CN103274992A - 一种联合膜分离和柱层析技术制备高纯度1-脱氧野尻霉素的方法 - Google Patents
一种联合膜分离和柱层析技术制备高纯度1-脱氧野尻霉素的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及天然产物有效成分的分离纯化领域，具体涉及到一种联合膜分离和柱层析技术富集1-脱氧野尻霉素的方法。该方法是将蚕、桑原料用超声辅助水提；然后通过离心、微滤膜处理，获得超滤进料液；再经过二次超滤、纳滤、阳离子交换树脂层析和葡聚糖凝胶层析的步骤，获得纯度为80%以上的1-脱氧野尻霉素产品。本发明的方法具有工艺简单、效率高、安全环保的优点。
Description
技术领域
本发明涉及天然产物有效成分的分离纯化领域，具体涉及到一种联合膜分离和柱层析技术富集1-脱氧野尻霉素的方法。
背景技术
1-脱氧野尻霉素（1-deoxynojirimycin，简称DNJ）是一种哌啶类多羟基生物碱。DNJ的结构与葡萄糖相似，能竞争性抑制α-葡萄糖苷酶，影响生物体的糖类代谢和生物加工等过程，具有降血糖、降血脂、病毒、抗肿瘤及抗炎等多种药理学活性。因此，其相关产品的开发研究有着广阔的发展前景。
研究表明，DNJ的天然来源主要有桑叶、桑枝、桑皮和家蚕等蚕桑资源。然而蚕桑资源中物质组成种类多，DNJ的含量少，分离纯化则存在着很大的挑战。目前报道中，水提醇沉法、减压真空蒸发法、吸附法、离子交换法和凝胶过滤法等方法普遍被用于分离纯化桑叶DNJ。CN102101840A的发明专利是通过水溶剂提取，离心过滤，乙醇沉淀，过强酸性阳离子交换柱、大孔树脂和碱性吸附柱等步骤，最终获得DNJ。虽能获得较高纯度的DNJ，但存在着处理工艺复杂，洗脱时间长，混有有机溶剂等缺点。CN101654428A专利用到凝胶过滤法纯化DNJ，每次上样量有限，而且成本相对较高。发明专利CN102718697A中虽然用到了微滤、超滤膜，但只是作为一种预处理方法，主要也还是用到大孔树脂和阴阳离子交换树脂进行分离纯化。相比之下，膜分离技术具有处理条件温和、操作灵活、环境友好、高效和安全等优点，可实现对多组分的溶质和溶剂进行分离、提纯和浓缩。在国内，联合应用微滤、超滤和纳滤多种膜技术和柱层析技术富集DNJ还未见报道。
发明内容
为改进现有技术工艺中存在的不足和缺点，本发明提供一种联合膜分离和柱层析技术富集1-脱氧野尻霉素的方法。
本发明的目的是通过以下技术方法来实现的。
一种联合膜分离和柱层析技术富集1-脱氧野尻霉素的方法，所述的方法为：
（1）超声水提：将干燥的蚕、桑原料粉碎、过筛，获得粗粉末；称取适量粗粉末，按40:1-10:1液料比（mL/g）加入蒸馏水，70℃水浴加热下超声波处理30min，离心过滤，收集上清液，将沉淀按上述步骤重复提取一次，合并两次上清液，即得提取液；
（2）预处理：将步骤（1）所得的提取液，通过离心、微滤膜处理，获得超滤进料液；
（3）二次超滤：将步骤（2）所得超滤进料液第一次超滤膜，超滤过程中，往料液桶中加去离子水，收集第一次超滤透过液；再将透过液用截留分子量更小的超滤膜处理，收集第二次超滤透过液；
（4）纳滤：用纳滤膜处理步骤（3）所得超滤透过液，收集截流液，即得1-脱氧野尻霉素纳滤浓缩液；
（5）阳离子交换树脂层析：将（4）中所得的1-脱氧野尻霉素纳滤浓缩液进行阳离子交换树脂分离，用水洗涤，再用氨水溶液洗脱，收集氨水洗脱液，并将其去氨浓缩，获得1-脱氧野尻霉素粗样品；
（6）葡聚糖凝胶层析：将（5）中阳离子纯化液进一步采用Sephadex LH-20树脂进行纯化，冷冻干燥后获得纯度为80%以上的1-脱氧野尻霉素精样品。
进一步，（1）中所述原料为桑叶、桑枝、桑树皮、桑树根和家蚕。
进一步，（2）中所述微滤膜为0.5-5μm的中空纤维型滤膜或0.45-2.0μm的微孔滤膜。
进一步，（3）中所述两次所用超滤膜均为聚PES或者复合卷式膜，第一次超滤时优选截留分子量为8.0-50kDa的超滤膜，操作压力为0.5-1.2MPa，料液温度为30℃；第二次超滤时优选截留分子量为1.0-2.0kDa的超滤膜，操作压力为0.5-2.7MPa，优选1.2-1.8MPa。
进一步，（4）中所述纳滤膜为卷式有机膜，截留分子量为100-200Da，操作压力为0.5-4.0MPa，优选1.2-2.5MPa。
