CN103221553A

CN103221553A - 诊断***癌的方法和试剂盒

Info

Publication number: CN103221553A
Application number: CN2011800443235A
Authority: CN
Inventors: 安德列亚斯·多利; 玛丽娜·里加图雷西纳; 胡安·莫罗特罗布莱斯; 米格尔·阿巴尔波萨达; 豪梅·雷文托斯普伊赫哈内尔
Original assignee: Fundacio Hospital Universitari Vall dHebron Institut de Recerca FIR VHIR
Current assignee: Fundacio Hospital Universitari Vall dHebron Institut de Recerca FIR VHIR
Priority date: 2010-07-14
Filing date: 2011-07-14
Publication date: 2013-07-24
Also published as: TW201217786A; EP2407555A1; BR112013000869A2; CA2805353A1; MX2013000502A; AU2011278285A1; EP2593562A1; US20130178393A1; WO2012007545A1; RU2013106420A; JP2013531997A

Abstract

本发明涉及用于诊断受试者体内***癌（PCa）的方法和试剂盒，其根据检测选自PCA3、PSMA和PSGR的组的至少一个基因表达水平的变化来评估或监测罹患PCa的受试者对疗法的响应或监测***癌PCa的进展。本发明还涉及用于评估受试者是否必须接受***活检的方法，所述受试者具有4ng/mL至10ng/mL的血清PSA浓度。

Description

诊断***癌的方法和试剂盒

技术领域

本发明属于诊断领域，更具体地，属于通过使用基因组合的方式诊断***癌的领域，其中该基因在***癌细胞中的表达相较于它们在正常（即非癌症）***细胞中的表达是过度表达的。

技术背景

在西方男性群体中，***癌（PCa）已经转变成最普遍的一类癌症，相比其他任何癌症（除肺癌外），它导致了更多的男性患者死亡。据估计，男性在一生中罹患这类癌症的风险为1/6，因转移性PCa而导致死亡的风险为1/36。尽管在上世纪80年代末，***特异性抗原（PSA）检验的引进使得PCa的检测获得了大幅度提高，但是死亡率并没有显著下降（Jemal,A.,等，(2007).Cancer statistics,2007.CA:a cancer journal forclinicians,2009,June9,57,43-66）。这主要有两个原因：50岁以上男性群体大范围接受的遗漏、非侵入性的早期诊断方法，和只有疾病仍限于***内的情况下才可以通过根治外科手术治愈的这一事实。

因为在早期阶段没有症状出现，与70%以上的女性群体相相比，只有不到30%的男性接受必要的预防性检查。目前，这些检查由三部分诊断组成：（i）患者血液内PSA的定量，（ii）直肠指检（DRE）检查，和最后（iii）通过大概10次经直肠超声引导的穿刺活检（TRUS）的一套诊断方法进行的确定，该经直肠超声引导的穿刺活检在具有异常DRE、升高的PSA（>4.0ng/mL）、具有实际倾向>2.5ng/mL或PSA速率（PSA变化率）>0.4ng至0.75ng/mL/年的男性中施行。所述检查在西半球里构成了用于PCa筛选治疗的黄金标准。然而，PSA和DRE缺乏明显的特异性，而且活检缺乏理想的敏感度。

PSA作为肿瘤标记的限制之一是其缺乏特异性，这导致高的阴性活检率。在PSA的灰色区域内（4-10ng/mL），在患有早期PCa和***良性症状如良性增生（BPH）和无症状慢性***炎的男性患者之间，血清PSA值有大量重叠（Loeb,S.等，(2009).Exclusion of inflammation in thedifferential diagnosis of an elevated prostate-specific antigen(PSA).UrolOncol27,64-66;Pannek,J.,和Partin,A.W.(1997).Prostate-specificantigen:what's new in1997.Oncology(Williston Park)11,1273-1278;discussion1279-1282）。

已经作出多种尝试以克服PSA筛选的限制。这些尝试包括使用年龄校正的PSA截止点、游离PSA、PSA密度、PSA速率、PSA斜度和PSA倍增时间。所有这些方法都已经被提出以作为改善“临床重要的”PCa实例检测的方式。然而，没有证据表明，这些检测策略的任何一种能改善健康结果。

作为目前筛选参数的结果，欧洲每年进行的大概390,000活检的约2/3都是不必要的（Catalona,WJ.等，Measurement of prostate-specificantigen in serum as a screening test for prostate cancer.N Engl J Med324:1156-61,(1991);Makinen,T.等，Second round results of the Finnishpopulation-based PCa screening trial.Clin Cancer Res10:2231-6(2004)）。活检的假阳性率大约为零，但是第一次活检中的假阴性率可能在12%至30%之间浮动。因此，很多具有阴性活检结果的男性经受重复活检以排除PCa。

需要更准确的检验以帮助鉴定哪些患者具有罹患PCa的高风险，以及对哪些患者实施强制性重复***活检。因此，迫切需要使用非侵入性程序在早期阶段检测出PCa。

已经鉴定出大范围的有希望的PCa生物标记，其不仅具有***特异性，而且还在***肿瘤中过度表达，其已被鉴定，包括GSTP1的CpG超甲基化、TMPRSS2:ERG基因融合和RNA生物标记PCA3（Marks,L.S.,和Bostwick,D.G.(2008).Prostate Cancer Specificity of PCA3Gene Testing:Examples from Clinical Practice.Rev Urol10,175-181;Saramaki等(2008).TMPRSS2:ERG fusion identifies a subgroup of prostate cancers with afavorable prognosis.Clin Cancer Res14,3395-3400;Vener等(2008).Development of a multiplexed urine assay for prostate cancer diagnosis.ClinChem54,874-882）。因为在具有PCa的男性的尿液中可以检测出***细胞，基于尿液的诊断检验具有非侵入性或最小侵入性的优势，从而将被更大范围的男性群体接受。尽管已经在大型筛选程序中证明了对PCA3表达和GSTP1甲基化作用的基于尿液的检验，但是只有两个基于诊断特征的研究考虑到癌症发展的异质性，一个使用RNA而另一个使用基因组DNA（Laxman等(2008).Cancer Res68,645-649）。

WO03/009814公开了评估患者是否罹患PCa的方法，其包含将选自患者样本中的一套标记的标记表达水平与对照的非PCa样本中所述标记的正常表达水平作比较，其中在患者样本中所述标记的表达水平显著高于正常水平表明患者罹患PCa。所述一套标记包括PCA3((M381)、PSMA(FOLH1)和PSGR(M311)标记；然而，WO03/009814没有公开所述PCA3、PSMA和PSGR标记的特异性组合作为特异性三基因组用于PCa的早期检测。

DE102006032394公开了用于诊断PCa的方法，其包含比较选自患者样本中的标记ZIP/CREB3L4、AMACR、DD3/PCA3、D-GPCR、EZH2、PCGEM1、PDEF、***特异性蛋白（prostein）、PSGR/OR51E2、PSMA/FOLH1、TMPRSS2和TRPM8的组的至少两个标记的表达。然而，通过逻辑回归分析进行数据分析。此外，没有一个DE102006032394中提到的优选的标记组合由PCA3、PSMA和PSGR标记的特异性组合组成。

另外，WO2008/121132公开了评估患者是否罹患PCa的方法，其包含将选自患者样本中一套标记的一个标记的表达水平和参考值作比较。所述一套标记包括PCA3、PSMA和PSGR标记；然而，WO2008/121132没有公开所述PCA3、PSMA和PSGR标记的特异性组合作为特异性三基因组用于PCa的早期检测。

尽管事实上与DRE和TRUS结合的PSA血清测量在西半球中构成了PCa筛选治疗的黄金标准，PSA和DRE明显缺乏特异性，而且活检缺乏理想的敏感度（12%至30%假阴性）。

用于PCa诊断的最普遍的标记之一是在尿液样中确定PCA3。VanGils等（van Gils MP,等Clin Cancer Res13:939-43(2007)）报道了534个患者（血清PSA在3ng/mL和15ng/mL之间）中PCA3敏感度为65%，特异性为66%（AUC0.66），其包括具有癌阳性活检的174个男性（33%）。Hessels等（Hessels D,等，Eur Urol44:8-15;discussion15-6(2003)）观察到在108个患者的群体研究中敏感度为67%，特异性为83%（AUC0.72）。Marks等（Marks LS,等;Urology69:532-5(2007)）观察到在重复活检后具有27%癌症表征的233个患者（PSA≥2.5ng/L）的群体研究中敏感度为58%，特异性为72%（AUC0.68）。Groskopf等（Groskopf J,等;Clin Chem52:1089-95(2006)）观察到在70个患者的群体研究中敏感度为69%，特异性为79%（AUC0.75）。Haese等（HaeseA,等;Eur Urol54:1081-8(2008)）报道了在463个患者研究中截止为35时PCA3敏感度为47%，特异性为72%（AUC0.66），该研究用于鉴别具有阳性重复活检高风险性的患者。

目前，活检策略可能遗漏了异质性肿瘤病灶，而基于尿液的试验将具有很大优势，因为可以将来自整个***的多个病灶细胞释放入尿液中并在尿液中收集（Laxman B,等，Neoplasia2006;8:885-8）。然而，如果在尿样中分析该标记，在***按摩（PM）后获得的排出尿液样本的沉淀物上进行的定量聚合酶链反应（qPCR）检测可能能够在占主导地位的非恶性细胞环境中检测出少量恶性细胞。此外，单个标记不一定能反映出PCa的多因子、多病灶及异质性质，多种生物标记组合将相对于单个标记明确地改进性能（Etzioni R,等Biostatistics2003;4:523-38）。将临床和人口统计资料数据与多个标记结合使用会辅助预测处于罹患PCa风险的患者并评估他们的预测。为此，敏感度>95%的单个标记，其特异性将大幅下降。例如，对于敏感度为96%的PCA3，发现其特异性只有14%（Marks LS等，Rev.Urol.2008;10:175-81）。

另外，尽管在这个主题上进行了研究，目前从临床观点看只有很少的肿瘤标记可用于PCa诊断。此外，欧洲每年进行数量非常庞大的不必要的活检（约260,000）。因此，在本领域中需要能够解决上述任何提到的缺陷的诊断PCa的方法。有利地，所述方法应当能使用非侵入性程序在早期阶段检测出PCa。因此，需要额外的生物标记以补充或潜在地替代目前使用的诊断技术。

发明简述

已经鉴定出尿转录物的新型多样组，其在PCa检测方面优于单个PCA3转录物和单个PSA。为了确定准备进行***活检的154个患者的推定PCa生物标记PCA3、PSGR和PSMA的过度表达，发明人已经检验了***按摩后的尿液沉淀。该组合标记模型的曲线下面积（AUC）为0.80。通过***活检的PCa检出率为37%（57/154）。随后，发明人在77个男性（35%罹患PCa）的目标子集中具体地测验了其临床有效性，这些男性的血清PSA在4ng/mL至10ng/mL之间并且在之前未接受活检（特殊目的组）。PSA密度（PSAD）也作为典型的临床工具包括在这项分析中以提高PSA特异性。通过使用多重模型，在所述特殊目的组内的男性中该曲线下面积（AUC）为0.89，而其在综合组中为0.80。具有96%的敏感度和62%的特异性（综合组为40%）。使用所述三基因组合结合PSAD将能够节省42%（综合组为26%）的不必要施行的活检。因此，发明人示出了一种敏感的方法以在尿液中检测PCa，其可以用于提高PSA的特异性，避免了大量不必要的活检。这种新型方法提高了PSA的诊断效率，而且在PSA的灰色区域特别有用。

因此，本发明基于基因组合的鉴定，所述基因的差异性表达与PCa相关。进一步使用这种模型以评估是否应该施行活检。在各方面，本发明提供了评估PCa存在或不存在（例如诊断或预测）的方法，以及评估或监测患有PCa的受试者对疗法响应的方法，以及监测受试者体内PCa进展的方法，所述方法基于来自受试者的样本，并确定与PCa相关的3个特异性基因（PCA3、PSMA和PSGR）量的定量测定。

因此，第一方面，本发明涉及在理想敏感度下用于诊断受试者体内***癌的方法，其包含

（i）确定从所述受试者中分离的生物流体样本中的PCA3、PSMA和PSGR基因的表达水平，其中所述生物流体选自由尿液、***分泌物、***和***按摩后的尿液构成的组中，以及

（ii）将所述PCA3、PSMA和PSGR基因的表达水平与每个所述基因的预定的截止值作比较，其中每个基因的所述预定的截止值对应于所述基因的表达水平，其与ROC（接受者操作特征）曲线中在所述理想敏感度下的最高特异性相关，该ROC曲线根据处于罹患PCa风险的患者群体中确定的所述PCA3、PSMA和PSGR基因的表达水平来计算，

其中，在所述样本中至少一个所述基因的表达水平相对于所述基因的所述预定的截止值的明显升高表明在所述理想敏感度下该受试者罹患PCa。

另一方面，本发明涉及用于评估或监测患有PCa的受试者对疗法响应的方法，其包含比较

（i）确定在施用所述疗法前获得的从所述受试者中分离的生物流体样本中的PCA3、PSMA和PSGR基因的表达水平，其中所述生物流体选自由尿液、***分泌物、***和***按摩后的尿液组成的组，以及

（ii）确定在施用所述疗法后获得的从所述受试者中分离的生物流体样本中的PCA3、PSMA和PSGR基因的表达水平，其中所述生物流体选自由尿液、***分泌物、***和***按摩后的尿液组成的组，以及

（iii）将在施用所述疗法前后获得的所述PCA3、PSMA和PSGR基因的表达水平与每个所述基因的预定的截止值作比较，其中每个基因的所述预定的截止值对应所述基因的表达水平，其与ROC（接受者操作特征）曲线中在理想敏感度下的最高特异性相关，该曲线根据处于罹患PCa风险的患者群体中确定的PCA3、PSMA和PSGR基因的表达水平来计算，

其中，施用所述疗法后，在受试者样本中至少一个所述基因的表达水平相对于所述基因的所述预定的截止值显著下降或没有变化，其表明施用的该疗法有效

或者其中，施用所述疗法后，在受试者样本中至少一个所述基因的表达水平相对于所述基因的所述预定的截止值显著升高，其表明施用的该疗法无效。

还一方面，本发明涉及用于监测受试者体内PCa进展的方法，其包含

（i）确定在第一时间段从所述受试者身上获得的生物流体样本中的PCA3、PSMA和PSGR基因的表达水平，其中所述生物流体选自由尿液、***分泌物、***和***按摩后的尿液组成的组，以及

