를 보유하였는 지를 확인하기 위하여, N2 대기, 실온에서 2시간 동안 Ms20의 분자간 이황화결합을 환원시키기 위하여 2 mM TCEP (트리스(2-카르복시에틸)포스핀; Sigma-Aldrich)을 처리하였다. 환원된 Ms20는 HEPES 완충액으로 용출시킨 HiTrap G-25 컬럼(GE healthcare)에 의해 탈염되었다. 말레이미드-카르복실 다중에틸렌 글리콜 (Mr 2,000)-유도된 디스테아로일포스파티딜에탄올아민(말레이미드-PEG-DSPE; NOF Corporation, Japan)을 페길화된 리포좀성 독소루비신 (Lee et al ., 2004; Lo et al ., 2008) 에 통합시키는 것은 하기와 같이 설명하고 있다. 말레이미드-PEG-DSPE를 HEPES 완충액에 용해시켰고, 리포좀 인지질의 0.5 mole%로 LD에 추가하였고, 이 혼합물을 부드럽게 교반시키면서 60℃에서 1 시간 동안 항온처리하였다. 환원된 Ms20은 한 개 리포좀 안에 약 60개의 Ms20을 만들기 위하여 4℃에서 하룻밤 동안 콘쥬게이트를 위하여 말레이미드-PEG-DSPE-삽입 LD와 함께 항온처리하였다. 모든 비활성 말레이미드 기들을 비활성화시키기 위하여 2-멀캅토에탄올(최종 농도 2 mM)을 이용한 후, 세파로즈 4B (GE healthcare) 겔 여과 크로마토그래피를 이용하여 방출된 유리(free) 약물, 콘쥬게이트안된 scFv, 그리고 병합안된 콘쥬게이트들을 제거하였다. 용출제의 분획내 독소루비신 농도는 분광형광계(Spectra Max M5, Molecular Devices)를 이용하여 λEx / Em = 485/590 nm에서 측정하였다. Ms20-LD 분획물들은 환원 SDS-PAGE으로 분리시키고, 이어서 콘쥬게이트 효과를 측정하기 위하여 질산은으로 착색시켰다.
인간 폐암 세포들에 Ms20-LD의 결합 확인. 이 세포들은 12-웰 플레이트 상에서 90% 합류되도록 성장시켰다. 도말된 세포들은 LD 또는 Ms20-LD (0.625-10 μg/ml의 독소루비신)의 연속 희석액으로 4℃에서 1 시간 동안 항온처리하였다. 항온처리 후, 이 세포들을 PBS로 세척하였고, 200 μl의 1% Triton X-100으로 용해시켰다. 독소루비신의 추출을 위하여, 300 μl의 IPA (0.75 N의 HCl/이소프로판올내)를 용해물에 추가하였고, 30분 동안 진탕시켰다. 용해물들을 12,000 rpm에서 5분간 원심분리시킨 후, 분광형광계로 λEx / Em = 485/590 nm에서 독소루비신에 대해 상청액을 측정하였다. 독소루비신의 농도는 표준 곡선을 이용하여 내삽법으로 계산하였다.
인간 암 세포들에 의한 Ms20-LD의 흡입. 이 종양 세포들은 12-웰 플레이트 상에서 90% 합류되도록 성장시켰다. 완전 배양 배지내 2.5 μg/ml의 Ms20-LD 또는 LD를 첨구하였고, 배양된 시간 동안 37℃에서 항온처리를 지속하였다. 이 세포들을 PBS로 세척하였고, 세포 표면 상에 있는 Ms20-LD 및 LD는 10분간 0.1 M의 글리신 pH 2.8로 제거하였다. 상기에서 설명된 것과 같이, 이 세포들에 의한 독소루비신의 흡입 양을 탐지하였다.
Ms20-LD의 세포성 흡입에 대한 공촛점 현미경 분석. H1993 세포들은 커버슬립상에서 준합류(subconfluency)되도록 성장시켰다. 2.5 μg/ml의 Ms20-LD 또는 LD를 함유하는 완전 배양 배지에서 37℃에서, 다양한 시간 동안 이 세포들을 항온처리하였다. PBS로 2차례 세척한 후, 이 세포들은 4% 파라포름알데히드로 고정시키고, 3% BSA를 추가하여 차단시켰다. 세포 막과 핵은 Alexa Fluor 647-콘쥬게이트된 밀배아 아글루티딘 (Invitrogen) 및 DAPI (Invitrogen)으로 차례로 착색시켰다. 세포내 독소루비신은 형광으로 λEx / Em = 485/590 nm에서 탐지되었다. 모든 형광 영상은 레이져 스캐닝 공촛점 현미경 (TCS-SP5, Leica)으로 잡았고, LAS AF 소프트웨어 (Leica)로 분석하였다.
세포 생존능 분석. 세포들을 웰당 3,000개로 96-웰 플레이트 상에 접종시키고, 37℃에서, 24시간 동안 배양 배지내(10% FBS) 다양한 농도의 MS20-LD 또는 LD(0-20 μg/ml)와 함께 항온처리시켰다. 과량의 약물을 제거한 후, 이 세포들을 PBS로 1회 세척시키고, 37℃에서 48시간 동안 배양 배지와 함께 항온처리를 지속하였다. MTT (Invitrogen) 분석에 의해 세포 생존능을 탐지하였다. 0.1 mg/ml의 MTT를 함유하는 배양 배지로 37℃에서 2.5 시간 동안 이 세포들을 항온처리하였다. 포르마잔 결정들을 후속적으로 DMSO (Sigma-Aldrich)에 용해시켰고, 미량적정 판독기(Model 680, BioRad)를 이용하여 540nm에서 흡수도를 측정하였다. 각 분석은 3회 반복하였다. 처리 안된 대조군 세포들의 생존과 비교하여 살아있는 세포들의 %로 데이터를 제시하였다.
