ES2484842T3 - Anticuerpo anti-DLK-1 humana que muestra la actividad antitumoral in vivo - Google Patents

Anticuerpo anti-DLK-1 humana que muestra la actividad antitumoral in vivo Download PDF

Info

Publication number
ES2484842T3
ES2484842T3 ES07832065.2T ES07832065T ES2484842T3 ES 2484842 T3 ES2484842 T3 ES 2484842T3 ES 07832065 T ES07832065 T ES 07832065T ES 2484842 T3 ES2484842 T3 ES 2484842T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
antibody
human
hdlk
tumor
cells
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES07832065.2T
Other languages
English (en)
Inventor
Koji Nakamura
Rie Tajima
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Livtech Inc
Original Assignee
Livtech Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Livtech Inc filed Critical Livtech Inc
Application granted granted Critical
Publication of ES2484842T3 publication Critical patent/ES2484842T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/02—Preparation of hybrid cells by fusion of two or more cells, e.g. protoplast fusion
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/77—Internalization into the cell
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)

Abstract

Un anticuerpo contra Dlk-1 humana, que tiene actividad antitumoral in vivo, en donde: - las secuencias de aminoácidos de las CDR 1 a 3 de la región V de la cadena H del anticuerpo son las secuencias de aminoácidos mostradas en los SEQ ID NO: 30 a 32, respectivamente; y - las secuencias de aminoácidos de las CDR 1 a 3 de la región V de la cadena L del anticuerpo son las secuencias de aminoácidos mostradas en los SEQ ID NO: 33 a 35, respectivamente.