（ii）确定在第二时间段相同受试者的生物流体样本中的所述PCA3、PSMA和PSGR基因的表达水平，其中所述第二时间段晚于所述第一时间段，而且其中所述生物流体选自由尿液、***分泌物、***和***按摩后的尿液组成的组，以及

（iii）将在第一和第二时间段获得的所述PCA3、PSMA和PSGR基因的表达水平与每个所述基因的预定的截止值作比较，其中每个基因的所述预定的截止值对应所述基因的表达水平，其与ROC（接受者操作特征）曲线中在所述理想敏感度下的最高特异性相关，该曲线根据处于罹患PCa风险的患者群体中确定的PCA3、PSMA和PSGR基因的表达水平来计算，

其中，在第二时间段，在受试者样本中至少一个所述基因的表达水平相对于在第一时间段的所述表达水平显著下降或没有变化，其表明受试者体内的阳性进展

或者其中，在第二时间段，在受试者样本中至少一个所述基因的表达水平相对于在第一时间段的所述表达水平显著升高，其表明受试者体内的阴性进展。

另一方面，本发明涉及用于评估受试者是否必须接受***活检的方法，其包含

（i）确定从所述受试者中分离的生物流体样本中的PCA3、PSMA和PSGR基因的表达水平，其中所述生物流体选自由尿液、***分泌物、***和***按摩后的尿液组成的组，以及

（ii）将所述PCA3、PSMA和PSGR基因的表达水平与每个所述基因的预定的截止值作比较，其中每个基因的所述预定的截止值对应所述基因的表达水平，其与ROC（接受者操作特征）曲线中在诉述理想敏感度下的最高特异性相关，该曲线根据处于罹患PCa风险的患者群体中确定的所述PCA3、PSMA和PSGR基因的表达水平来计算，

其中，在所述样本中至少一个所述基因的表达水平相对于所述基因的所述预定的截止值显著升高，其表明该受试者是***活检的候选者。

另一方面，本发明涉及包含第一组分和可选的第二组分的试剂盒，其中该第一组分是一套试剂，其由以下组成

（i）能够确定基因PCA3的表达水平的试剂；

（ii）能够确定基因PSMA的表达水平的试剂；

（iii）能够确定基因PSGR的表达水平的试剂；

其中，第二组分由能够确定一个或多个***持家基因表达水平的一个或多个试剂组成。

在另一方面，本发明涉及根据权利要求16所述的试剂盒在Pca诊断中的用途，其用于评估或监测患有PCa的受试者对疗法的响应或用于监测受试者体内的PCa进展。

附图说明

图1：基于尿液的PCa生物标记的特征。图1.1示出了在4ng/mL至10ng/mL的血清PSA中并在之前未接受活检（特殊临床目的的患者组）的情况下，患有PCa的男性对比患有良性症状的男性的体内PCA3(A)、PSGR(B)、PSMA(C)和PSAD(D)的相对水平以及患有PCa的男性对比患有良性症状的男性的体内PCA3(E)、PSGR(F)、PSMA(G)和PSAD(H)的相对水平。

图2：对在活检中检测出患有***癌的男性和在活检中没有检测出癌症的男性体内的组合生物标记的接受者操作特征（ROC）曲线。PCA3的ROC曲线（×）、PSGR的ROC曲线（·）和PSMA的ROC曲线（

），以及PSAD（×）组合的3基因ROC（◆）。组合的3基因+PSAD ROC曲线（□）。图中示出了完整的ROC曲线和对应于90%至100%敏感度的区域。

图3：在活检中检测出***癌的男性和在活检中未检测出癌症的男性中逻辑回归模型与mROC模型3M（PSMA对PSGR对PCA3）的比较。

图4：具有4ng/mL至10ng/mL的PSA并在之前未接受活检的男性中，比较单个标记和组合标记（PCA3、PSGR、PSMA+PSAD）的接受者操作特征（ROC）曲线。PCA3的ROC曲线（×）、PSGR的ROC曲线（·）和PSMA的ROC曲线（），以及PSAD（×）组合的3基因ROC（◆）。组合的3基因+PSAD ROC曲线（□）。图中示出了完整的ROC曲线和对应于90%至100%敏感度的区域。

图5：将研究中所有的患者与特殊目的的临床风险组（PSA在4ng/mL至10ng/mL范围内并在之前未接受活检）作比较可以节省的活检。活检节省（%）=（真阴性+假阴性）/所有患者。敏感度=真阳性/（真阳性+假阴性）。

发明详述

本发明的诊断方法

本发明的作者已经鉴定了特定基因的组合，其在诊断出患有PCa的患者肿瘤样本中相对于无PCa的参考样本进行差异性表达，所述参考样本在组合的ROC分析中分析时能够获得组合的标记，其能够以改进的性能进行PCa检测。比如，如本发明的图2所示，该组合的ROC分析能够通过0.80的AUC检测PCa，其与单个标记的AUC相比有所改进（PCA3为0.61，PSGR为0.64，PSMA为0.63）。对每个生物标记使用一个检测阈值（截止）；然后，如果至少一个分数高于其检测阈值，则将患者宣布为阳性。在阈值（截止）范围上计算敏感度和特异性值。

（ii）将所述PCA3、PSMA和PSGR基因的表达水平与每个所述基因的预定的截止值作比较，其中每个基因的所述预定的截止值对应所述基因的表达水平，其与ROC（接受者操作特征）曲线中在所述理想敏感度下的最高特异性相关，该曲线根据在处于罹患PCa风险的患者群体中确定的PCA3、PSMA和PSGR基因的表达水平来计算，

其中，在所述生物流体样本中至少一个所述基因的表达水平相对于所述基因的所述预定的截止值显著升高，其表明在所述理想敏感度下该受试者罹患PCa。

本发明涉及在理想敏感度下用于诊断受试者体内***癌的方法，其包含

（i）提供来自所述受试者的生物流体，其中所述生物流体选自由尿液、***分泌物、***和***按摩后的尿液组成的组，

（ii）确定在所述生物流体样本中的PCA3、PSMA和PSGR基因的表达水平，以及

（iii）将所述PCA3、PSMA和PSGR基因的表达水平与每个所述基因的预定的截止值作比较，其中每个基因的所述预定的截止值对应所述基因的表达水平，其与ROC（接受者操作特征）曲线中在理想敏感度下的最高特异性相关，该曲线根据在处于罹患PCa风险的患者群体中确定的所述PCA3、PSMA和PSGR基因的表达水平来计算，

如本文所使用的，术语“用于诊断的方法”涉及实质上地可以由前述步骤组成或可以包括其他步骤的方法。然而，必须理解的是，该方法在优选的实施方案中是在体外实施的方法，即其不在人类或动物体内实施。如本文所使用的，诊断涉及评估受试者患病的可能性。本领域技术人员将会理解的是，尽管其是优选地，这种评估正常情况下可能不是对100%的受诊断的患者都是正确的。然而，该术语要求可以将受试者的统计显著的部分鉴定为患病或具有患病倾向。本领域技术人员可以通过使用几种众所周知的统计评估工具立刻确定某部分是否是统计上显著的，例如，确定置信区间、确定p值、Student t检验、Mann-Whitney检验等等。详细内容参见Dowdy和Wearden,Statistics for Research,John Wiley&Sons,New York1983。优选的置信区间是至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%，优选地至少99%。P值优选的是0.2、0.1、0.05，优选地0.01。本发明用于诊断的方法能够评估受试者是否患有PCa。

术语“***癌”是指任何一种***的癌症，其中***细胞突变并开始不受控制的繁殖，其与癌症阶段无关。通过分析临床和组织病理学信息来评估***癌在患者体内的进展程度。癌症阶段根据肿瘤尺寸（T）、是否有***牵连（N）、转移的存在（M）和肿瘤等级（G）来分类。T1类肿瘤限于***，因为太小而不能通过直肠指诊检查出来。T1进一步包括T1a（在组织样本中癌细胞低于5%）和T1b（高于5%）子部分。T1c表明该患者具有升高的***特异性抗原（PSA；参见下文的定义）。如果肿瘤足够大而能够在直肠指诊中检查出来，则将其归类为T2。T2a是指只有***的一边（左边或右边）有肿瘤；T2b是指两边都有肿瘤。通常将T2称为“局部癌症”。如果该癌症是T3，其已经扩散到临近***的***（T3a）或精囊（T3b）的连接组织。T4表明癌症扩散到***旁边的组织，例如膀胱***、直肠或骨盆壁。***癌还可能扩散到骨盆的局部***内，将其评为***癌的N1阶段。将T3、T4和N1这些阶段统称为“局部晚期”或区域癌症。如果这种癌症已经扩散到远的地方，如骨骼，则将其称为“转移”或处于M1阶段。将已经扩散到远处***的***癌归类为M1a，而将已经扩散到骨骼的***癌归类为M1b，并将已经扩散到器官如肝脏和大脑等的***癌评估归类为M1c。如果不治疗，***癌几乎全部转移到骨骼中。

如本文所使用的，“受试者”是指任何一种归类为哺乳动物的动物，其包括但不限于家畜和农畜、灵长类动物和人类，例如人、非人类灵长类动物、牛、马、猪、绵羊、山羊、狗、猫或啮齿类动物。优选地，该受试者为任何年龄或人种的男人或女人。

在优选的实施方案中，实施确定的受试者显示出高于4ng/mL的PSA水平。在还更优选的实施方案中，对显示出低于10ng/mL、且更优选地在4ng/mL至10ng/mL之间的PSA水平的受试者实施本发明的方法。在另一实施方案中，对还未接受***活检的受试者实施本发明的方法。

在优选的实施方案中，受用本发明的方法的受试者是指患有***恶性肿瘤前病变、如单独的高等级***上皮内瘤形成的患者。

如本文所使用的，术语“高等级***上皮内瘤形成”或“HG-PIN”是指与***癌的高风险相关的症状，而且已知是发育异常、管内发育异常、大腺泡非典型增生、非典型原发性增生、伴有恶性变的增生、标记的非典型和管-腺泡发育不良的症状。HG-PIN的特征可能在于高的核/质比、着色过度、粗糙的颗粒状染色质、缺少核仁、分离的细胞以及细胞的和核多形性。用于诊断PIN的方法在本领域中已知，其包括但不限于穿刺活检和埃兹蛋白表达的测定，该蛋白为细胞骨架连接蛋白，其对控制癌细胞的增长和转移能力有积极作用（参见Pang等，Urology.2004Mar;63(3):609-12），美国专利号6,054,320提供了用于鉴别PIN的试剂盒。HG-PIN包括分离的及多病灶的HG-PIN。

因此，诊断出HG-PIN的患者是本发明的方法的特别合适的候选者，因为他们由于HG-PIN的恶性转化具有发生***癌的高风险。

如本文所使用的，术语“敏感度”是指当样本为阳性时，本发明的诊断方法得出阳性结果的概率。敏感度通过由真阳性结果数除以真阳性和假阴性的总数来计算。敏感度实质上是一种标准，衡量一种鉴别患有疾病的患者的方法的准确度，所述疾病为***癌。在本发明的方法中，可以选择截止值以使得在受验患者群体的至少60%、或受验患者群体的至少65%、70%、75%或80%中，诊断个体的敏感度为至少大约70%，而且可以是，例如至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%，或至少100%。

在第一步，本发明的诊断方法包含从将受诊断的受试者中分离的样本中的PCA3、PSMA和PSGR基因的表达水平的确定。

根据本发明的方法所使用的，术语“一个或多个基因的表达水平”涉及一个或多个基因表达的程度。典型地，通过测定RNA表达水平可以确定给定基因的表达水平，其中术语“RNA表达水平”是指转化成转录的RNA、初始未拼接的RNA转录物或成熟mRNA的DNA基因序列信息的确定水平。

可以通过测定该基因的全部RNA或子序列的水平来监测RNA表达。实际上，可以在本发明的框架下采用任何一种用于检测基因的存在并定量基因水平的方法，以检测和定量由生物标记基因编码的mRNA水平。通过非限制性说明，在特殊实施方案中，为了测定样本中特殊RNA的量，可以使用本领域技术人员已知的方法来提取并定量来自样本的关于生物标记基因（PSGR）的转录RNA。请参见WO2008/121132和WO98/24935，其关于RNA分析方案的内容通过参考的方式并入本文。简言之，从样本中，例如任意组织、体液、细胞（例如循环肿瘤细胞）等中提取RNA。例如，可以在合适的溶液中溶解细胞并洗脱RNA。在RNA提取之后，可以通过使用逆转录酶进行第一链合成。然后，可以进行基因扩增，更具体地是定量PCR试验，相对于内部标记例如18S rRNA校准目的基因，尽管也可以使用其他内源性标记，如28S-25S rRNA和5S rRNA。多次重复测试样本，例如3次重复。在本发明的实施方案中，使用扩增、报道试剂和如由Applied Biosystems商业化供应的仪器施行qPCR。给定靶转录物的扩增的限定效率，可检测的从扩增的靶模板发出信号的该点（例如循环数或ct）与测定样本中的特异性信息转录物直接相关。相似地，当其他可计量的信号如荧光、酶活性、每分钟分解、吸光度等与已知靶模板浓度相关（即参考标准曲线）或通过标准化成具有有限变异性标准时，可以将其用于定量未知样本内的靶模板的数量。

尽管并不限于扩增方法，定量基因表达技术可以使用靶转录物的扩增。可选地，或者与该靶转录物的扩增结合，还可以使用对内部标记的报道信号的定量，该内部标记由扩增产物的指数增长产生。可以通过等温基因扩增策略或通过使用热循环如PCR进行的基因扩增来完成该靶模板的扩增。

通过使用信使特异性引物或随机引物扩增特异性RNA。根据从公共数据库中获得的数据可以合成该特异性引物（例如，Unigene,NationalCenter for Biotechnology Information,National Library of Medicine,Bethesda,MD），这些数据包括来自从人类和其他动物身上获得的基因组和cDNA文库的信息。选择引物以优先从特异性RNA中扩增，该特异性RNA从检验或指示样本中获得（参见，例如RT PCR,Chapter15in RNAMethodologies.A Laboratory Guide for Isolation and Characterization.2ndedition,1998,Robert E.Farrell,Jr.,Ed.,Academic Press;或Chapter22pp.143-151,RNA Isolation and Characterization Protocols.Methods inMolecular Biology,Volume86,1998,R.Rapley和D.L.Manning Eds.,Human Press,或Chapter14Statistical refinement of primer designparameters;或Chapter5,pp.55-72,PCR Applications:protocols forfunctional genomics,M.A.Innis,D.H.Gelfand和J.J.Sninsky,Eds.,1999,Academic Press）。在等温条件下进行扩增或使用热循环仪扩增（例如，从Applied Biosystems获得的ABI9600或9700或7900）。通过使用荧光标记检测寡核苷酸探针来检测扩增的核酸（参见，例如，Taqman^TMPCR Reagent Kit,Protocol,part number402823,Revision A,1996,AppliedBiosystems），其根据针对扩增引物描述过的公知的数据库中鉴定并合成。