进一步，（5）中所述阳离子交换树脂为强酸型阳离子交换树脂，每次可上样2-4倍装柱树脂体积的1-脱氧野尻霉素纳滤浓缩液，水洗涤体积为1-2倍柱体积，氨水洗脱体积为4-6倍柱体积。
进一步，（6）中所述葡聚糖凝胶树脂为Sephadex LH-20葡聚糖凝胶树脂，装柱的径高比为1:20-1:40，选用10-50%的甲醇溶液以0.25-0.5mL/min流速进行洗脱，洗脱体积为6-8倍柱体积。
本发明所述方法中测定DNJ含量的方法为FMOC-Cl柱前衍生-高效液相色谱-荧光检测法，具体检测条件：检测器为RF-10AXL荧光检测器，色谱柱为Inertsil ODS-SP C18(4.6mm×250mm,5μm)，流动相为乙腈：0.1%醋酸水溶液（50:50，V/V），柱温25℃，流速1.0mL/min，分析时间25min，激发波长为254nm，发射波长为322nm，进样量为10μL。
与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在以下几点：
（1）本发明所述的方法中膜分离工艺合理，所采用的二次超滤步骤可有效分离蛋白、多糖等大分子杂质，分离选择性好、效率高；
（2）本发明所述的方法所选用的纳滤膜能除去金属离子等小分子杂质，并能快速富集浓缩DNJ有效组分，既能避免了真空浓缩等步骤，又能增大后续柱层析时样品的上样量，更有利于后续的加工；
（3）本发明所述的方法中膜分离工艺全过程均为物理分离，条件温和，且可实现连续化和自动化操作；
（4）本发明所述的方法中层析分离所用的树脂均为可再生、重复使用树脂，所用洗脱溶液为氨水和甲醇，浓缩时易挥发、可回收，安全环保；
（5）本发明所述的方法不是单一地组分膜分离技术和层析技术，而是通过实验探究，有效地联合膜分离和柱层析技术方能得出的最佳工艺和参数，既能实现高效地物理分离和浓缩DNJ，又能实现专一而有效地纯化，获得高纯度的DNJ。
附图说明
图1为本发明方法的工艺流程图；
图2为DNJ对照品标样的HPLC图谱；
图3为实施例1中DNJ纯化品的HPLC图谱。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1
工艺流程如图1，具体步骤如下：
（1）超声水提：将干燥原料粉碎、过筛，获得粗粉末。称取适量粗粉末，按40:1液料比（mL/g）加入蒸馏水，70℃水浴加热下超声波处理30min，离心过滤，收集上清液，将沉淀按上述步骤重复提取一次，合并两次上清液，即得提取液。
（2）预处理：将步骤（1）所得的提取液，通过离心，再经2.0μm的微孔滤膜进行处理，获得超滤进料液。
（3）二次超滤：将步骤（2）所得超滤进料液第一次超滤膜，超滤过程中，往料液桶中加去离子水，收集第一次超滤透过液；再将透过液用截留分子量更小的超滤膜处理，收集第二次超滤透过液。第一次超滤时优选截留分子量为50kDa的超滤膜，操作压力为1.2MPa，料液温度为30℃；第二次超滤时优选截留分子量为2.0kDa的超滤膜，优选1.8MPa。
（4）纳滤：优选截留分子量为200Da的纳滤膜对步骤（3）所得超滤透过液进行处理，优选操作压力为2.5MPa，收集截流液，即得1-脱氧野尻霉素（DNJ）纳滤浓缩液。
（5）阳离子交换树脂层析：选用强酸型阳离子交换树脂对（4）中所得DNJ纳滤浓缩液进行分离，量取2倍柱体积的DNJ纳滤浓缩液进行上样，用1倍柱体积水洗涤，再用6倍柱体积的氨水溶液按0.5mol/L流速进行洗脱，收集氨水洗脱液，并将其去氨浓缩。
（6）葡聚糖凝胶层析：将（5）中阳离子纯化液进一步采用Sephadex LH-20树脂进行纯化，装柱时，控制径高比为1:20，选10%甲醇溶液以0.25mL/min流速进行洗脱，洗脱体积为6倍柱体积。冷冻干燥后获得纯度为81.83%的DNJ精样品（图2为DNJ对照品的HPLC图谱，图3为DNJ精样品的HPLC图谱）。
实施例2
步骤（1）超声水提中，使用液料比为10:1液料比（mL/g），再将步骤（3）中的第一次超滤时优选截留分子量为20kDa的超滤膜，操作压力为0.8MPa，料液温度为30℃；第二次超滤时优选截留分子量为1.0kDa的超滤膜，优选1.2MPa。其他操作同实施例1。最终得到的DNJ精样品纯度为83.56%。