Description

Anticuerpo anti-DLK-1 humana que muestra la actividadantitumoral in vivo
Campo técnico
La presente invención se refiere a anticuerpos anti-Dlk-1 humana que tienen actividad antitumoral y en particular a anticuerpos anti-Dlk-1 humana que tienen actividad antitumoral in vivo. Además, la presente invención también se refiere a hibridomas que producen los anticuerpos antes mencionados y al uso de los anticuerpos antes mencionados.
Técnica anterior
La Dlk-1 humana (homólogo de tipo delta 1 (Drosophila); que se puede denominar en lo sucesivo "hDlk-1") es una proteína transmembrana de tipo I (de tipo transmembrana uno) con una longitud total de 383 residuos de aminoácidos que tiene con 6 motivos de tipo EGF en su región extracelular. La región extracelular presenta homología con una familia Notch/Delta/Serrate. Un gen hDlk-1 ha sido clonado como una molécula expresada en una línea celular derivada de carcinoma de pulmón de células pequeñas sensible a GRP (péptido liberador de gastrina) (Documento No de Patente 1), o como un factor para la supresión de la diferenciación de preadipocitos (Documento No de Patente 2). Desde el punto de vista de la homología de la secuencia de aminoácidos de hDlk-1 con la de Delta que es un ligando de un receptor Notch como regulador de la diferenciación celular, tal Dlk-1 es referida generalmente como un símbolo génico, DLK1. También tiene algunos otros símbolos génicos tales como Pref-1 (Documento No de Patente 2), PG2 (Documento No de Patente 3), SCP-1 (Documento No de Patente 4) y ZOG (Documento No de Patente 5). Sin embargo, estos símbolos génicos indican básicamentela mismamolécula.
Por otra parte, hDlk-1 se escinde con una proteasa no identificada que corta en las proximidades de la membrana celular en la región extracelular de hDlk-1, y se secreta a continuación a la sangre. La hDlk-1 libre (región extracelular de hDlk-1) es una molécula idéntica a una glicoproteína llamada FA-1 (Antígeno fetal 1) (Documento No de Patente 6) que consiste en 225 a 262 residuos de aminoácidos.
El gen hDlk-1 y un producto génico del mismo se expresan a un alto nivel en las células no diferenciadas, altamente proliferativas, fetales. En particular, el gen hDlk-1 y el producto génico del mismo son altamente expresados en hígado fetal, riñón fetal, músculo esquelético fetal, cerebro fetal y similares. Después del nacimiento, sin embargo, la expresión de tal gen hDlk-1 y del producto génico del mismo puede no ser observado en la mayoría de los tejidos. En tejidos adultos normales, el gen hDlk-1 y el producto génico del mismo se localizan en la glándula suprarrenal, la placenta y la hipófisis (Documento de Patente 1, DocumentoNo de Patente 2).
Además, incluso en tejidos maduros, la expresión de hDlk-1 se observó en células que se considera que son células madre no diferenciadas o células precursoras. Por ejemplo, se ha informado de que la expresión de hDlk-1 se ha observado en células ovales hepáticas que son indiferenciadas y tienen pluripotencia en hígado adulto (Documentos No de Patente 7 y 8) o en células madre mesenquimales que son las células madre de las células óseas/de cartílago/adiposas (Documento No de Patente 9). Se ha sugerido que hDlk-1 está asociado con las propiedades de tales células madre de tejidos, tales como el mantenimiento de la capacidad de indiferenciación.
Tal patrón de expresión de hDlk-1 localizado en las células fetales o células y una familia de genes/productos génicos que tienen motivos de tipo EGF (receptor Notch, ligando de Notch (Delta, Jagged, Serrate), etc.) generalmente controla el crecimiento o la diferenciación de células por la interacción intercelular a través de motivos de tipo EGF. Por lo tanto, se ha sugerido que hDlk-1 también tiene tales funciones. De hecho, se ha conocido que la expresión de hDlk-1 disminuye simultáneamente a la diferenciación de las células precursoras adiposas y que la diferenciación adiposa se suprime, si el gen hDlk-1 se ve obligado a expresarse en las células precursoras adiposas (Documento no de Patente 2). Sin embargo, en la actualidad, los detalles con respecto a una molécula (un ligando) que interactúe con hDlk-1 son desconocidos.
Por otra parte, se ha informado de que el gen hDlk-1 y el producto génico del mismo se expresan con una alta frecuencia en diversos tipos de cánceres o tumores. Los tipos de cáncer, en los que la expresión de hDlk-1 se ha confirmado hasta el momento, son: cánceres sólidos tales como un tumor neuroendocrino, neuroblastoma, glioma, neurofibromatosis de tipo 1, cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de hígado, cáncer de riñón y cáncer de ovario (Documentos de Patente 1 y 2 y Documentos No de Patente 1, 3, 10, 11, 12, 13 y 14); y cánceres de la sangre tales como el síndrome mielodisplásico (Documento de Patente 3 y Documentos No de Patente 15 y 16) y leucemia mielocítica aguda (Documento No de Patente 16). Se ha informado de que el crecimiento celular se acelera si se introduce un gen hDlk-1 en una célula K562 que es una línea celular de eritroleucemia (Documento No de Patente 16) y también que, si tal gen hDlk-1 se introduce en glioblastomas, causa la desaparición de la inhibición por contacto de las células, así como la aceleración del crecimiento celular, de manera que se puede lograr la capacidad de crecimiento celular independiente de anclaje. Se ha sugerido la relación entre hDlk-1 y la
carcinogénesis (Documento No de Patente 17).
<Documentos de Patente>
[0008]
Documento de Patente 1: Documento WO 2005/052156 (EP1702982 A1) Documento de Patente 2: Documento WO 02/081625 Documento de Patente 3: Patente Japonesa Abierta a la Inspección Pública Núm. 2001-269174
<Documentos No de Patente>
[0009]
Documento No de Patente 1: Laborda, J. et al., J. Biol. Chem., Vol. 268 (6), págs. 3817-3820 (1993) Documento No de Patente 2: Smas, C. M. et al., Cell, vol. 73(4), págs. 725-734 (1993) Documento No de Patente 3: Helman, L. J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 84, págs. 2336-2339 (1987) Documento No de Patente 4:. Maruyama, K. et al, No publicado, número de acceso Genebank D16847 (1993) Documento No de Patente 5: Halder, S. K. et al., Endocrinology, vol. 139, págs. 3316-3328 (1998) Documento No de Patente 6: Fay, T. N. et al., Eur. J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol., Vol. 29, págs. 73-85(1988) Documento No de Patente 7: Tanimizu, N. et al., Gene Expression Patterns, vol. 5, págs. 209-218 (2004) Documento No de Patente 8: Jensen, CH. et al., Am. J. Pathol., Vol. 164 (4), págs. 1347-1359(2004) Documento No de Patente 9: Abdallah, B. M. et al., J. BoneMiner. Res., Vol. 19 (5), págs. 841-852 (2004) Documento No de patente 10: Jensen, C. H. et al., Fr. J. Dermatol., Vol. 140(6), págs. 1054-1059 (1999) Documento No de patente 11: Jensen, C. H. et al., Tumor Biol., Vol. 20 (5), págs. 256-262 (1999) Documento No de patente 12: Yin, D. et al., Int. J. Oncol., Vol. 24(4), págs. 1011-1015 (2004) Documento No de patente 13: Yin, D. et al., Oncogene, vol. 25 (13), págs. 1852-1861 (2006) Documento No de patente 14: Fukuzawa, R. et al., J. Clin. Pathol., Vol. 58, págs. 145-150 (2006) Documento No de patente 15: Miyazato, A. et al., Blood, vol. 98, págs. 422-427 (2001) Documento No de patente 16: Sakajiri, S. et al., Leukemia, vol. 19 (8), págs. 1404-1410 (2005) Documento No de patente 17: Yin, D. et al., Oncogene, vol. 25 (13), págs. 1852-1861 (2006)
Descripción de la invención
Como se describió anteriormente, en el caso de los tejidos normales, la expresión de hDlk-1 se localiza en las células embrionarias o las células madre. Sin embargo, en el caso de tejidos cancerosos, hDlk-1 se expresa con una alta frecuencia en diversos tipos de células. Tal hDlk-1 es una proteína de la membrana celular/proteína secretora. Basándose en estos hechos, se considera que hDlk-1 es una buena diana en el tratamiento de diversos tipos de tumores, etc. Cuando se elige como diana tal hDlk-1, se considera que es útil un anticuerpo anti-hDlk-1.
Por lo tanto, un objeto de la presente invenición es proporcionar un anticuerpo anti-Dlk-1 humana que tenga actividad antitumoral y, en particular, un anticuerpo monoclonal anti-Dlk-1 humana que tenga actividad antitumoral in vivo. Por otra parte, otro objeto de la presente invención es proporcionar un hibridoma que produzca el anticuerpo anteriormente mencionado, un complejo del anticuerpo anteriormente mencionado y un agente, una composición farmacéutica para el diagnóstico o tratamiento de un tumor, un método para detectar un tumor y un kit para la detección o el diagnóstico de un tumor.
Los autores de la presente invención han realizado estudios exhaustivos dirigidos a la consecución de los objetos mencionados anteriormente. Como resultado, los autores de la presente invención han encontrado un anticuerpo que reacciona específicamente con Dlk-1 humana (concretamente, un anticuerpo monoclonal anti-Dlk-1 humana) y tiene actividad antitumoral y un complejo (un producto inmunoconjugado) del anticuerpo y diversos tipos de agentes. Los autores de la presente invención han confirmado a continuación que dichos anticuerpo y complejo tienen actividad antitumoral in vivo. Además, los autores de la presente invención también han encontrado que dichos anticuerpo y complejo son útiles para el tratamiento, diagnóstico y detección de un tumor, completando de este modo la presente invención.
Es decir, la presente invención es como sigue.
(1) Un anticuerpo contra Dlk-1 humana, que tiene actividad antitumoral in vivo, en donde:  las secuencias de aminoácidos de las CDR 1 a 3 de la región V de la cadena H del anticuerpo son las secuencias de aminoácidos mostradas en los SEQ ID NOS: 30 a 32, respectivamente; y
 las secuencias de aminoácidos de las CDR 1 a 3 de la región V de la cadena L del anticuerpo son las secuencias de aminoácidos mostradas en los SEQ ID NOS: 33 a 35, respectivamente.
El tumor descrito anteriormente es al menos un tipo seleccionado del grupo que consiste en cáncer de colon humano, cáncer demama humano, cáncer de hígado humano y neuroblastoma humano, por ejemplo.
La actividad antitumoral del anticuerpo de acuerdo con el apartado (1) anterior es la actividad inhibidora de la angiogénesis tumoral, por ejemplo.
El anticuerpo de acuerdo con el apartado (1) anterior es un anticuerpo policlonal o un anticuerpo monoclonal, por ejemplo.
El anticuerpo de la presente invención incluye un anticuerpo producido por un hibridoma, un anticuerpo genéticamente recombinante, etc.
El término "hibridoma" se utiliza en la presente memoria para significar células que producen un anticuerpo que tiene la especificidad antigénica deseada, que se forman por la fusión celular entre las células B obtenidas mediante la inmunización demamíferos distintos delos seres humanos con un antígeno y células demieloma.
El anticuerpo genéticamente recombinante incluye anticuerpos producidos por recombinación génica, tal como un anticuerpo quimérico (un anticuerpo quimérico humanizado), un anticuerpo humanizado, un anticuerpo humano y un fragmento de anticuerpo de los mismos. Un anticuerpo genéticamente recombinante, que tiene las características de un anticuerpo monoclonal, tiene una baja antigenicidad y tiene una vida media prolongada en la sangre, se utiliza preferiblemente como un agente terapéutico. En la presente memoria, un ejemplo del anticuerpo quimérico es un anticuerpo cuya secuencia de aminoácidos de la región V de la cadena H comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 23 y cuya secuencia de aminoácidos de la región V de la cadena L comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 25.
(2)
El anticuerpo puede ser uno en donde:
(a)
la actividad antitumoral es la actividadinhibidora de la angiogénesis tumoral;
(b)
dicho anticuerpo es un anticuerpomonoclonal; y/o
(c)
el tumor es al menos un tipo seleccionado entre cáncer de colon humano, cáncer de mama humano, cáncer de hígado humano y neuroblastoma humano; y/o
(d)
dicho anticuerpo es un anticuerpo genéticamenterecombinante, en donde dicho
(3)
El anticuerpo puede ser un anticuerpo genéticamente recombinante que es un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado o un anticuerpo humano.
(4)
La secuencia de aminoácidos de la región V de la cadena H del anticuerpo quimérico puede comprender la secuencia de aminoácidos que consiste en los aminoácidos en las posiciones 20 a 137 en la secuencia de aminoácidos como semuestra en SEQ ID NO: 23 y la secuencia de aminoácidos de la región V de la cadena L del anticuerpo quimérico puede comprender la secuencia de aminoácidos que consiste en los aminoácidos 21 a 132 en la secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 25. (5a) Un anticuerpo monoclonal contra Dlk-1 humana, que es producido por un hibridoma que tiene el Núm. de acceso FERM BP-10707. (5b) Un anticuerpo monoclonal contra Dlk-1 humana, que es producido por un hibridoma que tiene el Núm. de acceso FERM BP-10899. (5c) Un anticuerpo monoclonal contra Dlk-1 humana, que es producido por un hibridoma que tiene el Núm. de acceso FERM BP-10900.
(6)
Un anticuerpo contra Dlk-1 humana, quetiene actividad antitumoral in vivo y que se une a:
(a)
un epítopo de Dlk humana-1 a la que se une un anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma que tiene el Núm. de acceso FERM BP-10707 o FERM BP-10900; y/o
(b)
al menos una porción de una región que comprende los aminoácidos en las posiciones 26 a 85 o una región que comprende de los aminoácidos en las posiciones 131 a 244, en la secuencia de aminoácidos de Dlk-1 humana comomostrada en el SEQ ID NO: 2.
(7)
Un fragmento de anticuerpo que se une a Dlk humana-1, que tiene actividad antitumoral in vivo, que se obtiene de los anticuerpos de acuerdo con uno cualquiera de los apartados (1) a (6) anteriores y que comprende:
(a)
las secuencias de aminoácidos de las CDR 1 a 3 de la región V de la cadena H del anticuerpo que tiene las secuencias de aminoácidos mostradas en los SEQ ID NOS: 30 a 32; y/o
(b)
las secuencias de aminoácidos de las CDR 1 a 3 de la región V de la cadena L del anticuerpo que tiene las secuencias de aminoácidos mostradas en los SEQ ID NOS: 33 a 35.
(8)
El fragmento de anticuerpo puede ser un Fab, Fab', F(ab')2, Fv, un anticuerpo de cadena sencilla, scFv, diacuerpo o dsFv.
(9)
Los ejemplos del fragmento de anticuerpo de acuerdo con los apartados (7) u (8) anteriores incluyen un fragmento de anticuerpo que comprende:
(a)
la secuencia de aminoácidos que consiste en los aminoácidos en las posiciones 20 a 137 en la secuencia de aminoácidosmostrada en el SEQ ID NO: 23; y/o
(b)
la secuencia de aminoácidos que consiste en los aminoácidos 21 a 132 en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 25.
(19)
Un hibridoma, que produce:
(a)
el anticuerpo de acuerdo con uno cualquiera delos apartados (1) a (6); o
(b)
un anticuerpo monoclonal contra Dlk-1 humana, quetiene Núm. de acceso FERM BP-10707; o
(c)
un anticuerpo monoclonal contra Dlk-1 humana, quetiene Núm. de acceso FERM BP-10899, o
(d)
un anticuerpo monoclonal contra Dlk-1 humana, quetiene Núm. de acceso FERM BP-10900.
(11)
Un complejo, que comprende un compuesto que tiene actividad antitumoral y/o actividad destructora de células, y:
(a)
el anticuerpo de acuerdo con uno cualquiera delos apartados (1) a (6); o
(b)
el fragmento de anticuerpo de acuerdo con uno cualquiera de los apartados (7) a (9).
(12)
El complejo puede ser uno en donde:
(i)
la actividad antitumoral es la actividad inhibidora de la angiogénesis tumoral; y/o
(ii)
el tumor es al menos un tipo seleccionado entre cáncer de colon humano, cáncer de mama humano, cáncer de hígado humano y neuroblastoma humano.
(13)
Una composición farmacéutica, que comprende al menos uno de los anticuerpo de acuerdo con uno cualquiera de los apartados (1) a (6), el fragmento de anticuerpo de acuerdo con uno cualquiera de los apartados (7) a (9) y el complejo de acuerdo conlos apartados (11) o (12).
(14)
El anticuerpo de acuerdo con uno cualquiera de los apartados (1) a (6), el fragmento de anticuerpo de acuerdo con uno cualquiera de los apartados (7) a (9), el complejo de acuerdo con los apartados (11) o (12) o la composición de acuerdo con el apartado (13) anterior para uso en un método para el tratamiento de un tumor.
(15)
El anticuerpo, fragmento de anticuerpo, complejo o composición para uso en un método para el tratamiento de un tumor de acuerdo con el apartado (14) pueden ser uno en donde:
(i)
el tratamiento del tumor indica lainhibición dela angiogénesis tumoral; y/o
(ii)
dicho anticuerpo, fragmento de anticuerpo, complejo o composición no causan reducción de peso como efecto secundario; y/o
(iii) el tumor es al menos uno de cáncer de colon humano, cáncer de mama humano, cáncer de hígado humano y neuroblastoma humano.
(16)
Un agente terapéutico tumoral, que comprende al menos el anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de los apartados (1) a (6), el fragmento de anticuerpo de acuerdo con uno cualquiera de los apartados (7) a (9) y el complejo de acuerdo con(11) o (12).
(17)
Con respecto al agente de acuerdo con el apartado (16), el tumor puede ser al menos un tipo de cáncer de colon humano, cáncer demama humano, cáncer de hígado humano y neuroblastoma humano.
(18)
Un método para detectar un tumor, que comprende: permitir que al menos uno de los anticuerpos de acuerdo con uno cualquiera de los apartados (1) a (6), el fragmento de anticuerpo de acuerdo con uno cualquiera de los apartados (7) a (9) y el complejo de acuerdo con los apartados (11) o (12) reaccione con una muestra obtenida de un organismo vivo; y detectar una o varias señales del anticuerpo y/o fragmento de anticuerpo que han reaccionado.
(19)
En el método del apartado (18), opcionalmente el tumor es al menos uno de cáncer de colon humano, cáncer demama humano, cáncer de hígado humano y neuroblastoma humano.
(20)
Un kit para tratar, diagnosticar, o detectar un tumor, que comprende al menos uno de los anticuerpo de acuerdo con uno cualquiera de los apartados (1) a (6), el fragmento de anticuerpo de acuerdo con uno cualquiera de los apartados (7) a (9) y el complejo de acuerdo conlos apartados (11) o (12).
(21)
Con respecto al kit de acuerdo con el apartado (20), el tumor puede ser de al menos un cáncer de colon humano, cáncer demama humano, cáncer de hígado humano y neuroblastoma humano.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1muestralos resultados obtenidosmediantela administración de3 clones (1C1, 4C4 y 31C4) deun anticuerpo monoclonal anti-hDlk-1 conocido (WO 2005/052156) a modelos de Tratamiento de Xenoinjerto utilizando una línea celular de cáncer de hígado que expresando hDlk-1 (células Huh-7-hDlk). Cada anticuerpo se administró por vía intraperitoneal al modelo 4 veces en total (indicadas con las flechas en las
figuras), a saber, el 1er día (Día 1), el 4o día (Día 4), el 7o día (Día 7) y el 10o día (Día 10). Figura 1A: IgG de rata (grupo de control) (•), 1C1 (o) Figura 1B: IgG de rata (grupo de control) (•), 4C4 (o) Figura 1C: IgG de rata (grupo de control) (•), 31C4 (o) En cada una de las Figuras 1A a 1C, el número de ratones de cada grupo fue representado por N y cada valor de medición (volumen del tumor) fue representado por un valor medio ± error típico. Se llevaron a cabo en cada caso al menos 3 experimentos independientes. En ningún caso se observó actividad antitumoral contra el cáncer de hígado que se había establecido por vía subcutánea en ratones carentes de sistema inmunitario. La Figura 2 muestra la evaluación de la actividad antitumoral de un clon de anticuerpo monoclonal anti-hDlk-1 novedoso DI-2-14 (IgG1 deratón) en modelos de Tratamiento de Xenoinjerto utilizando células Huh-7-hDlk. Figura 2A: El crecimiento del tumor en un grupo de control (IgG de ratón) y un grupo de administración de DI2-14 se indicó con el tiempo transcurrido (un valor medio ± error típico). La flecha indica la administración del anticuerpo (20 mg/kg de peso corporal, administración intraperitoneal). * P <0,01 (mediante la prueba t de Student) Figura 2B: Una figura obtenida representando el peso del tumor de cada ratón en el momento del día 14o (Día 14) (el día final del experimento) en el ensayo de la Figura 2A anterior. El valor numérico descrito en cada gráficoindica un valor medio ± error típico. * P <0.01 (mediante la prueba t de Student) Figura 2C: Los resultados obtenidos mediante la evaluación de la actividad antitumoral de DI-2-14 en otro experimento independiente. * P <0.01 (mediantela prueba t de Student) La Figura 3muestra la evaluación de la actividad antitumoral de A: clon 2-13 (IgG2b de rata), B: clon BA-1-3D (IgG2a de ratón), C: clon DI-6 (IgG1 de ratón) y D: clon M3-1 (IgG1 de ratón), en modelos de tratamiento de xenoinjertos utilizando células Huh-7-hDlk. El volumen del tumor se indica mediante un valor medio ± error típico. El asterisco muestra los resultados de un ensayo de diferencia significativa (* P <0,01, ** P <0,05 mediante la prueba t de Student). La Figura 4 muestra la actividad antitumoral de un anticuerpo monoclonal anti-hDlk-1 (clon 2-13) en modelos de Tratamiento de Xenoinjerto utilizando la línea celular de cáncer de colon que expresa hDlk-1 (células SW480-hDlk). Las células SW480-hDlk se trasplantaron por vía subcutánea a ratones carentes de sistema inmunitario para establecer los tejidos de cáncer de colon. La flecha indica una administración intraperitoneal de anticuerpo (20 mg/kg de peso corporal) a los ratones. El volumen del tumor se indicó mediante un valor medio ± error típico (* P <0,01, ** P <0,05mediante la prueba t de Student). La Figura 5 muestra la reactividad de los anticuerpos monoclonales anti-hDlk-1 anticuerpos con células HEK293-hDlk medida mediante citometría de flujo. El número descrito en cada histograma indica cada número de clon. Las porciones rellenas indican los anticuerpos de control de isotipo. Las porciones perfiladas en color negroindican anticuerpos monoclonales anti-hDlk-1. La Figura 6 muestra la reactividad de los anticuerpos monoclonales anti-hDlk-1 con células Huh-7-hDlk medida mediante citometría de flujo. El número descrito en cada histograma indica cada número de clon. Las porciones rellenas indican los anticuerpos de control de isotipo. Las porciones perfiladas en color negro indican anticuerposmonoclonales anti-hDlk-1. La Figura 7 es una vista esquemática que muestra los mutantes en los que se suprimió cada motivo de tipo EGF, que se produjeron con el fin de analizar los epítopos reconocidos por los anticuerposmonoclonales antihDlk-1. La Figura 8muestralos resultados del análisis de epítopos del clon DI-2-14. Figura 8A: Una figura que muestra los resultados obtenidos transfectando transitoriamente cada mutante del gen hDlk-1 descrito a células COS-7 mediante lipofección y realizando después el análisis FACS de las células de 24 a 72 horas después de la transfección génica (izquierda: IgG1 de ratón, derecha: DI-2-14). Las porciones cerradas indican cada una de las células que expresan los mutantes reconocidas por el clon DI-2
14. Figura 8B: Fotografías que muestran los frotis de células COS-7 que expresan EGF (1-2), que se sometieron a inmunotinción con un control positivo (un anticuerpo policlonal anti-hDlk-1) y el clon DI-2-14. Las porciones teñidas en color rojo parduzco indicanla expresión de EGF (1-2). La Figura 9muestralos resultados delos análisis de epítopos de los clones DI-6, BA-1-3D y 2-13. Figura 9A: Una figura que muestra los resultados obtenidos transfectando transitoriamente cada mutante del gen hDlk-1 descrito a células COS-7 mediante lipofección y realizando a continuación el análisis FACS de las células 24 a 72 horas después de la transfección génica. Las porciones cerradas indican cada una de las células que expresan losmutantes reconocidas por cada clon. Figura 9B: Fotografías que muestran los frotis de células COS-7 que expresan EGF (1-2), que se sometieron a inmunotinción con los clones DI-6, BA-1-3D y 2-13. Las porciones teñidas en color rojo parduzco, que se indican conlas flechas, muestrala expresión de EGF (1-2). La Figura 10muestra los resultados del análisis de epítopos de clon M3-1mediante FACS. Los resultados se obtuvieron transfectanto transitoriamente cada mutante del gen hDlk-1 descrito a células COS-7 mediante lipofección y realizando a continuación el análisis FACS de las células de 24 a 72 horas después de la transfección génica. Las porciones cerradas indican cada una de las células que expresan los mutantes reconocidas por DI-2-14.
La Figura 11 muestra los resultados analíticos de la actividad de internalización de cada anticuerpo monoclonal anti-hDlk-1 después de que se una a un antígeno. Figura 11A: Se permitió que las células HEK293-hDlk reaccionaran con cada anticuerpo monoclonal antihDlk-1 (clones de M3-1, M1-290 y M3-4) (4°C, 20 minutos) y las células resultantes se lavaron a continuación con PBS 2 veces. Después de eso, las células se incubaron a 37°C durante el período de tiempo descrito en la figura. Después de eso, se permitió que las células reaccionaran con anti-IgG de ratón marcado con PE, seguido de análisis FACS. Los resultados se indican con valores relativos, que se obtienen cuando la intensidadmedia defluorescencia en caso de que no hayaincubación (0minutos) se define como 100%. Figura 11B: Se permitió que el clon marcado con FITC M3-1 (FITC-M3-1) reaccionara con las células HEK293-hDlk (4°C, 20 minutos) y las células resultantes se lavaron a continuación con PBS 2 veces. Después de eso, las células se incubaron a 37°C durante 120 minutos. La figura 11Bmuestra un cambio en la intensidad de fluorescencia media obtenida como resultado de la incubación antes mencionada. La columna de color negro indica un cambio en la intensidad de fluorescencia media obtenida cuando M3-1 no marcado se hizo reaccionar con las células de la misma manera que en la Figura 11A anteriormente, las células se incubaron a continuación a 37°C durante 120 minutos y se dejaron reaccionar después con anti-IgG de ratón marcado con PE. La Figura 12 muestra los resultados del análisis de la actividad de internalización de cada anticuerpomonoclonalanti-hDlk-1 marcadoconrodaminadespuésdequeseunaaunantígeno. Figura 12A: Se permitió que las células HEK293-hDlk reaccionaran con M3-1 marcado con rodamina (RhoM3-1) (4°C, 20 minutos) y las células resultantes se lavarona continuación 2 veces con PBS. Inmediatamente después del lavado, se preparó un frotis y se observó la localización de la Rho-M3-1 bajo un microscopio de fluorescencia. La Figura 12A es una fotografía que muestra tal localización de Rho-M3-1. Las Porciones de color naranja indican la localización de Rho-M3-1. Se observó la localización de la Rho-M3-1 en la membrana celular. Figura 12B a 12E: Se permitió que Rho-M3-1 (B), de Rho-DI-1 (C) y Rho-M1-290 (D) y Rho-M3-4 (E) reaccionaran con las células HEK293-hDlk y las células resultantes se lavaron a continuación 2 veces con PBS, seguido de incubación a 37°C durante 15 minutos. Después de eso, se produjeron los frotis y la localización de cada clon se observó bajo un microscopio de fluorescencia. Las Figuras 12B a 12E son fotografías que muestran tal localización de cada clon. Tanto Rho-M3-1 como Rho-DI-1, que reconocen los mismos epítopos (EGF 4-6), se incorporaron a las células y se localizaron a las mismas en forma de puntos. La Figura 13 muestra la actividad citotóxica de anticuerpos monoclonales anti-hDlk-1 conjugados con saporina a células Huh-7-hDlk y células SK-N-F1. Figura 13A: Una figura que muestra los efectos de un control (IgG de ratón-saporina (IgG-SAP)) y M3-1-SAP sobre células Huh-7-hDlk. El eje longitudinal indica la tasa de supervivencia de las células, que se indica mediante un valor relativo obtenido cuando la tasa de supervivencia de las células en el caso de la adición de anticuerpos se define como 100% (N = 3, un valor medio ± desviación típica). Figura 13B: Una vista que muestra los efectos de un control (IgG-SAP), M3-1-SAP y M1-290-SAP sobre células SK-N-F1. En la Figura 14, la Figura 14A muestra un cambio en el peso corporal de cada ratón y la Figura 14B muestra la tasa de supervivencia de los ratones, que se obtuvieron cuando IgG de ratón (20 mg/kg de peso corporal), M3-1-SAP (5 mg/kg de peso corporal) y M1-290-SAP (5 mg/kg de peso corporal) se administraron a los modelos de Xenoinjerto de células Huh-7-hDlk. El valor se indica mediante un valor medio ± desviación típica. Las flechasindican el día en el que se administraron los anticuerpos. La Figura 15 muestra los efectos inhibidores del crecimiento de tumores de IgG de ratón (●, N = 8) y M3-1-SAP (O, N = 8) obtenidos cuando estos anticuerpos se administraron por vía intraperitoneal a los modelos de Xenoinjerto de células Huh-7-hDlk. Las flechas indican el día en el que se administraron los anticuerpos. El valor se indica mediante un valor medio ± desviación típica (* P <0,01, ** P <0,05 mediante la prueba t de Student). En la Figura 16, la Figura 16A muestra un efecto inhibidor del crecimiento tumoral y la Figura 16B muestra un cambio en el peso corporal, que se obtuvieron cuando se administraron (40 g) por vía intratumoral IgG de ratón (●, N = 5) y M3-1-SAP (O, N = 5) a los modelos de Xenoinjerto de células Huh-7-hDlk. La Figura 16C muestra un efecto inhibidor del crecimiento tumoral y la Figura 16D muestra un cambio en el peso corporal, queseobtuvieron cuando seadministraron (5mg/kg depeso corporal) por víaintraperitoneal PBS (●, N = 4) y cisplatino (○, N = 4) a los modelos de Xenoinjerto de células Huh-7-hDlk. En todas las figuras, las flechas indican el día en que se administraron los anticuerpos y el valor se indica mediante un valor medio ± error típico (* P <0,01, ** P <0,05mediante la prueba t de Student). La Figura 17 incluye fotografías que muestran ejemplos típicos de una matriz de tejido de cáncer de colon humano (fabricada por Cybrdi; C05-01-001) sometida a inmunotinción con un anticuerpo anti-hDlk-1. Las porciones de color rojo parduzco indican tejidos de cáncer teñidos con el anticuerpo anti-hDlk-1. El término " negativo para hDlk-1" significa una sección en la que se observaron regiones no teñidas, como en el caso de la sección Núm. 48 (hombre de 69 años de edad, adenocarcinoma, Grado III). La sección Núm 19 (mujer de 55 años de edad, adenocarcinoma, Grado II) resultó muy fuertemente teñida y las secciones teñidas al mismo nivel que la sección Núm. 19 se definieron como "fuertemente positiva para hDlk-1". Además, como en el caso de la sección Núm. 25 (hombre de 75 años de edad, adenocarcinoma, Grado II), una sección que se confirmó claramente que era positiva para hDlk-1 y se tiñó ligeramente se definió como "débilmente positiva
para hDlk-1". La Figura 18 incluye fotografías que muestran ejemplos típicos de una matriz de tejido de cáncer de mama humano (fabricada por Cybrdi; CC08-02-002) sometida a inmunotinción con un anticuerpo anti-hDlk-1. Las porciones de color rojo parduzco indican tejidos de cáncer teñidos con el anticuerpo anti-hDlk-1. Las fotografías superiores muestran tejidos de las glándulas mamarias normales contenidos en la matriz de tejido, que se tiñeron con el anticuerpo anti-hDlk-1. Izquierda: Núm. 07 (mujer de 68 años de edad, glándula mamaria normal; negativa para hDlk-1), derecha: Núm. 01 (mujer de 43 años, lóbulos de la glándula mamaria normales; débilmente positiva para hDlk-1). Las flechas indican las porciones débilmente positivas para hDlk
1. Las fotografías inferiores muestran los tejidos de los pacientes con carcinoma ductal infiltrante. Izquierda: Núm. 08 (mujer de 45 años de edad, Grado II; negativa para hDlk-1), centro: Núm. 56 (mujer de 28 años de edad, Grado II; débilmente positivo para hDlk-1), derecha: Núm. 20 (mujer de 59 años de edad, Grado II; fuertemente positiva para hDlk-1). La Figura 19 muestra la actividad antitumoral dependiente de la dosis del clon DI-2-14 sobre modelos de tratamiento de xenoinjertos de células DLK-Huh-7. La Figura 20 muestra la actividad antitumoral dependiente de la dosis de clon DI-2-14 sobre modelos de tratamiento de xenoinjerto de células SK-N-F1. La Figura 20A muestra el crecimiento del tumor después del comienzo de la administración de los anticuerpos. El volumen del tumor se indica mediante un valor medio ± error típico (* P <0,01, ** P <0,05 mediante la prueba t de Student). La Figura 20B es un gráfico que muestra el peso de los tejidos de cáncer de extirpados el día vigésimotercero (Día 23) después dela administración delos anticuerpos. La Figura 21 muestra la secuencia de nucleótidos de ADNc (SEQ ID NO: 22) de la región variable (VH) de la cadena H (cadena pesada) de clon DI-2-14 y una supuesta secuencia de aminoácidos de la misma (SEC ID NO: 23). Los péptidos señal se describen en cursiva. El ácido glutámico de doble línea (E) representa el residuo de aminoácido N-terminal de un péptido maduro. Las secuencias de CDR (subrayadas) se proporcionan de acuerdo con la definición de Kabat et al. (Sequences of Proteins of Immunological Interests, Quinta edición, Publicación NIH Núm. 91-3242, U.S. Department of Health and Human Services, 1991). Las secuencias de aminoácidos de las CDR 1 a 3 del clon DI-2-14 VH fueron las mostradas en los SEQ ID NOS: 30 a 32, respectivamente. La Figura 22 muestra la secuencia de nucleótidos de ADNc (SEQ ID NO: 24) de la región variable (VL) de la cadena L (cadena ligera) del clon DI-2-14 y una supuesta secuencia de aminoácidos de la misma (SEC ID NO: 25). Los péptidos señal se describen en cursiva. El ácido aspártico de doble línea (D) representa el residuo de aminoácido N-terminal de un péptido maduro. Las secuencias de CDR (subrayadas) se proporcionan de acuerdo con la definición de Kabat et al. (1991; como se describió anteriormente). Las secuencias deaminoácidos delas CDR 1 a 3 del clon DI-2-14 VL son lasmostradas en los SEQ ID NOS: 33 a 35, respectivamente. La Figura 23 muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 26) de un gen VH del clon DI-2-14 y la secuencia de aminoácidos de la misma (SEC ID NO: 27). Se introdujo SpeI en el extremo 5' y se añadió un sitio HindIII al extremo 3' (se subrayaron los dos sitios). La secuencia de nucleótidos descrita en cursiva indica una secuencia correspondiente a unintrón. La Figura 24 muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 28) de un gen VL del clon DI-2-14 y la secuencia de aminoácidos de la misma (SEC ID NO: 29). Se añadió un sitio NheI al extremo 5' y se introdujo un sitio EcoRI en el extremo 3' (se subrayaron los dos sitios). La secuencia de nucleótidos descrita en cursiva indica una secuencia correspondiente a un intrón. La Figura 25 es una vista esquemática de un vector de expresión del gen DI-2-14 quimérico (pChDI-2-14). En la dirección de las agujas del reloj empezando desde el sitio SalI, este vector comprende una unidad de traducción de la cadena pesada partiendo de un promotor temprano inmediato principal de citomegalovirus humano (CMV) y un potenciador utilizado para el comienzo de la transcripción de un gen de la cadena pesada del anticuerpo. La región de CMV continúa entonces a un exón VH, la secuencia del gen de una región constante de cadena pesada γ1 humana (que comprende los exones de CH1, una región bisagra, CH2 y CH3, a través de intrones) y después de CH3, una porción de poli A utilizada para el procesamiento del ARNm. Después dela secuencia del gen dela cadena pesada, el vector comprende una unidad de traducción de la cadena ligera partiendo de un promotor de CMV y un potenciador y comprende adicionalmente un exón VL, el exón (CL) de una región constante de la cadena κ humana que tiene una porción intrónica aguas arriba de la misma y la señal de poli A de un gen κ. Después de eso, los genes de la cadena ligera continúa a un segmento que comprende un promotor temprano de SV40, un gen de guanina xantina fosforribosil transferasa (gpt) de E. coli y la porción de poli A de SV40. Por último, el plásmido tiene un porción de un plásmido pUC19 que comprende el origen dereplicación de bacterias y un gen de β-lactamasa. La Figura 26 muestra DI-2-14 de ratón y DI-2-14 quimérico (ChDI-2-14), que se desarrollaron mediante SDS-PAGE y a continuación se tiñeron con CBB. MW indica un marcador de tamaño y las flechas indican los pesos moleculares delas bandas (kD). La Figura 27 muestra la actividad de unión al antígeno de DI-2-14 y ChDI-2-14 medida mediante ELISA en fase sólida de FA-1 purificada (región extracelular de hDlk-1). ○ indica un anticuerpo IgG1 de ratón (clon DI-2