例如，但不限于，通过使用合适的检测***，例如ABI

7900序列检测***（Applied Biosystems）检测并定量扩增的cDNA。该检验样本中含有的特异性RNA的量可以与观察到的荧光相对量相关（参见，例如，Advances in Quantitative PCR Technology:5'Nuclease Assays,Y.S.lie and CJ.Petropolus,Current Opinion in Biotechnology,1998,9:43-48,或Rapid Thermal Cycling and PCR Kinetics,pp.211-229,chapter14in PCRapplications:protocols for functional genomics,M.A.Innis,D.H.GelfandandXJ.Sninsky,Eds.,1999;Academic Press）。

在特定实施方案中，使用定量PCR（qPCR）检测并定量PSGR、PCA3和PSMA基因的表达水平。可以从例如，Sambrook等，2001“Molecular cloning:to Laboratory Manual”,3^rd ed.,Cold Spring HarborLaboratory Press,N.Y.,Vol.1-3中找到定量基因表达水平的常见方法。

术语“PCA3”是指已知为***癌抗原3（在NCBI中的登录号为AF103907或NR_015342）的基因，其对应位于染色体9的非蛋白编码基因，该基因编码***特异性非编码RNA，该RNA在95%以上的原发性PCa样本和PCa转移中高度过度表达。

如本文所使用的，术语“PSMA”是指已知为***特异性膜抗原的基因，也称为FOLH1（叶酸水解酶***特异性膜抗原1），其编码至少2个转录变体（在NCBI中鉴定为NM_004476和NM_001014986），所述变体编码整体非剪切2型膜蛋白，其在***上皮细胞上高度并特异性表达，并在PCa以及其他固体肿瘤的新血管***中大力上调（Elsasser-Beile,U.et al..Curr Drug Targets10:118-25(2009)）。

如本文所使用的，术语“PSGR”是指***特异性G蛋白偶联受体，也称为OR51E2（嗅觉受体，51家族，E亚族，成员2，NM_030774），其为G蛋白偶联OR家族的一员，该家族具有高***组织特异性和肿瘤相关过度表达。

为确定起见，用于实践本发明的多核苷酸包括但不限于突变体、同系物、亚型、等位基因等等。应该理解的是，只要变体基因与自然基因相似，都显示出在它们的表达水平与PCa的存在之间的相关性，那就不需要本发明的序列编码PCA3、PSMA和PSGR基因的功能性变体。如本文所使用的，术语变体是指PSGR多核苷酸缺失、***或替代一个或多个核苷酸而得到的多核苷酸。该PSGR的变体包括但不限于显示出与PSGR mRNA至少70%、有利地至少75%、典型地至少80%、优选地至少85%，更优选地至少90%，还更优选地至少95%、97%、98%或99%的同一度的多核苷酸。可以通过常见方法，例如，通过本领域内已知的标准序列比对算法，比如BLAST确定两个氨基酸序列之间的同一度（Altschul S.F.等Basic local alignment search tool.J Mol Biol.1990Oct5;215(3):403-10）。

在本发明中，术语“样本”或“生物样本”是指从受试者身上分离的生物材料。如本文所使用的，术语“生物流体”是指提供来自***组织或细胞的核酸源的样本，其包括，例如***细胞、***组织、***液、尿液、***的***、***等。实际上，由于可以在PCa男性患者的尿液中检测出***细胞，推荐使用流体，如尿液。在特定的实施方案中，根据本发明用于确定生物标记的样本优选地是***按摩（例如DRE）后或***活检后（活检后）或通过自发排尿液得到的尿液样。优选地，根据本发明的方法包含***按摩（例如DRE）后得到的尿样的使用。该样本看起来是在男性患者中广泛接受的微创技术和为了作出正确诊断而获得足够细胞的可能性之间最好的折中。在另一实施方案中，根据本发明用于确定生物标记的样本是通过表达的***分泌物或***切除术得到的样本（作为阴性对照使用）。因为排出尿液样本的第一部分含有最高浓度的***和尿道分泌物（Iwakiri J,等J Urol149:783-6(1993)），选择***按摩后收集的排出尿液样本。此外，这种类型的样本比***或表达的***分泌物更容易从男性患者身上收集。

第二步，本发明的方法包含将所述PCA3、PSMA和PSGR基因的表达水平与每个所述基因预定的截止值作比较，其中每个基因的所述预定的截止值对应所述基因的表达水平，其与ROC（接受者操作特征）曲线中在理想敏感度下的最高特异性相关，该曲线根据处于罹患PCa风险的患者群体中确定的PCA3、PSMA和PSGR基因的表达水平来计算。

术语“截止值”，当指代PCA3、PSMA和PSGR基因的表达水平时，是指参考表达水平，其表明如果患者的表达水平高于上面的所述截止或参考水平，具有给定敏感度的受试者可能罹患PCa。典型地，使用接受者操作特征曲线（ROC曲线）来计算截止值。

实际上，典型地通过绘制在“正常”（即明显健康的）和“患病”群体中变量值对相对频率来计算接受者操作特征曲线（ROC曲线）。对任何特殊标记或标记组（即所述PCA3、PSMA和PSGR基因的表达水平），对患病和不患病受试者的标记水平分布可能会重叠。在这种情况下，检验无法100%准确地完全把正常受试者与患病受试者区分开，而且该重叠面积表明该检验不能把正常受试者与患病受试者区分开的位置。选择阈值或截止值，在其上（或在其下，这取决于标记如何随疾病改变）则认为该检验是不正常的，而在其下则认为该检验是正常的。ROC曲线下面积用于度量感知的测量值能够对症状进行正确鉴定的概率。甚至当检验结果未必给出精确数值时，也可以使用ROC曲线。只要一个人能够排列结果，其就能够作出ROC曲线。例如，可以根据等级（例如，l=低，2=正常，3=高）排列“疾病”样本的检验结果。该排列可以与“正常”群体中的结果相关，并作出ROC曲线。这些方法在本领域内众所周知。参见，例如Hartley等1982.Radiology143:29-36。优选地，选择阈值以提供大于约0.5，更优选地大于约0.7，还更优选地大于约0.8，甚至更优选地大于约0.85，最优选地大于约0.9的ROC曲线面积。在上下文中，术语“大约”是指给定测量值的+/-5%。

ROC曲线的横轴表示（1-特异性），其随着假阳性率而增加。该曲线的纵轴表示敏感度，其随真阳性率而增加。因此，对所选的特定截止，可以确定（1-特异性）的值，而且可以获得对应的敏感度。ROC曲线下面积用于度量测定的标记水平能够正确地鉴定疾病或症状的概率。因此，可以使用ROC曲线下面积来确定该检验的有效性。

在某些实施方案中，不用依靠用于一组内一个或多个标记的特定阈值来确定从受试者身上获得的标记水平分布图是否表明特定的诊断/预后。相反地，本发明可以应用标记组“分布图”的评估作为统一的整体。实质上，在这样的标记组中，特定“指纹”变化模式可以用作特异性诊断或预后指示物。如本文所讨论的，可以从单个样本或从该组内一个或多个成员的暂时变化（或组响应值）中获得这种变化模式。本文中的组是指一套标记。

如本文下文中所述，优选地通过绘制在不同截止值下标记的特定组的敏感度（即真阳性）对组的1-（特异性）（即假阳性）的ROC曲线来确定组响应值。在这些方法中，将来自受试者的标记测量值分布图一起考虑以提供诊断或预后的总概率（以数字分数或百分比风险表达）。在这样的实施方案中，标记的某些子集的增加能够充分表明一患者的特定诊断或预后，而标记的不同子集的增加能够充分表明其它患者的相同或不同诊断/预后。还可以将加权因子应用到组的一个或多个标记中，例如，当标记在鉴定特定的诊断/预后方面有特别高的应用性时，可以将其加权，从而在某个给定水平上，仅其一个就足以表明阳性结果。同样地，可以提供加权因子，从而未给定水平的特殊标记足以表明阳性结果，但是当另一个标记也应用于该分析时，其只能表明一个结果。

对在连续尺度上测定的标记，ROC曲线是真阳性分数对假阳性分数的绘图，其用于评估所有可能的截止点值。为了得到二进制的结果，即***癌是否存在，该ROC曲线定量了标记的区分实例与对照的鉴别能力。通过DeLong等的U-统计（Biometrics,1988,44:837-845）或引导重采样方法来计算在该曲线下面积（AUC）的标准方差和AUC之间的差别。

优选地，首先使用每个生物标记的k-分量检测阈值，然后如果至少一个分数高于其检测阈值，则宣称该检验为阳性，从而确定k标记的ROC曲线。通常在k-分量阈值范围内计算敏感度和特异性值，该区域能够产生点云。可以通过以下方法获得新标记的最佳ROC曲线点：对固定的敏感度值，在与敏感度值相匹配的点云的特异性区域内选择特异性最大值。

在某些实施方案中，选择标记和/或标记组以显示至少约70%的敏感度，更优选地至少约80%的敏感度，甚至更优选地至少约85%的敏感度，还更优选地至少约90%的敏感度，最优选地至少约95%的敏感度，与至少约70%的特异性，更优选地至少约80%的特异性，甚至更优选地至少约85%的特异性，还更优选地至少约90%的特异性，最优选地至少约95%的特异性组合。在特别优选的实施方案中，该敏感度和特异性都为至少约75%，更优选地至少约80%，甚至更优选地至少约85%，还更优选地至少约90%，最优选地至少约95%。在此上下文中术语“约”是指给定测量值的+/-5%。

技术人员会理解的是，将诊断或预后的指示物与诊断或未来临床结果的预后风险相联系是统计性分析。例如，如统计性显著水平所确定的，与具有小于或等于X的水平的患者相比，大于X的标记水平可以表明患者更有可能遭受不良结果。此外，基线水平的标记浓度变化可以反应患者预后，而且标记水平的变化程度可以与不良情况的严重程度相关。通常通过比较两个或多个群体，并确定置信区间和/或p值来确定统计显著性。参见，例如，Dowdy和Wearden,Statistics for Research,JohnWiley and Sons,New York,1983。本发明优选的置信区间是90%、95%、97.5%、98%、99%、99.5%、99.9%和99.99%，而优选的p值是0.1、0.05、0.025、0.02、0.01、0.005、0.001和0.0001。

如本文所使用的，术语“处于罹患***癌风险的患者群体”是指已经诊断为显示出罹患***癌风险的患者群体，该诊断基于可用于检测***癌的一个或多个试验。例如，该群体可以包含3、4、5、10、15、20、30、40、50或更多受试者。

处于罹患***癌风险的患者包括但不限于表现出一个或多个以下诊断特征的患者：

-DRE为阳性，即如Richie JP等（Urology,1993,42:365-74）和Carvalhal GF等（J.Urol.,1999,161:835-9）所述，检验员将戴手套的润滑的手指***直肠中检查***的尺寸、形状和结构，通过这样的程序检测出存在不规则、坚硬和块状的区域。尽管DRE只能评估***的背面，但是85%的***癌发生在***的这部分。通过DRE可以触摸到的***癌通常是发展到较晚期了。

-经直肠超声，也称为***超声、超声波扫描或超声描记术，其涉及将身体的一部分暴露于高频率声波下以产生身体内部的图像。因为超声图像是实时捕捉的，它们可以显示身体内部器官的结构和运动，以及流经血管的血液。

-血液中升高的PSA水平：尽管对血液中显示出升高的PSA水平的患者进行活检的判定水平不存在标准，已经任意选择了不同的PSA值作为判定水平，特别地，将高于4ng/mL的水平选为在临床试验中进行活检的判定水平，基于此FDA于1994年增加了对50岁年龄男性的***癌检测；将4ng/mL用作PLCO（***、肺、结肠直肠和卵巢癌）试验的活检判定水平，将3ng/mL用作ERSPC（欧洲***癌的随机筛查）和ProtecT试验，而且将2.5ng/mL用于2007NCCN（美国国立综合癌症网）指南。PSA水平可以因癌症之外的原因而改变。高PSA水平的两个普遍原因是***的膨大（良性***增生（BPH））和***感染（***炎）。

-血液中***酸性磷酸酶（PAP）的升高水平。

-年龄高于50岁的患者。

在优选的实施方案中，处于罹患***癌风险的患者群体中的患者是具有高于4ng/ml PSA水平的患者和/或具有阳性DRE的患者。在还更优选的实施方案中，处于罹患***癌风险的患者群体由具有在所谓的灰色区域内的PSA水平的患者组成，该灰色区域对应与不理想的大量假阳性和假阴性相关的血清或血液中的PSA水平。典型地，该灰色区域对应于高于4ng/ml并低于10ng/ml的PSA水平。

在更优选的实施方案中，实施本发明的方法的受试者是之前没有实施活检的患者。

一旦将在给定患者体内PCA3、PSMA和PSGR基因的水平与每个相应基因的表达水平作比较，该单个基因的表达水平通过使用多标记ROC曲线分析在理想敏感度下给出的最大特异性来确定，当至少一个上述基因的表达水平高于所述预定的表达水平时，诊断出在理想敏感度下患者罹患***癌。如本文所使用的，在所研究的受试者样本内，术语基因的“表达水平的显著升高”是指该表达水平相对于该截止值升高了至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少100%、至少110%、至少120%、至少130%、至少140%、至少150%或更多。

如本文所使用的，术语“特异性”是指当样本不是阳性时，本发明的诊断方法给出阴性结果的概率。特异性通过真阴性结果数除以真阴性与假阳性之和来计算。实质上，特异性是一种方法排除那些没有罹患***癌的患者的准确度的度量。在本发明的方法中，可以选择对PCA3、PSMA和PSGR基因表达的截止值，以使得当敏感度在至少约70%时，诊断个体的特异性在70%至100%的区域内，例如，在至少60%的受验的患者群体中，或在至少65%、70%、75%或80%的受验的患者群体中，该特异性为至少75%、80%、85%、90%或95%。如本发明实施例中所描述的，该方法能够诊断出在敏感度为96%，特异性为40%时，存在PCa，其阳性和阴性预测值分别为49%和95%（图2）。

如本文所使用的，术语“阴性预测值”与“NPV”同义，其是指诊断出未患有***癌的个体确实未患有***癌的概率。阴性预测值可以通过真阴性数除以真阴性和假阴性之和来计算。