시험관내 ( in vitro ) 세포 아폽토시스 ( apoptosis ) 연구. H1993 세포들을 24-웰 플레이트 상에 접종시키고, 하룻밤 동안 흡착시키고, 그 다음 10% FBS를 포함하는 RPMI1640에서 차례로 2.5 μg/ml Ms20-LD 또는 LD와 함께 항온처리하였다. 약물과 함께 24, 48, 및 72 시간 동안 항온처리한 후, 이 세포들을 용해 완충액 (Cell Signaling)내에 수거한 후, 웨스턴 블랏 분석을 거치도록 하였다. 다음 항체들을 이용하였다: 토끼 항-절단된 카스파제 9 (Asp315), 토끼 항-절단된 카스파제 3 (Asp175), 토끼 항-PARP (모두 Cell Signaling로부터 구입함), 그리고 마우스 항-알파-튜불린(Sigma-Aldrich). BioSpectrum 600 영상 시스템 (UVP)을 이용하여 화학적 발광 신호를 탐지하였고, VisionWorksLS 소프트웨어 (UVP)를 이용하여 정량화하였다.
scFv - 콘쥬게이트된 양자점(Quantum Dots:QD)의 합성. 시험관내 세포 결합 및 생체내 영상화를 위하여 차례로 Qdot 705 및 Qdot 800 ITK 아미노 PEG 양자점 (Invitrogen)를 이용하였다. 리간드-콘쥬게이트된 QD의 합성 과정은 기존 보고(Cai and Chen (2008) Nat Protoc 3:89-96)를 변형시킨 것이었다. 간단하게 설명하자면, QD 상에 말레이미드-활성화된 표면을 만들기 위하여 술포-SMCC (술포숙시니미딜-4-(N-말레이미도메틸) 사이클로헥산-1-카르복실레이트; Pierce)에 QD를 콘쥬게이트시키고, 자유 술포-SMCC는 NAP-10 탈염 컬럼(GE healthcare)으로 제거하였다. Ms20는 TCEP에 의해 환원시켜, 카르복실 말단에 활성화된 티올 기를 얻고, 후속적으로 하룻밤 동안 말레이미드-기능화된 QD와 함께 4℃에서 항온처리시켰다. HEPES 완충액으로 용출시킨 세파로즈 4B 겔 여과 크로마토그래피를 이용하여 Ms20-콘쥬게이트된 QD를 정제하였다. 분광형광계로 QD의 농도를 검사하였고, 표준 곡선을 이용한 내삽법에 의해 계산하였다.
인간 종양 이종이식편들의 생체내 형광 영상화. Six 12-주령의 SCID 수컷 마우스 6마리에게 2×106의 H1993 세포들을 피하로 이식하였다. 종양의 크기가 대략 300 mm3에 도달하였을 때, 이 마우스들을 무작위로 2개 집단(각 집단에 3마리의 마우스)으로 나누고, 400 pmole의 Ms20-QD 또는 QD를 차례로 정맥내 주사하였다. 마우스를 이소플루란 마취하에 두었고, Xenogen IVIS 200 영상 시스템 (Excitation: 525/50 nm; Emission: 832/65 nm)을 이용하여 지정된 시간들에서 형광 영상을 얻었다. 영상 과정 종료시, 경부 탈구(dislocation)에 의해 마우스들을 희생시켰다. 이 마우스로부터 장기 및 종양들을 절제해내고, 형광 영상을 거치도록 하였다. QD의 축적과 함께 Ms20-QD의 종양 축적을 정량적으로 비교하기 위하여, Living 영상 소프트웨어 (Xenogen)를 이용하여 배경을 뺌으로써 형광 강도를 계산하였다.
생체내 파아지 표적화 분석용 동물 모델. 5×106 폐암 세포들을 6마리의 SCID 마우스 (6-주령)의 피하로 주사하였다. 종양의 크기가 대략 300 mm3에 도달하였을 때, 이 마우스들을 무작위로 2개 집단(각 집단에 3마리의 마우스)으로 나누고, 항-c-Met scFv 파아지 클론 20 또는 대조군 파아지를 2×109 cfu로 정맥내로 주사하였다. 50 ml의 PBS로 관류시킨 후, 장기들 및 종양 조직을 제거하였고, 냉각된 PBS로 세척하였고, 무게를 측정하였다. 종양 조직에 결합된 파아지들은 TG1의 성장으로 회수하였고 그리고 용출된 파아지들에 대한 역가를 측정하였다.
인간 종양을 보유하는 마우스에서 표적화 파아지들의 조직 분포는 Super Sensitive 폴리머-HRP IHC 탐지 시스템 (BioGenex)을 이용하여 면역조직화학으로 평가하였다. 파라핀에 박혀있는 조직 견본들은 마우스 항-M13 Ab로 착색시킨 후, Super Enhancer 시약 및 폴리머 양고추냉이 과산화효소-표지된 항-마우스 IgG로 착색시켰다. PBST (0.1% Tween 20/PBS)로 세척시킨 후, 3,3'-디아미노-벤지딘(DAB) 용액 + 0.01% H2O2에 단편들을 담구고, PBST로 세척하였다. 이 조직 단편들은 헤마토실린으로 반대착색시키고, PBS내 50% 글리세롤과 함께 탐재한 후, 정립 현미경 (Axioplan 2 Imaging MOT, Zeiss)을 이용하여 검사하였다. 동물의 관리는 Academia Sinica, Taipei, Taiwan의 지침에 따라 실시하였다.
scFv-표적화된 요법에 의해 항종양 효과 측정을 위한 동물 모델. H460-유도된 폐암 이종이식편들 (~75 mm3)을 보유하는 SCID 마우스의 꼬리 정맥으로 Ms20-LD, LD 또는 동량의 PBS와 함께 전체 독소루비신 투약분량이 4 mg/kg (1 mg/kg, 일주일에 1회) 되도록 주사하였다. 종양을 칼리퍼로 일주일에 2회 측정하였고, 약물 독성의 증상으로 인한 체중 감염에 대해 일상적으로 마우스를 관찰하였다. 다음의 식에 따라 종양 체적을 계산하였다: 길이×(폭)2×0.52.