14) y • indica un anticuerpo quimérico (ChDI-2-14). La Figura 28 muestra la reactividad de DI-2-14 y ChDI-2-14 con células HEK293-hDlk medida mediante citometría de flujo. Los histogramas rellenos indican anticuerpos de control de isotipo y los histogramas perfilados en color negro (abiertos) indican DI-2-14 y ChDI-2-14. La Figura 29 muestra los resultados obtenidos mediante el análisis de la expresión de Dlk-1 de la superficie celular en líneas celulares de cáncer de hígado humano mediante citometría de flujo. La línea azul indica IgG1 de ratón y la línea roja indica un anticuerpo anti-Dlk-1 humana. Estos son histogramas obtenidos tiñendo cada tipo de células. La Figura 30 muestra los resultados obtenidos mediante el análisis de la expresión de Dlk-1 de la superficie celular en líneas celulares de cáncer de mama humano mediante citometría de flujo. La línea azul indica IgG1 de ratón y la línea roja indica un anticuerpo anti-Dlk-1 humana. Estos son histogramas obtenidos tiñendo cada tipo de células. La Figura 31 muestra los resultados obtenidos mediante el análisis de la expresión de Dlk-1 de la superficie celular en líneas celulares de leucemia humana mediante citometría de flujo. La línea azul indica IgG1 de ratón y la línea roja indica un anticuerpo anti-Dlk-1 humana. Estos son histogramas obtenidos tiñendo cada tipo de células. La Figura 32 muestra la inmunohistotinción de Flk-1/VEGF-R2 en tejidos de cáncer extirpados de los modelos de tratamiento de Xenoinjerto de células DLK-Huh-7. La Figura 32A incluye fotografías en las que las secciones frescas congeladas de tejidos de cáncer recogidos (extirpados) de un grupo al que se había administrado IgG de ratón (un grupo de control) y un grupo al que se había administrado el clon DI-2-14 se sometieron a inmunotinción con un anticuerpo anti-Flk-1/VEGF-R2 de ratón (objetivo de 200 veces). En las fotografías, las porciones indicadas por la flecha (▲) indican las células endoteliales vasculares tumorales positivas para Flk-1/VEGF-R2. La Figura 32B es un gráfico, que se preparó sometiendo a inmunotinción las secciones frescas congeladas de tejidos de cáncer recogidos (extirpados) de un grupo al que se había administrado IgG (2 individuos) y un grupo al que se había administrado DI-2-14 (4 individuos) con un anticuerpo anti-Flk-1/VEGF-R2 de ratón, contando a continuación el número de células endoteliales vasculares de tumor positivas para Flk-1/VEGF-R2 en 8 a 13 campos visuales (grupo de administración de IgG: total de 21 campos visuales, grupo de administración de DI-2-14: total de 35 campos visuales) bajo una lente de objetivo de con un aumento de 200 veces y, mostrando a continuación el número de células por campo visual (* P <0,01 mediante la prueba t de Student). La Figura 33 muestra la expresión génica de Flk-1/VEGF-R2 en tejidos de cáncer extirpados de los modelos de tratamiento de Xenoinjerto de células DLK-Huh-7. La Figura 33A muestra una imagen electroforética, en la que el tumor se extirpó de cada uno de un grupo al que se había administrado IgG (N = 7) y un grupo al que se había administrado DI-2-14 (N = 7), el ARN se extrajo después del tumor utilizando un reactivo Trizol, a continuación se sintetizó el ADNc de la primera hebra y después se confirmó génica de Flk-1/VEGF-R2 (mFlk-1) de ratón y GAPDH (GAPDH) de ratón/humana por medio de un método de PCR (30 ciclos) utilizando cada ADNc de la primera hebra como molde. Con respecto al gráfico inferior, una banda del producto de amplificación obtenido mediante la PCR realizada en mFlk-1 y GAPDH se cuantificó mediante imagen de NIH y a continuación se expresó en forma de una razón (mFlk-1/GAPDH). La Figura 33B es una figura obtenida de la misma manera como en la Figura 33A anterior, con la excepción de que se llevó a cabo la reacción de amplificación durante 35 ciclosmediante el método PCR.
Mejor modo dellevar a cabo la invención
En lo sucesivo, la presente invención se describirá en detalle. No se pretende que las siguientes descripciones limiten el alcance de la presente invención. Aparte de los siguientes ejemplos, la presente invención se puede modificar y se puede llevar a cabo, según sea apropiado, dentro de un rango que no perjudique el propósito de la presente invención.
La presente memoria descriptiva incluye todos los contenidos descritos en la memoria descriptiva de la Solicitud de Patente Japonesa Núm. 2006-305355, que es un documento de prioridad dela presente solicitud.
1. Compendio dela presente invención
Como se describió anteriormente, Dlk-1 humana (homólogo de tipo delta 1 (Drosophila); hDlk-1) es una proteína transmembrana de tipo I (de tipo transmembrana uno) con una longitud total de 383 residuos de aminoácidos y esta proteína tiene 6 motivos de tipo EGF en su región extracelular. Se ha sabido que un gen hDlk-1 y un producto génico del mismo se expresan con una alta frecuencia en diversos tipos de células cancerosas o tumorales. En general, es difícil de preparar y obtener un anticuerpo que exhiba actividad antitumoral in vivo. Por lo tanto, incluso si se produce un anticuerpo monoclonal anti-hDlk-1, este tiene actividad antitumoral in vitro pero no exhibe la actividad in vivo en muchos casos. Por otra parte, no se han aclarado el dominio funcional de hDlk-1 que actúa sobre el crecimiento de células cancerosas, un ligando (o un receptor) de hDlk-1, su ruta de transducción de la señal intracelular y similares.
Por lo tanto, es sustancialmente imposible producir eficazmente un anticuerpo limitando su diana. En tales circunstancias, en la presente invención, se ha obtenido con éxito un clon que tiene actividad antitumoral in vivo escrutándolo a partir de un gran número de clones.
En primer lugar, basándose en la inmunohistoquímica que utiliza anticuerpos anti-hDlk-1 conocidos, los autores de la presente invención han descubierto que hDlk-1 se expresa en el cáncer de colon y el cáncer de mama, además de los cánceres y las células tumorales mencionados anteriormente, en los que se había confirmado previamente la expresión de hDlk-1.
A continuación, los autores de la presente invención han producido recientemente aproximadamente 100 clones de anticuerpos monoclonales anti-hDlk-1 con el fin de producir anticuerpos anti-hDlk-1 capaces de destruir las células cancerosas que expresan hDlk-1 en nivel individual o inhibir el crecimiento del tumor, a saber, anticuerpos anti-hDlk1 que tienen actividad antitumoral in vivo. Después de eso, los autores de la presente invención han evaluado los efectos farmacéuticos in vivo (acción anti-tumoral) de estos clones, utilizando ratones portadores de tumores establecidos mediante el trasplante de varios tipos de líneas celulares de cáncer por vía subcutánea en ratones carentes de sistema inmunitario. Como resultado, los autores de la presente invención han tenido éxito en la obtención de varios clones que exhiben una actividad de inhibición del crecimiento tumoral significativa (nombre del clon: DI-2-14, 2-13, BA-1-3D, DI-6 y M3-1).
Por otra parte, entre los anticuerpos anti-hDlk-1 anteriormente mencionados, los autores de la presente invención han encontrado un anticuerpo excelente en términos de capacidad migratoria para moverse a las células que expresan hDlk-1 (actividad de internalización) y los autores de la presente invención han producido un complejo de anticuerpo-agente, el cual comprende tal anticuerpo y un compuesto que tiene actividad antitumoral o actividad destructora de células. Este complejo es lo que se denomina "producto inmunoconjugado", que es excelente en términos de capacidad deliberar agentes a las célulastumorales como dianas.
Los autores de la presente invención han encontrado que el anticuerpo anti-hDlk-1 o complejo de anticuerpo-agente anteriormente mencionados que tienen actividad antitumoral son útiles para el tratamiento de diversos tipos de tumores, o para el diagnóstico y la detección de tumores.
2. Preparación de anticuerpo anti-hDlk-1
Preparación del antígeno
La información relativa a la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 2) de hDlk-1 se describe como "Número de acceso: NP_003827" en el sitio web del NCBI (GenBank) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), por ejemplo. Además, la información referente a una secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 1) que codifica la secuencia de aminoácidos de hDlk-1 se describe como "Número de acceso: NM_003836" en el mismo sitio web anterior.
Como antígeno, se puede utilizar un polipéptido o péptido (que puede ser referido simplemente como "péptido" a veces) que comprende al menos una porción de (toda o una parte de) la secuencia de aminoácidos de hDlk-1 y preferiblemente, se puede utilizar un péptido que comprende al menos una porción de (toda o una parte de) la secuencia de aminoácidos de la región extracelular (FA-1) de hDlk-1. Como se indicó anteriormente, la región extracelular de hDlk-1 comprende 6 motivos de tipo EGF (EGF-1 a EGF-6). Esta región indica una región que comprende los aminoácidos en las posiciones 26 a 244 en la secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 2 y, preferentemente, una región que consiste en los aminoácidos de la "posición 24" a las posiciones "248-285" (aproximadamente 225 a 262 residuos de aminoácidos) en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 2.
Aquí, en el caso de un péptido utilizado como antígeno, la longitud de la "al menos una porción de la secuencia de aminoácidos" mencionada no está particularmente limitada. Por ejemplo, es preferible una región que comprende uno o dos o más de los 6 motivos de tipo EGF. Los ejemplos más preferibles incluyen una región que comprende EGF-1 y EGF-2 (es decir, una región que consiste en los aminoácidos de las posiciones 26 y 85 en la secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 2), una región que comprende EGF-3 y EGF-4 (es decir, una región que consiste en los aminoácidos de las posiciones 92 a 167 en la secuencia de aminoácidosmostrada en el SEQ ID NO: 2) y una región que comprende EGF-4, EGF y EGF-5-6 (es decir, una región consiste en los aminoácidos de las posiciones 131 a 244 en la secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 2).
Como método para preparar un péptido utilizado como antígeno, se puede aplicar ya sea una síntesis química, o una síntesis mediante ingeniería genética significa utilizar Escherichia coli o similares. Se pueden aplicar métodos bien conocidos por los expertos en la técnica.
En el caso de realizar una síntesis química de péptidos, se puede sintetizar un péptido de este tipo por medio de métodos bien conocidos para la síntesis de péptidos. En cuanto a tal síntesis, se pueden aplicar un método de síntesis en fase sólida o un método de síntesis en fase líquida. Se pueden utilizar aparatos de síntesis de péptidos
disponibles en el mercado (por ejemplo, PSSM-8, etc.; fabricado por Shimadzu Corp.).
En el caso de la síntesis de un péptido por medio de ingeniería genética, se diseña y sintetiza en primer lugar el ADN que codifica el péptido. El diseño y la síntesis del ADN pueden llevarse a cabo, por ejemplo, mediante un método de PCR, usando un vector que comprende un gen hDlk-1 completo o similar como molde y también usando cebadores diseñados de tal manera que se pueda sintetizar una región de ADN deseada con los mismos. Después de eso, el ADN sintetizado de estemodo se liga a un vector adecuado para obtener un vector recombinante utilizado en la expresión de una proteína. Este vector recombinante se introduce a continuación en un anfitrión de manera que se pueda tal que expresar en el mismo un gen de interés, con el fin de obtener un transformante (Sambrook J. et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3a edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001).
Como vector, se pueden utilizar un fago o un plásmido susceptibles de replicación autónoma en microorganismos anfitriones. Adicionalmente, también se puede utilizar un vector de virus de animal o virus de insecto. Para la preparación de un vector recombinante, el ADN purificado se puede escindir con enzimas de restricción adecuadas, la porción de ADN obtenida se puede insertar a continuación en el sitio de restricción del ADN vector adecuado, etc., y después se puede ligar a un vector. El tipo de un anfitrión utilizado en la transformación no está particularmente limitado, siempre y cuando sea susceptible de expresar un gen de interés. Los ejemplos de tal anfitrión incluyen bacterias (Escherichia coli, Bacillus subtilis,etc.), levaduras, células animales (células COS, células CHO, etc.), células de insectos e insectos. También es posible utilizar un mamífero tal como una cabra como un anfitrión. Se conoce unmétodo para introducir un vector recombinante en un anfitrión.
El transformante anteriormentemencionado se cultiva y un péptido utilizado como antígeno se recoge a continuación del cultivo. El término "cultivo" se utiliza para significar uno cualquiera de (a) un sobrenadante de cultivo y (b) células cultivadas, una masa de células cultivadas, o un producto disgregado delasmismas.
Después de la finalización del cultivo, cuando se produce el péptido de interés en las células bacterianas (cuerpos bacterianos) o en las células, tales células bacterianas o células se disgregan y a continuación se extrae un péptido. Por otro lado, se produce un péptido de interés fuera de la célula bacteriana o de las células, la solución de cultivo se utiliza directamente, o las células bacterianas o las células se eliminan por medio de centrifugación o similar. Después de eso, se aplican por separado o combinados métodos bioquímicos comunes utilizados en el aislamiento y la purificación de péptidos, tales como precipitación con sulfato de amonio, filtración en gel, cromatografía de intercambio iónico y cromatografía de afinidad, con el fin de aislar y purificar un péptido de interés.
En la presente invención, también se puede obtener un péptido utilizado como un antígeno mediante traducción in vitro utilizando un sistema de síntesis libre de células. En este caso, se pueden aplicar dos tipos de métodos, a saber, un método que utiliza ARN como molde y un método que utiliza ADN como molde (transcripción/traducción). Como tal sistema de síntesis libre de células, se pueden utilizar sistemas disponibles en el mercado, tales como el sistema Expressway™ (Invitrogen), PURESYSTEM (marca registrada; Post Genome Institute Co., Ltd.) y el sistema TNT (marca registrada; Promega).
El péptido obtenido de esta manera también puede estar unido a una proteína portadora adecuada, tal como albúmina de suero bovino (BSA), hemocianina de lapa ojo de cerradura (KLH), tiroglobulina humana, o gamma globulina de pollo.
Además, tal antígeno de este tipo puede ser un péptido, que consiste en una secuencia de aminoácidos que comprende una deleción, sustitución o adición de uno o múltiples aminoácidos con respecto a la secuencia de aminoácidos de hDlk-1 (SEC ID NO: 2) o la secuencia parcial anteriormente mencionada de la misma. Por ejemplo, también se puede utilizar un péptido, que consiste en una secuencia de aminoácidos que comprende una deleción de uno o múltiples (preferiblemente uno o varios (por ejemplo de 1 a 10 y más preferiblemente de 1 a 5)) aminoácidos, una sustitución de uno o múltiples (preferiblemente uno o varios (por ejemplo de 1 a 10 y más preferiblemente de 1 a 5)) aminoácidos por otros aminoácidos, o una adición de uno omúltiples (preferiblemente uno
o varios (por ejemplo de 1 a 10 y más preferiblemente 1 a 5)) aminoácidos, con respecto a la secuencia de aminoácidos de hDlk-1 o una secuencia parcial de la misma.
En la presente invención, un ejemplo de un gen que se va a introducir en las células o similares es un gen que codifica una proteína hDlk-1, un fragmento parcial de la misma, una proteína mutante de la misma, o un fragmento de la misma. Como tal gen, se puede utilizar, por ejemplo, un gen que tiene la secuencia de nucleótidos mostrada en el SEQ ID NO: 1 o una secuencia parcial dela misma.
Adicionalmente, como tal gen que se va a introducir en las células o similar, también se puede utilizar una secuencia de nucleótidos, que hibrida con una secuencia complementaria a la secuencia de nucleótidosmostrada en el SEC ID NO: 1 en condiciones rigurosas y codifica una proteína que tiene actividad hDlk-1, o una secuencia parcial de la misma. El término "condiciones rigurosas" se utiliza para referirse a las condiciones aplicadas al lavado después de la
hibridación, que consisten en una concentración de sal (de sodio) del tampón de entre 10 y 500 mM y una temperatura entre 42°C y 72°C y preferiblemente consisten en la concentración de sal de tampón mencionada de entre 50 y 300mM y una temperatura entre 55°C y 68°C.
La mutación puede introducirse en un gen por medio de métodos conocidos tales como un método Kunkel o un método Gapped Duplex, utilizando kits de introducción de mutación que utilizan mutagénesis dirigida al sitio, tales como GeneTailor™ Site Directed Mutagenesis System (fabricado por Invitrogen) o TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System (Mutan-K, Mutan-Super Express Km, etc.; fabricado por Takara BioInc.).
(2) Preparación de anticuerpo policlonal
El antígeno preparado se administra a un mamífero para la inmunización. El tipo de tal mamífero no está particularmente limitado. Los ejemplos de tal mamífero incluyen una rata, un ratón y un conejo. Entre otros, es preferible un ratón.
La dosis del antígeno por animal se puede determinar, según sea apropiado, dependiendo de la presencia o ausencia de un coadyuvante. Los ejemplos de tal coadyuvante incluyen coadyuvante completo de Freund (FCA), coadyuvante incompleto de Freund (FIA) y un coadyuvante de hidróxido de aluminio. La inmunización se puede llevar a cabo mediante la inyección del antígeno en la vena, la almohadilla plantar, el tejido subcutáneo, la cavidad abdominal, etc. Además, el intervalo de inmunización no está particularmente limitado. La inmunización se lleva a cabo de 1 a 10 veces y preferiblemente 2 o 3 veces, a intervalos de varios días a varias semanas y preferiblemente a intervalos de 1 semana. De tres a siete días después de la inmunización final, se mide el título de anticuerpo por medio de inmunoanálisis enzimático (ELISA o EIA), radioinmunoanálisis (RIA), etc. El día en el que se obtiene un título de anticuerpos deseado, se recoge sangre y a continuación se obtiene el antisuero. En un caso en el que un anticuerpo se debe purificar en el método mencionado anteriormente para recoger el anticuerpo, el método adecuado se selecciona apropiadamente entre los métodos conocidos tales como un método de precipitación por adición de sal con sulfato de amonio, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de filtración en gel y cromatografía de afinidad, o estos métodos se pueden utilizar combinados, para purificar el anticuerpo. Después de eso, la reactividad de un anticuerpo policlonal contenido en el antisuero semidemediante ELISA, etc.
(3) Preparación de anticuerpomonoclonal
(3-1) Recolección de las células productoras de anticuerpos
El tipo del anticuerpo anti-hDlk-1 de la presente invención noestá limitado. Es preferible un anticuerpo monoclonal.
El antígeno preparado se administra a un mamífero tal como una rata, un ratón o un conejo para la inmunización. La dosis del antígeno por animal se puede determinar, según sea apropiado, dependiendo de la presencia o ausencia de un coadyuvante. En la presentememoria se utilizan los mismos coadyuvantes que se han descrito anteriormente. Asimismo, en la presente memoria se aplican los mismos métodos de inmunización que se han descrito anteriormente. De uno a sesenta días, y preferiblemente de uno a catorce días después de la inmunización final, se recogen las células productoras de anticuerpos. Los ejemplos de tales células productoras de anticuerpos incluyen células de bazo, células de ganglios linfáticos y células de sangre periférica. Entre otras, son preferibles las células de los ganglios linfáticos ylas células de bazo.
(3-2) Fusión celular
Con el fin de obtener un hibridoma (una línea celular productora de anticuerpos), la fusión celular se lleva a cabo entre las células productoras de anticuerpos y las células de mieloma. Como células de mieloma que se van a fusionar con las células productoras de anticuerpos, fácilmente disponibles, se pueden utilizar líneas celulares establecidas, tales como las líneas de células de animales tales como ratones. En cuanto a las líneas celulares disponibles, son preferible aquellas que tienen la selectividad por fármacos, no pueden sobrevivir en un medio selectivo HAT (que contiene hipoxantina, aminopterina y timidina) cuando están en un estado no fusionado y pueden sobrevivir en él sólo cuando se fusionan con células productoras de anticuerpos.
Los ejemplos de las células de mieloma utilizadas en la presente memoria incluyen líneas celulares de mieloma de ratón tales como P3-X63-Ag8.653, P3-X63-Ag8 (X63), P3-X63-Ag8.U1(P3U1), P3/NS I/1-Ag4-1(NS1) y Sp2/0Ag14(Sp2/0). Tales células de mieloma se pueden seleccionar, mientras se tome en consideración la compatibilidad con las células productoras de anticuerpos, según sea apropiado.
Posteriormente, las células de mieloma se fusionan con las células productoras de anticuerpo para la fusión celular. Para este tipo de fusión celular, las células productoras de anticuerpos a una densidad celular de 1 x 106 a 1 x 107 células/ml se mezclan con células de mieloma a una densidad celular de 2 x 105 a 2 x 106células/ml, en un medio utilizado para células animales que no contiene suero, tal como DMEM o un medio RPMI-1640. La proporción de
células entre dichas células productoras de anticuerpos y tales células de mieloma (células productoras de anticuerpos:células de mieloma) no está limitada. En general, tal proporción celular se encuentra preferiblemente entre 1:1 y 10:1 y más preferiblemente 3:1. Con posterioridad, se lleva a cabo una reacción de fusión en presencia de un promotor de la fusión celular. En cuento a tal promotor de la fusión celular, se puede utilizar polietilenglicol que tiene un peso molecular medio entre 1.000 y 6.000 daltons (D) o similares, por ejemplo. Además, las células productoras de anticuerpos se pueden fusionar con células de mieloma usando un dispositivo de fusión celular disponible comercialmente que utiliza la estimulación eléctrica (p. ej., electroporación).
(3-3) Selección de hibridomas y clonación
Un hibridoma de interés se selecciona a partir de células obtenidas después del tratamiento de fusión celular. Como método de selección, una suspensión de células se diluye con un medio RPMI-1640 que contiene suero bovino fetal
o similar, según sea apropiado y la solución diluida se dispersa a continuación en una placa de microtitulación. Se añade un medio selectivo a cada pocillo y se lleva a cabo el cultivo a continuación, mientras que el medio selectivo se cambia apropiadamente por uno de nueva aportación. Como resultado, las células que crecen aproximadamente 14 días después del comienzo del cultivo en el medio selectivo pueden obtenerse en forma de hibridomas.
Posteriormente, se escruta la presencia o ausencia de un anticuerpo contra hDlk-1 en un sobrenadante de cultivo de los hibridomas en crecimiento. Dicho escrutinio de los hibridomas se puede llevar a cabo de acuerdo con métodos ordinarios y por lo tanto el tipo del método de escrutinio no está particularmente limitado. Por ejemplo, una porción del sobrenadante del cultivo de los hibridomas en crecimiento contenidos en el pocillo se puede recoger y tales hibridomas se pueden escrutar a continuaciónmediante ELISA, EIA, RIA, etc.
Las células fusionadas se pueden clonar mediante dilución limitante o similar. Un anticuerpo que presenta una fuerte reactividad con hDlk-1 se determina por medio de citometría de flujo o similar, y se selecciona y se establece como clon un hibridoma que produce el anticuerpo.
(3-4) Recolección del anticuerpomonoclonal
Comométodo decultivo delos hibridomas establecidos y posterior recolección del anticuerpomonoclonal a partir del cultivo obtenido, se puede adoptar un método de cultivo celular común, un método de formación de ascitis, etc. El término "cultivo" se utiliza para significar que se permite desarrollar un hibridoma en una placa de cultivo o botella de cultivo, o que se permite que prolifere un hibridoma en la cavidad abdominal de un animal, como se describe a continuación.
En el método de cultivo celular, los hibridomas se pueden cultivar en un medio de cultivo celular animal tal como un medio RPMI-1640 que contiene suero bovino fetal al 10%, un medio MEM o un medio libre de suero en condiciones de cultivo comunes (p. ej., 37°C, concentración de CO2 al 5%) durante 7 a 14 días y a continuación se puede obtener un anticuerpo del sobrenadante del cultivo.
En el método de formación de ascitis, los hibridomas se administran a una densidad celular de aproximadamente 1 x 107 células en la cavidad abdominal de un animal de la misma especie que el mamífero del que derivan las células de mieloma, con el fin de causar la proliferación de una gran cantidad de hibridomas. Después de eso, la ascitis se recoge preferiblemente de 2 a 3 semanasmás tarde.
En un caso en el que un anticuerpo debe ser purificado en el método anteriormente mencionado para recoger el anticuerpo, un método adecuado se selecciona apropiadamente a partir de métodos conocidos, tales como un método de precipitación por adición de sal con sulfato de amonio, cromatografía de intercambio iónico, filtración en gel y cromatografía de afinidad, o estos métodos se utilizan combinados, con el fin de purificar el anticuerpo anteriormentemencionado.
(3-5) Selección del clon que tiene actividad antitumoral
El anticuerpo anti-hDlk-1 dela presente invención es un anticuerpo que tiene actividad antitumoral in vivo.
En la presente memoria, el término "actividad antitumoral" se utiliza para significar la actividad de destrucción de células tumorales (células cancerosas) o inhibición del crecimiento tumoral. En la presente invención, como tal actividad antitumoral es preferible, por ejemplo, la actividad de inhibición de la angiogénesis tumoral. Por otra parte, los tipos de tumores humanos (células tumorales), sobre los que el anticuerpo de la presente invención es capaz de manifestar actividad antitumoral, incluyen: los tumores humanos conocidos antes mencionado en los que se había confirmado la expresión de hDlk-1 (específicamente, cánceres sólidos tales como tumor neuroendocrino, neuroblastoma, glioma, neurofibromatosis tipo 1, cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de hígado, cáncer de riñón y cánceres de ovario, y cánceres de la sangre tales como el síndrome mielodisplásico y la leucemia mieloide aguda); y cáncer de colon humano y cáncer de mama humano en los que la expresión de hDlk-1 ha sido
recientemente confirmada por los autores de la presente invención. De estos, son particularmente preferibles uno o dos o más tipos seleccionados entre cáncer de colon humano, cáncer de mama humano, cáncer de hígado humano y neuroblastoma humano.
La presencia dela actividad antitumoral in vivo se puede confirmar utilizando un ratón que porta cáncer, en el que se han trasplantado subcutáneamente las células tumorales deseadas, y a continuación administrando el anticuerpo obtenido al ratón. En este caso, el anticuerpo se puede administrar al ratón inmediatamente después del trasplante de las células tumorales (un modelo de Prevención), o el anticuerpo se puede administrar también al ratón después de que el tumor ha crecido hasta un volumen deseado después del trasplante (un modelo de Tratamiento). El método de administración no está limitado. Por ejemplo, el anticuerpo se puede administrar a la cavidad abdominal del ratón una vez cada 3 días a una dosis de 20 mg/kg de peso corporal a través de administración intraperitoneal. En el caso del modelo de Prevención, la presencia o ausencia de actividad antitumoral y su nivel se pueden evaluar en función de la frecuencia de la formación del tumor y del volumen del tumor. En el caso del modelo de Tratamiento, la presencia o ausencia de actividad antitumoral y el nivel de los mismos se pueden evaluar en función del volumen del tumor.
En la presente invención, los ejemplos preferidos de un anticuerpo anti-hDlk-1 que tiene actividad antitumoral in vivo incluyen un anticuerpo monoclonal anti-hDlk-1 (nombre del clon: M3-1) producido por un hibridoma que tiene el Núm. de acceso FERM BP-10707, un anticuerpomonoclonal anti-hDlk-1 (nombre del clon: DI-2-14) producido por un hibridoma que tiene el Núm. de acceso FERM BP-10899 y un anticuerpo monoclonal anti-hDlk-1 (nombre del clon: DI-6) producido por un hibridoma que tiene el Núm. de acceso FERM BP-10900. Además, se puede utilizar preferiblemente un anticuerpo monoclonal anti-hDlk-1 con el nombre de clon DI-2-14 como anticuerpo que tiene una alta actividad antitumoral in vivo.
En la presente memoria, el hibridoma que tiene el número de acceso FERM BP-10707 se ha denominado "Hibridoma de Ratón-Ratón: M3-1", y se ha depositado en el Organismo Internacional para el Depósito de Patentes (IPOD), Instituto Nacional de Ciencia Industrial Avanzada y Tecnología (AIST Tsukuba Central de 6, Higashi 1-1-1, Tsukuba, Ibaraki, Japón, Código postal: 305 a 8566), el 18 de octubre de 2006. El hibridoma que tiene el número de acceso FERM BP-10899 se ha denominado "Hibridoma de Ratón-Ratón DI-2-14," y se ha depositado en el mismo instituto nacional anterior el 21 de agosto de 2007. El hibridoma que tiene el número de acceso FERM BP-10900 se ha denominado "Hibridoma de Ratón-Ratón DI-6", y se ha depositado en el mismo instituto nacional el 21 de Agosto de 2007.
Adicionalmente, el anticuerpo anti-hDlk-1 de la presente invención incluye, como secuencias de aminoácidos de las CDR 1 a 3 de la región V de la cadena H, las secuencias de aminoácidos mostradas en los SEQ ID NO: 30 a 32, respectivamente, y, como secuencias de aminoácidos de las CDR 1 a 3 de la región V de la cadena L, las secuencias de aminoácidos mostradas en los SEQ ID NOS: 33 a 35 respectivamente. La región V de la cadena H antes mencionada consiste preferiblemente en la secuenciade aminoácidos de la posición 20 a la posición 137 de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 23 y la región V de la cadena L antes mencionada consiste preferiblemente en la secuencia de aminoácidos de la posición 21 a la posición 132 de la secuencia de aminoácidos mostrada en el SEC ID NO: 25.
Aún más, otro ejemplo preferido del anticuerpo anti-hDlk-1 de la presente invención es un anticuerpo anti-hDlk-1 que se une a un epítopo de Dlk-1 humana a la que se une (reconoce) un anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma quetiene el Núm. de acceso FERM BP-10707 o FERM BP-10900.
(3-6) Epítopo de anticuerpo anti-hDlk-1
Los epítopos preferidos (un determinante antigénico) del anticuerpo anti-hDlk-1 de la presente invención incluyen un epítopo que es al menos una porción de una región que consiste en los aminoácidos de las posiciones 26 y 85 (una región que comprende el EGF-1 a EGF-2 de hDlk-1), una región que consiste en los aminoácidos de las posiciones 92 a 167 (una región que comprende el EGF-3 a EGF-4 de hDlk-1), o una región que consiste en los aminoácidos de las posiciones 131 a 244 (una región que comprende el EGF-4 a EGF-6 de hDlk-1), en la secuencia de aminoácidos de hDlk-1 como semuestra en SEQ ID NO: 1. Entre otras, son más preferibles una región que comprende el EGF-4 a EGF-6 y una región que comprende el EGF-4 a EGF 6 de hDlk-1. Es particularmente preferible una región que consiste en los aminoácidos de las posiciones 92 a 120 (una región que comprende el EGF-3 de hDlk-1). Un anticuerpo anti-hDlk-1 que reconoce (se une a) dichas regiones tiene una alta actividad de internalización en las células tumorales, por ejemplo, y por lo tanto, es extremadamente útil como producto inmunoconjugado tal como se describemás adelante.
(4) Anticuerpo yfragmento de anticuerpo genéticamente recombinante (4-1) Anticuerpo genéticamente recombinante
En una realización preferida del anticuerpo anti-hDlk-1 de la presente invención, se proporciona un anticuerpo
genéticamente recombinante. El tipo de tal anticuerpo genéticamente recombinante no está limita. Los ejemplos incluyen un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizadoy un anticuerpo humano.
Un anticuerpo quimérico (es decir, un anticuerpo quimérico humanizado) es un anticuerpo formado por ligación (conjugación) de la región variable de un anticuerpo derivado de ratón con la región constante de un anticuerpo derivado de ser humano (por favor, remitirse a Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 6851-6855, (1984), etc.). Cuando se produce tal anticuerpo quimérico, el anticuerpo ligado de este modo se puede construir fácilmente por medio de una técnica de recombinación genética. La región V de la cadena H del anticuerpo quimérico consiste preferiblemente en la secuencia de aminoácidos de la posición 20 a la posición 137 de la secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 23, por ejemplo, y la región V de la cadena L del anticuerpo quimérico consiste preferiblemente la secuencia de aminoácidos de la posición 21 a la posición 132 de la secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 25, por ejemplo.
Cuando se produce un anticuerpo humanizado, una región determinante de la complementariedad (CDR) se trasplanta de la región variable de un anticuerpo de ratón a la región variable de un anticuerpo humano, en el fin de producir una región variable reconstruida, en la que una región marco (FR) deriva de la humana y la CDR deriva de la del ratón (lo que se denomina injerto de CDR (trasplante de CDR)). Posteriormente, la región variable humana reconstruida, humanizada de este modo se liga a una región constante humana. Tal método para producir un anticuerpo humanizado es bien conocida en el campo de la técnica actual (por favor, remitirse a Nature, 321, 522525 (1986); J. Mol. Biol., 196, 901-917 (1987); Queen C et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 10029-10033 (1989); Publicación de Patente Japonesa (Kohyo) Núm. 4-502408 A (1992) (Patente Japonesa Núm. 2828340; Queen et al.), etc.). Las secuencias de aminoácidos mostradas en losSEQ ID NOS: 30 a 32 se utilizan como las CDR 1 a 3 de la región V de la cadena H (en este orden) y las secuencias de aminoácidos mostradas en los SEQ ID NOS: 33 a 35 se utilizan como las CDR 1 a 3 de la región V dela cadena L(en este orden).
En general, en el caso de un anticuerpo humano (un anticuerpo humano completo), su estructura que comprende una región Hipervariable que es el sitio de unión a antígeno de una región V, otras partes de la región V y una región constante es la misma que la estructura del anticuerpo de un ser humano. Sin embargo, tal sitio Hipervariable también puede derivar de otros animales. Se conoce públicamente una técnica de producción de un anticuerpo humano y se ha establecido un método para la producción de secuencias génicas que son comunes en seres humanos mediante ingeniería genética. Un anticuerpo humano se puede conseguir, por ejemplo, por medio de un método que utiliza un ratón productor de anticuerpo humano que tiene fragmentos cromosómicos humanos que comprenden los genes de la cadena H y la cadena L del anticuerpo humano (por favor, remitirse a Tomizuka, K. et al., Nature Genetics, (1977) 16, 133-143; Kuroiwa, Y. et. al., Nuc. Acids Res., (1998) 26, 3447-3448; Yoshida, H. et al, Animal Cell Technology: Basic and Applied Aspects, (1999) 10, 69-73 (Kitagawa, Y., Matsuda, T. y Iijima, S. eds), Kluwer Academic Publishers; Tomizuka, K. et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (2000) 97, 722-727, etc.), o mediante un método de obtención de un anticuerpo humano derivados de presentación en fagos seleccionado de una biblioteca de anticuerpos humanos (por favor, remitirse a Wormstone, I. M. et. al, Investigative Ophthalmology & Visual Science., (2002) 43 (7), 2301-8; Carmen, S. et. al., Briefings in Functional Genomics and Proteomics, (2002) 1 (2), 189-203; Siriwardena, D. et. al., Ophtalmology, (2002) 109 (3), 427-431, etc.).
En el caso del anticuerpo quimérico, el anticuerpo humanizado y el anticuerpo humano anteriormente mencionados, la cadena de azúcar conectada mediante N-glicósido-ligado en la región Fc de anticuerpo es preferiblemente una cadena de azúcar, en la que la fucosa no se une a N-acetilglucosamina en el extremo reductor de la misma. Un ejemplo específico es un anticuerpo que consiste en moléculas de anticuerpos genéticamente recombinantes, que tienen, en la región Fc de las moléculas de anticuerpo, una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa no se une a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor de la cadena de azúcar conectada mediante N-glicósido a través de un enlace α. Dicho anticuerpo es capaz de mejorar significativamente la actividad ADCC. Este punto (las características de la cadena de azúcar conectada mediante N-glicósido en la región Fc de anticuerpo) es preferible también para el anticuerpo policlonal y el anticuerpo monoclonal mencionados anteriormente.
(4-2) Fragmento de anticuerpo
El fragmento de anticuerpo anti-hDlk-1 de la presente invención está incluido en el anticuerpo de la presente invención. En la presente memoria, el fragmento de anticuerpo de la presente invención tiene actividad de unión a hDlk-1 y actividad antitumoral in vivo, como en el caso del anticuerpo anti-hDlk-1 de la presente invención.
El fragmento de anticuerpo significa una región de una porción de un anticuerpo policlonal anti-hDlk-1 o anticuerpo monoclonal anti-Dlk-1 (a saber, un fragmento de anticuerpo derivado del anticuerpo anti-hDlk-1 de la presente invención). Los ejemplos de un fragmento de tal anticuerpo incluyen péptidos que comprenden, como al menos una porción del mismo, fragmentos Fab, Fab', F(ab')2, Fv (fragmento variable de anticuerpo), un anticuerpo de cadena sencilla (una cadena H, la cadena L, una región V de la cadena H y una región V de la cadena L, etc.), scFv, diacuerpo (dímero de scFv), dsFv (una región V estabilizada por disulfuro) y una región determinante de la
complementariedad (CDR).