如本文所使用的，术语“阳性预测值”与“PPV”同义，其是指诊断出患有纤维化的个体确实具有此症状的概率。阳性预测值可以通过真阳性数除以真阳性和假阳性之和来计算。

当至少一个本发明的方法测定的标记表达高于作为参考的截止值水平时，本发明的方法能够在理想敏感度下检测出PCa，而无需大幅度降低该诊断方法的特异性。这种令人惊奇的效果源自以下事实，即在一个患者中不同基因的变更表达可能与在另一个患者中的不同，其取决于肿瘤起源、肿瘤亚型、进展程度。在这种情况下，单个基因或成对明智的基因组合的确定会导致一些实例无法恰当地诊断，从而降低敏感度。根据本发明的方法能够通过测定所有三个基因的表达来提高敏感度，而不会影响特异性。

本领域技术人员将会理解的是，如果至少PCA3、至少PSMA或至少PSGR的表达水平高于截止值时，该诊断可以为阳性。此外，当3种上述基因中的2种的表达水平高于每个基因的参考值，比如，当PCA3和PSMA水平升高时，当PCA3和PSGR水平升高时或当PCA3和PSGR水平升高时，也可以诊断为阳性。此外，当PCA3、PSMA和PSGR的表达水平同时升高时，可以得到阳性诊断结果。

由本发明提供的PCa诊断方法是非侵入性方法，因为其可以通过使用来自所分析的受试者的含有***细胞的尿样来进行，而且由于该方法的高敏感度和特异性（在敏感度为96%时得到40%的特异性），其是安全可靠的；此外，阳性和阴性预测值分别为49%和95%。因此，合起来，可以将这些结果用于开发PCa的高特异性检验，这可以容易地整合到常规的泌尿科医生的工作流程中，而且如在下文中将讨论的，由于PSA检验特别在特殊临床目的患者组中的低特异性（患者具有4ng/mL至10ng/mL血清PSA并在之前未接受活检），其可以明显地降低大量不必要的活检。

在优选的实施方案中，考虑到在样本中基因升高的表达水平可能不是***细胞恶性增殖的结果，而是例如在BPH中发生的非恶性***增长的结果，所以通过使用持家基因的表达水平将PCA3、PSMA和PSGR基因的表达水平标准化。此外，可以在含有从组织而不是从表达这些标记的***中取得的细胞的样本中实施该方法。特别地，如果在尿液沉淀中实施该方法，除了癌细胞之外，还可能发现来自尿路上皮、肾脏、膀胱或血液的细胞。因此，在优选的实施方案中，将形成标记组的不同基因的表达水平标准化成持家基因的量。

如本文所使用的，术语“标准化”是指定量数值转换成可以与从其他基因表达分析中得到的基因表达量相比较的数值。典型地，使用稳定表达的持家基因的基因表达水平实施标准化，将该基因表达水平用作基因表达量的标准化指数。

如本文中所使用的，术语“持家基因”是指通常在所有组织中普遍表达的基因。这些基因编码蛋白质，其提供所有细胞生存所需的基础、实质的功能。持家基因通常在所有细胞和组织中以相同水平表达，但有一些差异，特别是在细胞生长和有机体发展过程中。普遍使用的持家基因包括但不限于GAPDH（3-磷酸甘油醛脱氢酶）、β-肌动蛋白基因、微管蛋白基因、编码核糖体的18S或28S rRNA亚基的基因。例如，可以在Trends in Genetics,19,362-365(2003)中找到持家基因的典型列表。

在优选的实施方案中，该持家基因为“***持家基因”。如本文所使用的，术语“***持家基因”是指不管***细胞是正常的***细胞还是***腺癌细胞，都在该细胞中以稳定水平表达的基因。该基因允许在样本中检测***派生细胞的数量。

因此，在优选的实施方案中，本发明的第一个方法包含在确定PCA3、PSMA和PSG的相同样本中，标准化成***持家基因表达水平后的PCA3、PSMA和PSGR基因的表达水平的用途。

本发明使用的合适的***持家基因包括但不限于PSA（Sokoll等,1997,Urol.Clin.North Am.24:253-259）、DD3（Cancer Res.,1999,59:5975-9）、HPG-1、PSM、NKX3、***的六跨膜上皮抗原（STEAP）、Trp-p8（Tsvaler等）、***酸性磷酸酶、肌酸激酶、胸腺素b-15、HPC1基础***癌基因、hKLK2基因编码的***特异性腺体激肽释放酶蛋白hK2、***特异性抗原蛋白、hKLK3基因编码的hK3（PSA）、SIM2基因（WO09135019A）、ERG基因（WO09135019A）、TMPRSS2、PSM或***特异性膜抗原（Fair等,1997,Prostate32:140-148）、PSCA或***干细胞抗原（Reiter等,1998.Proc.Natl.Acad.Sci.USA95:1735-1740）、TMPRSS2（Lin等,1999.Cancer Res.59:4180-4184）、PDEF（Oettgen等,2000,J.Biol.Chem.275:1216-1225）、PSG-1或***特异性基因-1（Herness,2003,Cancer Res.63:329-336）、PCA3（Bussemakers等,1999.,Cancer Res.59:5975-5979]、WO98/045420、WO01/0235、WO2004/070056、WO2005/003387）、PCGEM1（Srikantan等,2000.Proc.Natl.Acad.Sci.USA97:12216-12221）和基因P704P、P712P和P775P（Stolk等,2004.Prostate60:214-226）。

在优选的实施方案中，***持家基因是PSA基因。如本文所使用的，术语PSA是指位于染色体19上的基因，染色体19编码具有丝氨酸蛋白酶活性的糖蛋白，该糖蛋白通过***的腺上皮细胞在雄激素控制下表达，并分泌成精清以将其液化。正常情况下，PSA蛋白在***内，但是在如癌症或BPH的***疾病的情况下，PSA渗入到血液中，在其中其以不同的形式存在，该形态包括与蛋白络合物组合的形式和不与蛋白络合物组合的形式（El-Shirbiny,1994,Adv.Clin.Chem.31:99）。总PSA血清浓度的测定是***癌患者的筛选和管理中使用最频繁并获FDA认可的生物化学试验之一。迄今为止的研究表明，PSA筛选组合DRE和经直肠超声，通常提高了早期***癌的检出率，但其仍局限于腺体本身（Brawer等,1992,J.Urol.147:841）。血清PSA还用于治疗后、特别是***癌切除手术后对患者的监测。然而，总PSA的测定还鉴别出具有异常升高水平但后来发现未患有***癌的大量患者。最近，测定游离/总PSA比例百分比的概念示出在对具有4至10ng/mL PSA的男性进行筛选时增加***癌的特异性（Letran等,1998,J.Urol.160:426）。在优选的实施方案中，通过使用PSA mRNA水平实施标准化。

本发明的作者还观察到，可以通过合并***癌的其他生物标记可进一步提高该标记组的诊断值，该其他生物标记选自包含PSA密度（PSAD）或血清PSA水平的组。

因此，如本发明的实施例中所示，包含PCA3、PSMA和PSGR的表达水平以及PSAD的标记组能够在AUC为0.89时诊断出***癌，其中使用没有PSAD的3个表达水平导致AUC为0.82。该组合的标记模型的敏感度为96%，特异性为40%。阳性和阴性预测值分别为49%和95%（参见图2）。

术语“生物标记”在本领域内通用，其是指过程、结果或条件的区别性的生物的或生物派生的指示物。

将其他生物标记合并入该诊断方法要求（i）确定所研究的患者体内的其他生物标记值，（ii）将该生物标记值与所述参数的截止值作比较，其中所述截止值对应通过使用ROC曲线在理想敏感度下提供最高特异性的截止值，该曲线通过使用组合的4个标记组来计算。

其中，其他生物标记为PSAD，本发明的诊断方法还包含（i）确定在所研究的患者体内的PSAD值，（ii）将PSAD值与所述参数的截止值作比较，其中所述截止值对应通过使用ROC曲线在理想敏感度下提供最高特异性的截止值，该曲线通过使用组合的4个标记组来计算。

其中，其他生物标记为PSA，本发明的诊断方法还包含（i）确定在所研究的患者体内的PSA值，（ii）将PSA值与所述参数的截止值作比较，其中所述截止值对应通过使用ROC曲线在理想敏感度下提供最高特异性的截止值，该曲线通过使用组合的4个标记组来计算。

因此，在优选的实施方案中，本发明的诊断方法还包含步骤（i）确定患者体内的PSAD，步骤（ii）将患者体内的PSAD水平与PSAD的预定的截止值作比较，其中所述预定的截止值对应与ROC曲线中在理想敏感度下的最高特异性相关的PSAD值，该曲线根据处于罹患PCa风险的患者群体中确定的PCA3、PSMA、PSGR基因的表达水平和PSAD来计算，并且最后，判定患者是否显示出***癌，其中在所述样本中至少一个所述基因的表达水平相对于所述基因的所述预定的截止值升高，或PSAD值相对于所述预定的截止值升高，其表明在所述理想敏感度下受试者罹患PCa。

如本文所使用的，术语“PSA密度”或PSAD是指来自体液样本的PSA值除以***体积所得到的PSA值。

例如：PSA密度（PSAD）=PSA值/***体积

可以通过测定样本（例如，血清、血液等等，优选血清）中PSA的浓度和***体积（描述生态学）根据以下公式确定PSAD（PSA/***体积）值。

PSA密度=PSA体积/***体积

可以通过任何确定样本中PSA的浓度的方法，包括如上所述本领域技术人员众所周知的常见方法（例如免疫学方法等等）来确定样本中PSA的浓度。

通过测定***体积的任何方法，包括本领域技术人员众所周知的常见方法（包括但不限于使用公式HxWxLx0.52的所谓TRUS检查），来测定***体积。典型地根据超声测量值来确定该***体积，其包括但不限于以最大尺寸进行的经直肠超声测量值（TRUS）。在还一特定实施方案中，通过HxWxLx0.52的椭球体积方法来计算TRUS测量值。可以通过测量整个***腺体来计算体积，或可选地，也可以获得测量过渡区（TZ）/尿道周良性***腺体叶（腺瘤）的体积并且该值用于确定PSA密度。

“经直肠超声”或“TRUS”是5至15分钟的门诊病人程序，其使用声波创建***腺体的视频图像。该程序包括将小型润滑探针置入直肠内，其释放声波并当它们进入***时产生回声。***肿瘤通常产生与正常***组织不同的回声。反弹回的回声被发送到计算机，其将回声模式转换成***图片。使用TRUS估计该***腺体的重量，帮助医生对辅助鉴别BPH和PCa的PSA密度有更好的了解。

“用于测定***体积的椭球体积方法”是一种用于评估***体积的方法，而且其是TRUS程序的重要组成部分。已经使用了几个公式，但是最普遍的一个是椭球公式，其需要3个***尺寸的测量值。通过在最宽的横向尺寸的估计点上测定横向和前后尺寸来首先在轴平面确定尺寸。在中线旁边的径向平面上测定纵向尺寸，因为膀胱颈经常遮住腺体的向头侧部分。然后应用该椭球体积公式：体积=高度.次数.宽度.次数.长度.次数.0.52。

可选地，可以通过使用PSA、cPSA（PSA至α1抗凝乳蛋白酶）、游离PSA、B-PSA（良性PSA）的组合；PRO-PSA（游离PSA的前体同种型，其与***癌相关而且其由天然PSA前体以及截短的PSA前体形式组成，[-2]pPSA和[-4]pPSA）和/或人类激肽释放酶（HK2）测量值来确定该***体积。

如本文所使用的，术语“PSA”涉及33kDa的胰凝乳蛋白酶类蛋白的血清浓度，该蛋白是人类激肽释放酶基因家族的一员，其由***腺体细胞产生。

如本文所使用的，术语“总PSA血清水平”涉及PSA血清浓度，其对应于“游离PSA”（未结合或不与其他实体结合的PSA）和“结合PSA”（与其他实体如α1抗凝乳蛋白酶（ACT）、α1抗胰蛋白酶（AT）、蛋白酶C抑制剂（PCl）和α2macroglobupsilonlin（A2M）结合的PSA）之和。

如本文所使用的，术语“游离PSA血清水平”是指未结合或不与其他实体结合的PSA的量。

术语“游离对总血清PSA的比例”是指“游离PSA”（未结合或不与其他实体结合的PSA）与“结合PSA”（与其他实体如α1抗凝乳蛋白酶（ACT）、α1抗胰蛋白酶（AT）、蛋白酶C抑制剂（PCl）和α2macroglobupsilonlin（A2M）结合的PSA）在血清中的浓度比例。

如本文所使用的，术语“PSA前体”是指PSA的前体形式。PSA的全长度前体形式包括7个氨基酸的前肽（即前导肽）、在237个氨基酸的成熟PSA蛋白之前的APLILSR。PSA前体的全长度氨基酸序列在本领域中是已知的，而且其由Kumar A.等（Cancer Res,1997,57:3111-3114）充分描述过。为了达到本发明的目的，将前肽序列的最后的氨基酸“R”算作[-1]氨基酸。例如，[-7]PSA前体是具有在前肽的-7氨基酸上起始的末端的PSA前体，其含有全长度PSA前体。[-5]PSA前体表明该PSA前体的末端在该前肽的-5氨基酸上起始，而且其含有该前肽序列的最后5个氨基酸序列。为了达到本发明的目的，PSA前体包括其末端在前肽的任何氨基酸上起始的全长度和截短形式的PSA前体，即PSA前体可以是[-l]PSA前体、[-2]PSA前体、[-3]PSA前体、[-4]PSA前体、[-5]PSA前体、[-6]PSA前体、[-7]PSA前体及以上组合。

将术语“PSA倍增时间”定义为在治疗期间血清PSA的倍增数。

本发明的方法能够鉴定罹患PCa的患者，其中至少一个上述标记相对于截止值明显地增加。如本领域技术人员将会理解的，如果至少PCA3、至少PSMA或至少PSGR或至少PSAD/血清PSA的表达水平高于截止值水平，诊断为阳性。另外，当3个标记中的2个的表达水平高于每个基因的参考值时，比如，当PCA3水平和PSGR水平升高，当PCA3水平和PSMA水平升高，当PCA3水平和PSAD/血清PSA水平升高，当PSGR和PSMA水平升高，当PSGR水平和PSAD/血清PSA水平升高或当PSMA水平和PSAD/血清PSA水平升高时，也为阳性诊断。此外，当PCA3、PSMA和PSGR的表达水平同时升高，当PCA3、PSMA和PSAD/PSA血清值的表达水平同时升高，当PCA3和PSGR以及PSAD/PSA血清值的表达水平同时升高，当PSGR和PSMA以及PSAD/PSA血清的表达水平同时升高时，得到了阳性诊断结果。