实施例3
步骤（1）超声水提中，使用液料比为20:1液料比（mL/g），再将步骤（3）中的第一次超滤时优选截留分子量为8kDa的超滤膜，操作压力为0.8MPa，料液温度为30℃；第二次超滤时优选截留分子量为1.0kDa的超滤膜，优选1.2MPa；优选截留分子量为150Da的纳滤膜对步骤（3）所得超滤透过液进行处理，优选操作压力为1.2MPa。其他操作同实施例1。最终得到的DNJ精样品纯度为85.24%
实施例4
步骤（5）阳离子交换树脂层析中，量取4倍柱体积的DNJ纳滤浓缩液进行上样，用1倍柱体积水洗涤，再用8倍柱体积的氨水溶液按0.5mol/L流速进行洗脱，收集氨水洗脱液，并将其去氨浓缩，其他操作同实施例1。最终得到的DNJ精样品纯度为84.62%。
实施例5
在步骤（6）葡聚糖凝胶层析中，将装柱时的径高比控制到1:40，选50%甲醇溶液以0.5mL/min流速进行洗脱，洗脱体积为8倍柱体积，其他操作同实施例1。冷冻干燥后获得纯度为87.15%的DNJ精样品。
Claims (7)
1.一种联合膜分离和柱层析技术制备高纯度1-脱氧野尻霉素的方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）超声辅助水提：将干燥的蚕、桑原料粉碎、过筛，获得粗粉末；称取适量粗粉末，按40:1-10:1液料比（mL/g）加入蒸馏水，70℃水浴加热下超声波处理30min，离心过滤，收集上清液，将沉淀按上述步骤重复提取一次，合并两次上清液，即得提取液；
（2）预处理：将步骤（1）所得的提取液，通过离心、微滤膜处理，获得超滤进料液
（3）二次超滤：将步骤（2）所得超滤进料液第一次超滤膜，超滤过程中，往料液桶中加去离子水，收集第一次超滤透过液；再将透过液用截留分子量更小的超滤膜处理，收集第二次超滤透过液；
（4）纳滤：用纳滤膜处理步骤（3）所得超滤透过液，收集截流液，即得1-脱氧野尻霉素纳滤浓缩液；
（5）阳离子交换树脂层析：将（4）中所得的1-脱氧野尻霉素纳滤浓缩液进行阳离子交换树脂分离，用水洗涤，再用氨水溶液洗脱，收集氨水洗脱液，并将其去氨浓缩，获得1-脱氧野尻霉素粗样品；
（6）葡聚糖凝胶层析：将（5）中阳离子纯化液进一步采用Sephadex LH-20树脂进行纯化，冷冻干燥后获得纯度为80%以上的1-脱氧野尻霉素产品。
2.根据权限要求1的一种联合膜分离和柱层析技术富集1-脱氧野尻霉素的方法，其特征在于所述步骤（1）中原料为桑叶、桑枝、桑树皮、桑树根和家蚕。
3.根据权限要求1的一种联合膜分离和柱层析技术富集1-脱氧野尻霉素的方法，其特征在于所述步骤（2）中微滤膜为0.5-5μm的中空纤维型滤膜或0.45-2.0μm的微孔滤膜。
4.根据权限要求1的一种联合膜分离和柱层析技术富集1-脱氧野尻霉素的方法，其特征在于所述步骤（3）中2次所用超滤膜均为聚PES或者复合卷式膜，第一次超滤时优选截留分子量为8.0-50kDa的超滤膜，操作压力为0.5-1.2MPa，料液温度为25-40℃，加入的去离子水体积为1-2倍进料液体积；第二次超滤时优选截留分子量为1.0-2.0kDa的超滤膜，操作压力为0.5-2.7MPa，优选1.2-1.8MPa。
5.根据权限要求1的一种联合膜分离和柱层析技术富集1-脱氧野尻霉素的方法，其特征在于所述步骤（4）中纳滤膜为卷式有机膜，截留分子量为100-200Da，操作压力为0.5-4.0MPa，优选1.2-2.5MPa。
6.根据权限要求1的一种联合膜分离和柱层析技术富集1-脱氧野尻霉素的方法，其特征在于所述步骤（5）中阳离子交换树脂为强酸型阳离子交换树脂，每次可上样2-4倍装柱树脂体积的DNJ纳滤浓缩液，水洗涤体积为1-2倍柱体积，氨水洗脱体积为4-6倍柱体积。
7.根据权限要求1的一种联合膜分离和柱层析技术富集1-脱氧野尻霉素的方法，其特征在于所述步骤（6）中葡聚糖凝胶树脂为Sephadex LH-20葡聚糖凝胶树脂，装柱的径高比为1:20-1:40，选用10-50%的甲醇溶液以0.25-0.5mL/min流速进行洗脱，洗脱体积为6-8倍柱体积。
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