말단 데옥시뉴클레오티딜 전이효소-유도된 dUTP 니크 ( nick ) 단부 표지 (TUNEL) 분석. 처리를 받은 마우스로부터 종양을 제거하였고, 액화 질소내 O.C.T Compound (Tissue-Tek)와 함께 묻었다. 냉동 종양 조직 절편(sections)들을 준비하였고, 제조업자(Roche Diagnostics)의 지시에 따라 TUNEL 시약으로 처리하고, DAPI으로 반대착색시켰다. 전체 절편들은 TissueFAXS 시스템 현미경 (TissueGnostics)을 이용하여 스캐닝하였다. 모든 세포들의 확인을 위한 마스터 채널로써 DAPI를 세팅함으로써 MetaMorph 소프트웨어 (Molecular Devices)으로 정량화하였다.
종양 혈관 착색. 냉동된 종양 조직들로부터 절편들을 준비하였다. 이 절편들을 1% 파라포름알데히드로 고정시켰고, PBS로 세척시키고, 정상적인 말 혈청 (Vector Laboratories)에서 차단시킨 후, 쥐 항-마우스 CD31 (BD)와 함께 항온처리하였다. 0.1% Tween 20를 담고있는 PBS로 세척한 후, Alexa Fluor 594-콘쥬게이트된 항-쥐 IgG (Invitrogen)와 함께 절편들을 침잠시켰다. TissueFAXS 시스템 현미경으로 절편들을 스캐닝하였고, MetaMorph를 이용하여 형광 영상들을 분석하였다.
실시예 1
c-Met에 결합하는 파아지-디스플레이된 scFv의 확인
c-Met-결합 scFv를 선별하기 위하여, 2×109 구성부를 함유하는 파아지-디스플레이된 인간 고유의 scFv 라이브러리를 구축하였다. 라이브러리로부터 Dynabeads-결합 파아지들을 우선 제거하고, c-Met-콘쥬게이트된 Dynabeads에 의한 c-Met-결합 파아지들을 선별하였다. 5회 친화력 선별 후, 5회째 파아지 회수는 첫 번째 경우보다 약 1000-배 증가되었다(도. 1, 패널 A). 59개 파아지 클론들을 무작위로 선별하였고, ELISA를 이용하여 c-Met 결합에 대해 테스트하였다. 14개 파아지 클론들은 c-Met-Fc 단백질에 대해 우수한 결합 활성을 보유한 것으로 밝혀졌다(A490 > 0.2). 대조군 파아지 (Con-P)는 음성 대조군으로 이용하였다. c-Met에 특이적으로 결합하지만, VEGFR2 및 BSA 대조군 단백질에 결합하지 않는 16개 클론들을 확인하였다(도 1, 패널 B). 16개의 모든 개별 클론들을 서열화함으로써, 3가지 독특한 항-c-Met 파아지 클론들(PC1, PC20, 및 PC21)을 확인하였다. 하기 표 1 참고.
[표 1]
항-c-Met scFvs의 VH 및 VL 도메인들의 아미노산 서열들
Figure pct00001
VH 및 VL 도메인들 모두에 대한 상보성-결정 영역들 1-3 (CDR1-3), 및 기본골격 영역들 1-4 (FW1-4)은 상기 표에 나타낸다. V 도메인 족들은 VBASE2 데이터베이스 (www.vbase2.org)를 이용하여 배열시켰다.
이 3가지 파아지 클론들의 특이성 및 결합 친화력을 검사하기 위하여, 동일한 파아지 역가를 이용한 비교성 ELISA를 실시하였다. PC1은 PC20 또는 PC21 보다 더 강력한 c-Met 결합 친화력을 보유하였다(도 1, 패널 C). 인간 c-Met를 정규장소외(ectopically)에서 발현시키는 293T 세포들을 이용한 유동세포분석법 및 면역형광 분석에 의해 세포 표면 c-Met에 대한 이들 3가지 클론의 결합을 평가하였다. 파아지 미립자들 및 외인성 c-Met를 차례로 항-M13 및 항-myc 항체들에 의해 탐지한 후, 파아지 미립자를 c-Met를 과다발현시키는 293T 세포들과 항온처리하였다. 도 1, 패널 E의 대표적인 영상은 c-Met-myc가 국소화된 항-c-Met 파아지들을 설명하는데, 이는 세포 발현된 c-Met에 대한 이들의 결합 특이성을 나타낸다. 세 가지 클론들 모두 과다발현된 c-Met를 가진 293T 세포들에 결합하지만, 293T 세포들에는 결합하지 않았다(도1, 패널 D 및 E). 그러나, 유사하게, 세포성 c-Met에 대한 PC1의 결합 능력은 PC20 및 PC21 보다는 더 높았다. 후속적으로, 항-c-Met scFvs의 역학 상수를 조사하기 위하여, c-Met932-Fc 재조합 단백질을 만들었고, 뿐만 아니라 PC1, PC20, 및 PC21 차례로 대응하는 S1, S20, 및 S21로 명명된 가용성 항-c-Met scFvs를 만들었다. 가용성 c-Met932-Fc 단백질은 단백질 G 세파로즈 컬럼을 통하여 정규장소외로 c-Met932-Fc-발현시키는 293T 세포들의 배양 배지로부터 정제하였다(도 8). 가용성 항-c-Met scFvs는 단백질 L 아가로즈 크로마토그래피에 의해 파아지-감염된 대장균 HB2151의 주변세포질 추출물로부터 정제시키고, 그 다음 단백질 분자량 표식에 대응하는 30kDa 주변에 국소화된 정제된 항-c-Met scFv 단백질들(S1, S20 및 S21)을 나타내는 코마시 블루 착색으로 평가하였다.(도 8의 상부 패널, 패널 B).
c-Met932-Fc 단백질에 대한 각 가용성 scFv의 결합 역학 상수(K on 및 K off ) 및 친화력은 표면 플라스몬 공명 (SPR)으로 측정하였다. 각 가용성 scFv for c-Met932-Fc 에 대한 각 가용성 scFv의 K d 값은 6.82 내지 14.9 nM 범위다. 하기 표 2 참고.