用于评估或监测对PCa疗法响应的方法

可以将本发明的教导用于监测和确定对患有PCa的受试者施用的疗法的疗效。特别地，本发明基于的事实是可以将不同标记的表达水平用于监测PCa是否对给定治疗发生响应。然而，***的手术移除导致不同标记不再表达，因为负责产生这些标记的器官已经不存在了。因此，本发明的方法特别地用于那些情况，其中使用不会导致***完全移除的方法治疗患者（例如，放疗、化疗等）。

因此，另一方面，本发明涉及用于评估或监测患有PCa的受试者对疗法响应的方法，其包含比较：

（i）确定在施用所述疗法前从所述受试者中分离的生物流体样本中的PCA3、PSMA和PSGR基因的表达水平，其中所述生物流体选自由尿液、***分泌物、***和***按摩后的尿液组成的组，以及

（ii）确定在施用所述疗法后从所述受试者中分离的生物流体样本中的所述PCA3、PSMA和PSGR基因的表达水平，其中所述生物流体选自由尿液、***分泌物、***和***按摩后的尿液组成的组，以及

（iii）将施用所述疗法前后获得的所述PCA3、PSMA和PSGR基因的表达水平与每个所述基因的预定的截止值作比较，其中每个基因的所述预定的截止值对应所述基因的表达水平，其与ROC（接受者操作特征）曲线中在理想敏感度下的最高特异性相关，该曲线根据处于罹患PCa风险的患者群体中确定的所述PCA3、PSMA和PSGR基因的表达水平来计算，

其中，施用所述疗法后，在受试者样本中至少一个所述基因的表达水平相对于所述基因的所述预定的截止值显著下降或没有变化，其表明施用的该疗法有效。

可选地，另一方面，本发明涉及用于评估或监测患有PCa的受试者对疗法响应的方法，其包含比较

（i）确定在施用所述疗法前获得的从所述受试者中分离的样本中的所述PCA3、PSMA和PSGR基因的表达水平，其中所述生物流体选自由尿液、***分泌物、***和***按摩后的尿液组成的组，以及

（ii）确定在施用所述疗法后获得的从所述受试者中分离的样本中的所述PCA3、PSMA和PSGR基因的表达水平，其中所述生物流体选自由尿液、***分泌物、***和***按摩后的尿液组成的组，以及

（iii）将施用所述疗法前后获得的所述PCA3、PSMA和PSGR基因的表达水平与每个所述基因的预定的截止值作比较，其中每个基因的所述预定的截止值对应所述基因的表达水平，其与ROC（接受者操作特征）曲线中在理想敏感度下的最高特异性相关，该曲线根据处于罹患***癌风险的患者群体中确定的所述PCA3、PSMA和PSGR基因的表达水平来计算，

其中，施用所述疗法后，在受试者样本中至少一个所述基因的表达水平相对于所述基因的所述预定的截止值显著升高，其表明施用的疗法无效。

如本发明所使用的，表述“评估或监测对疗法的响应”涉及确定患有PCa的受试者对施用于该受试者的疗法的响应的可能性。在PCa疗法中，可以采取多种治疗以试图根除或控制癌症。对PCa的治疗可以包括主动监视、激素疗法、包括近距离放疗（***近距离放疗）和外粒子束辐射的放疗、高强度聚焦超声（HIFU）、化疗或一些组合。哪种选择最好取决于疾病的阶段、Gleason评分和PSA水平。其他重要因素为男性年龄、整体健康状况、对潜在治疗的感觉和它们可能产生的副作用。因为所有的治疗可具有明显的副作用，如***功能障碍和尿失禁，治疗讨论通常集中在如何平衡疗法的目标和生活方式变更的风险。

简言之，根据上述因素（例如，受试者年龄，以及尺寸、位置和癌症阶段），可以使用（i）细胞毒性/细胞抑制治疗，如化疗，其使用抗癌药品通过使药品经过血管在体内循环以破坏癌细胞；放疗，其使用高能量辐射杀死癌细胞，和抗癌剂；和/或（ii）免疫疗法，其中施用的化合物刺激、提高或增强免疫***抗癌的天然功能以识别和根除体内的癌细胞。因此，本发明的方法能够确定患有PCa的受试者对任何治疗的响应，特别地，针对任何细胞毒性和/或细胞抑制治疗，更具体地，针对通过化疗、放疗、抗癌剂或以上组合的方式的治疗。

合适的化疗试剂包括但不限于烷化剂（例如，顺铂、卡铂、奥沙利铂、BBR3464、苯丁酸氮芥、氮芥、环磷酰胺、Ifosmade、苯丙氨酸氮芥、卡氮芥、福替目丁、洛莫司汀、链脲菌素、白消安、氮烯咪(唑)胺、二氯甲基二乙胺、甲基苄肼、替莫唑胺、ThioTPA、芥尿嘧啶等）；抗代谢药（例如，嘌呤（硫唑嘌呤、巯基嘌呤）、嘧啶（卡培他滨、阿糖胞苷、氟尿嘧啶、吉西他滨）、叶酸（氨甲喋呤、培美曲塞、雷替曲塞）等）；长春花生物碱（例如，长春新碱、长春花碱、长春瑞滨、长春地辛）；紫杉烷（例如，紫杉醇、多西他奇、BMS-247550等）；蒽环类抗生素（柔红霉素、阿霉素、表柔比星、伊达比星、米托蒽醌、戊柔比星、博莱霉素、羟基脲、丝裂霉素等）；拓扑异构酶抑制剂（例如，托泊替康、伊立替康依托泊苷、替尼泊甙等）；单克隆抗体（例如，阿仑单抗、贝伐单抗、西妥昔单抗、吉姆单抗、帕尼单抗、利妥昔单抗、曲妥单抗）；光敏剂（例如，氨基酮戊酸、甲基氨基酮戊酸盐、卟吩姆钠、维替泊芬等）；酪氨酸激酶抑制剂（例如，Gleevec^(TM)）；表皮生长因子受体抑制剂（例如，Iressa^(TM)，埃罗替尼（Tarceva^(TM))、吉非替尼等）；FPTase抑制剂（例如，FTIs（Rl15777、SCH66336、L-778,123）等）；KDR抑制剂（例如，SU6668、PTK787等）；蛋白体抑制剂（例如，PS341等）；TS/DNA合成抑制剂（例如，ZD9331、雷替曲塞（ZD1694、拓优得）、ZD9331、5-FU等）；S腺苷蛋氨酸脱羧酶抑制剂（例如，SAM468A等）；DNA甲基化剂（例如，TMZ等）；DNA粘合剂（例如，PZA等）；粘合并钝化O⁶-烷基鸟嘌呤AGT的试剂（例如BG）；c-ra/-l反义寡脱氧核苷酸【例如，ISIS-5132（CGP-69846A））；肿瘤免疫治疗；甾族的和/或非甾族的抗炎药（例如，皮质类固醇、COX-2抑制剂）；或其他试剂如阿利维A酸、六甲蜜胺、安吖啶、阿那格雷、三氧化二砷、天门冬酰胺酶、贝沙罗汀、硼替佐米、塞来考昔、达沙替尼、Denileukin Diftitox、雌氮芥、羟基脲、伊马替尼、喷司他丁、马丙考、米托担、天门冬酰胺酶和维甲酸。合适的化疗试剂在相关文献中有更详细的描述，如The Merck Index in CD-ROM,13^thedition。

根据本发明的这一方面，将在第一时间段从患有PCa的受试者身上获得的样本（第一受试者样本）中确定的基因PCA3、PSMA和PSGR表达水平与在第二时间段从患有PCa的受试者身上获得的样本（第二受试者样本）中确定的基因PCA3、PSMA和PSGR表达水平作比较，从而能够评估或监测所述患有PCa的受试者对疗法响应的效力。可以在第二时间段，也就是第一时间段后的任何时间，例如第一受试者样本后的1天、1周、1个月、2个月、3个月、1年、2年或更久的时间，从进行第一次测定的患有PCa的相同受试者身上采集第二受试者样本。在特殊实施方案中，在受试者接受治疗（例如化疗或放疗）前采集第一受试者样本；并在治疗后采集第二受试者样本。在另一特殊实施方案中，在受试者已经开始/接受治疗（例如化疗或放疗）后采集第一受试者样本，并在之后，在治疗过程的不同时间段采集第二受试者样本，将评估和监测该治疗的疗效。这些方法能够对之前诊断出PCa的所选受试者的特定治疗进行评估。因此，如果该疗法对治疗所述受试者体内的PCa无效，那么应该改变所述疗法并应该设计新疗法以治疗所述受试者体内的PCa。根据此方法可以轻易的跟进新治疗过程。

如前所述关于本发明的诊断方法，可以通过本领域中已知的任何合适方法（例如qPCR）来确定生物标记基因（PCA3、PSMA和PSGR）的表达水平。在大量可重复的条件下获得该测量值。

一旦确定在不同时间段的受试者样本（第一和第二受试者样本）中生物标记基因的表达水平，则有必要鉴定，在第二受试者样本中每一个所述基因的表达与在第一受试者样本中的所述基因生物标记的表达水平相比是否显著下降。当第二受试者样本中的表达水平相对于第一受试者样本中的该表达水平降低了至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少100%（即缺失）时，在所研究的第二受试者样本中基因表达相对于所述第一受试者样本中所述生物标记基因的表达水平的降低被认为是“显著下降”。

同样地，当第二受试者样本中的表达水平相对于第一受试者样本中的该表达水平升高了至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少100%、至少110%、至少120%、至少130%、至少140%、至少150%或更多时，所研究的第二个受试者样本中的基因表达相对于所述第一受试者样本中所述生物标记基因的表达水平的升高被认为是“显著升高”。

同样地，当研究第二受试者样本中的表达水平时，所研究的第二受试者样本中基因表达相对于所述第一受试者样本中所述生物标记基因的表达水平没有变化，这表明该表达水平在两个测量值之间是实质上恒定的。例如，恒定的表达水平表明第一测量值不高于105%、不高于104%、不高于103%、不高于102%、不高于101%、不低于99%、不低于98%、不低于97%、不低于97%、不低于96%或不低于95%。

因此，在第二受试者样本中至少一个所述生物标记基因（PCA3、PSMA和PSGR）的表达水平相对于在第一受试者样本中每个所述生物标记基因的表达水平显著下降，其表明施用于患有PCa的受试者的疗法是有效的。反之，如果在第二受试者样本中所述生物标记基因的表达水平相对于在第一受试者样本中所述生物标记基因的表达水平没有显著下降（没有变化或显著升高），或者甚至，在第二受试者样本中至少一个所述生物标记基因的表达水平相对于在第一受试者样本中至少一个所述生物标记基因的表达水平显著升高，那么施用于所述受试者的该疗法对治疗所述受试者体内的PCa是无效的；因此，应该改变所述疗法并设计新疗法以治疗所述受试者体内的PCa。根据此方法可以轻易的跟进新治疗过程。

此外，可以通过将不同基因的表达水平与对PCa的其他生物标记值结合来进一步改进根据本发明的用于评估或监测对PCa疗法响应的方法，从而，当至少一个上述基因的表达水平或至少其他生物标记值低于截止值时，该疗法被认为是有效的，或者当至少一个上述基因的表达水平或至少其他生物标记值高于截止值时，疗法被认为是无效的。如本发明的诊断方法的上下文所描述的，从由PSA密度（PSAD）、游离血清PSA水平、总血清PSA水平、游离血清PSA水平对总血清PSA水平的比例、PSA前体水平和PSA倍增时间（PSADT）或PSA组成的组中选出其他生物标记。

因此，在优选的实施方案中，通过施行上述定义的步骤（i）和（ii）来实施根据本发明的用于监测对疗法响应的方法，但是其中步骤（i）和（ii）还包含确定来自患者体内的PSAD，其中步骤（iii）还包含将患者体内的PSAD水平与对PSAD的预定的截止值作比较，其中所述预定的截止值对应与ROC（接受者操作特征曲线）中在所述理想敏感度下的最高特异性相关的PSAD值，该曲线根据在处于罹患PCa风险的患者群体中确定的PCA3、PSMA和PSGR基因的表达水平和PSAD来计算。最后，该方法能够得出疗法是否有效，其如下所述进行判断，即如果检测出在所述样本中至少一个所述基因的表达水平相对于所述基因的所述预定的截止值降低了，或PSAD值相对于所述预定的截止值降低了，疗法是有效的，或者如果检测出在所述样本中至少一个所述基因的表达水平相对于所述基因的所述预定的截止值升高了或没有变化，或PSAD值相对于所述预定的截止值升高了或没有变化，疗法是无效的。

因此，在优选的实施方案中，通过施行上述定义的步骤（i）和（ii）来实施根据本发明的用于监测对疗法响应的方法，但是其中步骤（i）和（ii）还包含确定来自患者体内的PSA，其中步骤（iii）还包含将患者体内的PSA水平与PSA的预定的截止值作比较，其中所述预定的截止值对应与ROC（接受者操作特征曲线）中在所述理想敏感度下的最高特异性相关的PSA值，该曲线根据在处于罹患***癌风险的患者群体中确定的PCA3、PSMA和PSGR基因的表达水平和PSA来计算。最后，该方法能够得出疗法是否有效，其如下所述进行判断，即如果检测出在所述样本中至少一个所述基因的表达水平相对于所述基因的所述预定的截止值降低了，或PSA值相对于所述预定的截止值降低了，疗法是有效的，或者如果检测出在所述样本中至少一个所述基因的表达水平相对于所述基因的所述预定的截止值升高了或没有变化，或PSA值相对于所述预定的截止值升高了或没有变化，疗法是无效的。

监测受试者体内PCa的进展

还可以将本发明的教导用于监测受试者体内PCa的进展。因此，另一方面，本发明涉及一种用于监测受试者体内PCa进展的方法，其包含

（i）确定在第一时间段从所述受试者身上分离的生物流体样本中的所述PCA3、PSMA和PSGR基因的表达水平，其中所述生物流体选自由尿液、***分泌物、***和***按摩后的尿液组成的组，以及

（ii）确定在第二时间段分离的相同受试者的生物流体样本中的所述PCA3、PSMA和PSGR基因的表达水平，其中所述生物流体选自由尿液、***分泌物、***和***按摩后的尿液组成的组，而且所述第二时间段晚于所述第一时间段；

（iii）将在第一和第二时间段获得的所述PCA3、PSMA和PSGR基因的表达水平与每个所述基因的预定的截止值作比较，其中每个基因的所述预定的截止值对应所述基因的表达水平，其与ROC（接受者操作特征）曲线中在理想敏感度下的最高特异性相关，该曲线根据处于罹患PCa风险的患者群体中确定的所述PCA3、PSMA和PSGR基因的表达水平来计算，