El Fab es un fragmento de anticuerpo con un peso molecular de aproximadamente 50.000 que tiene actividad de unión al antígeno, que se forma uniendo una mitad de la porción N-terminal de la cadena H y toda la cadena L a través de un enlace disulfuro, entre los fragmentos obtenidos mediante el tratamiento de moléculas de anticuerpo con una proteasa, la papaína. Además, también es posible producir tales Fab insertando ADN que codifica el Fab de un anticuerpo en un vector de expresión procariótico o un vector de expresión eucariótico e introduciendo a continuación el vector en un procariota o un eucariota con el fin de permitir que el ADN se exprese en los mismos.
El F(ab')2 es un fragmento de anticuerpo con un peso molecular de aproximadamente 100.000 que tiene actividad de unión al antígeno, cuyo tamaño es ligeramente mayor que el Fab que se une a Fab a través de un enlace disulfuro en la región bisagra, entre losfragmentos obtenidos por tratamiento demoléculas de anticuerpo con una proteasa, la pepsina. Además, también es posible producir tales F(ab')2 mediante enlace tioéter o disulfuro de Fab, como se describemás adelante.
El Fab' es un fragmento de anticuerpo con un peso molecular de aproximadamente 50.000 que tiene actividad de unión al antígeno, que se forma escindiendo el enlace disulfuro en la región bisagra de F(ab')2 mencionado anteriormente. Además, también es posible producir tal Fab' insertando el ADN que codifica el fragmento Fab' de un anticuerpo en un vector de expresión procariótico o un vector de expresión eucariótico y luego introduciendo el vector en un procariota o un eucariota con el fin de permitir que el ADN se exprese en los mismos.
El scFv es un fragmento de anticuerpo que tiene actividad de unión al antígeno, que es un polipéptido VH-P-VL o VL-P-VH formado conectando una sola región V de la cadena H (VH) a una sola región V de la cadena L (VL) utilizando un conector peptídico adecuado (P). Tal scFv puede producirse obteniendo ADNc que codifica VH y VL de un anticuerpo, construyendo el ADN que codifica el scFv, insertando el ADN en un vector de expresión para procariotas o un vector de expresión para eucariotas y a continuación introduciendo el vector en un procariota o un eucariota con el fin de permitir que el ADN se exprese en los mismos.
El diacuerpo es un fragmento de anticuerpo formado por la dimerización de scFv, que tiene actividades de unión a antígeno divalentes. Tales actividades de unión a antígeno divalentes pueden ser idénticas entre sí, o también pueden ser diferentes entre sí. Tal diacuerpo puede producirse obteniendo ADNc que codifica VH y VL de un anticuerpo, construyendo ADN que codifica scFv de tal manera que la longitud de la secuencia de aminoácidos de P sea de 8 residuos o menos, insertando el ADN en un vector de expresión para procariotas o un vector de expresión para eucariotas y a continuación introduciendo el vector en un procariota o un eucariota con el fin de permitir que el ADN se exprese en los mismos.
El dsFv es un fragmento de anticuerpo formado uniendo polipéptidos, en el que un residuo de aminoácido en cada una de VH y VL ha sido sustituido por un residuo de cisteína, uno por otro a través de un enlace disulfuro entre los residuos de cisteína. El residuo de aminoácido que se va a sustituir por residuos de cisteína se puede seleccionar basándose en la estimación de la estructura tridimensional del anticuerpo de acuerdo con el método de Reiter et al. (Protein Engineering, 7, 697-704, 1994). Tal dsFv puede producirse obteniendo ADNc que codifica VH y VL de un anticuerpo, construyendo ADN que codifica dsFv, insertando el ADN en un vector de expresión para procariotas o un vector de expresión para eucariotas y a continuación introduciendo el vector en un procariota o un eucariota con el fin de permitir que el ADN se exprese en los mismos.
Un péptido que comprende las CDR comprende al menos una región de CDR (CDR 1 a 3) de VH o VL. Múltiples péptidos que comprenden las CDR se pueden unir entre sí, directamente o a través de un conector peptídico adecuado. Tal péptido que comprende las CDR se puede producir construyendo ADN que codifica la VH y VL de un anticuerpo, insertando el ADN en un vector de expresión para procariotas o un vector de expresión para eucariotas y a continuación introduciendo el vector de expresión en un procariota o un eucariota así como permitiendo que el ADN se exprese en los mismos. Por otra parte, tal péptido que comprende las CDR también se puede producir mediante métodos de síntesis química tales como un método Fmoc (un método con fluorenilmetiloxicarbonilo) y un método tBoc(un método con t-butiloxicarbonilo).
El fragmento de anticuerpo de la presente invención, tal cual, puede ser un fragmento de anticuerpo, que comprende una parte o toda la región Fc del anticuerpo en el que la fucosa no se une a N-acetilglucosamina en el extremo reductor de una cadena de azúcar conectada mediante N-glicósido. Por otro lado, el fragmento de anticuerpo de la presente invención también puede ser una proteína de fusión, en la que el fragmento de anticuerpo antes mencionado se fusiona con una parte o toda la región Fc del anticuerpo en el que fucosa no se une a Nacetilglucosamina en el extremo reductor de un cadena de azúcar conectada mediante N-glicósido. Tal fragmento de anticuerpo es capaz demejorar significativamentela actividad de ADCC y por lo tanto es preferible.
El tipo del fragmento de anticuerpo de la presente invención no está limitado, siempre y cuando los fragmentos de anticuerpo comprendan las secuencias de aminoácidos mostradas en los SEQ ID NOS: 30 a 32 (CDR 1 a 3 de la
región V de cadena H) y/o las secuencias de aminoácido mostradas en los SEQ ID NOS: 33 a 35 (CDR 1 a 3 de la región V de la cadena L). Un ejemplo específico es un fragmento de anticuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos de la posición 20 a la posición 137 de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 23 (la región V de la cadena H). Otro ejemplo específico es un fragmento de anticuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos de la posición 21 a la posición 132 de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 25 (la región V de la cadena L).
En lo sucesivo, en las descripciones de la presente memoria descriptiva, los fragmentos de anticuerpos anteriormentemencionados están tambiénincluidos en el anticuerpo anti-hDlk-1 de la presente invención.
3. Preparación de complejo de anticuerpo-agente
Como producto inmunoconjugado preparado utilizando el anticuerpo anti-hDlk-1 anteriormente mencionado de la presente invención, se puede proporcionar un complejo de anticuerpo-agente, que comprende el anticuerpo anteriormente mencionado y un compuesto que tiene actividad antitumoral y/o actividad destructora de células. Es de señalar que un complejo formado preparando previamente cada una de la molécula de anticuerpo mencionada anteriormente y el compuesto mencionado anteriormente que tiene actividad antitumoral y/o actividad destructora de células, por separado y combinándolos a continuación se denomina generalmente producto inmunoconjugado. Por otro lado, un complejo obtenido ligando una toxina proteica utilizada como tal compuesto que tiene actividad antitumoral y/o actividad destructora de células a un gen de anticuerpo en un gen de acuerdo con una técnica de recombinación genética, de manera que le permita expresarse como una sola proteína (una proteína de fusión), se denomina generalmenteinmunotoxina.
Los ejemplos de un compuesto que tiene actividad antitumoral incluyen doxorrubicina, caliqueamicina, mitomicina C y Auristatina E.
Los ejemplos de un compuesto que tiene la actividad destructora de células incluyen saporina, lisina, exotoxina de Pseudomonas y toxina dela difteria. De éstos, se utilizan preferiblemente saporina y exotoxina de pseudomonas.
Un método para producir un complejo de anticuerpo-agente no está limitado. Por ejemplo, se aplica un método de acoplamiento de un anticuerpo con un agente a través de unenlace disulfuro o un enlace hidrazona.
El anticuerpo anti-hDlk-1 de la presente invención anteriormente mencionado es excelente en términos de actividad de internalización en células tumorales diana que expresan hDlk-1. Por lo tanto, combinando previamente un compuesto que tiene actividad antitumoral y actividad destructora de células con el anticuerpo anti-hDlk-1, se hace posible permitir que tal compuesto actúe directamente y muy selectivamente sobre las células tumorales. El complejo de anticuerpo-agente de la presente invención es extremadamente excelente en términos de capacidad de liberación del agente a las células tumorales diana.
La actividad de internalización en las células se puede evaluar marcando fluorescentemente un anticuerpo con rodamina o similar y luego observando el comportamiento migratorio y la localización del anticuerpo utilizando un microscopio de fluorescencia o similar.
Por otra parte, en la presente invención, además del complejo de anticuerpo-agente antes mencionado, también se puede proporcionar un complejo de fragmento de anticuerpo-agente, en el que el fragmento de anticuerpo antes mencionado se utiliza en lugar de un anticuerpo. Con respecto a los detalles de tal complejo de fragmento de anticuerpo-agente, se pueden aplicar, según sea apropiado, las descripciones del complejo anticuerpo-agente anteriormentemencionado.
En lo sucesivo, en las descripciones de la presente memoria descriptiva, tal complejo de fragmento de anticuerpoagente está también incluido en el complejo de anticuerpo-agente de la presente invención.
4. Composición farmacéutica
El anticuerpo anti-hDlk-1 y complejo de anticuerpo-agente de la presente invención son útiles como ingredientes activos contenidos en una composición farmacéutica.
La composición farmacéutica es útil como composición farmacéutica para el tratamiento y/o diagnóstico de un tumor. En particular, puesto que el anticuerpo anti-hDlk-1 de la presente invención y un complejo de anticuerpo-agente que comprende el anticuerpo antes mencionado tienen actividad inhibidora de la angiogénesis tumoral en cuanto a tal actividad antitumoral, se utilizan preferiblemente en el tratamiento del tumor. Es decir, el anticuerpo anti-hDlk-1 y el complejo de anticuerpo-agente de la presente invención son útiles como ingredientes activos contenidos en un agente terapéuticotumoral, uninhibidor de la angiogénesis tumoral y un agente de diagnóstico del tumor.
Es preferible proporcionar la composición farmacéutica de la presente invención en forma de una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo anti-hDlk-1 y/o el complejo de anticuerpo-agente de la presente invención como ingrediente o ingredientes activos y que comprende adicionalmente un portador farmacológicamente aceptable.
Las enfermedades diana (tumores), a los que se aplica la composición farmacéutica de la presente invención, incluyen: los tumores humanos conocidos anteriormente mencionados, en los que se había confirmado previamente la expresión de hDlk-1; y el cáncer de colon humano y el cáncer de mama humano, en los que la expresión de hDlk1 ha sido confirmada por los autores de la presente invención. Entre otros, son particularmente preferibles uno o dos
o más tipos seleccionados entre cáncer de colon, cáncer de mama humano, cáncer de hígado humano y neurocitoma humano. Dicha enfermedad diana puede ser una sola enfermedad, o se pueden desarrollar combinadas dos o más enfermedades.
Los ejemplos del "portador farmacológicamente aceptable" incluyen un excipiente, un diluyente, un expansor, un disgregante, un estabilizador, un conservante, un tampón, un emulsionante, un agente aromático, un agente colorante, un edulcorante, un espesante, un corrector, un solubilizante y otros aditivos. Utilizando uno o más tipos de tales portadores, se puede preparar una composición farmacéutica en forma de un inyectables, un agente líquido, una cápsula, una suspensión, una emulsión, un jarabe, etc. Estas composiciones farmacéuticas se pueden administrar por vía oral o parenteral. Otra forma para la administración parenteral es un inyectables que comprende uno o más ingredientes activos, que se prepara por medio de un método habitual. Tal inyectable se puede producir disolviendo o suspendiendo el presente anticuerpo en un vehículo farmacológicamente aceptable, tal como una solución salina normal o agua destilada asequible comercialmente utilizada para el inyectable.
En particular, cuando un fragmento de anticuerpo derivado del anticuerpo anti-hDlk-1 de la presente invención (particularmente, un fragmento de anticuerpo con un bajo peso molecular) se administra a un organismo vivo, se puede utilizar un sistema de dispersión coloidal además de los componentes anteriormente mencionados. Se prevé que tal sistema de dispersión coloidal tenga un efecto demejora dela estabilidad de un compuesto (un fragmento de anticuerpo) en un organismo vivo o un efecto de transporte eficaz de tal compuesto a un órgano, tejido, o célula específicos. El tipo de tal sistema de dispersión coloidal no está limitado, con tal de que se utilice comúnmente. Un ejemplo de tal sistema de dispersión coloidal es un sistema de dispersión que comprende, como base, polietilenglicol, un complejo macromolecular, un agregado macromolecular, una nanocápsula, microesferas, cuentas y lípidos incluyendo un emulsionante de aceite en agua, micelas, micelas mixtas y liposomas. Los ejemplos preferidos de un sistema de dispersión coloidal incluyen múltiples tales liposomas y las vesículas de membrana artificial, que tienen un efecto de transporte eficaz de tal compuesto a un órgano, tejido, o célula específicos (Mannino et al., Biotechniques, 1988, 6, 682; Blume y Cevc, Biochem. et Biophys. Acta, 1990, 1029, 91; Lappalainen et al., Antiviral Res., 1994, 23, 119; Chonn y Cullis, Current Op. Biotech., 1995, 6, 698).
La dosis de la composición farmacéutica de la presente invención difiere dependiendo de la edad, el sexo, el peso corporal y los síntomas del paciente, los efectos terapéuticos, el método de administración, el tiempo de tratamiento, los tipos de anticuerpo anti-hDlk-1 y el complejo de anticuerpo-agente de la presente invención contenido en la composición farmacéutica, etc. En general, la presente composición farmacéutica se puede administrar en el intervalo entre 600 mg y 6.000 mg por adulto por administración. Sin embargo, la dosis no está limitada al intervalo anteriormentemencionado.
En un caso en el que la composición farmacéutica se administra en forma de un inyectable, por ejemplo, se puede administrar a una dosis de 100 µg a 100 mg, por administración, por peso corporal de un paciente humano, una vez
o dividida en varias administraciones, como una dosis diaria media. Los ejemplos de la forma de dosificación incluyen inyección intravenosa, inyección subcutánea, inyección intradérmica, inyección intramuscular e inyección intraperitoneal. De éstas, es preferiblela inyección intravenosa.
Además, tal inyectable se puede preparar en forma de un diluyente no acuoso (p. ej., polietilenglicol, aceite vegetal tal como aceite de oliva, alcoholes tales como etanol, etc.), una suspensión, o una emulsión. Tal inyectable se puede esterilizar mediante esterilización mecánica utilizando un filtro, la mezcla de un microbicida, etc. El inyectable se puede producir en forma de un inyectable que se prepara antes de su uso. Es decir, una composición sólida esterilizada se prepara mediante un método de liofilización o similares, y la composición se disuelve a continuación en agua destilada esterilizada utilizada para inyectables u otros disolventes antes de su uso, de modo que se puede utilizar a continuación.
La presente invención proporciona el uso del anticuerpo anti-hDlk-1 y/o el complejo de anticuerpo-agente de la presente invención anteriormente mencionados en la producción de un producto farmacéutico (un agente) para el tratamiento y/o diagnóstico de tumores. Además, la presente invención proporciona el anticuerpo anti-hDlk-1 y/o el complejo de anticuerpo-agente de la presente invención anteriormente mencionados, que se utiliza para el tratamiento y/o diagnóstico de tumores.
5. Método para la detección de tumores
El método para la detección de un tumor de la presente invención se caracteriza porque comprende permitir que el mencionado anticuerpo anti-hDlk-1 de la presente invención reaccione con una muestra obtenida de un organismo vivo (referida de aquí en adelante comomuestra biológica) ydetectar una señal del anticuerpo que hareaccionado.
Como se describió anteriormente, puesto que se ha confirmado que hDlk-1 se expresa específicamente en diversos tipos de células tumorales, se puede utilizar hDlk-1 y en particular, hDlk-1 libre (una porción de la región extracelular de hDlk-1) como marcador para diversos tipos de tumores. En particular, tal hDlk-1 se puede utilizar preferiblemente comomarcador para el cáncer de colon humano, el cáncer de mama humano y el cáncer de hígado humano.
Por lo tanto, se permite que el anticuerpo anti-hDlk-1 de la presente invención reaccione con una muestra biológica y a continuación se detecta una señal del anticuerpo que ha reaccionado, con el fin de detectar un tumor. La señal de anticuerpo obtenida se puede utilizar como un indicador de la cantidad de un antígeno en la muestra biológica (es decir, la cantidad de hDlk-1 o la cantidad de hDlk-1 libre). En la detección del tumor utilizando el anticuerpo de la presente invención, primero, se permite que una muestra biológica recogida como analito de un sujeto, tal como una sección de tejido o sangre que se utiliza como diana de ensayo, se una al anticuerpo de la presente invención por medio de una reacción antígeno-anticuerpo. Con posterioridad, basándose en los resultados de la medición de la cantidad de anticuerpo unido, se mide la cantidad de un antígeno de interés contenido en la muestra biológica. Esta medición puede llevarse a cabo de acuerdo con métodos de inmunoanálisis conocidos. Por ejemplo, se pueden utilizar un método de inmunoprecipitación, un método de inmunoaglutinación, radioinmunoensayo, inmunonefelometría, un método de transferencia Western, citometría de flujo y similares. En el radioinmunoensayo, se utiliza un anticuerpo marcado y por lo tanto una señal de anticuerpo se expresa como la cantidad de anticuerpo marcado que se detecta directamente. Por otra parte, se puede utilizar un anticuerpo cuya concentración o título de anticuerpos sea conocida como una solución patrón y de este modo una señal del anticuerpo diana se puede expresar como un valor relativo. Es decir, tanto la solución patrón como el analito se pueden medir utilizando un dispositivo de medición y una señal de anticuerpo en una muestra biológica se puede expresar como un valor relativo al valor de la solución patrón que se utiliza como criterio. Los ejemplos de tales radioinmunoanálisis incluyen el método ELISA, el método EI, el método RIA, inmunoensayo de fluorescencia (FIA) e inmunoensayo de luminiscencia. De éstos, el método de ELISA es particularmente preferible puesto que es simple y altamente sensible.
En la presente invención, el estado de tumor se puede evaluar o diagnosticar, utilizando el resultado de detección obtenido por medio del método de detección antes mencionado como indicador. Por ejemplo, cuando el resultado de la detección excede de un valor estándar predeterminado, el estado de tumor se define como tumor positivo y cuando el resultado de la detección es menor que el valor estándar predeterminado, éste se define como tumor negativo. En el caso del tumor positivo, se determina que se podría haber desarrollado un cierto tipo de tumor y por lo tanto se puede evaluar el estado del tumor. El término "estado del tumor" se utiliza en la presente memoria para significar la presencia o ausencia del desarrollo de tumor, o el grado de progreso del mismo. Por lo tanto, los ejemplos específicos del estado del tumor incluyen la presencia o ausencia de desarrollo del tumor, el grado de progreso del mismo, el grado de malignidad, la presencia o ausencia de metástasis y la presencia o ausencia de recurrencia.
En la evaluación anteriormente mencionada, en cuanto al estado del tumor que se va a evaluar, solo se puede seleccionar un estado a partir de los ejemplos mencionados anteriormente, o se pueden combinar y seleccionar múltiples ejemplos. La presencia o ausencia del tumor se pueden evaluar mediante la determinación de si el tumor se ha desarrollado o no, con referencia al valor estándar predeterminado utilizado como límite, basándose en el resultado de detección obtenido. El grado demalignidad se utiliza como un indicador que indica el grado de progreso del cáncer. Basándose en el resultado de la detección, el tumor diana se puede clasificar en un cierto estadio de la enfermedad y se puede evaluar. Por otra parte, el cáncer temprano y el cáncer avanzado se pueden distinguir entre sí y en ese caso se pueden evaluar. Por ejemplo, también es posible determinar el tumor diana como cáncer temprano o cáncer avanzado, utilizando el resultado de la detección como indicador. La metástasis tumoral se puede evaluar determinando si ha aparecido neoplasia o no en un sitio aparte de la posición de la lesión inicial, utilizando el resultado de la detección como indicador. La recurrencia se puede evaluar mediante la determinación de si el resultado de la detección ha superado o no el valor estándar predeterminado de nuevo después de la etapa de intervalo o de remisión.
6. Kit para la detección o el diagnóstico detumores
El anticuerpo anti-hDlk-1 de la presente invención se puede proporcionar en forma de un kit para detectar o diagnosticar un tumor. El kit de la presente invención comprende una sustancia marcadora, un reactivo en fase sólida en la que se ha inmovilizado el anticuerpo o el anticuerpo marcado, etc., así como el anticuerpo antes mencionado. Una sustancia marcadora quemarca el anticuerpo significa una sustancia marcada con una enzima, un radioisótopo, un compuesto fluorescente, un compuesto quimioluminiscente, etc. El kit de la presente invención
también puede comprender otros reactivos utilizados para llevar a cabo la detección de la presente invención, además de los elementos integrantes mencionados anteriormente. Por ejemplo, cuando tal sustancia marcadora es una sustancia marcado enzimática, el kit de la presente invención puede comprender un sustrato enzimático (un sustrato cromogénico, etc.), una solución disolvente del sustrato enzimático, una solución de parada de la reacción
5 enzimática, un diluyente utilizado para analitos, etc. Además, el presente kit puede comprender adicionalmente diversos tipos de tampones, agua esterilizada, diversos tipos de recipientes de cultivo de células, diversos tipos de reactores (un tubo Eppendorf, etc.), un agente de bloqueo (un componente del suero tal como albúmina de suero bovino (BSA), leche desnatada, o suero de cabra), un agente de lavado, un agente tensioactivo, varios tipos de placas, un antisépticotal como azida de sodio, un manual defuncionamiento experimental (instrucciones), etc.
10 El kit de la presente invención se puede utilizar eficazmente para llevar a cabo el método de detección de la presente invención anteriormentemencionado y por lotanto es extremadamente útil.
En adelante, la presente invención se describirá más específicamente en los siguientes ejemplos. Sin embargo, no 15 sepretendequeestosejemploslimitenelalcancedelapresenteinvención.
[Ejemplo 1]
<Materiales ymétodos > 20
1. Líneas celulares
Se produjeron las líneas celulares HEK-293-hDlk, 7E2-C-hDlk y Huh-7-hDlk de acuerdo con las descripciones del documento WO 2005/052156 y se utilizaron. Sin embargo, las células SK-N-F 1 de neuroblastoma humano se 25 adquirierondelaColeccióndeCultivosTipoAmericana(ATCC;Núm.decatálogoCRL2142).
Las células SW480-hDlk se obtuvieron introduciendo un vector de expresión, pcDNA-hdlk-Flag (por favor remitirse al documento WO 2005/052156) que contenía un gen hDlk-1 completo, en una línea celular derivada de cáncer de colon humano, SW480 (obtenida del Laboratorio de Crecimiento y Diferenciación Celular, Instituto de Biociencia
30 Molecular y Celular, Universidad de Tokio), seleccionado a continuación las células utilizando un antibiótico G418 (geneticina, GIBCO BRL) y estableciendo a continuación una línea celular que exprese establemente hDlk-1.
2. Preparación de anticuerpo policlonal anti-hDlk-1
35 Con el fin de construir un vector de expresión de la región extracelular de hDlk-1 (FA-1), se diseñaron y se sintetizaronlos siguientes cebadores. Cebador directo (F): 5'-cgcgtccgcaaccagaagccc-3' (SEQ ID NO: 3) Cebador inverso (R): 5'-ctcgaggtgctccggctgctgcaccggc-3' (SEQ ID NO: 4)
40 Para diseñar el cebador R, se añadió la secuencia de la enzima de restricción digerida por XhoI al cebador R. Se llevó a cabo la reacción de PCR con la siguiente composición de una solución de reacción en las siguientes condiciones de reacción utilizando estos cebadores y ADNc de hDlk-1 comomolde.
<<Composición dela solución de reacción>> 45
ADN Molde:
1 µL
10 × Tampón de PCR:
5 µL
dNTP 2,5 mM:
4 µL
ADN polimerasa de Taq:
0,5 µL
Cebador F (10 µM):
1 µL
Cebador R (10 µM):
1 µL
Agua esterilizada:
37,5 µL
Total:
50 µL
<<Condiciones de Reacción>>
Se repitió un ciclo que consistía en "desnaturalización por calor/disociación: 95°C (60 seg) → Recocido: 55°C (60 50 seg) → Síntesis/elongación: 72°C (60 seg)" 35 veces (total 35 ciclos).
El ADNc obtenido de la región extracelular de hDlk-1 (FA1 humana) se clonó en un vector pCRII (Invitrogen) (pCRIIhFA1). El ADNc de FA1 humana clonado se confirmó por medio de un secuenciador.
Un fragmento EcoRI/XhoI que contenía el ADNc de FA1 humana se cortó de pCRII-hFA1 y a continuación se insertó
5 en el sitio EcoRI/XhoI de un vector pcDNA4/Myc-His (Invitrogen) (pcDNA4-hFA1). Se añadieron una etiqueta Myc y una etiqueta His al extremo C de la proteína Dlk-1 de este vector de expresión y de este modo se expresión FA1 humana como una proteína de fusión con la etiqueta Myc y la etiqueta His. La proteína de fusión se utilizó como un antígeno y se inmunizó un conejo con el antígeno de acuerdo con un método común, con el fin de preparar un anticuerpo policlonal anti-hDlk-1.
3.Preparacióndeun mutantedelgenhDlk-1carentedemotivodetipoEGF
Para su uso en el análisis epitópico del anticuerpo monoclonal anti-hDlk-1, se prepararon mutantes del gen hDlk-1 carentes del motivo de tipo EGF, como se describe a continuación.
15 En primer lugar, se prepararon cebadores para la amplificación de la región diana mediante un método de PCR. Las secuencias de los cebadores preparados se muestran en la siguiente Tabla 1. Para preparar los cebadores, se añadió una secuencia de enzima de restricción digerida con NotI al cebador F y se añadió una secuencia de enzima de restricción digerida con XbaI al cebador R. Sin embargo, semejante secuencia de enzima de restricción digerida
20 con XbaI no se añadió al cebador R utilizado para amplificar las regiones de EGF (4-6) y EGF (5-6). Se debe observar que, en la columna "constructo" de la Tabla 1, la indicación tal como "EGF (1-4)" representa regiones continuas de EGF-1 a EGF-4 en los 6 motivos de tipo EGF (EGF-1 a EGF-6) que existen en la región FA-1 de hDlk
1.
25 Tabla 1
Constructo
Nombre del cebador* Secuencia del cebador SEQ ID NO:
EGF(1-4)
Y403Not 5'-gcggccggctgaatgcttcccggcc -3' 5
Y402Xba
5'-tctagagaggctgttggccacgatctcgc -3' 6
EGF(1-3)
Y403Not 5'-gcggccggctgaatgcttcccggcc -3' 7
Y410Xba
5'-tctagacccgtcctttttctggcagtcc -3' 8
EGF(1-2)
Y403Not 5'-gcggccggctgaatgcttcccggcc -3' 9
Y405Xba
5'-tctagaggcccgaacatctctatcac -3' 10
EGF(4-6)
Y409Not 5'-gcggccgcaaaaaggacgggccctgtg -3' 11
Rv
5'-gcgtatagtaagctctgcgg -3' 12
EGF(5-6)
Y401Not 5'-caggcagcggccgcgagatcgtggccaac -3' 13
Rv
5'-gcgtatagtaagctctgcgg -3' 14
* Con respecto a cada constructo, la mayúscula indica el cebador F y la minúscula indica el cebador R.
Utilizando cada uno de los cebadores anteriormente mencionados, se llevó a cabo la PCR con la siguiente composición dela solución de reacción en las siguientes condiciones de reacción.
30 <<Composicióndelasolucióndereacción>>
ADN molde:
1 µL
10 × tampón PCR:
5 µL
dNTP 2,5 mM:
4 µL
ADN polimerasa Taq:
0,5 µL
Cebador F (10 µM):
1 µL
Cebador R (10 µM):
1 µL
Agua esterilizada:
37,5 µL
Total:
50 µL
<<Condiciones de Reacción>>
Se repitió un ciclo que consistía en "desnaturalización con calor/disociación: 95°C (60 seg) → Recocido: 55°C (60 seg) → Síntesis/elongación: 72°C (60 seg)" 35 veces (total 35 ciclos).
Cada fragmento amplificado semediante el método de PCR se clonó en un vector pCRII (Invitrogen) utilizando un kit de clonación TA (Invitrogen) y a continuación se confirmó la secuencia de nucleótidos del mismo. Después de eso, se obtuvo un fragmento mediante escisión con NotI/XbaI y a continuación se subclonó este fragmento en el sitio NotI/XbaI de pME18S-CFHX-FXYD TM. Se debe observar que pME18S-CFHX-FXYD TM es un vector de expresión (obtenido del Laboratorio de Crecimiento y Diferenciación Celular, Instituto de Biociencia Molecular y Celular, Universidad de Tokyo), que se ha diseñado de manera que la proteína expresada de interés pueda tener la secuencia señal de CD8a humano (Núm. de Acceso GenBank NM_001768) y una secuencia de etiqueta His en el extremo N del mismo.
4. Preparación de anticuerpo monoclonal anti-hDlk-1
(1)
Inmunización celular, inmunización de antígeno proteico
Las líneas celulares que expresaban hDlk-1 (células HEK-293-hDlk, células 7E2-C-hDlk) y la región FA-1 de hDlk-1 (referida en adelante como hFA-1) preparada mediante el método anteriormente mencionado se utilizaron como antígeno. En el caso de las líneas celulares que expresaban hDlk-1, se mezclaron 1 x 107 células con un coadyuvante de inmunización (coadyuvante completo de Freund; Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) o TiterMax Gold (Funakoshi Corp.) a una razón de mezcla de 1 : 1. En el caso de la proteína hFA-1, se mezclaron 20 µg de la proteína con un coadyuvante de inmunización (coadyuvante completo de Freund; Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) o TiterMax Gold (Funakoshi Corp.) a una razón demezcla de 1 : 1. De este modo, se preparó una emulsión por medio de semejante mezcla y a continuación ésta se inyectó en las almohadillas de ambas patas de ratas de 6 semanas de edad (Wister) y ratones (C57/BL6, Balb/c) (inmunización inicial). Tres días y diez días después de la inmunización inicial, se llevó a cabo el refuerzo. El día de la inmunización final, se recogieron ganglios linfáticos de ambas patelas de los mismos y a continuación se prepararon linfocitos a partir de los mismos. Para el refuerzo, se utilizó una suspensión celular formada suspendiendo 5 × 106 células en PBS en el caso de la inmunización celular. En el caso de un antígeno proteico, se utilizaron 5 µg en solución de PBS. El día después de la inmunización final, se recogieron los nódulos linfáticos de ambas patelas y a continuación se prepararon linfocitos de los mismos. Para el refuerzo, se utilizó una suspensión celular que empleaba PBS como antígeno. Los linfocitos preparados de este modo se mezclaron con una línea celular de mieloma de ratón (P3-X63-Ag8.653) a una razón de mezcla de 3 : 1 y después se llevó a cabo la fusión celular mediante el método de polietilenglicol. Se utilizó un medio selectivo que contenía HAT (aminopterina, hipoxantina y timidina) y las células se cultivaron en una placa de fondo plano de 96 pocillos, una incubadora con 5% de CO2. Las células se cultivaron durante 10 a 14 días y el sobrenadante de cultivo de los hibridomas en proliferación se sometió a un primer escrutinio de acuerdo con Cell ELISA (como se describe más adelante) y a continuación se sometió a un segundo escrutinio de acuerdo con un análisis FACS utilizando células HEK-293. Después de eso, se prepararon clones de hibridoma que producían anticuerpos monoclonales anti-hDlk-1 mediante unmétodo de dilución limitante.
(2)
Inmunización con ADN
Del mismo modo, con el fin de preparar anticuerpos monoclonales anti-hDlk-1, utilizando un método denominado método de inmunización con ADN, se produjeron anticuerpos que reconocían la estructura tridimensional de hDlk-1 e inhibían la actividad fisiológica del organismo. En el caso del método de inmunización con ADN, puesto que un gen hDlk-1 incorporado en el vector de expresión introducido es expresado en el organismo de un ratón, esto hace posible presentar un antígeno, mientras se mantiene la estructura tridimensional de original o los diferentes tipos de modificaciones después de la traducción (p. ej. modificación de la cadena de azúcar, entrecruzamiento de disulfuro, etc.). De este modo, se llevó a cabo un intento de producir un anticuerpo monoclonal específico que reconozca la estructura tridimensional de hDlk-1 e inhiba la actividad fisiológica del organismo, aunque la producción de semejante anticuerpo monoclonal resulte difícil cuando se utilice la proteína desnaturalizada convencional o el péptido sintético como inmunógeno.
Se incorporó el ADNc completo de hDlk-1 a un vector de expresión demamífero con una etiqueta añadida. Antes de la inmunización, se examinó si el constructo génico producido era expresado o no sobre la superficie de una célula utilizando células de mamífero. Es decir, el constructo génico producido se introdujo transitoriamente en células de mamífero. Las células de mamífero con el constructo génico introducido se cultivaron en una incubadora con CO2 durante 24 horas y a continuación se utilizaron en un análisis FCM. Para semejante análisis FCM, se añadió un anticuerpo que reaccionaba con la etiqueta añadida al gen introducido anteriormente mencionado a la solución de cultivo que contenía las células cultivadas con el gen introducido y la solución se dejó en reposo a continuación durante 30 minutos. Después de eso, se añadió un anticuerpo secundario marcado fluorescentemente que reconoce
específicamente la etiqueta añadida a la solución de reacción y a continuación la solución se dejó en reposo durante 30 minutos. Luego, se utilizó la solución de reacción en el análisis FCM. Se demostró que el constructo génico producido en la presente invención era expresado sobre la superficie celular.
Con el fin de desarrollar un anticuerpo monoclonal anti-hDlk-1 que reconozca la estructura tridimensional de hDlk-1 e inhiba la actividad fisiológica del organismo, se utilizaron diversos tipos de constructos génicos como el construido anteriormente solos o combinados y se introdujeron en un animal que iba a ser inmunizado de acuerdo con diferentes métodos de inducción génica (inyección intramuscular, electroporación, o pistola génica) (durante aproximadamente 2 a 3 meses). Con el fin de analizar el suero recogido del animal inmunizado, se utilizaron las células HEK293-hDlk anteriormente mencionadas. El suero recogido del animal inmunizado con el gen introducido mencionado con anterioridad se añadió a un sobrenadante de cultivo que contenía las células HEK293-hDlk y a continuación el sobrenadante de cultivo se dejó en reposo durante 30 minutos. Después de eso, se añadió a la solución de reacción un anticuerpo secundario marcado fluorescentemente que reconocía específicamente la inmunoglobulina del animal inmunizado. Después de haber dejado la solución en reposo durante 30 minutos, ésta se utilizó en un análisis FCM. Se anatomizó un animal que producía un anticuerpo específico re reconocía fuertemente las células HEK293-hDlk y las células B se aislaron a continuación del animal de acuerdo con un método ordinario, con el fin de producir anticuerpos monoclonales anti-hDlk-1.
5.
Purificación de anticuerpos
Los clones de hibridoma producidos mediante el método mencionado con anterioridad se administraron a una densidad celular de 3 × 106 células a la cavidad abdominal de un ratón carente de sistema inmunitario BALB/c, al que se había administrado previamente (7 días antes) 2,6,10,14-tetrametilpentadecano (pristina). Dos semanas más tarde, se recogió la ascitis. Después de eso, se llevó a cabo la purificación por afinidad de esta ascitis utilizando una columna con proteína G (proteína G HiTrap; GE Healthcare Biosciences) después de la precipitación de ácido caprílico, con el fin de obtener un anticuerpo monoclonal anti-hDlk-1 producido por cada clon de hibridoma. Se llevaron a cabo análisis posteriores utilizando los anticuerposmonoclonales anti-hDlk-1 purificados de estemodo.
6.
Marcaje de anticuerpos
Con el fin de clasificar los anticuerpos monoclonales anti-hDlk-1 producidos basándose en los epítopos o con el fin de evaluar la actividad de internalización, se marcaron los anticuerpos obtenidos. El marcaje con biotina del anticuerpo se llevó a cabo utilizando el módulo de Biotinilación de Proteínas ECL (GE Healthcare Biosciences; RPN2202). El marcaje con rodamina del anticuerpo se llevó a cabo utilizando el Kit de Marcaje de Proteínas con Rodamina EZ-Label™ (Pierce; 53002). El marcaje con FITC del anticuerpo se llevó a cabo utilizando el Kit de Marcaje de Proteínas con Isotiocianato de Fluoresceína (FITC) EZ-Label™ (Pierce; 53004). Se utilizó el manual incluido en cada kit.
7.
ELISA celular