[표 2]
항-c-Met scFvs의 동역학 상수 및 결합 친화력
Figure pct00002
K on 및 K off 는 정제된 scFvs를 이용하여 BIAcore에서 SRP로 측정하였고, K d 값은 BIAevaluation 소프트웨어를 이용하여 계산하였다.
실시예 2
인간 암 및 VEGF-자극된 내피 세포들에 결합된 항-c-Met scFvs
내생성 c-Met에 대한 항-c-Met scFvs의 결합 활성을 ELISA를 이용하여 암 세포들에서 분석하였다(도 9, 패널 A). 대조군 항체와 비교하였을 때, 항-c-Met S1 및 S20는 모두 SKOV3, Mahlavu, SAS, PC3, MDA-MB-231, HCT116, Paca-2, NPC-TW04, H1993 세포들을 포함하는, 몇 가지 유형의 인간 세포 암 계통에 결합하는 것으로 밝혀졌다. 그러나, scFvs는 A498, U2OS, 및 NNM 세포들과는 반응하지 않았다. 정상적인 마우스 IgG를 대조군 항체로 이용하였다. FACS 분석을 실행하여 항-c-Met scFvs가 모두 VEGF-자극 HUVECs에 결합되는지를 증명하였다. 항-CD31 항체 및 대조군 scFv를 차례로 양성 및 음성 대조군으로 이용하였다(도 9, 패널 B).
항-c-Met scFv가 인간 암 세포들 상에 있는 내생성 c-Met에 특이적으로 결합하는 지를 더 확인하기 위하여, H460 세포들 및 c-Met 녹다운 H460 세포들은 S1 또는 S20중 하나인 항-c-Met scFv로 착색시키고, FACS 분석을 실행하였다(도 10, 패널 B). scFvs는 모두 H460 세포들에 결합할 수 있었지만, scFvs의 결합 활성은 c-Met 녹다운 H460 세포들에서 급진적으로 감소되었다. β-튜불린은 음성 대조군으로 작용하였고, *bkg는 도 10, 패널 A에서 배경 신호를 나타낸다.
실시예 3
항-c-Met scFv에 의해 암세포들에 HGF 결합 경쟁
3가지 항-c-Met scFvs가 c-Met에 HGF의 결합을 억제할 수 있는 지를 테스트하기 위하여, 인간 폐암 세포 계 H1993를 선택하여 경쟁 ELISA를 실시하였다(Lutterbach B et al . (2007) Cancer Res 67:2081-2088). 대조군 파아지 (Con-P)는 동일한 조건하에서 결합에 영향을 주지 않았다. 경쟁물질들 없이 HGF가 H1993 세포에 결합하는 것을 100%로 간주하였다. H1993는 c-Met를 높은 수준으로 발현시키는 것으로 공지되어 있다. H1993 세포들을 파아지 클론들 존재하에서 HGF와 항온처리하였을 때, H1993 세포들에 HGF의 결합은 항-c-Met scFv PC1에 의해 90% 이상 감소되었다. PC20은 c-Met에 HGF의 결합을 50% 이상 억제시켰다(도 2, 패널 A). 상이한 농도의 가용성 scFvs에 의한 HGF의 경쟁적 억제 또한 테스트하였다. 정상적인 마우스 IgG (NMIgG)를 음성 대조군으로 이용하였다. 경쟁물질없이 고정된 c-Met 단백질에 HGF의 결합을 100%로 간주하였다. 도 2, 패널 B에 나타낸 것과 같이, c-Met에 대한 HGF의 결합 활성은 S1 및 S20에 의해 약량-의존적으로 억제되었지만, S21에 의해서는 약간만 억제되었다. c-Met에 HGF 결합에 대한 IC50는 S1 및 S20의 경우 차례로 27.4 nM 및 249.5 nM이었다(도 2, 패널 B).
따라서, c-Met의 HGF 결합 도메인 안에 국소화된 항-c-Met scFvs의 결합 에피토프들을 조사하였다. c-Met의 세포외 도메인을 포함하는 c-Met932-Fc 단백질과, Sema 및 PSI 도메인을 포함하는 c-Met567-Fc 단백질에 대해 항-c-Met scFvs의 결합 능력을 검사하였는데, 이들 단백질 모두는 HGF 결합 영역들로 특징되었다(도 2, 패널 C). c-Met 재조합 단백질들을 적정 웰에 고정시키고, 항-c-Met scFvs와 함께 항온처리하였다. 항-c-Met 다클론성 항체 및 항-E 태그 항체들은 양성 및 음성 대조군으로 각각 이용하였다. 도 2, 패널 D에서 나타낸 것과 같이, S21은 c-Met932-Fc의 것과 비교하였을 때, c-Met567-Fc에 대한 이의 결합 활성은 급격히 감소되었다. c-Met932-Fc에 대한 S1의 결합 강도는 c-Met567-Fc에 대한 결합 강도와 유사하였다. S20은 c-Met932-Fc보다는 덜 효과적으로 c-Met567-Fc에 결합하였다. S1 및 S20의 결합 에피토프들은 c-Met의 HGF 결합 영역내에 위치하고, 반면, S21은 Ig-유사 도메인을 통하여 c-Met를 인지한다는 것을 이들 결과들은 나타낸다 (도 2, 패널 D).
항-c-Met scFv S1은 우위적인 경쟁적 능력을 제시하기 때문에, 암 세포들에서 c-Met를 활성화시키기 위하여 S1이 HGF를 길항하는지를 검사하였다. A549 세포들을 HGF와 S1로 37℃에서 15분간 공동-처리하였다. 전체 세포 용해물은 항-티로신-포스포릴화된 c-Met 항체 및 c-Met β-쇄 (c-Met)에 대항하는 항체를 이용하여 웨스턴 블랏팅을 거치게 하였다. 포스포릴화된 c-Met의 정량화는 발광 광도에 근거하였고, 전체 c-Met로 표준화시켰다. HGF-유도된 c-Met 포스포릴화는 S1에 의해 억제되었으며, S1 처리를 하지 않은 암 세포들과 비교하여 c-Met 포스포릴화의 65.7%를 억제하였다(도 2, 패널 E).