其中，在第二时间段，受试者样本中至少一个所述基因的表达水平相对于在第一时间段的所述表达水平显著下降或没有变化，其表明PCa在受试者体内没有进展。

可选地，用于监测受试者体内PCa进展的方法包含

a）确定在第一时间段获得的受试者样本中的PCA3、PSMA和PSGR基因的表达水平，其中所述生物流体选自由尿液、***分泌物、***和***按摩后的尿液组成的组，以及

b）确定在第二时间段获得的相同受试者的样本中的所述PCA3、PSMA和PSGR基因的表达水平，其中所述生物流体选自由尿液、***分泌物、***和***按摩后的尿液组成的组，而且所述第二时间段晚于所述第一时间段；

c）将在第一和第二时间段获得的所述PCA3、PSMA和PSGR基因的表达水平与每个所述基因的预定的截止值作比较，其中每个基因的所述预定的截止值对应所述基因的表达水平，其与ROC（接受者操作特征）曲线中在所述理想敏感度下的最高特异性相关，该曲线根据处于罹患PCa风险的患者群体中确定的PCA3、PSMA和PSGR基因的表达水平来计算，

其中，在第二时间段，受试者样本中至少一个所述基因的表达水平相对于在第一时间段的所述表达水平显著升高，其表明PCa有进展。

如本发明所使用的，表述“监测PCa的进展”相当于“确定预后”，其涉及确定一个或几个表明诊断患有PCa的患者体内疾病进展的参数。适用于确定诊断患有PCa的受试者发展的参数选自由肿瘤响应、复发风险、无病生存和/或该受试者的总生存率构成的组。如本文所使用的，表述“复发风险”应理解为受试者在无病阶段后再次发生PCa和/或二次转移的概率；“无病生存”应理解为在治疗后没有发现癌症的时段；而“受试者总生存率”应理解为从诊断或治疗的时间起，在确定的时段后受试者存活的百分比。如本文所使用的，疾病恶化是指

在优选的实施方案中，可以将用于监测PCa进展的方法用于检测器官局限性疾病（OCD）与非器官局限性疾病（NOCD）之间的差异。在另一优选的实施方案中，可以将用于监测PCa进展的方法用于预测侵略性***癌或临床显著的/慢性PCa）。

根据本发明的这一方面，将在第一时间段从患有PCa的受试者身上获得的样本（第一受试者样本）中确定的PCA3、PSMA和PSGR基因的表达水平和在第二时间段从患有PCa的受试者身上获得的样本（第二受试者样本）中确定的PCA3、PSMA和PSGR基因的表达水平分别与每个基因的截止值作比较，其中对所述截止值如上所述地进行确定。可以在第二时间段，即第一时间段后的任何时间，例如第一受试者样本后的1天、1周、1个月、2个月、3个月、1年、2年或更久的时间，从进行第一次测量的患有PCa的相同受试者身上采集第二受试者样本。在特定实施方案中，在受试者接受治疗（例如化疗或放疗）前采集第一受试者样本；并在治疗后采集第二受试者样本。在另一特定实施方案中，在受试者已经开始/接受治疗（例如化疗或放疗）后采集第一受试者样本，并在之后，在治疗过程的不同时间段采集第二受试者样本。这些方法能够对之前诊断罹患PCa的所选受试者的Pca进展进行评估。因此，如果该PCa预后不良，那么应该设计其他疗法以治疗所述受试者体内的PCa。根据本发明提供的教导可以轻易的跟进施用所述新治疗后PCa的进展。

如前所述关于本发明的诊断方法，可以通过本领域已知的任何合适方法（例如qPCR）来确定生物标记基因（PCA3、PSMA和PSGR）的表达水平。在大量可重复的条件下获得该测量值。

一旦确定在不同时间段的受试者样本（第一和第二受试者样本）中生物标记基因的表达水平，则有必要鉴定，在第二受试者样本中至少一个所述基因的表达与在第一受试者样本中的所述基因生物标记的表达水平相比是否显著升高。可选地，如果需要，可以分析在第二受试者样本中至少一个所述基因的表达与在第一受试者样本中所述基因生物标记的表达水平相比是否显著下降或没有变化。应用于生物标记基因表达水平的术语“显著升高”、“显著下降”和“没有变化”在之前已经定义。

因此，在第二受试者样本中至少一个所述生物标记基因（PCA3、PSMA和PSGR）的表达水平相对于在第一受试者样本中每个所述生物标记基因的表达水平显著升高，其表明所研究的受试者体内PCa在进展（即其具有不良的预后）；因此，应该改变施用于所研究的受试者的疗法并应该设计新疗法以治疗所述受试者体内的PCa。根据此方法可以轻易跟进受试者体内PCa的进展。

反之，如果在第二受试者样本中至少一个所述生物标记基因的表达水平相对于在第一受试者样本中每个所述生物标记基因的表达水平没有显著升高，或者甚至，如果在第二受试者样本中至少一个所述生物标记基因的表达水平相对于在第一受试者样本中每一个所述生物标记基因的表达水平显著下降，那么所研究的该受试者体内的PCa没有进展（即，其不具有不良预后）。

此外，可以通过不同基因表达水平与PCa的其他生物标记值的结合来进一步改进根据本发明的用于监测PCa进展的方法，从而当至少一个上述基因的表达水平或至少所述其他生物标记值低于截止值时，可以认为疾病没有进展。如上所述，在由PSAD和PSA组成的组中选择其他生物标记。

因此，另一方面，通过施行上述定义的步骤（i）和（ii）来实施根据本发明的用于监测对疗法响应的方法，但是其中步骤（i）和（ii）还包含确定患者体内的PSAD，其中步骤（iii）还包含将患者体内的PSAD水平与PSAD的预定的截止值作比较，其中所述预定的截止值对应与ROC（接受者操作特征曲线）中在所述理想敏感度下的最高特异性相关的PSAD值，该曲线根据处于罹患***癌风险的患者群体中确定的PCA3、PSMA和PSGR基因的表达水平和PSAD来计算。最后，该方法能够推断PCa是否有进展，即如果所述样本中至少一个所述基因的表达水平相对于所述基因的所述预定的截止值升高了或没有变化，或PSAD值相对于所述预定的截止值升高了或没有变化，则PCa在进展中。

另一方面，通过施行上述定义的步骤（i）和（ii）来实施根据本发明的用于监测对疗法响应的方法，但是其中步骤（i）和（ii）还包含确定患者的体内的PSA，其中步骤（iii）还包含将患者体内的PSA水平与PSA的预定的截止值作比较，其中所述预定的截止值对应与ROC（接受者操作特征曲线）中在所述理想敏感度下的最高特异性相关的PSA值，该曲线根据处于罹患***癌危险风险的患者群体中确定的PCA3、PSMA和PSGR基因和PSA的表达水平来计算。该方法能够推断PCa是否有进展，如果检测出在所述样本中至少一个所述基因的表达水平相对于所述基因的所述预定的截止值升高了或没有变化，或PSA值相对于所述预定的截止值升高了或没有变化，则PCa在进展中。

选择活检患者

如上所述，可以将本发明的教导用于选择活检患者。事实上，由于PSA检验的低特异性进行了很多不必要的活检。特别是具有在被称为“灰色区域”的4.0ng/mL至10.0ng/mL区域中的血清PSA水平的患者的情况下，PSAD远比总PSA更精确（Ohori M,等Urology46:666-71(1995)）。

如本发明的作者所示，本发明的标记组的应用能够判定具有升高的敏感度和特异性的患者是否罹患PCa，从而能够大幅度减少不必要活检的数量。比如本发明的实施例中所示，通过在特殊临床目的组（血清PSA范围在4ng/mL至10ng/mL内，并在之前未接受活检）中使用本发明提供的3分量生物标记结合PSAD节省的活检数计算为“节省的活检=真阴性+假阴性”，其将是：

-敏感度为100%时，可以节省32.5%的活检，

-敏感度为96%时，可以节省41.6%的活检，

这对应于欧洲地区每年节省大约126,750至162,240的活检。

因此，另一方面，本发明涉及用于评估受试者是否必须接受***活检的方法，其包含

（ii）将所述PCA3、PSMA和PSGR基因的表达水平与每个所述基因的预定的截止值作比较，其中每个基因的所述预定的截止值对应所述基因的表达水平，其与ROC（接受者操作特征）曲线中在理想敏感度下的最高特异性相关，该曲线根据处于罹患PCa风险的患者群体中确定的所述PCA3、PSMA和PSGR基因的表达水平来计算，

可以通过确定其他***生物标记来改进用于评估受试者是否必须接受***活检的方法。特别的，该其他标记可以是PSA密度（PSAD）、游离血清PSA水平、总血清PSA水平、游离血清PSA水平对总血清PSA水平的比例、PSA前体水平和PSA倍增时间（PSADT）（如上述在本发明的诊断方法的内容中所解释的进行定义和计算）。

根据本发明的方法进行分析的患者优选是之前未接受***活检的患者。在另一优选的实施方案中，根据本发明进行分析的该患者是之前至少接受过一次活检、之前至少接受过两次活检、之前至少接受过三次或更多次活检的患者。

因此，在优选的方面，本发明涉及根据本发明选择活检的患者的方法，

其中步骤（i）还包含在确定患者体内的PSAD，

其中步骤（ii）还包含将患者体内的PSAD水平与PSAD的预定的截止值作比较，其中所述预定的截止值对应与ROC（接受者操作特征曲线）中在所述理想敏感度下的最高特异性相关的PSAD值，该曲线根据处于罹患***癌风险的患者群体中确定的PCA3、PSMA和PSGR基因的表达水平和PSAD来计算，而且

其中，在所述样本中至少一个所述基因的表达水平相对于所述基因的所述预定的截止值升高，或PSAD值相对于所述预定的截止值升高，其表明该受试者为***活检的候选者。

在另一优选的方面，本发明涉及根据本发明选择活检的患者的方法，

其中步骤（i）还包含确定患者体内PSA，

其中步骤（ii）还包含将患者体内的PSA水平与PSA的预定的截止值作比较，其中所述预定的截止值对应与ROC（接受者操作特征曲线）中在所述理想敏感度下的最高特异性相关的PSA值，该曲线根据处于罹患***癌风险的患者群体中确定的PCA3、PSMA和PSGR基因的表达水平和PSA来计算，而且

其中，在所述样本中至少一个所述基因的表达水平相对于所述基因的所述预定的截止值升高，或PSA值相对于所述预定的截止值升高，其表明该受试者为***活检的候选者。

在优选的实施方案中，用于评估受试者是否必须接受***活检的方法由PSA水平高于4ng/mL的患者、具有阳性DRE的患者或50岁以上的患者组成。在更优选的实施方案中，处于罹患PCa风险的患者群体由PSA水平低于10ng/mL的患者组成。

本发明的试剂盒

另一方面，本发明涉及包含第一组分和可选的第二组分的试剂盒，其中该第一组分是一套试剂，其由以下试剂组成

（i）能够确定基因PCA3表达水平的试剂；

（ii）能够确定基因PSMA表达水平的试剂；

（iii）能够确定基因PSGR表达水平的试剂；

可以将本发明的试剂盒用于诊断PCa，即用于评估患者是否罹患PCa，或用于评估或监测PCa患者对疗法的响应，即用于评估治疗对诊断出PCa的受试者的疗效，或用于监测受试者体内PCa的进展或分化，即用于确定诊断出PCa的受试者的预后。

在本发明的上下文中，“试剂盒”应理解为含有实施本发明的方法所必须的不同试剂的产品，将其包装以便运输和储存。适于包装试剂盒成分的材料包括水晶、塑料（聚乙烯、聚丙烯、聚碳酸酯等等）、瓶、管瓶、纸、信封等等。此外，本发明的试剂盒可以包含试剂盒内不同成分的同时、连续或独立使用的说明书。所述说明书可以是打印的材料的形式，或能够被受试者读取的可以储存说明书的电子支持的形式，如电子存储介质（磁盘、磁带等等）、光学介质（CD-ROM、DVD）等等。此外或者可选地，该介质可以含有提供所述说明书的互联网adDRMsses。

“能够确定基因表达水平的试剂”是指能够确定基因表达水平，例如，RNA材料的提取等等，例如，确定对应mRNA的水平等等的一种化合物或一套化合物，例如通过RT的方式用于对应的cDNA合成的引物，用于DNA扩增的引物，能够与由所述基因编码的mRNA（或相应的cDNA）特异性杂交的探针，Taqman探针等等。

在特定实施方案中，设计本发明的试剂盒以用于qPCR试验。此外，在优选的实施方案中，本发明的试剂盒的第一组分由PCA3、PSMA和PSGR每一个基因的特异性Taqman探针组成。用于qPCR分析的基因表达试验可以由本领域技术人员设计或购买自例如Applied Biosystems，编码Hs01371938-m1（PCA3）、Hs00379515-m1（PSMA）和Hs00951952-m1（PSGR）（实施例1）。

另一方面，本发明涉及本发明的试剂盒的用途，其用于PCa的诊断、评估或监测患有PCa的受试者对疗法的响应、监测受试者体内PCa的进展或判定患者是否必须接受***活检。

在优选的实施方案中，对具有4ng/mL至10ng/mL血清PSA水平的受试者实施本发明的试剂盒。

通过以下实施例的方式对本发明进行详述，其仅为说明，而绝不用于限制本发明的范围。

实施例1

尿液中PCa早期检测的三基因组的鉴定

1.材料和方法

1.1患者和尿液收集

此研究获Vall d’Hebron医院的机构审查委员会认可。从Valld’Hebron医院（巴塞罗那-西班牙）的泌尿部门获得并在***按摩（PM）后立刻从接受***活检的198个男性身上采集所有尿样，活检指示为异常的直肠指检（DRE）和/或高于4.0ng/ml的血清PSA。获得所有患者的书面通知许可。将具有其他已知肿瘤和/或之前接受过PCa疗法的患者从此研究中排除。表1示出了这154个患者的临床和病理学信息数据。

PM操作方法：通过对***从底到顶，每个叶从侧边到中线***地应用数字重压施行PM。

活检操作方法和PCa检出率：使用端射式超声波换能器（Falcon2101,B-K Medical Inc）和自动18号针头（Bard,Inc.）进行活检。根据维也纳列线图，每个过程中除去的最低核心数量为10，而且将1-8个的多余核心除去（Remzi等，J.Urol.2005;174:1256-60;discussion1260-1;author reply1261）。