La línea celular mencionada con anterioridad 7E2-C(hdlk) se sembró a una densidad celular de 7,5 × 103 células/pocillo en una placa de cultivo de 96 pocillos recubiertos con gelatina (Corning) y a continuación las células se cultivaron a 37°C durante 2 días. Después las células se lavaron con PBS enfriada con hielo y a continuación se fijaron con una solución de paraformaldehído al 4% y luego se trataron con una solución de Triton-X-100 al 0,2% (nombre del producto), con el fin de obtener una placa utilizada para el ELISA celular. Después de eso, se llevó a cabo un método de ELISA de acuerdo con unmétodo habitual. Los procedimientos específicos son los siguientes.
En primer lugar, se llevó a cabo el bloqueo utilizando una solución de BSA-PBS al 1% a la temperatura ambiente durante 2 horas. Con posterioridad, se añadió a esto un sobrenadante de hibridoma y la mezcla se hizo reaccionar a la temperatura ambiente durante 1 hora. Después de eso, las células (o placas) se lavaron con una solución de Tween 20 (nombre del producto)-PBS al 0,1% 3 veces. Se diluyó anti-IgG de rata biotinilada (Vector Laboratory) 100 veces con una solución de Tween 20-PBS al 0,1% y se utilizó como anticuerpo secundario. Las células se dejaron reaccionar con ella a la temperatura ambiente durante 1 hora y a continuación las células se lavaron con una solución de Tween 20-PBS al 0,1% 3 veces. Después de eso, se dejó que peroxidasa de rábano picanteestreptavidina (HRP; Vector Laboratory) diluida 1.000 veces con una solución de Tween 20-PBS al 0,1% reaccionara con las células a la temperatura ambiente durante 1 hora y luego se lavaron las células con una solución de Tween 20-PBS al 0,1% 3 veces. Se añadió una solución sustrato de TMB (3,3',5,5'-tetrametilbencidina; SIGMA) a las células para llevar a cabo una reacción cromogénica y luego se añadió ácido sulfúrico 1 M a la solución de reacción para terminar lareacción. Utilizando un Lector de MicroplacaModelo 550 (Bio-Rad), semidió la absorbancia.
8. Análisis FACS
Las células se retiraron de la placa de cultivo mediante tratamiento con tripsina y a continuación se preparó una suspensión celular (densidad celular: 5 × 106 células/mL). Después de eso, se dejó que 0,5 µg de anticuerpo
monoclonal anti-Dlk humana reaccionaran con 100 µL de la suspensión celular a 4°C durante 30 minutos. Después de que el producto de reacción se hubiera lavado con PBS, éste se dejó reaccionar con anti-IgG de ratón marcado con PE o anti-IgG de rata marcado con PE (ambos los cuales son asequibles de BD Pharmingen) (0,5 µg) a 4°C durante 30 minutos, seguido de análisis utilizando FACSCalibur (Becton, Dickinson and Company).
9. Cálculo de la constante de disociación (valor Kd) mediante el método ELISA
La afinidad por el antígeno (valor Kd) del anticuerpo monoclonal anti-hDlk-1 producido se calculó mediante un método que utilizaba ELISA (Djavadi-Ohaniance L. et al. (1996), En Antibody Engineering, Capítulo 4, págs. 77-97. IRL Press, Oxford).
Específicamente, se añadió la proteína hFA-1 recombinante purificada (1 µg/mL) a una placa de cultivo de 96 pocillos (Corning) para fijarla como antígeno (a la temperatura ambiente durante 1 hora). Con posterioridad, la placa se lavó con PBS 3 veces y a esto se le añadió leche desnatada al 2% (solución en PBS) para el bloqueo (a la temperatura ambiente durante 1 hora). Después de que la placa fuera lavada con PBS 2 veces, se añadió a la placa de ELISA mencionada con anterioridad un complejo de antígeno-anticuerpo formado mezclando previamente una solución de antígeno (una proteína hFA-1 purificada; 50, 25, 12,5, 6,25 y 3,125 nM) con cada clon del anticuerpo monoclonal anti-hDlk-1 (0,5 nM) y equilibrando a continuación la mezcla para que reaccionaran (a la temperatura ambiente durante 1 hora). Una vez que la placa se hubo lavado con PBS 3 veces, ésta se dejó reaccionar con anti-IgG de ratón marcada con PE (concentración final: 1 µg/mL) o anti-IgG de rata marcada con HRP (concentración final: 1 µg/mL) (ambos los cuales se encontraban disponibles en GE Healthcare Biosciences), que habían sido diluidos con una solución de bloqueo, ala temperatura ambiente durante 1 hora.
10.
Análisis epitópico de anticuerpomonoclonal anti-Dlk-1 humana
Los aproximadamente 100 tipos de anticuerpos monoclonales anti-hDlk-1 preparados se clasificaron utilizando epítopos que los reconocían. Cada uno de los vectores de expresión mencionados con anterioridad, hdlk-EGF(1-3)/pME18S-CFHX, hdlk-EGF (3-4)/pME18S-CFHX y hdlk-EGF (4-6)/pME18S-CFHX, se introdujo en células COS-7. De 24 a 72 horas después de la introducción del gen, las células se retiraron de la placa de cultivo por medio de un tratamiento con tripsina y a continuación se examinó el tipo de motivo similar a EGF de hDlk-1 reconocido por cada clon de anticuerpo mediante análisis FACS.
11.
Método deinmunotinción
Se sometió una matriz de tejidos cancerosos humanos (Cybrdi; matriz de tejido de cáncer de colon Lote: CC05-01001; matriz de tejido de cáncer de mama Lote: CC08-02-002) a tratamiento de desparafinación. Después de eso, se sometió a un tratamiento de activación de antígeno utilizando un autoclave (121°C, 5 minutos) en tampón de ácido cítrico 10 mM (pH 6,0) y a continuación se utilizó en la tinción utilizando un anticuerpo policlonal anti-hDlk-1. Se llevó a cabo una reacción cromogénica utilizando DAB (3,3'-diaminobencidina) como sustrato y después de eso, sellevó a cabo la tinción nuclear utilizando hematoxilina como contratinción. Específicamente, se llevaron a cabo las siguientes operaciones.
Una sección, que se había fijado con formalina neutra y se había incluido en parafina, se sometió a tratamiento de desparafinación y a continuación a tratamiento de activación de antígeno utilizando un autoclave (121°C, 5 minutos) en solución de citrato de sodio 10 mM. Con posterioridad, la sección resultante se trató a la temperatura ambiente durante 20 minutos con una solución formada añadiendo una solución de peróxido de hidrógeno a metanol a una concentración final de 0,3%, con el fin de eliminar la actividad peroxidasa endógena. Después de eso, la sección se lavó con PBS a la temperatura ambiente durante 5 minutos 2 veces y a continuación se bloqueó durante 30 minutos utilizando un reactivo Block-Ace (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.), con el fin de llevar a cabo una operación para bloquear sitios de unión no específica en los tejidos. Con posterioridad, un anticuerpo policlonal anti-hDlk-1 (concentración final: 0,5 µg/mL), que se había diluido con un reactivo Block-Ace diluido 1/10, se dejó reaccionar con la sección a la temperatura ambiente durante 1 hora y después se lavó con PBS durante 5 minutos 3 veces. Con posterioridad, se dejó que un anticuerpo anti-IgG de conejo biotinilado que se había diluido 100 veces con reactivo Block-Ace diluido 1/10, reaccionara con la sección a la temperatura ambiente durante 1 hora y a continuación se lavó con PBS durante 5 minutos 3 veces. Después de eso, los reactivos de un kit ABC semezclaron de acuerdo con las instrucciones incluidas en él para producir un complejo ABC y a continuación se dejó que reaccionara con la sección a la temperatura ambiente durante 30 minutos. El resultante se lavó con PBS durante 5 minutos 3 veces y a continuación se llevó a cabo una reacción cromogénica utilizando un sustrato de peroxidasa (DAB al 0,02% (3,3'diaminobencidina), una solución de peróxido de hidrógeno al 0,03% y Tris-HCl 50 mM (pH 7,5)). Una vez confirmado el desarrollo de color, el producto de reacción selavó con agua durante 10minutos y el núcleo setiñó a continuación con una solución de hematoxilina de Mayer (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). Después de eso, se deshidrató con alcohol, se hizo penetrar con xileno y a continuación se incluyó en Entellan New (Merch Japan).
12. Preparación de ratones portadores de cáncer y evaluación de la eficacia como fármaco del anticuerpo
monoclonal anti-hDlk-1
(1) Modelo de prevención
Se retiró una línea celular de cáncer de hígado (Huh-7-hDlk) que expresa hDlk-1 mediante tratamiento con tripsina y a continuación se añadió a PBS para preparar una suspensión celular a una densidad celular de 6 × 107 células/mL. La suspensión se mezcló con una cantidad igual de matrigel (BD Pharmingen) sobre hielo. Utilizando una jeringa 26 G, se inyectaron subcutáneamente 100 µl (3 × 106 células) de la mezcla en el flanco derecho de cada ratón carente de sistema inmunitario hembra de 6 semanas de edad (Balb/c, nu/nu). El día del transplante de las células cancerosas, los ratones se dividieron en varios grupos y se inició la administración de un anticuerpo (20 mg/kg de peso corporal; administración intraperitoneal). Después de eso, se llevó a cabo la misma administración que antes a intervalos de una vez cada 3 días. La actividad anti-tumoral se evaluó basándose en la frecuencia de formación de tumores y en el volumen delos tumores. Tal volumen de los tumores se calculó utilizando la siguiente expresión:
Volumen del tumor (mm3) = (ejemenor)2 x (ejemayor) x π/6
(2) Modelo de tratamiento
Se retiraron una línea celular de cáncer de hígado (Huh-7-hDlk) que expresa hDlk-1 y una línea celular de cáncer de colon (SW480-hDlk) que expresa hDlk-1 mediante tratamiento con tripsina y cada línea celular se añadió después a PBS para preparar una suspensión celular a una densidad de 6 × 107 a 10 × 107 células/mL. La suspensión se mezcló con una cantidad igual de matrigel (BD Pharmingen) sobre hielo. Utilizando una jeringa 26 G, se inyectaron subcutáneamente 100 µL (3 × 106 a 5 × 106 células) de la mezcla en el flanco derecho de cada ratón carente de sistema inmunitario hembra de 6 semanas de edad (Balb/c, nu/nu). De diez a catorce días después del transplante de las células cancerosas, los ratones cuyo volumen tumoral había llegado a 50 -150 mm3 (valor medio: aproximadamente 100 mm3) se dividieron en varios grupos. El día en el que los ratones se dividieron se definió como el primer día (Día 1) y la administración de un anticuerpo se inició ese día. El anticuerpo se administró intraperitonealmente a los ratones a intervalos de una vez cada 3 días (20 mg/kg peso corporal). La actividad antitumoral se evaluó midiendo el volumen del tumor. Sellevó acabo un ensayo de diferencia significativa mediante una prueba de la t de Student y cuando el valor obtenido fue P < 0,05 se determinó que era estadísticamente significativo.
13. Evaluación de la actividad de internalización del anticuerpo monoclonal anti-hDlk-1
La actividad de internalización, por medio de la cual un anticuerpo monoclonal para hDlk-1 se incorpora a las células mediada por endocitosis después de que se haya unido al antígeno, depende de un epítopo reconocido por el anticuerpo. De este modo, se evaluó la actividad de internalización de los anticuerpos monoclonales anti-hDlk-1 producidos. Como método para evaluar la actividad de internalización mediante análisis FACS, se evaluó semejante actividad de internalización mediante análisis FACS y observación bajo el microscopio de fluorescencia.
La evaluación de la actividad de internalización mediante análisis FACS se llevó a cabo mediante el siguiente método. Se añadió un anticuerpo monoclonal anti-hDlk-1 (0,5 µg) a células HEK-293-hdlk (2 × 105 células) para la reacción (4°C, 20 minutos) y las células se lavaron a continuación con PBS 2 veces. Después de eso, las células se suspendieron en medio DMEM, seguido de incubación a 37°C (60 minutos, 90 minutos, 120 minutos y 240 minutos), con el fin de promover la internalización de un complejo antígeno-anticuerpo sobre la superficie celular. Luego, las células se centrifugaron (1.000 rpm, 5 minutos) para recuperarlas y las células recuperadas se dejaron reaccionar a continuación (4°C, 20 minutos) con anti-IgG de ratón (o de rata) marcado con PE (0,5 µg). Después, las células se analizaronmediante FACSCalibur (Becton, Dickinson and Company).
En este mismo método, se permitió que un anticuerpo monoclonal anti-hDlk-1 marcado con FITC reaccionara con células HEK-293-hdlk mediante el mismo método anterior y las células se lavaron después con PBS 2 veces. A continuación, las células se suspendieron en medio DMEM, seguido de incubación a 37°C (120 minutos). Las células se analizaron después mediante FACSCalibur (Becton, Dickinson and Company).
Por otra parte, se añadió un anticuerpo monoclonal anti-hDlk-1 marcado con rodamina (0,5 µg) a células HEK-293hdlk (2 × 105 células) para que reaccionaran (4°C, 20 minutos) y después las células se lavaron con PBS 2 veces. Después de eso, las células se suspendieron en medio DMEM, seguido de incubación a 37°C (15 minutos, 30 minutos, 60 minutos y 120 minutos). Luego, se prepararon preparaciones de frotis por medio de Cytospin (Shandon) (800 rpm, 3 minutos) y a continuación las preparaciones de frotis se atraparon utilizando una solución de montaje (Vector Laboratory). Más tarde, se observó la localización del complejo antígeno-anticuerpo al microscopio de fluorescencia (Nikon; Eclipse E800).
14. Preparación de producto inmunoconjugado utilizando anticuerpo monoclonal anti-hDlk-1
Se conjugó saporina, una toxina proteica derivada de plantas, con un clon de anticuerpo monoclonal anti-hDLk-1 M3-1 (IgG1 de ratón) que tenía una actividad de internalización elevada después de unirse al antígeno y con un clon M1-290 (IgG2b de ratón) utilizado como control, con el fin de preparar productos inmunoconjugados (Advanced Targeting System, San Diego).
15. Evaluación de la eficacia como fármaco de productos inmunoconjugados utilizando anticuerpo monoclonal antihDlk-1
Se retiraron las células de la placa de cultivo mediante tratamiento con tripsina y se preparó una suspensión celular a una densidad celular de 1 x 105 células en medio DMEM, al que se había añadido FBS al 10%. La suspensión celular se inoculó a una densidad celular de 1 x 104 células/pocillo sobre una placa de fondo plano de 96 pocillos recubierta con colágeno y las células se cultivaron a continuación durante 2 a 3 horas, demanera que las células se adhirieran a la misma. Con posterioridad, se añadieron a las células varios tipos de productos inmunoconjugados tales como IgG de ratón-saporina (IgG-SAP), M3-1-saporina (M3-1-SAP) y M1-290-saporina (M1-290-SAP). Cada producto inmunoconjugado se añadió a concentraciones de 0,1, 1, 10, 100 y 1.000 ng/mL. De 48 a 72 horas después del cultivo, semidió la absorbanciamediante un método MTT.
Se evaluó la actividad anti-tumoral in vivo, utilizando ratones que tenían cáncer en los cuales se utilizaron las células Huh-7-hDlkmencionadas con anterioridad.
16. Método MTT
Se añadió TetraColor ONE (Seikagaku Corp.) a células cultivadas sobre una placa de 96 pocillos y se hicieron reaccionar en una incubadora con 5% de CO2 durante 3 a 4 horas. Una vez completada la reacción, la placa de 96 pocillos se aplicó directamente a un Lector de Microplaca, con el fin de medir la absorbancia a una longitud de onda de 490 nm (longitud de onda de control: 655 nm).
<Resultados>
1. Análisis de actividad inhibidora del crecimiento tumoral de anticuerpos monoclonales anti-hDlk-1 conocidos (1C1, 4C4 y 31C4) en xenoinjertos de células de cáncer de hígadohumanas (Modelos de prevención)
hDlk-1 se expresa sobre las superficies de diferentes tipos de células cancerosas. Si un gen hDlk-1 es expresado establemente en una línea celular de cáncer de hígado humana, la tasa de crecimiento tumoral es significativamente estimulada cuando el gen mencionado con anterioridad se transplanta subcutáneamente a un ratón carente de sistema inmunitario (por favor, remitirse al documento WO 2005/052156). De este modo, se considera que un anticuerpo anti-hDlk-1 es útil como agente terapéutico contra el cáncer. Puesto que la secuencia del gen/secuencia de aminoácidos de hDlk-1 es conocida, en principio, es posible obtener un anticuerpo monoclonal contra hDlk-1 de acuerdo con un método conocido utilizando un péptido sintético o una proteína purificada como inmunógeno. Sin embargo, en general, la posibilidad de producir realmente un anticuerpo que muestre actividad como agente terapéutico contra el cáncer, esto es, un anticuerpo que muestre actividad anti-tumoral a nivel individual (in vivo) es todavía desconocida, y no se puede estimar a partir del tipo de antígeno, el nivel de expresión, la estructura de la proteína, etc. Entre aproximadamente varias decenas de miles de tipos de anticuerpos monoclonales, aquellos que se han situado en el mercado como agentes terapéuticos para enfermedades incluyendo tumores (cánceres) como ejemplos típicos son solo aproximadamente 20 tipos. Como resulta claro a partir de este hecho, la mayoría de los anticuerpos nomuestran efectos farmacéuticos a nivel individual.
Se ha sabido que los anticuerpos monoclonales anti-hDlk-1 conocidos (clones 1C1, 4C4 y 31 C4) destruyen células de cáncer de hígado humano en presencia de, al menos, un complemento (por favor, remitirse al documento WO 2005/052156). No obstante, los efectosfarmacéuticos detales anticuerpos in vivo son desconocidos.
En primer lugar, la actividad anti-tumoral in vivo de cada uno de los tres clones conocidos se examinó transplantando una línea celular de cáncer de hígado (Huh-7-hDlk) que expresa hDlk-1 subcutáneamente a un ratón carente de sistema inmunitario, iniciando la administración del anticuerpo al mismo tiempo que el transplante y analizando a continuación el efecto del anticuerpo sobre la implantación de las células tumorales subcutáneamente en el ratón carente de sistema inmunitario y el crecimiento del tumor.
Como se muestra en la Tabla 2 de más abajo, en el caso en el que la administración del anticuerpo se inició al mismo tiempo que el transplante celular, el 14o día (Día 14), se formó un tumor en los 10 individuos del grupo de control (se administra IgG de rata) (volumen tumoral medio: 382,0 ± 74,8 mm3). Por otra parte, en el caso de los grupos a los que se había administrado el anticuerpo monoclonal anti-hDlk-1, la tasa de formación de tumor fue del 40% en el grupo al que se había administrado 1C1 y fue del 30% en el grupo al que se había administrado 4C4 y el grupo al que se había administrado 31C4. De este modo, la tasa de formación de tumor fue significativamente baja en los grupos a los que se había administrado anticuerpo monoclonal anti-hDlk-1. Incluso el 21o día (Día 21), la tasa
de formación de tumor fue del 70% en el grupo de administración 1C1 y fue del 50% en el grupo de administración 4C4 y el grupo al que se había administrado 31C4. De este modo, en todos los grupos a los que se había administrado anticuerpo, se inhibió la formación de tumores por medio de la administración del anticuerpo. El volumen (valor medio) del tumor formado en los grupos a los que se había administrado anticuerpo fue inferior al del grupo de control. Sin embargo, no se encontró una diferencia estadísticamente significativa entre los dos tipos de grupos.
Tabla 2
Grupo de administración N (Núm. de ratones) Tasa de formación de tumor Volumen del tumor (mm3)
Día 14
IgG de rata 10 100% (10/10) 382,0 ± 74,8
1C1 4 40% (4/10) 656,2 ± 241,21
4C4 3 30% (3/10) 77,1 ± 30,0
31C4 3 40% (3/10) 156,5 ± 55,8
Día 18
IgG de rata 10 100% (10/10) 979,2 ± 152,7
1C1 6 60% (6/10) 646,7 ± 280,8
4C4 5 50% (5/10) 371,7 ± 118,2
31 C4 5 50% (5/10) 474,5 ± 163,1
Día 21
IgG de rata 10 100% (10/10) 1464,4 ± 207,6
1C1 7 70% (7/10) 899,25 ± 308,4
4C4 5 50% (5/10) 653,5 ± 212,8
31C4 5 50% (5/10) 770,1 ± 216,1,8
2. Análisis de la actividad inhibidores del crecimiento tumoral de anticuerpos monoclonales anti-hDlk-1 conocidos (1C1, 4C4 y 31C4) en Xenoinjertos de células de hígado humanas (Modelos de tratamiento)
Para que un anticuerpo monoclonal anti-hDlk-1 pueda mostrar su efecto farmacéutico como anticuerpo terapéutico contra el cáncer, es extremadamenteimportanteque el anticuerpo muestresu actividad anti-tumoral sobrelos tejidos tumorales establecidos. Además, en los Modelos de prevención mencionados con anterioridad, se puede suponer la actividad anti-tumoral de un anticuerpo hasta cierto punto realizando una comparación entre las tasas de formación de tumores. Sin embargo, tales tasas de formación de tumores varían ampliamente entre los individuos y por lo tanto, la actividad anti-tumoral no se puede evaluar con exactitud.
De este modo, se transplantaron subcutáneamente células Huh-7-hDlk a un ratón carente de sistema inmunitario y se evaluó el efecto farmacéutico de cada anticuerpo utilizando Modelos de tratamiento, en los que la administración del anticuerpo seinició en unafase en la que el volumen tumoral medio había alcanzado 100mm3.
Como semuestra en la Figura 1, en el caso de semejantes Modelos de tratamiento, cada uno de 1C1 (IgG1 de rata) (Figura 1A), 4C4 (IgG2a de rata) (Figura 1B) y 31C4 (IgG2a de rata) (Figura 1C) se administró a una dosis de 20 mg/kg peso corporal en la cavidad abdominal del ratón carente de sistema inmunitario y a continuación se analizó el efecto del anticuerpo sobre el crecimiento del tumor. Sin embargo, como resultado, ninguno de los clones mostró una actividad inhibidora del crecimientotumoral significativa.
3. Análisis de la actividad anti-tumoral de un anticuerpo monoclonal anti-hDlk-1 nuevo in vivo en Xenoinjertos de células de cáncer de hígado humanas (Modelos detratamiento) Resulta esencial para un anticuerpo terapéutico contra el cáncer que se dirija a hDlk-1 para destruir específicamente tejidos tumorales que expresen hDlk-1 o muestre actividad inhibidora del crecimiento tumoral en Modelos de tratamiento de Xenoinjerto.
Los anticuerpos monoclonales anti-hDlk-1 (aproximadamente 100 clones), que fueron producidos de nuevo en la invención de la presente solicitud, se evaluaron también utilizando Modelos de tratamiento con Xenoinjerto en los que se utilizaron células Huh-7-hDlk. Entre los aproximadamente 100 clones recién producidos, la mayoría de los clones no mostraron su efecto farmacéutico en los Modelos de tratamiento, como los tres clones conocidos. Sin embargo, se obtuvieron varios clones que mostraban una actividad inhibidora del crecimiento tumoral significativa, tales como los clones DI-2-14, 2-13, BA-1-3D, DI-6 y M3-1.
En el grupo al que se había administrado el clon DI-2-14 (IgG1 de ratón), después de la administración del anticuerpo, se inhibió el crecimiento tumoral en todos los individuos (N = 8). El 14o día (Día 14) después del inicio de la administración del anticuerpo, el volumen tumoral fue de 175,5 ± 46,5 mm3 (P < 0,01 mediante la prueba de la t de Student) en el grupo al que se había administrado el clon DI-2-14, mientras fue de 907,7 ± 142,8 mm3 en el grupo de control (N = 8) (Figura 2A). Cuando el volumen del tumor en el momento del inicio de la administración del anticuerpo se definió como 1,0, el volumen del tumor el 14o día (Día 14) fue de 1,85 en el grupo al que se había administrado el clon DI-2-14, mientras fue de 9,24 en el grupo de control. El peso del tumor escindido fue de 0,15 ± 0,04 (g) (P < 0,01 mediante la prueba de la t de Student) en el grupo al que se había administrado el clon DI-2-14, mientras fue de 0,58 ± 0,07 (g) en el grupo de control (Figura 2B).
Como se muestra en la Figura 2C, la actividad anti-tumoral del clon DI-2-14 administrado se reprodujo en otro ensayo independiente. De la misma manera que se ha descrito anteriormente, en una fase en la que el valor medio del volumen tumoral había alcanzado 100 mm3 (grupo de control: 103,8 ± 11 mm3 (N = 7); grupo al que se había administrado con DI-2-14: 101,4 ± 9,5 mm3 (N = 8)), se inició la administración del anticuerpo. El 14o día (Día 14) después del inicio de la administración, el volumen tumoral del grupo al que se había administrado el clon DI-2-14 fue de 148,83 ± 32,65 mm3 (P < 0,01 mediante la prueba de la t de Student), mientras fue de 733,37 ± 244,86 mm3 en el grupo de control.
En el grupo al que se había administrado el clon 2-13 (IgG2b de rata) (N = 10), esto no resultó perfecto, pero la tasa de crecimiento del tumor fue inhibida de una manera estadísticamente significativa. El 14o día (Día 14) después del inicio de la administración del anticuerpo, el volumen tumoral del grupo al que se había administrado el clon 2-13 fue de832,9 ± 131,8mm3(P<0,01mediantelapruebadelatdeStudent),mientrasfuede1580,2 ± 179,4mm3enel grupo de control (N = 10). De este modo, el clon 2-13 mostró una actividad inhibidora del crecimiento tumoral de aproximadamente 50% (Figura 3A).
Del mismo modo, en el grupo al que se había administrado el clon BA-1-3D (IgG2a de ratón) (N = 8) y en el grupo al quesehabíaadministradoelclonDI-6(IgG1deratón)(N =8),elvolumentumoralfuede380,8 ± 54,4mm3(Figura 3B) en el grupo al que se había administrado BA-1-3D y fue de 321,0 ± 59,6 mm3 (Figura 3C) en el grupo al que se había administrado el clon DI-6, mientras fue de 907,7 ± 142,8 mm3 en el grupo de control (N = 8). De este modo, el crecimiento tumoral fue inhibido significativamente por ambos tipos de anticuerpos (P < 0,01 por medio de la prueba de la t de Student).
Por otra parte, también en el grupo al que se había administrado el clon M3-1 (IgG1 de ratón) (N = 8), la tasa de crecimiento del tumor fue inhibida significativamente. El 14o día (Día 14) después del inicio de la administración, el volumen tumoral fue de 457,0 ± 123,75 mm3 en el grupo al que se había administrado el clon M3-1 (P < 0,05 por medio de la prueba de la t de Student), mientras fue de 1123,8 ± 249,1 mm3 en el grupo de control (N = 7) (por favor, remitirse a la Figura 3D y a la Tabla 3).
Entre los clones mencionados con anterioridad, el hibridoma que produce el clon M3-1 fue referido como hibridoma Ratón-Ratón: M3-1," y fue depositado en NITE Patent Microorganisms Depositary (NPMD), National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, una Institution Administrativa Independiente del Ministerio de Economía, Comercio e Industria, (AIST Tsukuba Central 6, Higashi 1-1-1, Tsukuba, Ibaraki, Japón, código postal: 305-8566), el 18 de Octubre de 2006 (Núm. de acceso FERM BP-10707).
El hibridoma que produce el clon DI-2-14 fue referido como "hibridoma Ratón-Ratón: DI-2-14," y fue depositado en el mismo instituto nacional el 21 de Agosto de 2007 (Núm. de acceso FERM BP-10899).
Del mismo modo, el hibridoma que produce el clon DI-6 fue referido como "hibridoma Ratón-Ratón: DI-6," y fue depositado en el mismo instituto nacional anterior el 21 de Agosto de 2007 (Núm. de acceso FERM BP-10900).
Tabla 3
4. Análisis de actividad anti-tumoral en Xenoinjertos de células de cáncer de colon humanas (Modelos de tratamiento)
Como en el caso de la utilización de Modelos de tratamiento de Xenoinjertos de células de cáncer de hígado humanas mencionado con anterioridad, se analizó la actividad anti-tumoral del clon 2-13 en Modelos de tratamiento de Xenoinjerto de línea celular de cáncer de colon humana (SW480-hDlk) (Figura 4).
En el grupo al que se había administrado el clon 2-13, el crecimiento del tumor fue inhibido significativamente cuando se comparó con un grupo de control (un grupo al que se había administrado IgG de rata). El 16o día (Día 16), el volumen del tumor fue de 452,71 ± 54,97 mm3 (que correspondía a 2,87, cuando el valor el día del inicio de la administración se definió como 1,0) en el grupo al que se había administrado el clon 2-13 (N = 8) (P < 0,05 por medio de la prueba de la t de Student), mientras fue de 877,27 ± 176,82 mm3 (lo que correspondía a 5,01, cuando el valor el día de inicio de la administración se definió como 1,0) en el grupo al que se había administrado IgG de rata (N = 7) (Figura 4).
A partir de los resultados anteriores, quedó claro que el anticuerpo monoclonal anti-hDlk-1 muestra una actividad inhibidora del crecimiento tumoral in vivo, no solamente en células de cáncer de hígado, también en células de cáncer de colon.
5. Actividad de unión al antígeno de anticuerpos monoclonales anti-hDlk-1 (clones DI-2-14, 2-13, BA-1-3D, DI-6 y M3-1) (análisis FACS utilizando células HEK-293-hDlk y cálculo de la constante de disociaciónmediante ELISA)
Con respecto a los anticuerpos monoclonales anti-hDlk-1 que mostraban una actividad anti-tumoral significativa en modelos de Xenoinjerto de células de cáncer humanas, se analizó su afinidad para hDlk-1 como antígeno por medio de FACS utilizando células HEK-293-hDlk (Figura 5) y células Huh-7-hDlk (Figura 6). Como resultado, se demostró que todos los clones reconocían todas las líneas celulares y que reconocían la estructura tridimensional de hDlk-1. Aunque no se proporcionan los datos, ninguno de los clones reconoció en absoluto las células HEK293 ni las células Huh-7 que no expresaban hDlk-1.
Con posterioridad, la afinidad (constante de disociación) de estos clones para un antígeno se calculó mediante el método ELISA mencionado con anterioridad. Como resultado, se encontró que el valor Kd del con DI-2-14 era de 9,26 × 10-9 (M), se encontró que el del clon M3-1 era de 6,28 × 10-9 (M), se encontró que el del clon BA-1-3D era de 32,2 × 10-9 (M) y se encontró que el del clon DI-6 era de 10,1 × 10-9 (M). La afinidad del clon 2-13 por la hFA-1 recombinante purificada y por lo tanto el valor de Kd del mismo no se pudo calcular mediante el método mencionado con anterioridad.
6. Análisis epitópicos de los anticuerposmonoclonales anti-hDlk-1
A continuación, sellevaron a cabo los análisis epitópicos de los anticuerposmonoclonales anti-hDlk-1.
Cada uno de los vectores de expresión hDlk (EGF 1-2)-pME-CHFX, hDlk (EGF 1-3)-pME-CHFX, hDlk (EGF 3-4)-pME-CHFX, hDlk (EGF 4-6)-pME18-CHFX y hDlk (EGF 5-6)-pME18-CHFX (Figura 7) se introdujo en células COS-7 y a continuación se sometieron a análisis FACS e inmunotinción de especímenes con Cytospin, con el fin de examinar los sitios de una región que contenían 6 motivos de tipo EGF en la región FA-1 (región extracelular) de hDlk-1, que fueron reconocidos por cada anticuerpomonoclonal anti-hDlk-1.
Como resultado del análisis FACS y la inmunotinción, se encontró que el clon DI-2-14 reconocía EGF (1-3) y EGF
(3-4), pero que no reconocía en absoluto EGF (1-2), EGF (4-6) ni EGF (5-6) (Figura 8). Se demostró que el epítopo reconocido por el clon DI-2-14 podía ser una región que contenía del 3er motivo de tipo EGF (EGF-3) de hDlk-1 al 4 motivo de tipo EGF (EGF-4) del mismo (una región que comprendía los aminoácidos de las posiciones 92 a 167 de hDlk-1) y que éste podría ser EGF-3 (una región que comprendía los aminoácidos de las posiciones 92 a 120 de hDlk-1). Se ha informado de que, entre los isotipos de IgG de ratón, IgG2a e IgG2b tienen una fuerte actividad citotóxica dependiente de anticuerpos (ADCC) y que la ADCC de IgG1 es baja (por favor, remitirse a Kipps, T. J. et al., 1985). El isotipo del clon DI-2-14 es IgG1 de ratón. De este modo, se demostró que la actividad inhibidora del crecimiento tumoral extremadamente fuerte del clon DI-2-14 inhibía las funciones de hDlk-1 a un nivel superior que la actividad citotóxica de las células cancerosas a través de células efectoras, tal como la actividad ADCC y de por lo tanto que mostraba actividad anti-tumoral. Por consiguiente, se demostró que una región que contenía EGF-3 y EGF-4 de hDlk-1 y concretamente EGF-3, era un dominio especialmente importante para lasfunciones de hDlk-1.
Por otra parte, los clones 2-13, DI-6 y BA-1-3D reconocieron EGF (1-2) y EGF (1-3), pero no reconocieron en absoluto EGF (3-4) ni EGF (4-6) (Figura 9). Se demostró que los epítopos reconocidos por los tres clones anteriores son una región que contiene del 1er motivo de tipo EGF (EGF-1) al 2o motivo de tipo EGF (EGF-2) de hDlk-1 (una región comprende los aminoácidos de las posiciones 26 a 85 de hDlk-1). De este modo, se demostró que la región que contenía el EGF-1 y el EGF-2 de hDlk-1 es un dominio especialmente importante para las funciones de hDlk-1.
Además, el clon M3-1 reconoció EGF(1-4) y EGF(4-6), pero no reconoció EGF(1-2), EGF(1-3) ni EGF(3-4) (Figura 10). Se demostró que el epítopo reconocido por el clon M3-1 es una región que comprende del 4o motivo de tipo EGF (EGF-4) al 6o motivo de tipo EGF (EGF-6) de hDlk-1 (una región que comprendía los aminoácidos de las posiciones 131 a 244 de hDlk-1). De este modo, se demostró que la región que contenía EGF-4, EGF-5 y EGF-6 de hDlk-1 era un dominio especialmente importante para las funciones de hDlk-1.
7. Actividad de internalización del anticuerpomonoclonal anti-hDlk-1
Los clones de anticuerpos monoclonales anti-hDlk-1 producidos se clasificaron basándose en los epítopos reconocidos por los clones. Con respecto a los clones clasificados de ese modo pertenecientes a varios grupos, se examinó su actividad de internalización después del reconocimiento delos antígenos.
Con respecto al clon M1-290 que reconocía EGF(1-2), al clon M3-1 que reconocía EGF(4-6) y al clon M3-4 que reconocía EGF(5-6), se dejó que cada anticuerpo reaccionara con células HEK293-hDlk, seguido de incubación a 37°C. Después de eso, se dejó que reaccionaran con un anti-anticuerpo de ratón marcado con PE. Como se muestra en la Figura 11A, cuando la intensidad de fluorescencia obtenida sin incubación se definió como el 100%, cuando se comparó con otros clones, la intensidad de fluorescencia del Clon M3-1 se redujo a una tasa significativamente rápida, dependiendo del tiempo de incubación. Este resultado demostró que, una vez completada la reacción antígeno-anticuerpo, la cantidad de complejo antígeno-anticuerpo sobre cada superficie celular sereduce al ser internalizado en las células de una manera dependiente del tiempo. La intensidad de fluorescencia después de cada tiempo deincubación es la siguiente. 60 minutos; M3-1:38,7 %, M1-290: 52,1%, M3-4: 74,1% 90 minutos; M3-1: 36,9%, M1-290: 47,1%, M3-4: 71,15% 120 minutos; M3-1: 28,1%, M1-290: 36,3%, M3-4: 57,3% 240 minutos; M3-1: 12,2%, M1-290: 31,2%, M3-4: 41,4%
Se confirmó que el factor de reducción de una intensidad de fluorescencia media después de la incubación no es la eliminación del anticuerpo monoclonal anti-hDlk-1 del antígeno, que se ha unido al antígeno durante la incubación. El clon M3-1 semarcó directamente con FITC y a continuación se dejó que reaccionara con células HEK293-hDlk de la misma manera que antes. Después de lavar con PBS, se incubó a 37°C durante 120 minutos. A continuación, se llevó a cabo el análisis FACS y se comparó la intensidad de fluorescencia obtenida inmediatamente después de la reacción con la intensidad de fluorescencia obtenida 120 minutos después de la incubación. Como resultado, no hubo una diferencia significativa entre los dos tipos de intensidad de fluorescencia (sin incubación: 100%; 120 minutos después dela incubación: 110,9%) (Figura 11B).
Con posterioridad, el anticuerpo marcado con rodamina se dejó reaccionar con células HEK293-hDlk. Después de lavar con PBS, se incubó a 37°C de la misma manera que antes. Después de eso, se prepararon preparaciones de frotis utilizando Cytospin y se observó la localización del anticuerpo marcado con fluorescencia al microscopio de fluorescencia. Como resultado, como se muestra en la Figura 12, sin incubación, se observó la localización del anticuerpo en la membrana celular. Sin embargo, en el caso de los clones M3-1 y DI-1 que reconocen EGF(4-6), los clones se incorporaron a las células debido a endocitosis mediante incubación a 37°C solamente durante 15 minutos y después se incorporaron a vesículas, de manera que la localización intracelular de los clones se observó como puntos. Por otra parte, en el caso de los clones M1-290 y M3-4, la mayor parte de ellos se localizó en la membrana celular, aunquela localización se observó como puntos (Figura 12).
A partir de los resultados mencionados con anterioridad, se encontró que los anticuerpos que reconocen EGF(4-6),
tales como el clon M3-1, tenían una actividad de internalización significativamente elevada después del reconocimiento de los antígenos, cuando se comparó con otros anticuerpos que reconocían otros dominios. Por consiguiente, puesto que un producto inmunoconjugado de un anticuerpo anti-hDlk-1 tal como el con M3-1 y un agente anti-canceroso o citotoxina se incorpora rápidamente a una célula diana, se considera que el producto inmunoconjugado muestra un efecto farmacológico elevado del agente anticanceroso o la citotoxina y que tiene pocos efectos secundarios.
8. Actividad citotóxica del producto inmunoconjugado de anticuerpo monoclonal anti-hDlk-1
Se dejó que la saporina se uniera a cada clon M3-1 que tenía actividad de internalización elevada y al clon M1-290 utilizado como control, con el fin de preparar productos inmunoconjugados (M3-1-SAP y M1-290-SAP). De este modo, se evaluaron los efectos farmacéuticos de estos productos inmunoconjugados por lo tanto se analizó la eficacia de una terapia con misil utilizando un producto inmunoconjugado del anticuerpo monoclonal anti-hDlk-1. Ni M3-1-SAP ni M1-290-SAPmostraron toxicidad en absoluto para las células HEK293 que no expresaban hDlk-1.
Con posterioridad, se añadieron estos productos inmunoconjugados a las células Huh7-hDlk y a las células SK-N-F1 (neuroblastoma que expresa hDlk-1 endógena) que expresaban hDlk-1 y a continuación se cultivaron. Como resultado, un control (IgG de ratón-SAP) nomostró casi toxicidad sobre ninguna de las células. Sin embargo, cuando se añadió M3-1-SAP a la solución de cultivo y a continuación se cultivaron, las células resultaron dañadas de una manera dependiente de la concentración. En el caso de una concentración de 1 µg/mL, se encontró que la tasa de supervivencia era de 23,3 ± 1,35% (N = 3) en las células Huh-7-hDlk y se encontró que era de 9,38 ± 2,1% (N = 3) en las células SK-N-F1. De estemodo, M3-1-SAP mostró una fuerte actividad citotóxica (Figura 13).