실시예 4
공촛점 현미경을 이용한 항-c-Met scFv 내재화의 검사
항체-유도된 리포좀성 약물들의 개발에서 항체의 내재화 능력이 결정적이다 (Sapra and Allen (2002) Cancer Res 62:7190-7194). 항-c-Met scFv S1 및 S20의 내재화 연구는 H1993 세포들에서 37℃에서 실행하였다. scFvs는 세포들을 고정시키고, 투과화시켜, FITC-표지된 제 2 항체와 함께 항온처리함으로써 항-E 태그 항체로 탐지하였다. 세포 핵은 DAPI로 착색시켰다. 공촛점 현미경에서 4℃에서 scFvs는 세포 막에 결합되었고(도 3A, a 및 b), 그리고 내재화된 scFv는 37℃에서 세포 세포질 안에 형광 신호를 방출하였다는 것을 보여주었다(도 3, 패널 A; c 및 d). S20-처리된 H1993 세포들에서 형광 신호의 양은 S1-처리된 세포들보다 더 많았고, 이는 S20의 내재화 능력이 S1보다 우의에 있었음을 암시한다. 저-출력 확대하에서, 대부분의 암 세포들에서 내재화 S20이 관찰되었다 (도 3, 패널 A; e).
더욱이, S20의 흡입은 세포 표면에서 c-Met 발현에 의존적인지를 증명하기 위하여, H460 및 c-Met 녹다운 H460 세포들에서 내재화 실험들을 실시하였다. 공촛점 현미경에서 H460 세포들의 세포질 안에서 S20 형광 신호들은 나타났지만(도 3, 패널 B; a 및 b), 그러나 c-Met 녹다운 H460 세포들에서는 나타나지 않았다(도 3, 패널 B; c). 이런 결과들은 항-c-Met scFv S20은 c-Met-발현된 암 세포들에서 특이적 내재화를 나타냄을 표시한다. 이와 같이, 이는 항체-유도된 세포내 약물 운반의 개발에 이용될 수 있다.
실시예 5
Ms20 - 콘쥬게이트된 나노입자들은 약물 결합, 세포내 운반 및 세포독성을 강화시켰다
c-Met-발현시키는 종양 세포들에서 S20이 리포좀성 약물 운반을 촉진시킬 수 있는지를 조사하기 위하여, C-말단에서 시스테인과 융합된 S20 유전자를 인코딩하는 박테리아 발현 벡터를 만들었고, 후속적으로 S20-시스테인 융합 단백질을 생산하였으며, 이를 여기에서 Ms20이라고 지칭한다(도 11, 패널 A 및 B). 부위-지향적인 콘쥬게이트 Ms20은 독소루비신을 함유하는 리포좀의 외부 표면 상에 말레이미드-변형된 PEG 쇄들에 이의 c-말단 시스테인을 통하여 특이적으로 결합시켜, Ms20-콘쥬게이트된 리포좀성 독소루비신 (Ms20-LD)을 만들었다 (도 11, 패널 C 및 D).
Ms20-콘쥬게이트된 리포좀이 암 세포들 안으로 약물 운반을 증가시키는 지를 밝히기 위하여, 몇 가지 인간 폐암 세포주를 37℃에서 Ms20-LD 및 LD로 처리하였다. 표면-결합된 리포좀성 약물들을 제거하기 위하여 산 글리신 완충액 세척 후, 내재화된 독소루비신을 정량화하였다. 독소루비신의 세포성 흡입은 H1993, H441 및 A549 세포들을 Ms20-LD로 처리함으로써 이들 세포들에서 실질적으로 상승하였지만, H520 및 CL1-5 세포들에서는 유의적인 변화가 없었다(도 4, 패널 A). 세포성 c-Met 발현에서 Ms20-LD 흡입의 의존성의 추가 증명하기 위하여, 각 세포주에서 c-Met 발현을 Ms20-표지된 양자점(Ms20-QD)를 이용한 유동세포분석법으로 비교하였다 (도 4, 패널 B). 흥미로운 것은, H520 및 CL1-5 세포들은 소량의 c-Met 만을 발현시키는 것으로 나타났고(도 4, 패널 B), 이는 Ms20-LD의 열악한 흡입에 대응한다(도 4, 패널 A). 이러한 발견은 종양 세포들의 Ms20-LD 흡입은 세포 표면에서 c-Met의 발현 수준에 의존적임을 암시한다.
Ms20은 종양 세포들 상에서 LD의 결합 효능을 개선시킬 수 있었는지를 증명하기 위하여, H1993 세포들은 Ms20-LD 및 비-표적화된 LD(LD)의 농도를 다양하게 하면서 4℃에서 1시간 동안 별도로 항온처리하였다. 리포좀성 약물의 결합 활성은 이 세포들을 용해시킨 후 형광으로 정량화하였다. LD과 비교하여, H1993 세포들에 대한 Ms20-LD의 결합은 약물 농도에 따라 13- 내지 26배로 급격하게 증가되었다(도 4, 패널 C). 동일한 실험 조건들하에서 H460 세포들에 대해 유사한 결과들을 관찰하였다. Ms20이 암 세포들에게 세포내 약물 운반을 강화시켰다는 것을 확인하기 위하여, H1993 세포들은 경과된 시점에서 Ms20-LD 및 LD과 항온처리하였다. 표면에서 비-내재화된 리포좀성 약물을 박탈시킨 후, 세포내 독소루비신 흡입들을 측정하였다. Ms20은 각 시점에서 비-콘쥬게이트된 LD와 비교하여 암 세포들로 약물 운반을 상당히 강화시켰다(도 4, 패널 D).