在所研究的总受试者组中，198个样本中有154个获得了足够用于分析的RNA，其对应78%的信息样本率（91%的PCa患者和28%的良性患者）。通过***活检的PCa检出率为37%（57/154）。在77个特殊临床目的患者的子组中，为了判定是否应该施行活检，而且其具有4ng/mL至10ng/mL的PSA范围并在之前未接受活检，该PCa检出率为36%（28/77）（表1）。

表1：信息患者的临床和病理学信息

1.2样本制备

在尿收集杯中收集尿样（第一次收集大约50mL），在冰上保存，运送到实验室并在30分钟内处理。将该尿样在4°C下以2500g离心10分钟，然后用冷PBS1X清洗小球2次。最后，将该小球在-80°C下用1:5RNA Later（Ambion）保存直到RNA提取。

1.2.1RNA分离和预扩增

用

病毒RNA迷你试剂盒（Qiagen）提取尿液RNA。使用SuperScript III逆转录酶（Invitrogen）合成单链cDNA，将cDNA在-20°C下保存直到用TaqMan Preamp Master混合试剂盒（AppliedBiosystems）预扩增。

1.2.2定量PCR分析

由发明人选择3个假定的PCa尿生物标记（PCA3、PSMA和PSGR）。通过使用

基因表达检测（Applied Biosystems）将定量PCR（qPCR）用于分析所述3个假定的PCa尿生物标记和对照转录物PSA。在ABI-棱镜-7900qPCR装置上实施3次反应，只接受标准方差（STDEV）小于（<）0.38的结果。将阈值水平设置到qPCR的指数期。使用ABI-棱镜-7900SDS软件V2.3（Applied Biosystems）进行数据分析，并对每个平板设置相同的基线和阈值，以对每个样本的所有基因产生阈值循环（C_t）值。为了排除一种可能性，即所述标记也可能在可在尿沉淀中正常发现的非癌症细胞（如来自尿路上皮、肾脏、膀胱和血液的细胞）中表达，将临床样本的含量标准化成***源RNA的量。因为在尿中只发现相对少量的***细胞，在qPCR前施行cDNA预扩增步骤。然后发明人建立预扩增前的ct（PSA）小于（<）35的qPCR截止，以确定样本是否是提供信息的，即存在的RNA的量足以产生精确的结果。对每个标记按log（（ct（标记）/ct（PSA）×1000）计算分数。确定每个标记的截止值，而且当该标记超过该截止值时认为该样本为阳性。

1.3统计分析

通过比较PCa和阴性活检个体之间的平均值来完成候选生物标记的特征化。当数据分布正常时使用T检验及Welch校正，并在其他情况下使用Mann-Whitney检验。使用Shapiro-Wilk正态性检验证明正态性。根据用于稳定方差的对数转化数据进行所有检验。使用多变量分析以研究候选标记和疾病状况之间的联系。

使用接受者操作特征（ROC）曲线和曲线下面积（AUC）评估每个标记分数的性能，作为区别PCa组患者和其他组患者的一项措施。对每个标记单独计算ROC曲线，并对标记组合以及PSA计算多变量ROC（多ROC）。

简言之，对每个生物标记使用检测阈值；然后，如果至少一个分数高于该检测阈值，将新标记表示为阳性。在阈值的范围内计算敏感度和特异性值。按下列方法获得新标记的多ROC曲线点：对固定的敏感度值，从与敏感度值匹配的点云中的特异性范围中选择特异性最大值。

为了组合一个以上标记（k），后续过程如下：首先，对每个生物标记使用k-分量检测阈值；然后，如果至少一个分数高于该检测阈值，将新标记表示为阳性。在k-分量阈值的范围内计算敏感度和特异性值。这产生了点云。按下列方法获得新标记的最佳ROC曲线点：对固定的敏感度值，从与敏感度值匹配的点云中的特异性范围中选择特异性最大值（Baker,S.G.,J Natl Cancer Inst2003,95,511-515）。因为当k增长时，计算的复杂性指数增长，只有3个标记同时加入。使用指向最佳ROC曲线点的k-分量截止值来新变量加入k-多样标记。将这些k-分量阈值与该新变量值结合，从而产生用于获得新的最佳ROC曲线的（k+1）分量检测阈值。其使用PASW V17.0和自由统计语言R以及来自Bioconductor项目（http://www.bioconductor.org）的ROC包来施行统计分析。

测量多ROC曲线下面积（AUCm），以比较组合标记和单个标记之间的结果预测性能。为了确定在固定的敏感度下，该组合模型的预测效果是否明显比单个生物标记预测效果更好，我们使用比例的z检验来比较对应的假阳性率。如Krzanowski等（J.Biopharm.Stat.2009,20:485–487）中所述，单独对PSMA、PSGR和PCA3计算z检验的假阳性率的方差。我们在PSMA、PSGR和PCA3的组合和PSA（（PSMA_PSGR_PCA3）_PSA）的实例中使用重采样方法。对多个检验问题修正这些比较中的P值，然后进行假发现率过程（J.R.Stat.Soc.Ser.B(Methodol)1995;57:289–300））。

制作ROC曲线以表明生物标记组合性能的主要问题是过拟合。为了控制这种偏差，我们使用根据分半（50%）方法的方式来验证该结果（J.Clin.Epidemiol.2001;54:774–781）。简言之，使用50%的该样本作为训练集以计算ROC曲线。使用该ROC曲线以确定获得限定组的敏感度（90至100%）需要的截止值。因此，通过确定的截止，使用检验样本以评估对应于每个敏感度的特异性。重复该程序500次，并通过计算所有重复后产生的平均值获得最后的评定。通过使用PASW V17.0和自由统计语言R以及来自Bioconductor项目（http://www.bioconductor.org）的ROC包来施行统计分析。

2.结果

通过***活检的PCa检出率为37%（57/154）。在所研究的总受试者组，198个样本中有154个产生足够用于分析的RNA，其对应78.8%的信息样本率（PCa患者为95.0%，良性患者为70.3%）。

通过***按摩后从154个患者身上获得的尿沉淀中检验PCA3、PSGR、PSMA和其他临床参数，以确定它们是否能够区别患有PCa的患者和具有阴性穿刺活检的患者。PCA3（p=0.018）、PSGR（p<0.001）、PSMA（p=0.016）和PSAD（p=0.027）统计上显著（图1（A至D）方框和晶须图），而PSA（p=0.55）、游离PSA（fPSA）（p=0.60）和***体积（PST VOL）（p=0.053）没有显示统计上的显著性。

在多变量分析后，发明人选择PCA3、PSGR、PSMA和PSAD用于ROC曲线分析以使诊断效力直观化，并总结该尿样的基于基因的qPCR试验的数据。获得以下AUC值：PCA3（0.60）、PSGR（0.64）、PSMA

（0.62）和PSAD（0.61）（图2）。显著水平P（面积=0.5）分别为p=0.043、0.002、0.012和0.051。

为了确定多种生物标记的组合是否能够超过单个生物标记改进性能，使用多ROC方法（PSMA_PSGR_PCA3）并使用传统二进制逻辑回归分析来组合PSMA、PSGR和PCA3（3M）。

由于癌症的多因子性质，标记A在一个患者体内可能是阳性，而标记B在另一个患者体内，逻辑模型满足逻辑曲线以适于患者的疾病概率。使用这种技术，两个标记的组合是实质上线性的，其将单独的权重分配给每个标记。其在两个标记的表达比每个标记的单独表达更显著的假设条件下是有效的。然而，当A或B自身的表达足以将患者分类时，出现了信息缺失。因此，在本发明中研究的模型中，如果至少一个分数高于其检测阈值，那么将该组合标记表示为阳性。该多ROC模型的性能高于该逻辑回归分析（图3）。

3M（PSMA_PSGR_PCA3）的多ROC下面积为0.74（0.68–0.80）（图2）。它们之间进行比较得到以下结果：3M对PCA3P=0.0071，3M对PSGR P=0.0493，3M对PSMA P=0.0253，PSMA对PSGR P=0.75，PSMA对PCA3P=0.69，和PSGR对PCA3P=0.46（表2）。

表2通过比例的Z检验对PSMA、PSGR、PCA3和3M（PSMA_PSGR_PCA3）的比较

通过使PSMA的敏感度和特异性的和最大化，该试验敏感度为81%（68至90），该特异性为41%（31至52）。如所得到的，对于PSGR，该试验敏感度为63%（49至77），该特异性为64%（54至73），而且对于PCA3，该敏感度为86%（74至94），该特异性为35%（27至45）。对于3M，敏感度为89%（79至95），特异性为45%（35至57）。表2示出了ROC曲线的统计性比较。当通过将敏感度固定在90至100%的临床目的值范围比较PSMA、PSGR、PCA3和3M，而当单个标记的特异性从100%敏感度下降到0%时，该组合模型维持29%（21至39）的特异性（图2）。施行标准Z检验以确定这些差异是否显著。例如，对于96%的敏感度，获得以下P值：3M比PSMA；P1/40.0001，3M比PSGR，P1/40.0002，3M比PCA3；P1/40.0006。为了验证这些数据，我们通过500次重复的分半方法进行验证。我们建立了敏感度范围在90%至100%的验证ROC曲线（表3）。

表3：通过500次重复的分半方法的验证

然后将这3个标记模型（3M）与PSAD（PSA/PST VOL）组合成新标记。为此，发明人对每个标记使用4-分量标记检测阈值。如果至少一个标记高于其检测阈值，则将该组合标记表示为阳性。为了绘制该ROC曲线，发明人计算4-分量阈值范围内的敏感度和特异性。因此，发明人能够确定敏感度的值。从发明人已经获得的与敏感度相匹配的特异性范围中选择特异性最大值。组合的标记模型的AUC为0.80（0.71至0.83）。敏感度为96%时，特异性为40%。阳性和阴性预测值分别为48%和95%（图2）。表4含有所述组合（（PCA3、PSRG和PSMA）和PSAD）的数值。

表4：（PCA、PSRG和PSMA）和PSAD组合的最佳截止值

在具有4ng/mL至10ng/mL的PSA的患者体内的3标记模型

为了判定是否应该施行活检，检验特殊临床目的的子组。该组由之前没有接受PB的82个患者组成，其结果在4ng/mL至10ng/mL之间的PSA诊断“灰色区域”内。通过PB的PCa检出率为34%（28/82）（表1）。在所研究的总受试者组中，93个样本中有82个产生足够用于分析的RNA，对应信息的样本率88.2%。

通过单变量分析检验所有标记，以观察它们是否能够区分PCa患者和具有阴性PB的患者。得到以下结果：PSMA（p=0.003）、PSGR（p=0.009）、PCA3（p=0.025）、PSAD（p=0.036）（图1），而且***体积（p=0.02）统计上显著，而PSA（p=0.26）和fPSA（p=0.67）没有显示任何统计显著性。我们获得了以下AUC（95%CI）值：PSMA0.74（0.63-0.86）、PSGR0.66（0.54-0.79）、和PCA30.61（0.48-0.74）。3M的AUC为0.82（0.77-0.86），3M与PSAD组合的AUC为0.80（图4）。表2示出了ROC曲线的统计比较。

通过使PSMA的敏感度和特异性的和最大化，敏感度为64%（44至81），特异性为70%（56至82）。对于PSGR，敏感度为61%（41至79），特异性为70%（56至82），对于PCA3，试验敏感度为71%（51至87），特异性为54%（40至67）。对于3M，敏感度为89%（72至96），特异性为57%（44至70）。然后，我们通过将敏感度固定在90至100%的临床目的值范围内比较PSMA、PSGR、PCA3和3M，而当单个标记的特异性在100%敏感度下降到0%时，该组合模型维持46%（37至63）的特异性。我们获得了PSMA的特异性为4%（1至13），PSGR的特异性为12%（6至24）和PCA3的特异性为0%（0至7）（图3）。对两部分在敏感度范围（90%至100%）内施行标准检验以确定这些差异是否显著。表5示出了在敏感度90%至100%的区域内的验证ROC曲线。例如，对96%的敏感度，我们获得以下P值：3M比PSMA，p=0.0005；3M比PSGR，p<0.0001；3M比PCA3；p=0.0001。

表5：在特异性临床（血清PSA4ng/mL至10ng/mL，在之前未接受活检）患者的子组中（PCA、PSRG和PSMA）和PSAD组合的最佳截止值

确定可以避免的活检数

最后，通过在全组上和PSA为4ng/mL至10ng/mL的组上使用组合的标记模型（3M）来计算可以避免的活检数，其公式为节省的活检%=真阴性+假阴性。敏感度为96%时，在全组中可以避免23%（具有3M∨PSA23%）的活检，其包括PSA的全部范围和重复活检。在此实例中该阳性（PPV）预测值和阴性（NPV）预测值分别为46%和94%。在之前未接受活检的特殊目的的临床风险组的分析和PSA“灰色区域”在4ng/mL至10ng/mL之间的结果中，敏感度为96%时，可以避免34%的活检。PPV和NPV分别为51%和96%（图5）。

3个标记组合（PCA3、PSMA和PSGR）提供了比PCA3、PSMA和 AMACR组合更高的敏感度

如前所述确定该分数

对每个生物标记使用检测阈值（截止）；然后，如果至少一个分数高于其检测阈值，将该患者表示为阳性。在阈值（截止）范围内计算敏感度和特异性值。对固定的敏感度值，从与该敏感度值相匹配的点云中的特异性范围中选择特异性最大值。

在以上实施例中，从25个患者的同期群组（48%罹患PCa）中测定PCA3、PSMA、PSGR和PSMA的相对表达。PCA3、PSMA和PSGR的截止组合（分别为10.3、16.57和1.43）得到92%的敏感度和67%的特异性。当具有相同的PCA3和PSMA截止并具有AMACR的102截止的PCA3、PSMA和AMACR组合得到77%的敏感度和64%的特异性时，两者都低（并且敏感度的差异非常大）。

然后，计算敏感度和特异性之和（分别为1.6和1.4）。PCA3、PSMA和PSGR组合得到比PCA3、PSMA和AMACR组合更高的值。

使用AMACR的较低截止增加了敏感度但却降低了特异性，因此其不是一个可行的选择。例如，96截止给出了84.62%的敏感度和54.55%的特异性，而敏感度和特异性之和维持在1.4，表明这不是一个较好的总结果。

该实施例示出了如果至少一个分数高于其检测阈值就将该患者表示为PCa阳性的该方法提高了敏感度并且未降低特异性。这是令人惊奇的，因为改变用于单个标记的截止总是会同时改变敏感度和特异性。一般来说，使用较低的截止以提高敏感度导致较低的特异性值。令人惊奇的是，通过使用PCA3、PSMA和PSGR的组合，能够使用较高的和更特异性的截止值以达到与单独使用每个标记时相同的敏感度值。