La actividad citotóxica de M3-1-SAP sobre las células SK-N-F1 (neuroblastoma que expresa hDlk-1 endógena) se comparó con la actividad citotóxica de M1-290-SAP sobre las mismas células anteriores. Como resultado, como se muestra en la Figura 13B, las actividades de estos productos inmunoconjugados fueron casi equivalentes entre sí (Figura 13B).
9. Actividad inhibidora del crecimiento tumoral in vivo de los productos inmunoconjugados de anticuerpos monoclonales anti-hDlk-1
Se evaluaron la eficacia de M3-1-SAP como producto inmunoconjugado, esto es, su actividad anti-tumoral y los efectos secundarios que se producen cuando se administra a ratones individuales, utilizando modelos de Xenoinjerto de células Huh-7-hDlk. Se utilizó M1-290-SAP como control. Se evaluó la actividad anti-tumoral basándose en el volumen del tumor de la misma manera que se ha descrito anteriormente. Los efectos secundarios se analizaron basándose en el cambio en el peso corporal y la tasa demortalidad después de la administración de tales productos inmunoconjugados.
En un grupo al que se había administrado IgG de ratón (N = 8), no se observó aumento ni disminución en el peso corporal durante todo el período de ensayo (14 días). Por otra parte, en el grupo al que se había administrado M3-1-SAP (5 mg/kg peso corporal; administración intraperitoneal) (N = 8) y el grupo al que se había administrado M1-290-SAP (5 mg/kg peso corporal; administración intraperitoneal) (N = 8), se observó una disminución del peso corporal el 4o día (Día 4) después del inicio dela administración decada producto inmunoconjugado (en el caso de "M3-1-SAP," Día 1: 21,2 ± 1,36 (g), Día 4: 185 ± 1,44 (g); en el caso de "M1-290-SAP," Día 1: 21,13 ± 0,81 (g), Día 4: 17,9 ± 0,85 (g)). En particular, la toxicidad de M1-290-SAP que tiene una escasa actividad de internalización fue fuerte, dos de ocho ratones murieron el 4o día (Día 4) y los seis ratones restantemurieron el 5o día (Día 5). De estemodo, como resultado, 5 días después del inicio de la administración, todos los ratones murieron (Figura 14B).
Por otra parte, todos los ratones del grupo al que se había administrado M3-1-SAP sobrevivieron y su peso corporal se recuperó después del 8o día (Día 8).
Asimismo, como se muestra en la Figura 15, el crecimiento tumoral resultó fuertemente inhibido en el grupo al que se había administrado M3-1-SAP. El día 14o (Día 14), se encontró que el volumen del tumor en el grupo de control era de 1123,8 ± 245,65 mm3, mientras se encontró que el volumen del tumor en el grupo al que se había administrado M3-1-SAP era de 415,8 ± 105,1 mm3 (P < 0,05 prueba de la t de Student) (el producto inmunoconjugado se administró dos veces, el Día 1 y el Día 4).
Por otra parte, con el fin de confirmar la actividad anti-tumoral de M3-1-SAP, se administró localmente M3-1-SAP a una porción detumor (1 mg/mL deM3-1-SAP, 40 µL/tumor). Seadministraron dos veces M3-1-SAP eIgG decontrol, esto es, en el momento en el que el volumen del tumor alcanzaba un volumen previamente determinado (grupo de control: 144,98 ± 6,1 mm3 (N = 5); grupo con M3-1-SAP: 145,87 ± 21,26 mm3 (N = 5)) y el 4o día (Día 4) después del inicio de la administración. Después de eso se observó el crecimiento del volumen del tumor.
Como resultado, como se muestra en la Figura 16A, en el grupo al que se había administrado M3-1-SAP, el
crecimiento del tumor fue inhibido casi completamente hasta el 7o día (Día 7) (grupo de control: 584,02 ± 137,07 mm3; grupo con M3-1-SAP: 148,67 ± 38,0 mm3; P < 0,01 por medio de la prueba de la t de Student). Incluso el 14o día, se encontró que el volumen del tumor en el grupo al que se había administrado M3-1-SAP era de 575,75 ± 216,61 mm3 (P < 0,05 por medio de la prueba de la t de Student), mientras se encontró que el volumen del tumor en el grupo de control era de 2038,66 ± 333,17 mm3. De este modo, M3-1-SAP mostró una actividad anti-tumoral extremadamentefuerte.
Como semuestra en la Figura 16B, incluso en el caso de la administración intratumoral de M3-1-SAP, después de la segunda administración el 4o día (Día 4), todos los ratones sobrevivieron, aunquese observó una ligera reducción de su peso corporal. Después del 9o día (Día 9), su peso corporal se recuperó gradualmente y el 10o día (Día 10), se había recuperado completamente hasta las condiciones normales antes de la administración.
Por otra parte, como se muestra en la Figura 16C, cuando se administró el agente anti-canceroso existente Cisplatino (agente anti-tumor maligno Randa Inyección; Nippon Kayaku Co., Ltd.), el crecimiento del tumor fue inhibido casi completamente mediante la administración de 5 mg/kg del agente (el 16o día, grupo de control (grupo conPBS):1085,36 ± 286,30mm3;grupoconCisplatino:77,28 ± 15,20mm3;P<0,01pormediodelapruebadela t de Student). No obstante, como se muestra en la Figura 16D, en el grupo al que se había administrado Cisplatino, se observó un descenso significativo en el peso corporal a lo largo del tiempo. El 16o día (Día 16), se encontró que el peso corporal de los ratones en el grupo al que se había administrado Cisplatino era de 13,24 ± 1,83 g (P < 0,01 por medio de la prueba de la t de Student), mientras se encontró que el peso corporal de los ratones en el grupo de control era de 20,58 ± 0,53 g. De este modo, se observó un fuerte efecto secundario significativo (reducción del peso corporal).
Los resultados anteriores demostraron que, cuando se utiliza el clon M3-1 que tiene actividad de internalización (un anticuerpo que reconoce EGF(4-6)) como producto inmunoconjugado, éste tiene pocos efectos secundarios y una actividad anti-tumoral elevada, cuando se compara con otrosclones.
10. Expresión de hDlk-1 en tejidos de cáncer de colon humano y tejidos de cáncer demama humano
Se ha informado anteriormente de que hDlk-1 es expresada en cánceres sólidos tales como tumores neuroendocrinos, neuroblastoma, glioma, neurofibromatosis de tipo 1, cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de hígado, cáncer de riñón y cáncer de ovario y cánceres de la sangre tales como síndromemielodisplásico y leucemiamielocítica aguda.
Con el fin de examinar la expresión de hDlk-1 en cánceres distintos delos mencionados con anterioridad, se sometió a inmunotinción una matriz de cánceres humanos disponible en el mercado con un anticuerpo anti-hDlk-1 y se analizó la expresión de hDlk-1 en diferentes cánceres. La tasa de hDlk-1 positivos en el cáncer de colon se examinó utilizando una matriz de tejidos de cáncer de colon (Cybrdi; lote Núm. CC05-01-001). La Figura 17 muestra fotografías teñidas representativas. Se examinaron setenta especímenes de tejidos de cáncer de colon. Como resultado, en el caso del adenocarcinoma, 12 de 43 especímenes (27,9%) fueron fuertemente positivos y 19 especímenes de los mismos (44,2%) fueron débilmente positivos. En los casos de adenocarcinoma en conjunto, 31 de 43 analitos (72,1%) fueron positivos para hDlk-1 (Por favor remitirse a la Tabla 4).
Por otra parte, en el caso de 11 especímenes de adenocarcinoma papilar en la misma matriz de tejidos, 6 analitos (54,5%) fueron fuertemente positivos para hDlk-1 (por favor, remitirse a la Tabla 4).
Tabla 4
Adenocarcinoma
Negativo para hDlk-1 Débilmente positivo para hDlk-1 Fuertemente positivo para hDlk-1
Grado I
0 2 1
Grado II
4 13 8
Grado III
8 4 3
Total
12 19 12
Adenocarcinoma papilar
Negativo para hDlk-1 Débilmente positivo para hDlk-1 Fuertemente positivo para hDlk-1
Grado I
0 3 3
Grado II
1 2 3
Grado III
0 0 0
Se hizo evidente que hDlk-1 era fuertemente expresada en aproximadamente 30% de los cánceres de colon y cánceres de mama, así como en los cánceres que expresaban hDlk-1 previamente conocidos. Como se describe en
15 el ejemplo mencionado con anterioridad, un anticuerpo monoclonal anti-hDlk-1 mostró actividad anti-tumoral sobre los modelos de Xenoinjerto de células de cáncer de colon, así como sobre modelos de Xenoinjerto de células de cáncer de hígado. De este modo, el anticuerpo monoclonal anti-hDlk-1se convierte en un agente terapéutico eficaz para el cáncer de colon, así como para el cáncer de hígado. De un modo similar, también se convierte en un agente terapéutico eficaz que se dirige al cáncer demama o a otrascélulas cancerosas que expresan hDlk-1.
20 [Ejemplo 2]
1. Actividad anti-tumoral dependiente de la dosis del anticuerpo anti-Dlk-1 humana de ratón (clon DI-2-14) en
modelos de tratamiento de Xenoinjerto de línea celular de cáncer de hígado que expresa Dlk-1 humana (células 25 Huh-7-Dlk)
<Propósito>
Como se describe en el Ejemplo 1, el clon DI-2-14 (IgG1 de ratón) que es un anticuerpo monoclonal anti-Dlk-1
30 humana mostró una actividad anti-tumoral extremadamente elevada, a una dosis de 20 mg/kg de peso corporal, en modelos de Tratamiento de Xenoinjerto de línea celular de cáncer de hígado humano (células Huh-7-hDlk). De este modo, con el fin de examinar adicionalmente la actividad anti-tumoral del clon DI-2-14, se evaluó la actividad antitumoral dependiente de la dosis.
35 <Método>
Se evaluó la actividad anti-tumoral de la misma manera que se describe en el Ejemplo 1, excepto que se cambió la dosis del anticuerpo.
40 <Resultados>
Como se muestra en la Figura 19, el crecimiento del tumor fue inhibido de una manera dependiente de la dosis por medio de la administración del clon DI-2-14. El 8o día (Día 8) después de la administración del anticuerpo, se encontró que el volumen del tumor era de 522,76 ± 107,9 mm3 en el grupo al que se había administrado DI-2-14 (1 45 mg/kg) (N = 9), se encontró que era de 309,2 ± 58,9 mm3 en el grupo al que se había administrado DI-2-14 (2 mg/kg) (N = 9) y se encontró que era de 285,8 ± 38,2 mm3 en el grupo al que se había administrado DI-2-14 (5 mg/kg) (N = 9). En contraste, en el grupo de control (N = 9), se encontró que el volumen del tumor era de 782,1 ±
124,4mm3.
2. Actividad anti-tumoral de anticuerpo Dlk-1 humana de ratón (clone DI-2-14) en modelos de Xenoinjerto de células de neuroblastoma SK-N-F1 humano
<Propósito>
Como se describe en el Ejemplo 1, entre los 5 tipos de anticuerpos monoclonales anti-Dlk-1 humana que mostraron actividad anti-tumoral en modelos de tratamiento de Xenoinjerto de línea celular de cáncer de hígado humano (células Huh-7-hDlk), con respecto al clon DI-2-14 (IgG1 de ratón) que mostraba una actividad anti-tumoral particularmente fuerte, se evaluó su actividad anti-tumoral en los modelos de Xenoinjerto de neuroblastoma humano (células SK-N-F1). Se consideró que las células Huh-7-Dlk eran una línea celular, en la que se permitía que un gen Dlk-1 humano se expresara establemente demanera extrínseca en células Huh-7. Por el contrario, se consideró que las células SK-N-F1 eran una línea celular, en la que Dlk-1 es expresada endógenamente sobre la superficie celular. Por consiguiente, el fenómeno por medio del cual el clon DI-2-14 muestra actividad anti-tumoral en semejante modelo de tratamiento de Xenoinjerto de la línea celular SK-N-F1 cuando se administra al mismo es idéntico al fenómeno por medio del cual un anticuerpo monoclonal anti-Dlk-1 humana muestra su efecto farmacéutico sobre células de neuroblastoma humano. Al mismo tiempo, también se puede decir que dicho anticuerpo monoclonal antiDlk-1 humana (en particular, el clon DI-2-14) es eficaz para (muestra su efecto farmacéutico sobre) diferentes tipos de células cancerosas, que expresan Dlk-1 sobre la superficie de la célula.
<Método>
Se retiró un neuroblastoma humano (células SK-N-F1; Núm. de catálogo ATCC CRL2142) que expresa endógenamente hDlk-1 sobre la superficie celular mediante tratamiento con tripsina y a continuación se preparó una suspensión celular (6 x 107 células/mL) con PBS. La suspensión celular se mezcló con una cantidad igual de matrigel (BD Pharmingen) sobre hielo. Utilizando una jeringa 26 G, se inyectaron 100 µL (3 x 106 células) de la mezcla bajo la piel del flanco derecho de cada ratón hembra de 6 semanas de edad con inmunodeficiencia combinada grave (NOD-scid). De diez a catorce días después del transplante de las células cancerosas, los ratones cuyo volumen tumoral había crecido de 50 a 150 mm3 (valor medio: 100 mm3) se dividieron en varios grupos. El día en el que los ratones se dividieron en varios grupos se definió como primer día (Día 1) y se inició la administración de un anticuerpo (clon DI-2-14). El anticuerpo se administró intraperitonealmente a intervalos de una vez cada 3 días (5 mg/kg de peso corporal, 20 mg/kg de peso corporal). Como con el Ejemplo 1, se evaluó la actividad anti-tumoral midiendo el volumen del tumor. Además, el último día del experimento, el tumor se extirpó mediante autopsia y se midió y evaluó el peso del tumor. Se llevó a cabo un ensayo de diferencia significativa mediante la prueba de la t de Student y se determinó que P < 0,05 era estadísticamente significativo.
<Resultados>
Como se muestra en la Figura 20A, en el caso del grupo al que se había administrado el clon DI-2-14 (IgG1 de ratón), el crecimiento del tumor fue inhibido significativamente tanto en el grupo al que se habían administrado 5mg/kg (N = 8) como en el grupo al que se habían administrado 20 mg/kg (N = 7), cuando se compararon con el grupo de control (N = 7). En particular, en el grupo al que se habían administrado 20 mg/kg (N = 7), desde el día siguiente al inicio de la administración hasta el 23o día (Día 23) en el que se completó el experimento, el volumen del tumor con respecto al mismo día anterior fue significativamente pequeño desde el punto de vista estadístico (P < 0,01 por medio de la prueba de la t de Student).
El 23o día (Día 23) después del inicio de la administración, se encontró que el volumen del tumor era de 333,8 ± 6,8 mm3 (P < 0,01 por medio de la prueba de la t de Student) en el grupo al que se había administrado el clon DI-2-14 (5 mg/kg de peso corporal) y se encontró que era de 233,0 ± 16,4 mm3 (P < 0,01 por medio de la prueba de la t de Student) en el grupo al que se había administrado el clon DI-2-14 (20 mg/kg de peso corporal), mientras se encontró que era de 527,8 ± 48,9 mm3 en el grupo de control. De este modo, se confirmó la actividad anti-tumoral dependiente de la dosis del clon DI-2-14 (DI-2-14 (5 mg/kg) vs DI-2-14 (20 mg/kg), Día 23, P < 0,01 por medio de la prueba de la t de Student).
Se encontró que el peso del tumor extirpado era de 0,03 ± 0,009 (g) (P < 0,05 por medio de la prueba de la t de Student) en el grupo al que se había administrado el clon DI-2-14 (5 mg/kg de peso corporal) y se encontró que era de0,02 ± 0,005(g)(P<0,05pormediodelapruebadelatdeStudent)enelgrupoalquesehabíaadministradoel clon DI-2-14 (20 mg/kg peso corporal), mientras se encontró que era de 0,07 ± 0,04 (g) en el grupo de control. Como en el caso del volumen del tumor, hubo una diferencia significativa en el peso del tumor entre el grupo al que se habían administrado 5 mg/kg del clon ID-2-14 y el grupo al que se habían administrado 20 mg/kg del clon DI-2-14 (P < 0,05 por medio de la prueba de la t de Student). De este modo, se confirmó la actividad anti-tumoral dependiente de la dosis (Figura 20B).
3. Determinación de la secuencia de la región variable del gen del anticuerpo del anticuerpo anti-Dlk-1 humana de ratón (clon DI-2-14) y construcción del vector de expresión de DI-2-14 quimérico
Se cultivaron hibridomas productores de anticuerpo monoclonal anti-Dlk humana de ratón en medio DMEM que contenía suero bovino fetal al 10% a 37°C en una incubadora con 7,5% de CO2. El ARN total se extrajo de 3 x 106 hibridomas, utilizando un reactivo TRIzol (Invitrogen). Después de eso, empleando el Kit GeneRacer (Invitrogen), se sintetizó ADNc de acuerdo con un método incluido en el kit, utilizando cebadores oligo dT. Se clonó un gen que codificaba cada una de las regiones variables de la cadena H y la cadena L (VH y VL) del clon DI-2-14 (IgG1 de ratón) mediante un método de PCR utilizando el ADNc sintetizado como molde y un cebador incluido en el Kit GeneRacer como cebador 5'. Por otra parte, con respecto al cebador 3', se utiliza un cebador que tiene una secuencia complementaria a una región constante γ1 de ratón como cebador 3' utilizado en la amplificación de VH y se utiliza un cebador que tiene una secuencia complementaria a una región constante κ de ratón como cebador 3' utilizado en la amplificación de VL. cebador 5' (cebador F): 5'-cgactggagcacgaggacactga-3' (SEQ ID NO: 15) cebador 3' (cebador R): VH: 5'-gccagtggatagacagatgg-3' (SEQ ID NO: 16) VL: 5'-gatggatacagttggtgcagc-3' (SEQ ID NO: 17)
Utilizando cada uno de los cebadores mencionados con anterioridad, se llevó a cabo la PCR con la siguiente composición de una solución dereacción, en las siguientes condiciones dereacción.
<<Composición dela solución de reacción>>
ADNc molde:
1,5 µL
10 × tampón de PCR ThermalAce:
5 µL
dNTP 2 mM:
5 µL
Polimerasa ThermalAce:
0,5 µL
Cebador F (10 µM):
3 µL
Cebador R (10 µM):
1,5 µL
Agua esterilizada:
33,5 µL
Total:
50 µL
<<Condiciones de reacción>>
Un ciclo que consistía de "desnaturalización por calor/disociación: 94°C (10 seg) → Recocido: 55°C (10 seg) → Síntesis/elongación: 72°C (60 seg)" se repitió 35 veces (total 35 ciclos).
El ADNc de cada una de VH y VL sintetizadas se subclonó en un vector pCR4Blunt-TOPO (Invitrogen) y a continuación se determinó su secuencia de nucleótidos. Se determinaron las secuencias de nucleótidos de múltiples clones de VH clones y clones VL clones y se identificaron las secuencias de nucleótidos típicas de las regiones variables de la cadena H y la cadena L de ratón. Las Figuras 21 y 22 muestran las secuencias de ADNc consenso de VH y VL de DI-2-14 y las supuestas secuencias de aminoácidos.
Posteriormente, a las regiones codificantes de VH y VL, se les añadieron, respectivamente, las señales donadoras de corte y empalme derivadas de JH y Jκ de la línea germinal de ratón, cada una correspondiente a las regiones anteriormente mencionadas. Después de eso, se añadieron adicionalmente secuencias de reconocimiento de enzimas de restricción adecuadas utilizadas para la inserción en un vector de expresión de células animales a ambos extremos. Los genes de VH (Figura 23) y VL (Figura 24) producidos de este modo que tenían funciones como exones se insertaron en un vector de expresión de células animales (Figura 25) que tenía las regiones constantes de la cadena γ1 y la cadena κ humanas, con el fin de producir un vector de expresión (pChDI-2-14) de anticuerpo quimérico ratón-humano (IgG1/κ de DI-2-14).
4. Purificación dela proteína anticuerpo ChDI-2-14
La línea celular NS0 establecida que produce de forma estable un anticuerpo CHDI-2-14 fue adaptada a un medio libre de suero (Hibridoma SFM, Invitrogen). Después de eso, se recuperó un sobrenadante de cultivo obtenido cultivando las células en el medio libre de suero y a continuación se purificó un anticuerpo por medio de un método habitual utilizando una columna de Proteína A (GE Healthcare).
La figura 26 muestra un anticuerpo de ratón DI-2-14 y un anticuerpo ChDI-2-14 purificado, que se aplicaron a SDS-PAGE y a continuación se tiñeron con CBB. En ambos casos, se detectaron en condiciones reductoras una cadena H de aproximadamente 50 kD y una cadena L de aproximadamente 25 kD, de modo que se confirmó la producción de una proteína anticuerpo ChDI-2-14.
5. Afinidad antigénica del anticuerpo DI-2-14 quimérico (ChDI-2-14)
La afinidad antigénica de la proteína ChDI2-14 purificada se analizó por medio de un método en el que se utilizaba ELISA.
El ELISA se llevó a cabo de la misma manera que se ha descrito en el Ejemplo 1, utilizando una placa de ELISA sobre la que se había sido inmovilizado la proteína HFA-1 recombinante purificada (0,5 a 1 µg/ml). Específicamente, la placa de ELISA se lavó con un tampón de lavado 3 veces y a continuación se bloqueó utilizando una solución de bloqueo a temperatura ambiente durante 1 hora (o a 4°C durante la noche). Después de eso, la placa se lavó con un tampón de lavado 2 veces y se añadieron a la placa un anticuerpo DI-2-14 de ratón y un anticuerpo ChDI-2-14, en donde se produjeron series de dilución usando un tampón de ELISA, de manera que se les dejara reaccionar (a 4°C durante la noche). Después de eso, la placa se lavó con un tampón de lavado 3 veces y a continuación se dejó reaccionar con anti-IgG de ratón marcado con HRP (concentración final: 1 µg/mL) o anti-IgG humana marcado con HRP (concentración final: 1 µg/ml) (ambos productos fabricados por GE Healthcare), que se habían diluido con una solución de bloqueo. Como resultado, la curva de reacción de DI-2-14 de ratón y la curva de reacción de ChDI2-14 casi se solaparon y la CE50 fue de 10 ng/ml en ambos casos (Figura 27).
Por otra parte, la actividad de unión de cada anticuerpo a una proteína Dlk-1 expresada en la superficie de una célula viva se analizó mediante citometría de flujo utilizando células HEK293-hDlk. Como resultado, al igual que con los resultados de ELISA, ChDI2-14 exhibió una capacidad de unión al antígeno que era equivalente a la de DI-2-14 de ratón(Figura 28).
Los resultados anteriores demostraron que, puesto que un anticuerpo DI-2-14 quimérico (ChDI2-14) mantiene una afinidad antigénica casi equivalente a un anticuerpo DI-2-14 de ratón, el anticuerpo DI-2-14 quimérico producido mantiene la fuerte actividad antitumoral in vivo del anticuerpo de ratón DI-2-14 y por lo tanto que el anticuerpo DI-214 quimérico puede ser un anticuerpo terapéutico, un anticuerpo de diagnóstico, o un anticuerpo detector, que es eficaz para cánceres que expresan Dlk-1 en la superficie celular.
6. Expresión de Dlk-1 en la superficie de células de cáncer de hígado, cáncer de mama y líneas celulares de leucemia (FACS) humanas
Con el fin de examinar la expresión de Dlk-1 en células de cáncer humano más en detalle, se realizó el análisis por citometría de flujo utilizando un anticuerpo anti-Dlk-1 humana en líneas celulares de cáncer de hígado (7 líneas celulares), líneas celulares decáncer de mama (10 líneas celulares) y líneas celulares deleucemiamielocítica aguda (LMA) (7 líneas celulares).
Las líneas celulares utilizadas que se enumeran a continuación fueron adquiridas de Japanese Health Sciences Foundation (Health Science Research Resources Bank), ATCC (American Type Culture Collection), ECACC (European Collection of Cell Cultures) y DSMZ (German Collection of Microorganisms and Cell Cultures). HL-60 (ATCC), NB-4 (DSMZ), MV-4-11 (ATCC), KG-1 (ATCC), KG-la (ATCC), TF-1 (ATCC), CMK-11-5 (Japanese Health Sciences Foundation), HepG2 (Japanese Health Sciences Foundation), C3A/HepG2 (ATCC), Huh-7 (Japanese Health Sciences Foundation), OCUG-1 (Japanese Health Sciences Foundation), HLE (Japanese Health Sciences Foundation), HLF (Human Science Promotion Corporation), SK-HEP-1 (ATCC), HCC1143 (ATCC), JIMT-1 (DSMZ), ZR-75-1 (ATCC), MDA-MB-415 (ATCC), BT549 (ATCC), BT-474 (ATCC), MDA-MB-231 (ATCC), DU4475 (ATCC), T47D (ATCC) and MDA-MB-468 (ATCC).
En el caso de las líneas celulares de cáncer de hígado, la expresión de Dlk-1 en la superficie celular se confirmó en las 7 líneas celulares utilizadas (Figura 29). En el caso de las líneas celulares de cáncer de mama, entre los 10 tipos de líneas celulares utilizados, se confirmó la expresión fuerte de Dlk-1 en células HCC1143 y en células JimT-1 (Figura 30) e incluso en los 8 tipos de líneas celulares restantes, se confirmó la expresión de Dlk-1 en la superficie celular, aunque el nivel de expresión fue bajo (Figura 30). En el caso de las líneas de células AML, entre los 7 tipos de líneas celulares utilizados, se confirmó la expresión de Dlk-1 en la superficie celular en 4 tipos de líneas celulares tales como las células CMK-11-5, las células TF-1, las células MV-4-11 y las células NB-4 (Figura 31).
[Ejemplo 3]
Efecto inhibidor de la angiogénesis del anticuerpo DI-2-14 (anticuerpo monoclonal de ratón anti-Dlk-1 humana, clon DI-2-14) in vivo
<Método>
Inmunohistotinción
Utilizando ratones portadores de cáncer de células Huh-7-hDlk, los tejidos cancerosos se extirparon de cada uno de un grupo de administración de IgG de ratón (un grupo de control: 2 ratones) y un grupo de administración de DI-2-14 (4 ratones). Los tejidos cancerosos se embebieron en un compuesto O.C.T (Tissue-Tek) y se produjo una sección fresca congelada (7 µm). La sección se fijó a temperatura ambiente con glutaraldehído al 2,5%/PBS durante 15 minutos y después con Triton X-100 al 0,5%/PBS durante 3 minutos. A continuación se lavó con PBS a temperatura ambiente durante 5 minutos, 3 veces. Posteriormente, la sección se trató a temperatura ambiente durante 5 minutos utilizando una solución producida mediante la adición de una solución de peróxido de hidrógeno a metanol a una concentración final de 0,3%, con el fin de eliminar la actividad peroxidasa endógena. Después de eso, el portaobjetos se lavó con PBS, Tween al 0,1%/PBS y Tween al 0,02%/PBS por este orden, a temperatura ambiente durante 5 minutos para cada solución de lavado. De acuerdo con los protocolos de M.O.M.™ Immunodetection Kit (VECTOR), se llevó a cabo una operación de bloqueo utilizando Reactivo de Bloqueo de Ig de ratón M.O.M.™, para bloquear los sitios de unión no específicos en los tejidos. Después de eso, el portaobjetos se lavó con PBS a temperatura ambiente durante 2 minutos 2 veces. A continuación, se hizo reaccionar con Diluyente MOM™ a temperatura ambiente durante 5 minutos. Puesto que los vasos tumorales en el tumor derivado de células Huh-7hDlk formado deriva de las células endoteliales vasculares de ratón, se hizo reaccionar con él un anticuerpo anti-Flk1/VEGF-R2 de ratón (concentración final: 2 µg/ml) diluido con Reactivo de Bloqueo de Ig de ratón MOM™ a temperatura ambiente durante 30 minutos y a continuación el portaobjetos se lavó con PBS a temperatura ambiente durante 2 minutos 2 veces. Posteriormente, se dejó reaccionar un anticuerpo anti-IgG de rata biotinilado diluido 100 veces con Diluyente MOM™ con el producto de reacción a temperatura ambiente durante 10 minutos. Después de lavar el producto de reacción con PBS durante 2 minutos 2 veces, la inmunohistotinción se llevó a cabo según el método de la inmunohistotinción como se ha descrito en el apartado 11.
(2) RT-PCR
El término "RT-PCR" se utiliza en el presente ejemplo para significar una reacción en la que se llevaron a cabo, por separado la síntesis de ADNc a partir del ARN extraído y la PCR utilizando el ADNc comomolde.
Utilizando ratones portadores de cáncer de células Huh-7-hDlk, los tejidos cancerosos se extrajeron de cada uno de un grupo de administración de IgG de ratón (un grupo de control: 7 ratones) y un grupo de administración de DI-2-14 (7 ratones). Después de eso, el ARN se extrajo de los tejidos cancerosos, utilizando un reactivo Trizol (Invitrogen). Posteriormente, usando kit de síntesis de ADNc de la 1a hebra (GE Healthcare), se sintetizó la 1a hebra de ADNc de acuerdo con los protocolos incluidos con el kit.
Utilizando el ADNc de la 1a hebra sintetizada como molde, la expresión de un gen Flk-1/VEGF-R2 de ratón (Núm. de Acceso Genbank X70842) utilizada como marcador de células endoteliales vasculares tumores en los tejidos cancerosos extirpados de cada uno del grupo de administración de IgG de ratón (el grupo de control: 7 ratones) y el grupo de administración de DI-2-14 (7 ratones) se analizó mediante el método PCR.
Se utilizaron los siguientes cebadores de PCR (producto de amplificación de PCR: 336 pb). cebador F: 5'-ctt-tac-tct-ccc-cag-tta-ca-3' (SEQ ID NO: 18) cebador R: 5'-ctt-tct-att-gtc-aag-gtg-ct-3' (SEQ ID NO: 19)
Utilizando los cebadores anteriormente mencionados, se llevó a cabo la PCR con la siguiente composición de una solución de reacción bajo las siguientes condiciones de reacción.
<<Composición dela solución de reacción>>
«Condiciones de reacción»
Después de realizar la desnaturalización a 95°C (3 minutos), un ciclo que consistía en "desnaturalización por calor/disociación: 95°C (60 seg) → Recocido: 55°C (60 seg) → Síntesis/elongación: 72°C (60 seg )" se repitió 35 veces (35 ciclos en total).
Como control interno, se utilizó GAPDH (GAPDH humana: NM_002046; GAPDH de ratón: NM_008084, NM_001001303, XM_001003314, XM_988853, XM_990238). Como cebadores de PCR utilizados en la amplificación de GAPDH, se utilizaron los siguientes cebadores (producto de amplificación de PCR: 452 pb). Estos cebadores permiten la amplificación en los en los que se utiliza cualquiera deGAPDH humano o GAPDH de ratón como molde.
cebador F: S'-acc-aca-gtc-cat-gcc-atc-ac-3' (SEQ ID NO: 20)
cebador R: 5'-tcc-acc-acc-ctg-ttg-ctg-ta-3' (SEQ ID NO: 21)
La amplificación de GAPDH se llevó a cabo en las mismas condiciones de PCR de FLK-1/VEGFR-2 descrito anteriormente.
Con el fin de cuantificar los productos de PCR, los productos se separaron en primer lugar mediante electroforesis en gel de agarosa al 1,2% y a continuación se tiñeron con bromuro de etidio. Después de eso, se capturó por medio de un escáner la imagen electroforética obtenida, a continuación se cuantificó el producto de PCR con NIH Image y después se produjo un gráfico basándose en la razón de Flk-1/GAPDH.
<Resultados>
Como se muestra en la Figura 32, se contó el número de células endoteliales vasculares tumorales, cuyos núcleos fueron confirmados por medio de tinción nuclear con hematoxilina en 8 a 13 campos visuales (una lente de objetivo de 200 aumentos) a partir de cada uno de un grupo de administración de IgG (20 mg/kg de peso corporal) (2 ratones) y un grupo de administración de DI-2-14 (20 mg/kg de peso corporal) (4 ratones), y que fueron positivos para Flk-1/VEGF-R2, (grupos de administración de IgG: 25 campos visuales en total; el grupo de administración de DI-2-14: 35 campos visuales en total) y se contó el número de células vasculares tumorales por campo visual. Como resultado, se encontró que el número de tales células era de 112,0 ± 63,6 (número de células positivas para Flk1/campo visual) en el grupo de administración de IgG, mientras que se encontró que el número de tales células era de 36,3 ± 2,2 (número de células positivas para Flk-1/campo visual) en el grupo de administración de DI-2-14. De este modo, el número de células vasculares tumorales fue significativamente pequeño (P < 0,01) y por lo tanto se demostró que la angiogénesis tumoral resultaba inhibida por la administración de DI-2-14.
Por otra parte, en otro experimento, también se utilizaron ratones que portan cáncer de células Huh-7-hDlk-1 y también se analizó semicuantitativamente mediante RT-PCR la expresión de un gen de Flk-1/VEGF-R2 que actúa como gen marcador específico de células endoteliales vasculares tumorales en el tumor formado a partir de cada uno de un grupo de administración de IgG (20 mg/kg de peso corporal, N = 7) y un grupo de administración de DI-214 (20 mg/kg de peso corporal, N = 7). Como resultado, según se muestra en la Figura 33, la expresión del gen Flk1/VEGF-R2 disminuyó en el tumor del grupo de administración de DI-2-14. Este resultado demostró que la angiogénesis tumoral resultaba inhibida por la administración de DI-2-14.
<Consideración>
Se sabe que la angiogénesis tumoral es esencial para la formación del cáncer. Como anticuerpo terapéutico que actúa principalmente inhibiendo tal angiogénesis tumoral, se conoce un anticuerpo anti-VEGF (Avastina). Hasta la fecha, no se ha proporcionado información referente a la angiogénesis o a la actividad inhibidora de la angiogénesis
de Dlk-1 y a un anticuerpo anti-Dlk-1. Además, con respecto a las funciones de Dlk-1, se han referido el control de la diferenciación de las células adiposas y la aceleración del crecimiento de las células de glioma o las células de leucemia por medio de la introducción estable del gen Dlk-1. Sin embargo, ha sido imposible pronosticar, basándose en la información previa, el hecho de que un anticuerpo anti-Dlk-1 (DI-2-14) tiene actividad inhibidora de la
5 angiogénesis tumoral. El presente ejemplo mostró al menos un mecanismo de acción de la actividad anti-tumoral in vivo del anticuerpo DI-2-14.
Aplicabilidad industrial
10 De acuerdo con la presente invención, se puede proporcionar un anticuerpo contra Dlk-1 humana que tiene actividad antitumoral in vivo, en donde:  las secuencias de aminoácidos de las CDR 1 a 3 de la región V de la cadena H del anticuerpo son las secuencias delos aminoácidos mostradas en los SEQ ID NOS: 30 a 32, respectivamente; y  las secuencias de aminoácidos de las CDR 1 a 3 de la región V de la cadena L del anticuerpo son las 15 secuencias de aminoácidos mostradas en los SEQ ID NOS: 33 a 35, respectivamente.
Por otra parte, la presente invención proporciona hibridomas que producen los anticuerpos anteriormente mencionados, un complejo de los anticuerpos anteriormente mencionados y diversos tipos de agentes, una composición farmacéutica para diagnosticar o tratar un tumor, un método para detectar tumores y un kit para
20 detectar o diagnosticar un tumor.
Texto libre de la lista de secuencias
SEQ ID NO: 3
ADN sintético
SEQ ID NO: 4
ADN sintético
SEQ ID NO: 5
ADN sintético
SEQ ID NO: 6
ADN sintético
SEQ ID NO: 7
ADN sintético
SEQ ID NO: 8
ADN sintético
SEQ ID NO: 9
ADN sintético
SEQ ID NO: 10
ADN sintético
SEQ ID NO: 11
ADN sintético
SEQ ID NO: 12
ADN sintético
SEQ ID NO: 13
ADN sintético
SEQ ID NO: 14
ADN sintético
SEQ ID NO: 15
ADN sintético
SEQ ID NO: 16
ADN sintético
SEQ ID NO: 17
ADN sintético
SEQ ID NO: 18
ADN sintético
SEQ ID NO: 19
ADN sintético
SEQ ID NO: 20
ADN sintético
SEQ ID NO: 21
ADN sintético
SEQ ID NO: 26
ADN recombinante
SEQ ID NO: 27
Constructo sintético (proteína recombinante)
SEQ ID NO: 28
ADN recombinante
SEQ ID NO: 29
Constructo sintético (proteína recombinante)
<110> LivTech, Inc.
<120> anticuerpo anti-hDlk-1 39
<130> PCT07-0041
<150> JP 2006-305355
<151> 2006-11-10
<160> 35 5 <170> PatentIn version 3.4
<210> 1
<211> 1532
<212> ADN
<213> Homo sapiens 10 <220>
<221> CDS
<222> (154).. (1305)
<400> 1
<210> 2
<211> 383
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
<210> 3
<211> 21
<212> ADN
5
<213> Artificial
<220>
<223> ADN sintético
<400> 3
cgcgtccgca accagaagcc c
21
10
<210> 4
<211> 28
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
15
<223> ADN sintético
<400> 4
ctcgaggtgc tccggctgct gcaccggc
28
<210> 5
<211> 25
20
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN sintético
<400> 5
25
gcggccggct gaatgcttcc cggcc
25
<210> 6
<211> 29
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN sintético
<400> 6
5
tctagagagg ctgttggcca cgatctcgc 29
<210> 7
<211> 25
<212> ADN
<213> Artificial
10
<220>
<223> ADN sintético
<400> 7
gcggccggct gaatgcttcc cggcc
25
<210> 8
15
<211> 28
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN sintético
20
<400> 8
tctagacccg tcctttttct ggcagtcc
28
<210> 9
<211> 25
<212> ADN
25
<213> Artificial
<220>
<223> ADN sintético
<400> 9
gcggccggct gaatgcttcc cggcc
25
30
<210> 10
<211> 26
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
35
<223> ADN sintético
<400> 10
tctagaggcc cgaacatctc tatcac
26
<210> 11
<211> 27
40
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN sintético
<400> 11
gcggccgcaa aaaggacggg ccctgtg
27
<210> 12
<211> 20
5
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN sintético
<400> 12
10
gcgtatagta agctctgcgg 20
<210> 13
<211> 29
<212> ADN
<213> Artificial
15
<220>
<223> ADN sintético
<400> 13
caggcagcgg ccgcgagatc gtggccaac
29
<210> 14
20
<211> 20
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN sintético
25
<400> 14
gcgtatagta agctctgcgg
20
<210> 15
<211> 23
<212> ADN
30
<213> Artificial
<220>
<223> ADN sintético
<400> 15
cgactggagc acgaggacac tga
23
35
<210> 16
<211> 20
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
40
<223> ADN sintético
<400> 16
gccagtggat agacagatgg
20
<210> 17
<211> 21
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
5
<223> ADN sintético
<400> 17
gatggataca gttggtgcag c
21
<210> 18
<211> 20
10
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN sintético
<400> 18
15
ctttactctc cccagttaca 20
<210> 19
<211> 20
<212> ADN
<213> Artificial
20
<220>
<223> ADN sintético
<400> 19
ctttctattg tcaaggtgct
20
<210> 20
25
<211> 20
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN sintético
30
<400> 20
accacagtcc atgccatcac
20
<210> 21
<211> 20
<212> ADN
35
<213> Artificial
<220>
<223> ADN sintético
<400> 21
tccaccaccc tgttgctgta
20
40
<210> 22
<211> 411
<212> ADN
<213> Mus musculus
<220>
<221> CDS
<222> (1).. (411)
<400> 22
<210> 23
<211> 137
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 23
<210> 24
<211> 396
<212> ADN
<213> Mus musculus
<220>
<221> CDS
<222> (1).. (396)
<400> 24
<210> 25
<211> 132
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 25
<210> 26
<211> 442
<212> ADN 5 <213> Artificial
<220>
<223> ADN recombinante
<220>
<221> CDS 10 <222> (13).. (420)
<400> 26
<210> 27
<211> 136
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Constructo sintético (proteínarecombinante)
<400> 27
<210> 28 5 <211> 431
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN recombinante 10 <220>
<221> CDS
<222> (13).. (420)
<400> 28
<210> 29 5 <211> 134
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Constructo sintético (proteínarecombinante) 10 <400> 29
<210> 30
<211> 5
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 30
10 <210> 31
<211> 17
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 31
<210> 32
<211> 8
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 32
<210> 33
<211> 16
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 33
<210> 34 15 <211> 7
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 34
20 <210> 35
<211> 9
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 35