Ms20은 LD의 세포독성을 강화시킬 수 있는 지를 더 평가하기 위하여, MTT 분석을 이용하여 인간 폐암 세포들에서 Ms20-LD의 세포독성 효과를 연구하였다 (도 5, 패널 A). 세포 생존능은 살아있는 세포들의 %로 계산하였다. 붉은 점선은 평균 50% 생존능을 의미한다. 각 점은 4가지 실험의 평균을 나타낸다. LD와 비교하여, Ms20-LD는 암 세포들에게 약물 세포독성을 상당히 강화시켰고, H1993 및 H441 세포들에서 최대 억제 농도의 절반(IC50)을 6배 정도 감소시켰다 (도 5, 패널 B). 아폽토시스성 표식들의 발현 예컨대 절단(cleavage) PARP, 절단 카스파제 9 및 절단 카스파제 3은 Ms20-LD-처리된 H1993 세포들에 의해 또한 강화되었다 (도 5, 패널 C). α-튜불린은 로딩 대조군으로 프로브시켰다. 농도계측(Densitometry)을 이용하여 처리안된 세포들과 비교하여 절단된 PARP의 배수 증가를 예측하였고, α-튜불린으로 표준화시켰다(하부).
실시예 6
생체내 종양 귀소(homing) 및 항-c-Met scFv의 영상화
생체내에서 항-c-Met scFv의 종양 귀소(homing) 능력을 조사하기 위하여, H460-유도된 폐 종양 이종이식편들을 가지고 있는 마우스의 정액으로 항-c-Met scFv PC20 또는 대조군 파아지를 주사하였다. 종양으로부터 회수한 PC20의 역가는 내장 장기들로부터 얻은 역가보다 높았다. 이 실험을 2회 실시하였고, 동일한 결과를 얻었다. 주입후, 결합 파아지들을 회수하였고, 종양 덩어리 및 정상 장기로부터 측정하였다. 결과에서 항-c-Met scFv PC20은 정상 장기보다 더 효과적으로 종양으로 귀소하였다는 것을 보여주었다(도 6, 패널 A). 대조군 파아지는 이러한 귀소 능력을 보유하지 않았다. 추가적으로, 이 조직 절편들을 면역착색시키기 위하여 항-파아지 항체를 이용하여 항-c-Met scFv PC20의 조직 분포를 검사하였다. PC20 파아지들은 정상적인 장기 조직들 예컨대 뇌, 폐, 그리고 심장보다는 종양 조직들에 선택적으로 국소화되어 있음을 발견하였고, 이는 PC20-처리된 마우스로부터 또한 유도되었지만, 종양 및 정상 장기 조직들에서 대조군 파아지는 탐지되지 않았다 (도 6, 패널 B).
항-c-Met scFv S20을 종양 영상 분석에 적용시킬 수 있는 지를 테스트하기 위하여, Ms20-콘쥬게이트된 양자점 (Ms20-QD) 또는 비-콘쥬게이트된 양자점(QD)을 H1993-유도된 폐 종양 이종이식편들을 가지고 있는 마우스에 주사하였다. 주사후 6시간 시점에서, Ms20-QD-처리된 마우스의 종양 조직 안에서 관찰된 근적외(NIR) 형광 신호 강도는 QD-처리된 마우스의 신호 강도보다 5.2배 더 높았다(도 6, 패널 C). 주사 24시간 후, 이 마우스들을 희생시키고, Ms20-QD의 조직 분포를 조사하기 위하여 해부하였다. 대표적인 영상은 3가지 독립적인 실험 결과다. 도 6, 패널 D에 나타낸 것과 같이, Ms20-QD는 정상 장기들과는 대조적으로 종양에 강력하고, 선택적으로 축적되었다. Ms20-QD는 QD보다는 종양을 5.4배 더 효과적으로 표적화하였다. 이들 결과는 항-c-Met scFv가 종양 영상화에 이용하는데 적합하다는 것을 나타낸다.
실시예 7
인간 폐 암종 이종이식편들에서 Ms20-LD의 치료 효과
Ms20이 항암 약물의 화학요법 효과를 개선시킬 수 있는지를 평가하기 위하여, Ms20을 페길화된(PEGylated) 리포좀성 독소루비신 (Ms20-LD)에 커플링시켜 표적화된 약물 운반 시스템을 만들었다. H460 이종이식편들 (~75 mm3)을 가지고 있는 SCID 마우스의 정맥으로 총 독소루비신 투약량이 4 mg/kg이 되도록 리포좀성 약물들을 주사하였다(주 단위로 1mg/kg). H460-유도된 폐암을 가지고 있는 마우스들에게 Ms20-LD, LD, 및 PBS를 투여하였다. LD-집단과 대조군 PBS 집단에서 마우스의 종양 크기는 Ms20-LD 집단과 비교하여 차례로 1.9배 및 4.4배 더 컸다(n = 8) **, P < 0.01. 그래프의 점들은 평균 종양 용적을 나타낸다. Ms20-LD를 투여받은 마우스의 종양은 LD 단독으로 투여받은 마우스의 용적보다 더 작은 것으로 나타났다 (P < 0.01) (도 7, 패널 A). LD 집단의 종양 크기는 25일 시점까지 Ms20-LD의 것보다 1.9배 점진적으로 증가하였다. Ms20-LD 및 LD 집단들은 치료 기간 동안 체중에는 유의적인 변화를 가지지 않았다 (도 7, 패널 B). 치료 종료시, LD로 처리를 받은 마우스의 최종 평균 종양 무게 0.73 g와 PBS 완충액을 주사맞은 마우스의 평균종양 무게 1.8g과 비교하여, Ms20-LD로 처리를 받은 마우스의 최종 평균 종양 무게는 0.31 g이었다(도 7, 패널 C 및 D). 따라서, LD 집단보다는 Ms20-LD 집단에서 종양 무게가 더 적었다(n = 8) *, P < 0.05. 게다가, 각 집단에서 종양 조직을 항-CD31 항체로 검사하여 종양 혈액 혈관을 탐지하였고, 말단 데옥시뉴클레오티딜 전이효소 dUTP 니크 단부 표지(TUNEL) 분석으로 아폽토시스성 세포들을 확인하였다. 절편들은 자동화된 세포 획득 (TissueGnostics)을 이용하여 분석하였고, CD31-양성 및 TUNEL-양성 영역들은 MetaMorph 소프트웨어 (Molecular Devices)를 이용하여 정량화하였다. 도 7, 패널 E에서 나타낸 것과 같이, LD-처리된 집단보다는 Ms20-LD-처리된 집단에서 CD31-양성 영역이 더 많이 감소되었다. 따라서, Ms20-LD 집단에서 CD31 양성 내피의 양은 LD 집단보다 더 적었다. Ms20-LD-처리된 집단에서 아폽토시스성 세포들의 수는 LD-처리된 집단에서의 수의 2배였다(도 7, 패널 F).