实施例示出了如果3个标记（PCA3、PSMA和PSGR）中任何一个的至少一个分数高于其检测阈值，将该患者表示为阳性的方法可以在与每个单独标记一起使用的相同敏感度值下鉴定出更多的患者。PSGR能够鉴定***癌患者#16和#25，其具有低水平的PCA3和PSMA。PSMA能够鉴定***癌患者#19，其具有低水平的PCA3和PSGR（左边组）。该组合能够鉴定出患有PCa的较大的患者库，因为其捕获更多的***癌中常见的突变异质性。相比之下，与AMACR而不是与PSGR的组合不能在这种组合的敏感度和特异性（右边组）下鉴定出其他患者。

3.讨论

发明人已经研究了在PM后的尿沉淀中对PCa的多样的基于qPCR的检验。引入其他临床参数能够进一步改进诊断精确度。这些参数之一可以是PSAD。在被称为“灰色区域”的血清PSA4.0ng/mL至10.0ng/mL范围内，PSAD明显比总PSA更精确（Ohori M,等1995,Urology46:666-71）。因此发明人将PSAD作为标准包括在内，以用于确定是否施行***活检。

在PCa细胞中高度过度表达的***特异性mRNA会是理想的目标。因为这些基因也可以在尿沉淀中正常发现的非癌症细胞（如来自尿路上皮、肾脏、膀胱和血液的细胞）中表达，将其在临床样本中的含量标准化成***源RNA的量。这可通过使用基因/PSA mRNA浓度的比例作为诊断指示物来达成。与血液中的蛋白浓度相比，可以看出PSA mRNA表达在正常***细胞中相对稳定，并且仅报道过PCa细胞内PSA表达的微弱下调（Meng FJ,等，Cancer Epidemiol Biomarkers Prev11:305-9(2002)）。本研究中所使用的基因在***肿瘤中，与非肿瘤***组织相比显示出高的上调。因此在***肿瘤中PSA的下调将导致肿瘤-基因/PSA的比例提高。因为PSA在尿中存在的其他细胞，如变移上皮、血液或肾脏中不表达，所以可以将其用作***腺体持家基因。为了判定样本是否可以提供信息，即存在的RNA的量是否足以产生精确的结果，发明人使用PSA mRNA产量，因为其只在***细胞中出现，而且不会受尿中存在的其他细胞类型的不同含量影响。

尽管已经在大型筛选程序中证明了对PCA3表达的基于尿的检验，只有两个基于诊断分布图的研究分析考虑到癌症发展的异质性。多种生物标记的组合应该更明确地改进单个标记的性能。为此，发明人使用尿转录物的新型多样组，其通过在组合的ROC分析中将3个最好的标记（PCA3、PSGR和PSMA）和PSAD组合形成新标记而产生。在该分析的研究组中，组合的标记模型的AUC（0.80）与单个标记的AUC：PCA3（0.60）、PSGR（0.64）和PSMA（0.62）相比得到了显著改善。例如，PCA3分数为7.23，与PSGR的65.51分数、PSMA的46.61分数和PSAD的0.21分数组合对应在具有高诊断精确度的ROC曲线上的点：敏感度和特异性（分别为96%和40%）（图2）。只分析具有血清PSA4ng/mL至10ng/mL并在之前未接受活检的患者，该组合的标记模型在96%的敏感度和AUC（0.89）下其特异性提高到62%（图4）。

因为发明人和之前的研究使用不同方法来检测患者尿中的PCA3转录物，而且它们很多没有在其研究组中使用相同的PCa患病率（大概35%），直接比较AUC可能不恰当；然而，发明人示出了当与上述研究的结果或血清PSA比较时，PCA3显示出改善的AUC。重要的是，发明人已经表明，组合模型与单独的PCA3相比明显改善了预测能力。构成组合生物标记方法的原理与用于鉴定乳腺癌患者中的高复发风险的检验一致（Paik S,等；N Engl J Med351:2817-26(2004)y van de Vijver MJ,等，N.Engl.J.Med.347:1999-2009(2002)）。总之，发明人已经展示了来自准备进行***活检的患者的尿沉淀上的多样qPCR试验比单独的血清PSA或PCA3性能更优越。

为了将这些发现转入临床，必须分析假阴性和假阳性的相对重要性。结果，我们设想将敏感度固定在高范围（90%至100%）上，并计算对应的特异性。我们选择高百分比，因为在判定活检是否应该施行的检验中，假阴性会比假阳性更糟。这是因为遗漏癌症事例的后果可能对患者产生致命的影响（Pepe等，2008,J.Natl.Cancer Inst.,100:1432-1438）。在接近100%敏感度时，单个标记的特异性通常大幅度下降。在该研究中，在100%敏感度下，PSMA、PSGR和PCA3的特异性为0%，而组合模型（3M）维持29%的特异性。使用3M与PSA的组合没有出现更多的优势（29%）。

由本发明提供的该组合的3标记模型+PSA的结果提供了完全升高的敏感度，而没有降低特异性。转入临床中，发明人只通过PSA检验获得了同样高的敏感度，但大幅增加了特异性。使用此方法，在100%、33%的敏感度和96%的敏感度下，可以节省42%的活检。这相当于在欧洲地区每年节省大约126,750至162,240例的活检。

作为本研究和其他研究的可能的限制，对PCa的阴性患者的定义是基于近期的阴性活检。然而这种定义可能存在问题，因为12%至32%的具有阴性***活检的患者实际上会在晚些时候被诊断出罹患PCa（Cervera Deval J,等Actas Urol.Esp.28:666-71(2004)and Raber M,等，Arch.Ital.Urol.Androl.72:197-9(2000)）。结果，很多发现具有阴性活检的男性经受重复活检以排除PCa，因此将会出现进行阳性检验的大量个体，其表现为阳性，尽管其活检为阴性。然而，本发明提供的数据支持将本发明提供的4标记非侵入性试验方法应用于对PCa的精确诊断检验。

Claims

1.一种在理想敏感度下用于诊断受试者体内***癌（PCa）的方法，其包括

2.根据权利要求1所述的方法，

其中步骤（i）还包含确定患者体内用于PCa的其他生物标记，其中所述生物标记选自由PSA密度（PSAD）、游离血清PSA水平、总血清PSA水平、游离PSA水平对总血清PSA水平的比例、PSA前体水平和PSA倍增时间（PSADT）构成的组，以及

其中步骤（ii）还包含比较患者体内所述其他生物标记的水平与所述生物标记的预定的截止值，其中所述预定的截止值对应生物标记值，其与ROC（接受者操作特征）曲线中在所述理想敏感度下的最高特异性相关，该曲线根据处于罹患PCa风险的患者群体中确定的所述PCA3、PSMA和PSGR基因的表达水平和其他生物标记的水平来计算，以及

其中，在所述样本中至少一个所述基因的表达水平相对于所述基因的所述预定的截止值升高，或其他生物标记的水平相对于所述预定的截止值升高，其表明在所述理想敏感度下该受试者罹患PCa。

3.一种用于评估或监测患有PCa的受试者对疗法响应的方法，其包含比较

（i）确定在施用所述疗法之前获得的从所述受试者分离的生物流体样本中的所述PCA3、PSMA和PSGR基因的表达水平，其中所述生物流体选自由尿液、***分泌物、***和***按摩后的尿液组成的组，以及

（ii）确定在施用所述疗法过程之中或之后从所述受试者中分离的生物流体样本中的所述PCA3、PSMA和PSGR基因的表达水平，其中所述生物流体选自由尿液、***分泌物、***和***按摩后的尿液组成的组，以及

（iii）将施用所述疗法之前和之中或之后获得的所述PCA3、PSMA和PSGR基因的表达水平与每个所述基因的预定的截止值作比较，其中每个基因的所述预定的截止值对应所述基因的表达水平，其与ROC（接受者操作特征）曲线中在理想敏感度下的最高特异性相关，该曲线根据处于罹患PCa风险的患者群体中确定的所述PCA3、PSMA和PSGR基因的表达水平来计算，

其中，施用所述疗法后，生物流体样本中至少一个所述基因的表达水平相对于所述基因的所述预定的截止值显著下降或没有变化，其表明施用的疗法有效，

或者

其中，施用所述疗法后，生物流体样本中至少一个所述基因的表达水平相对于所述基因的所述预定的截止值显著升高，其表明施用的疗法无效。

4.根据权利要求3所述的方法，

其中步骤（i）和步骤（ii）还包含确定患者体内对PCa的其他生物标记，其中所述其他生物标记选自由PSA密度（PSAD）、游离血清PSA水平、总血清PSA水平、游离PSA水平对总血清PSA水平的比例、PSA前体水平和PSA倍增时间（PSADT）构成的组，以及

步骤（iii）还包含比较所述其他生物标记的水平与所述生物标记的预定的截止值，其中所述预定的截止值对应生物标记值，其与ROC（接受者操作特征）曲线中在理想敏感度下的最高特异性相关，该曲线根据处于罹患PCa风险的患者群体中确定的所述PCA3、PSMA和PSGR基因的表达水平和所述其他生物标记来计算，

其中，在所述样本中至少一个所述基因的表达水平相对于所述基因的所述预定的截止值显著下降或没有变化，或所述生物标记的水平相对于所述预定的截止值降低了，其表明施用的疗法有效，

或者

其中，使用所述疗法后，在该受试者样本中至少一个所述基因的表达水平相对于所述基因的所述预定的截止值显著升高，或所述生物标记的水平相对于所述预定的截止值显著升高，其表明施用的疗法无效。

5.一种用于监测受试者体内***癌（PCa）进展的方法，其包含

（i）确定在第一时间段从所述受试者身上分离的生物流体样本中的PCA3、PSMA和PSGR基因的表达水平，其中所述生物流体选自由尿液、***分泌物、***和***按摩后的尿液组成的组，

（ii）确定在第二时间段从相同受试者身上获得的生物流体样本中的所述PCA3、PSMA和PSGR基因的表达水平，其中所述生物流体选自由尿液、***分泌物、***和***按摩后的尿液组成的组，而且其中所述第二时间段晚于所述第一时间段，以及

其中，在第二时间段，在该样本中至少一个所述基因的表达水平相对于在第一时间段的所述表达水平显著下降或没有变化，其表明***癌在该受试者体内没有进展，

或者

其中，在第二时间段，在该受试者样本中至少一个所述基因的表达水平相对于在第一时间段的所述表达水平显著升高，其表明***癌的进展。

6.根据权利要求5所述的方法，

其中步骤（i）和步骤（ii）还包含确定患者体内对PCa的其他生物标记的水平，其中所述其他生物标记选自由PSA密度（PSAD）、游离血清PSA水平、总血清PSA水平、游离PSA水平对总血清PSA水平的比例、PSA前体水平和PSA倍增时间（PSADT）构成的组，以及

步骤（iii）还包含比较患者体内所述生物标记的水平与所述生物标记的预定的截止值，其中所述预定的截止值对应生物标记水平，其与ROC（接受者操作特征）曲线中在所述理想敏感度下的最高特异性相关，该曲线根据处于罹患PCa风险的患者群体中确定的所述PCA3、PSMA和PSGR基因的表达水平和所述生物标记来计算，

其中，在第二时间段，在该受试者样本中至少一个所述基因的表达水平或该生物标记的水平相对于在第一时间的段所述表达水平显著下降或没有变化，其表明受试者的阳性进展，

或者

其中，在第二时间段，在该受试者样本中至少一个所述基因的表达水平或该生物标记的水平值相对于在第一时间段的所述表达水平显著升高，其表明受试者的阴性进展。

7.一种用于评估受试者是否必须接受***活检的方法，其包含

（ii）将所述PCA3、PSMA和PSGR基因的表达水平与每个所述基因的预定的截止值作比较，其中每个基因的所述预定的截止值对应所述基因的表达水平，其与ROC（接受者操作特征）曲线中在理想敏感度下的最高特异性相关，该曲线根据处于罹患PCa风险的患者群体中确定的PCA3、PSMA和PSGR基因的表达水平来计算，

其中，在所述生物流体样本中至少一个所述基因的表达水平相对于所述基因的所述预定的截止值显著升高，其表明该受试者是***活检的候选者。

8.根据权利要求7所述的方法，

其中步骤（i）还包含确定患者体内对PCa的其他生物标记，其中所述其他生物标记选自由PSA密度（PSAD）、游离血清PSA水平、总血清PSA水平、游离PSA水平对总血清PSA水平的比例、PSA前体水平和PSA倍增时间（PSADT），而且

步骤（ii）还包含比较患者体内所述其他生物标记的水平与所述生物标记的所述预定的截止值，其中所述预定的截止值对应生物标记水平值，其与ROC（接受者操作特征）曲线中在理想敏感度下的最高特异性相关，该曲线根据处于罹患PCa风险的患者群体中确定的所述PCA3、PSMA和PSGR基因的表达水平和所述生物标记来计算，

其中，在所述样本中至少一个所述基因的表达水平相对于所述基因的所述预定的截止值升高，或所述生物标记的水平相对于所述预定的截止值升高了，其表明该受试者是***活检的候选者。

9.如权利要求7或8中任一项所定义的方法，其中处于罹患PCa风险的患者群体由PSA水平高于4ng/mL和/或具有阳性DRE的患者组成。

10.根据权利要求9所述的方法，其中处于罹患PCa风险的患者群体由PSA水平低于10ng/mL的患者组成。

11.在权利要求1至10中任一项所定义的方法，其中所述生物流体样本是在***按摩后获得的排出尿液样本的沉淀。

12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述理想敏感度为100%。

13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中在确定PCA3、PSMA和PSGR的相同的样本中，将PCA3、PSMA和PSGR基因的表达水平标准化成***特异性持家基因的表达水平。

14.根据权利要求13所述的方法，其中***持家基因是PSA，而且通过测定该PSA mRNA水平确定PSA的表达水平。

15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中通过定量PCR确定所述PCA3、PSMA和PSGR基因和/或所述持家基因的表达水平。

16.根据权利要求15所述的方法，其中定量PCR是多重PCR。

17.根据权利要求1至16任一项所述的方法，其中该患者罹患单独的或多病灶高等级***上皮内瘤。

18.一种包含第一组分和可选的第二组分的试剂盒，其中第一组分是一套试剂，其由以下组成

（i）能够确定基因PCA3表达水平的试剂；

（ii）能够确定基因PSMA表达水平的试剂；

（iii）能够确定基因PSGR表达水平的试剂；

19.根据权利要求18所述的试剂盒的用途，其用于诊断***癌、评估或监测罹患***癌的受试者对疗法的响应或监测受试者体内***癌的进展。

20.根据权利要求19所述的用途，其中作为***活检的候选者而待评估的受试者具有4ng/mL至10ng/mL的血清PSA水平。