Claims (18)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un anticuerpo contra Dlk-1 humana, que tiene actividad antitumoral in vivo, en donde: -las secuencias de aminoácidos de las CDR 1 a 3 de la región V de la cadena H del anticuerpo son las
    5 secuencias de aminoácidos mostradas en los SEQ ID NO: 30 a 32, respectivamente; y -las secuencias de aminoácidos de las CDR 1 a 3 de la región V de la cadena L del anticuerpo son las secuencias de aminoácidos mostradas en los SEQ ID NO: 33 a 35, respectivamente.
  2. 2. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1, en donde 10 (a)laactividadantitumoraleslaactividadinhibidoradelaangiogénesisantitumoral;
    (b)
    dicho anticuerpo es un anticuerpomonoclonal; y/o
    (c)
    el tumor es al menos un tipo seleccionado entre cáncer de colon humano, cáncer de mama humano, cáncer de hígado humano y neuroblastoma humano; y/o
    (d) dicho anticuerpo es un anticuerpo genéticamenterecombinante. 15
  3. 3.
    El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 2, que un anticuerpo genéticamente recombinante y es un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado o un anticuerpo humano.
  4. 4.
    El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 3, que es un anticuerpo quimérico y la secuencia de aminoácidos
    20 de la región V de la cadena H comprende la secuencia de aminoácidos que consiste en los aminoácidos de las posiciones 20 a 137 en la secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 23 y la secuencia de aminoácidos de la región V de la cadena L comprende la secuencia de aminoácidos que consiste en los aminoácidos 21 a 132 en la secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 25.
    25 5. Un anticuerpo monoclonal contra Dlk-1 humana, que es producida por un hibridoma que tiene el Núm. de acceso FERM BP-10707, FERM BP-10899, o FERM BP-10900.
  5. 6. Un anticuerpo contra Dlk-1 humana, que tiene actividad antitumoral in vivo y que se une a:
    (a)
    un epítopo de Dlk-1 humana al que se une un anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma que tiene el 30 Núm. de acceso FERM BP-10707 o FERM BP-10900; y/o
    (b) al menos una porción de una región que comprende los aminoácidos de las posiciones 26 a 85 o una región que comprende los aminoácidos de las posiciones 131 a 244, en la secuencia de aminoácidos de Dlk-1 humana como semuestra en el SEQ ID NO: 2.
    35 7. Un fragmento de anticuerpo que se une a Dlk-1 humana, que tiene actividad antitumoral en vivo, que deriva delos anticuerpos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y que comprende:
    (a) las secuencias de aminoácidos de las CDR 1 a 3 de la región V de la cadena H del anticuerpo que tiene las secuencias de aminoácidos mostradas en los SEQ ID NO: 30 a 32; y/o
    (b)
    las secuencias de aminoácidos de las CDR 1 a 3 de la región V de la cadena L del anticuerpo que tiene las 40 secuencias de aminoácidos mostradas en los SEQ ID NO: 33 a 35.
  6. 8. El fragmento de anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 7, que es un Fab, Fab', F(ab')2, Fv, un anticuerpo monocatenario, scFv, diacuerpo o dsFv.
    45 9. El fragmento de anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 7 u 8, que comprende:
    (a)
    la secuencia de aminoácidos que consiste en los aminoácidos de las posiciones 20 a 137 en la secuencia de aminoácidosmostrada en el SEQ ID NO: 23; y/o
    (b)
    la secuencia de ácidos que consiste en los aminoácidos 21 a 132 en la secuencia de aminoácidos mostrada
    en el SEQ ID NO: 25. 50
  7. 10. Un hibridoma, que produce:
    (a)
    el anticuerpo de acuerdo con una cualquiera delas reivindicaciones 1 a 6; o
    (b)
    un anticuerpo monoclonal contra Dlk-1 humana, quetiene el Núm. de acceso FERM BP-10707; o
    (c)
    un anticuerpo monoclonal contra Dlk-1 humana, quetiene el Núm. de acceso FERM BP-10899, o 55 (d)unanticuerpomonoclonalcontraDlk-1humana,quetieneelNúm.deaccesoFERMBP-10900.
  8. 11. Un complejo, que comprende un compuesto que tiene actividad antitumoral y/o actividad destructora de células,
    y:
    (a)
    el anticuerpo de acuerdo con una cualquiera delas reivindicaciones 1 a 6; o 60 (b) el fragmento de anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9.
  9. 12. El complejo de acuerdo con la reivindicación 11, en donde:
    (i) la actividad antitumoral es la actividad inhibidora de la angiogénesis antitumoral; y/o
    (ii) el tumor es al menos uno de cáncer de colon humano, cáncer de mama humano, cáncer de hígado humano y neuroblastoma humano.
  10. 13.
    Una composición farmacéutica, que comprende al menos uno del anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, el fragmento de anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9 y el complejo de acuerdo conla reivindicación 11 o 12.
  11. 14.
    El anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, el fragmento de anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, el complejo de acuerdo con la reivindicación 11 o 12 o la composición de acuerdo con la reivindicación 13 para su usoen un método para el tratamiento de untumor.
  12. 15.
    El anticuerpo, fragmento de anticuerpo, complejo o composición para su uso en un método para el tratamiento de un tumor de acuerdo con lareivindicación 14, en donde:
    (i)
    el tratamiento del tumor indica inhibición de la angiogénesis tumoral;
    (ii)
    dicho anticuerpo, fragmento de anticuerpo, complejo o composición no causa reducción de peso como efecto secundario; y/o
    (iii) el tumor es al menos uno de cáncer de colon humano, cáncer de mama humano, cáncer de hígado humano y neuroblastoma humano.
  13. 16.
    Un agente de diagnóstico de tumores, que comprende al menos un del anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, el fragmento de anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9 y el complejo de acuerdo conla reivindicación 11 o 12.
  14. 17.
    El agente de acuerdo con la reivindicación 16, en donde el tumor es al menos uno de cáncer de colon humano, cáncer demama humano, cáncer de hígado humano y neuroblastoma humano.
  15. 18.
    Un método para detectar un tumor, que comprende: permitir que al menos uno del anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, el fragmento de anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9 y el complejo de acuerdo con la reivindicación 11 o 12, reaccione con una muestra recogida del un organismo vivo; y detectar una o varias señales del anticuerpo y/o fragmento de anticuerpo que han reaccionado.
  16. 19.
    El método de acuerdo con la reivindicación 18, en donde el tumor es al menos uno de cáncer de colon humano, cáncer demama humano, cáncer de hígado humano y neuroblastoma humano.
  17. 20.
    A kit para tratar, diagnosticar, o detectar un tumor, que comprende al menos uno del anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, el fragmento de anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9 y el complejo de acuerdo conla reivindicación 11 o 12.
  18. 21.
    El kit de acuerdo con la reivindicación 20, en donde el tumor es al menos uno de cáncer de colon humano, cáncer demama humano, cáncer de hígado humano y neuroblastoma humano.
ES07832065.2T 2006-11-10 2007-11-12 Anticuerpo anti-DLK-1 humana que muestra la actividad antitumoral in vivo Active ES2484842T3 (es)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2006305355 2006-11-10
JP2006305355 2006-11-10
PCT/JP2007/072335 WO2008056833A1 (fr) 2006-11-10 2007-11-12 Anticorps anti-humain spécifiques de dlk1 présentant une activité anti-tumorale in vivo