SEQUENCE LISTING <110> Liang, Chi-Ming Wu, Han-Chung Lu, Ruei-Min <120> Anti-C-Met Antibody and Methods of Use Thereof <130> SNCA-005WO <150> 61/402,788 <151> 2010-09-03 <160> 50 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 1 Pro Gly Ser Gly Gly Ser 1 5 <210> 2 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 2 Pro Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 3 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 3 Pro Gly Gly Ser Gly 1 5 <210> 4 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 4 Pro Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 <210> 5 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 5 Pro Gly Ser Gly Ser Gly 1 5 <210> 6 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 6 Pro Gly Ser Gly Gly Gly 1 5 <210> 7 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide 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Met 1 5 <210> 15 <211> 15 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 15 Pro Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 1 5 10 15 <210> 16 <211> 18 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 16 Pro Ser Thr Lys Asp Ser Asp Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 1 5 10 15 Arg Gly <210> 17 <211> 31 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 17 Pro Met Ala Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys 1 5 10 15 Pro Ser Gly Thr Leu Ser Leu Lys Cys Asp Ala Ser Ala Ile Ser 20 25 30 <210> 18 <211> 8 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 18 Pro Met Asp Ser Asn Tyr Trp Trp 1 5 <210> 19 <211> 15 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 19 Pro Ser Trp Leu Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 1 5 10 15 <210> 20 <211> 18 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 20 Pro Gly Glu Ile Ser His Ser Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Pro Ser Leu 1 5 10 15 Lys Ser <210> 21 <211> 33 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 21 Pro Arg Ile Ser Ile Asn Ala Glu Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu 1 5 10 15 Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala 20 25 30 Arg <210> 22 <211> 16 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 22 Pro Ala Gly Phe Cys Ser Gly Gly Asn Cys Tyr Pro Gly Ser Glu Asp 1 5 10 15 <210> 23 <211> 14 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 23 Pro Ala Phe Asp Leu Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val 1 5 10 <210> 24 <211> 33 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 24 Pro Arg Phe Thr Ile Ala Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 1 5 10 15 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala 20 25 30 Arg <210> 25 <211> 8 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 25 Pro Asp Phe Pro Gly Gly Pro Asn 1 5 <210> 26 <211> 14 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 26 Pro Ala Phe Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val 1 5 10 <210> 27 <211> 32 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 27 Pro Arg Ala Thr Ile Ser Ile Asp Lys Ser Lys Lys Gln Phe Phe Leu 1 5 10 15 Arg Leu Lys Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 20 25 30 <210> 28 <211> 8 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 28 Pro Gly Leu Leu Ser Pro Leu Asp 1 5 <210> 29 <211> 14 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 29 Pro Ala Phe Asp Glu Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val 1 5 10 <210> 30 <211> 23 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 30 Pro Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Pro Ser Leu Ser Val Ser Val 1 5 10 15 Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr 20 <210> 31 <211> 13 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 31 Pro Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Thr Asn Asp Leu Asn 1 5 10 <210> 32 <211> 16 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 32 Pro Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Gln Leu Leu Ile Tyr 1 5 10 15 <210> 33 <211> 8 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 33 Pro His Ala Ser Glu Leu Glu Thr 1 5 <210> 34 <211> 33 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 34 Pro Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 1 5 10 15 Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe 20 25 30 Cys <210> 35 <211> 13 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 35 Pro Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Thr Thr Tyr Leu Val 1 5 10 <210> 36 <211> 16 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 36 Pro Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 1 5 10 15 <210> 37 <211> 8 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 37 Pro Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr 1 5 <210> 38 <211> 23 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 38 Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 1 5 10 15 Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr 20 <210> 39 <211> 13 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 39 Pro Cys Arg Ala Ser Gln Arg Val Ala Thr Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 40 <211> 16 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 40 Pro Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Asn Leu Leu Ile Tyr 1 5 10 15 <210> 41 <211> 8 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 41 Pro Glu Ala Ser Ser Leu Gln Ser 1 5 <210> 42 <211> 33 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 42 Pro Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Phe Gly Thr Asp Phe 1 5 10 15 Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Ala Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr 20 25 30 Cys <210> 43 <211> 10 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 43 Pro Gln Gln Tyr Asp Asp Leu Pro Leu Thr 1 5 10 <210> 44 <211> 12 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 44 Pro Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 1 5 10 <210> 45 <211> 33 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 45 Pro Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 1 5 10 15 Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe 20 25 30 Cys <210> 46 <211> 10 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 46 Pro Gln Gln Arg Ser Asp Trp Pro Pro Thr 1 5 10 <210> 47 <211> 12 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 47 Pro Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 1 5 10 <210> 48 <211> 33 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 48 Pro Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Arg Arg Ser Gly Thr Asp Phe 1 5 10 15 Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr 20 25 30 Cys <210> 49 <211> 10 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 49 Pro Gln Gln Ser Tyr Asn Thr Pro Tyr Thr 1 5 10 <210> 50 <211> 12 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 50 Pro Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg 1 5 10

Claims (27)

  1. 클론 1, 20, 또는 21의 항체에 의해 특이적으로 결합되는 c-Met의 에피토프에 특이적으로 결합하거나; c-Met에의 결합을 위해 항체 클론 1, 20, 또는 21과 경쟁하는 단리된 항체.