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2484842T3 true ES2484842T3 (es) 2014-08-12

Family

ID=39364634

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES07832065.2T Active ES2484842T3 (es) 2006-11-10 2007-11-12 Anticuerpo anti-DLK-1 humana que muestra la actividad antitumoral in vivo

Country Status (9)

Country Link
US (1) US8227578B2 (es)
EP (1) EP2096122B1 (es)
JP (1) JP5219827B2 (es)
KR (1) KR101512203B1 (es)
CN (2) CN103073641B (es)
AU (1) AU2007318483B2 (es)
CA (1) CA2669731C (es)
ES (1) ES2484842T3 (es)
WO (1) WO2008056833A1 (es)

Families Citing this family (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2527521T3 (es) 2008-03-17 2015-01-26 Livtech Inc. Anticuerpos antihumanos frente a Dlk-1 que tienen actividad antitumoral
KR100982170B1 (ko) * 2010-03-16 2010-09-15 한국생명공학연구원 ＤＬＫ１―Ｆｃ 융합 단백질을 유효성분으로 함유하는 암 전이 억제용 조성물
ES2381161B1 (es) * 2010-10-21 2013-04-18 Consejo Superior De Investigaciones Científicas (Csic) Uso de dlk1 como inhibidor de angiogénesis.
WO2012138102A2 (ko) * 2011-04-04 2012-10-11 한국생명공학연구원 Ｄｌｋ１ 특이적 인간 항체 및 이를 포함하는 약학적 조성물
WO2012138100A2 (ko) * 2011-04-04 2012-10-11 한국생명공학연구원 Ｄｌｋ１ 세포 외 수용성 도메인을 포함하는 액티빈 수용체 타입 2ｂ 억제제
KR101461706B1 (ko) * 2011-04-04 2014-11-18 한국생명공학연구원 Ｄｌｋ１ 세포 외 수용성 도메인을 포함하는 액티빈 수용체 타입 2ｂ 억제제
US9345770B2 (en) 2011-11-16 2016-05-24 University of Pittsburgh—of the Commonwealth System of Higher Education Immunogenic tumor associated stromal cell antigen peptides and methods of their use
KR102149565B1 (ko) * 2012-10-03 2020-08-28 가부시키가이샤 리부텍쿠 in vivo 에서 항종양 활성을 갖는 항인간 Dlk-1 항체
WO2014129590A1 (ja) * 2013-02-21 2014-08-28 国立大学法人九州大学 Ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１遺伝子発現抑制剤および抗腫瘍剤
CN108136038A (zh) 2015-11-25 2018-06-08 乐高化学生物科学股份有限公司 包含肽基团的缀合物及其相关方法
PT3380124T (pt) 2015-11-25 2024-04-30 Legochem Biosciences Inc Conjugados que compreendem grupos autoimoladores e métodos com eles relacionados
EP3380126A4 (en) 2015-11-25 2019-07-24 LegoChem Biosciences, Inc. ANTIBODY-MEDICINAL CONJUGATES COMPRISING BRANCHED LINKS AND RELATED METHODS
BR112019020136A2 (pt) 2017-03-29 2020-04-22 Legochem Biosciences Inc profármaco de dímero de pirrolobenzodiazepina e composto de conjugado ligando-ligante do mesmo
WO2019050362A2 (ko) * 2017-09-08 2019-03-14 주식회사 와이바이오로직스 인간 dlk1에 대한 항체 및 이의 용도
CN110031629B (zh) * 2018-01-11 2020-08-18 上海交通大学 检测人血清dlk1蛋白的elisa试剂盒及其用途
CN108456662B (zh) * 2018-01-16 2021-02-12 上海交通大学 针对肝癌相关抗原dlk1为靶点的car-t构建方法
SG11202010443WA (en) 2018-05-09 2020-11-27 Legochem Biosciences Inc Compositions and methods related to anti-cd19 antibody drug conjugates
BR112021017303A2 (pt) * 2019-03-06 2021-11-16 Legochem Biosciences Inc Conjugado de anticorpo ou um sal ou solvato farmaceuticamente aceitável deste, anticorpo que se liga com especificidade ao dlk1 ou um fragmento de ligação ao antígeno deste, composição farmacêutica para prevenção ou tratamento de doença proliferativa, câncer ou angiogênica, métodos para prevenção e para tratamento de doença proliferativa, câncer ou angiogênica, e, uso do conjugado
AU2020255907A1 (en) * 2019-04-01 2021-10-28 Chiome Bioscience Inc. Medicament for treating cancer
KR20210028544A (ko) 2019-09-04 2021-03-12 주식회사 레고켐 바이오사이언스 인간 ror1에 대한 항체를 포함하는 항체 약물 접합체 및 이의 용도
AU2021355919A1 (en) 2020-10-05 2023-05-11 Chiome Bioscience Inc. Medicine for treating cancer
CA3198996A1 (en) 2020-11-24 2022-06-02 Matthew T. Burger Bcl-xl inhibitor antibody-drug conjugates and methods of use thereof
CA3240297A1 (en) * 2021-12-07 2023-06-15 Dennis Slamon Dlk1 antibodies and methods of treating cancer
TW202408588A (zh) 2022-05-20 2024-03-01 瑞士商諾華公司 抗體-藥物結合物抗腫瘤化合物及其使用方法
WO2023223097A1 (en) 2022-05-20 2023-11-23 Novartis Ag Antibody drug conjugates

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL162181A (en) 1988-12-28 2006-04-10 Pdl Biopharma Inc A method of producing humanized immunoglubulin, and polynucleotides encoding the same
AU677623B2 (en) 1992-12-11 1997-05-01 Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, The Delta-like gene expressed in neuroendocrine tumors
JP2001269174A (ja) 2000-03-24 2001-10-02 Kirin Brewery Co Ltd 骨髄異形成症候群（ｍｄｓ）の検出方法及びｍｄｓの治療剤
CA2442739A1 (en) * 2001-04-03 2002-10-17 Curagen Corporation Novel antibodies that bind to antigenic polypeptides, nucleic acids encoding the antigens, and methods of use
US20030185815A1 (en) 2001-04-03 2003-10-02 Muralidhara Padigaru Novel antibodies that bind to antigenic polypeptides, nucleic acids encoding the antigens, and methods of use
EP1421179A1 (en) * 2001-08-24 2004-05-26 Nsgene A/S Isolation of cells from neural cell populations using antibodies to fa1/dlk1
AU2003215525A1 (en) * 2002-03-21 2003-10-08 Nsgene A/S Detection and isolation of cell populations from muscle using antibodies to fa1/dlk1
EP1517921B1 (en) * 2002-06-28 2006-06-07 Domantis Limited Dual specific ligands with increased serum half-life
CA2500687A1 (en) 2002-10-02 2004-04-15 Genentech, Inc. Compositions and methods for the diagnosis and treatment of tumor
DE602004027085D1 (de) 2003-11-28 2010-06-17 Kanagawa Kagaku Gijutsu Akad M für leberkrebs sowie heilmittel gegen krebs
US7717878B2 (en) 2005-04-25 2010-05-18 Tyco Healthcare Group Lp Surgical portal with seal system
ES2527521T3 (es) * 2008-03-17 2015-01-26 Livtech Inc. Anticuerpos antihumanos frente a Dlk-1 que tienen actividad antitumoral

Also Published As

Publication number Publication date
CN103073641B (zh) 2015-01-21
JPWO2008056833A1 (ja) 2010-02-25
AU2007318483A1 (en) 2008-05-15
WO2008056833A1 (fr) 2008-05-15
EP2096122A4 (en) 2010-11-10
JP5219827B2 (ja) 2013-06-26
KR101512203B1 (ko) 2015-04-15
KR20090088893A (ko) 2009-08-20
CN101631802A (zh) 2010-01-20
EP2096122A1 (en) 2009-09-02
US8227578B2 (en) 2012-07-24
AU2007318483B2 (en) 2013-05-02
CA2669731C (en) 2016-01-19
EP2096122B1 (en) 2014-07-16
CA2669731A1 (en) 2008-05-15
CN101631802B (zh) 2014-03-05
CN103073641A (zh) 2013-05-01
US20090326205A1 (en) 2009-12-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2484842T3 (es) Anticuerpo anti-DLK-1 humana que muestra la actividad antitumoral in vivo
ES2527521T3 (es) Anticuerpos antihumanos frente a Dlk-1 que tienen actividad antitumoral
US9670287B2 (en) Anti-human TROP-2 antibody having anti-tumor activity in vivo
US10202461B2 (en) Anti-human TROP-2 antibody having an antitumor activity in vivo
ES2665341T3 (es) Anticuerpo anti-DLK-1 humana con actividad antitumoral in vivo
NZ716839B2 (en) Anti-human trop-2 antibody having an antitumor activity in vivo
NZ716839A (en) Anti-human trop-2 antibody having an antitumor activity in vivo
NZ623464B2 (en) Anti-human trop-2 antibody having an antitumor activity in vivo