  2. 청구항 1에 있어서, 살아있는 포유동물 세포의 표면 상의 c-Met에 결합될 때, 상기 세포에 의해 세포내이입되는, 단리된 항체.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 항체는 c-Met의 에피토프에의 결합을 위해 다음을 포함하는 항체와 경쟁하는, 단리된 항체:
    a) 클론 1의 VH CDR1;
    b) 클론 1의 VH CDR2; 및
    c) 클론 1의 VH CDR3.
  4. 청구항 3에 있어서, 상기 항체는 c-Met의 에피토프에의 결합을 위해 다음을 포함하는 항체와 경쟁하는, 단리된 단클론성 항체:
    a) 클론 1의 VL CDR1;
    b) 클론 1의 VL CDR2; 및
    c) 클론 1의 VL CDR3.
  5. 청구항 4에 있어서, 상기 항체는 c-Met의 에피토프에의 결합을 위해 다음을 포함하는 항체와 경쟁하는, 단리된 단클론성 항체:
    a) 클론 1의 전장 VH; 및
    b) 클론 1의 전장 VL.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 항체는 c-Met의 에피토프에의 결합을 위해 다음을 포함하는 항체와 경쟁하는, 단리된 단클론성 항체:
    a) 클론 20의 VH CDR1;
    b) 클론 20의 VH CDR2; 및
    c) 클론 20의 VH CDR3.
  7. 청구항 6에 있어서, 상기 항체는 c-Met의 에피토프에의 결합을 위해 다음을 포함하는 항체와 경쟁하는, 단리된 단클론성 항체:
    a) 클론 20의 VL CDR1;
    b) 클론 20의 VL CDR2; 및
    c) 클론 20의 VL CDR3.
  8. 청구항 7에 있어서, 상기 항체는 c-Met의 에피토프에의 결합을 위해 다음을 포함하는 항체와 경쟁하는, 단리된 항체:
    a) 클론 20의 전장 VH; 및
    b) 클론 20의 전장 VL.
  9. 청구항 1에 있어서, 상기 항체는 c-Met의 에피토프에의 결합을 위해 다음을 포함하는 항체와 경쟁하는, 단리된 단클론성 항체:
    a) 클론 21의 VH CDR1;
    b) 클론 21의 VH CDR2; 및
    c) 클론 20의 VH CDR3.
  10. 청구항 9에 있어서, 상기 항체는 c-Met의 에피토프에의 결합을 위해 다음을 포함하는 항체와 경쟁하는, 단리된 단클론성 항체:
    a) 클론 21의 VL CDR1;
    b) 클론 21의 VL CDR2; 및
    c) 클론 21의 VL CDR3.
  11. 청구항 10에 있어서, 상기 항체는 c-Met의 에피토프에의 결합을 위해 다음을 포함하는 항체와 경쟁하는, 단리된 항체:
    a) 클론 21의 전장 VH; 및
    b) 클론 21의 전장 VL.
  12. 청구항 1 내지 11 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 단일 쇄 Fv (scFv'), IgG, Fab, (Fab')2, 또는 (scFv)2인, 단리된 항체.
  13. 청구항 1 내지 11 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 표지된, 단리된 항체.
  14. 청구항 1 내지 11 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 항-암 물질에 콘쥬게이트된, 단리된 항체.
  15. 표면 및 내부 공간을 포함하는 지질성 나노입자로서, 상기 내부 공간은 항-암 물질을 포함하며, 청구항 1 내지 11 중 어느 한 항에 따른 단리된 항체는 상기 지질성 나노입자의 표면에 부착되는, 지질성 나노입자.
  16. 청구항 15에 있어서, 상기 지질성 나노입자를 세포 표면 c-Met를 발현시키는 세포와 접촉시킬 때, 상기 항체는 세포 표면 c-Met에 결합되고, 상기 지질성 나노입자는 세포내이입되는, 지질성 나노입자.
  17. 다음을 포함하는 조성물:
    제약학적으로 수용가능한 운반체; 및
    청구항 1 내지 11 중 어느 한 항에 따른 단리된 항체 또는 청구항 15 또는 16에 따른 지질성 나노입자.
  18. 청구항 17에 있어서, 상기 조성물은 장관외 투여용으로 제형화된, 조성물.
  19. 청구항 17에 있어서, 상기 조성물은 정맥내, 수막공간내, 또는 심실내 투여용으로 제형화된, 조성물.
  20. 암 피험자를 치료하는 방법으로서,
    상기 피험자에게 청구항 1 내지 11 중 어느 한 항에 따른 단리된 항체 또는 청구항 15 또는 16에 따른 지질성 나노입자의 양을 투여하는 것을 포함하고, 상기 양은 암의 성장을 늦추는데 충분한 양인, 방법.
  21. 청구항 20에 있어서, 상기 항체는 암 세포 안으로 내재화되는, 방법.
  22. 청구항 20에 있어서, 상기 암은 폐암인, 방법.
  23. 다음을 포함하는, 피험자에서 암 세포를 탐지하는 방법:
    청구항 1 내지 11 중 어느 한 항에 따른 항체를 암인 것으로 의심되는 상기 피험자의 세포와 접촉시키는 단계; 및
    상기 세포에 결합된 상기 항체를 탐지하는 단계.
  24. 하기의 아미노산 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산:
    클론 1의 항체의 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3을 포함하는 VH;
    클론 1의 항체의 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3을 포함하는 VL;
    클론 20의 항체의 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3을 포함하는 VH;
    클론 20의 항체의 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3을 포함하는 VL;
    클론 21의 항체의 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3을 포함하는 VH; 또는
    클론 21의 항체의 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3을 포함하는 VL.
  25. 청구항 24에 있어서, 상기 뉴클레오티드 서열은 청구항 1 내지 11 중 어느 한 항의 항체의 아미노산 서열을 인코딩하는, 단리된 핵산.
  26. 청구항 24 또는 25의 핵산을 포함하는, 재조합 숙주 세포.
  27. 청구항 17의 조성물을 포함하는, 키트.
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