CN106282374A - Fam13aos作为检测***癌的分子标记物及其应用 - Google Patents

Fam13aos作为检测***癌的分子标记物及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种与***癌相关的分子标记物，所述分子标记物为FAM13AOS。本发明还公开了一种用于检测***癌的诊断试剂盒，所述诊断试剂盒含有与***癌相关的分子标记物FAM13AOS。本发明进一步公开了所述的分子标记物在制备***早期诊断试剂或试剂盒中的应用。利用该分子标记物及含有该分子标记物的诊断试剂盒检测***癌不仅能够快速有效的做到早期检测，而且为基因治疗、药物治疗等临床应用提供了治疗靶点和重要依据。

Description

FAM13AOS作为检测***癌的分子标记物及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及FAM13AOS作为检测***癌的分子标记物及其应用。
背景技术
***癌是发生于男性***组织中的恶性肿瘤，在全球范围内已经成为男性第二大类常见肿瘤，位于癌症相关死亡率第六位。在欧美等发达国家和地区，它是男性最常见的恶性肿瘤，其死亡率居各种癌症的第二位；在亚洲，其发病率低于西方国家，但近年来呈迅速上升趋势，且增长比欧美发达国家更加迅速。我国***癌发病率也在逐年提高，已位于男性泌尿生殖***恶性肿瘤的第三位，仅次于膀胱癌和肾癌。***癌一般在50岁以后发病，95％发生于60岁以上的老年男性，发生率持续地随着年龄增长而增加。***癌早期多无任何症状，即使有所不适，也不足以引起病人的重视，当肿瘤增大压迫尿道时，又往往与***增生相混淆。在我国约80％的病人首先发现远处转移病灶才发现***癌。此时，病变已达晚期，预后不良。所以，***癌的早期诊断对***癌病人的治疗有极为重大的意义。
目前***癌的临床诊断方式目前主要有***直肠指检(DRE)、血清***特异性抗原(PSA)检测、直肠超声波检测、活组织病理检查等。直肠指检是***癌诊断的经典技术，主要通过医生的食指触摸***，以判断***结节的大小和形状，从而判断是否患有***癌。但直肠指检的局限性也很强：(1)患者***肿块不大时，易漏诊；(2)部分患者***癌肿大不明显，但已属于晚期；(3)患者直肠有疾患时不能使用此检测；(4)医生经验不足时可能有漏诊或者误诊的可能。***超声波检测虽然操作简单直观、无损伤，但该方法容易与***炎和***肥大混同，已不再用于***癌分期诊断。活组织病理检查因其创伤性、复杂性不能作为初筛的手段，但它是***癌确诊的金标准，一般与其他方法技术连用。目前对***癌的筛查诊断主要依靠血清PSA检测和***穿刺病理活检相结合的方法。正常情况下血液中的PSA不高(不高于4ng/ml)，当处于***癌及其他***疾病患病状态时，PSA升高成为目前筛查***癌最敏感的瘤标，但PSA增高也常见与非***癌疾病，如***炎症、***增生等多重泌尿***疾病有关，因此不易确诊，甚至可能导致疾病的误检、误诊或者病情的延误。此外，PSA增高确诊***癌时，往往患者已经属于中后期，达不到早期诊断的目的。而穿刺活检的检出率与活体穿刺的次数、位置都有较大关系，不是非常稳定的诊断方案。因此，研究更有效的***癌标记物对提高***癌的早期诊断及为患者制定合理的个体化治疗方案，减少***癌患者死亡率和改善生活质量有重要的意义，如果能有一种检测试剂盒，可以提高***癌的检出率和准确率，对于***癌的临床治疗有着重大的意义。
FAM13AOS又名FAM13A-AS1，全称FAM13A antisense RNA 1，属于lncRNA(longnon-codingRNA，长链非编码RNA)，位于第4号染色体上，是一类转录本长度超过200bp核苷酸的非编码RNA，全长3210bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，目前尚未发现它在***癌中的相关报道。
近年研究发现lncRNA是一类具有重要生物学功能的RNA，参与基因组印记、染色体沉默、染色质修饰、转录激活、转录干扰、核内运输等多种重要的调控过程，在细胞分化和发育、基因转录和翻译、遗传和表观遗传等生命活动中均发挥重要的调控作用。越来越多的权威研究证实lncRNA在肿瘤的发生发展中起着抑制或促进肿瘤的作用，在调控肿瘤细胞增殖、凋亡、细胞周期、侵袭转移能力等方面，均具有十分重要作用。目前己有较多lncRNAs被证实在包括乳腺癌、***、黑色素瘤、肝癌、结肠癌、膀胱癌等在内的人类多种肿瘤中存在差异表达并执行重要的调控功能。
近年来的研究表明，lncRNA与***癌密切相关，它们可能参与肿瘤的发生、发展和转移，所以对肿瘤的发病机制、早期诊断、个体化治疗、转移的检测和预后等可能有相应的作用。lncRNA对早期有效检测肿瘤的发生、发展及提高抗癌药物的疗效对于癌症的治疗有重要的作用。发明新型肿瘤标志物作为诊断与治疗的靶点一直是肿瘤研究的热点。
发明内容
为了实现***癌的早期发现，早期干预，本发明的目的在于提供一种与***相关的新的分子标记物。
本发明的第二目的是提供一种***癌诊断试剂盒。
本发明的第三目的是提供所述分子标记物在制备***早期诊断试剂或试剂盒中的应用。
为实现上述目的，本发明首先提供一种与***癌相关的分子标记物，所述分子标记物为FAM13AOS，其核苷酸序列为SEQ ID NO:1所示。本发明经研究发现FAM13AOS在***癌生物学样品中表达下调，显示FAM13AOS与***癌的肿瘤发生、发展存在着密切的相关性。
进一步地，本发明提供了一种用于检测***癌的诊断试剂盒，所述诊断试剂盒含有与***癌相关的分子标记物FAM13AOS。
优选的，所述的***癌的诊断试剂盒包括：特异性扩增***癌相关基因FAM13AOS的引物和说明书。
优选的，所述引物具有如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列。
优选的，所述试剂盒还包括以下组分：
(1)组织样本、血液或尿液中总RNA提取试剂：Trizol、氯仿、异丙醇和75％乙醇等。
(2)反转录试剂：逆转录缓冲液、M-MLV逆转录酶、热稳定DNA聚合酶活性的酶、RNA酶抑制剂和T重复寡核苷酸Oligo dT。
(3)定量PCR试剂：PCR缓冲液、SYBR Green荧光染料、dNTPs组成的SYBR Green聚合酶链式反应体系，引物和RNase Free H2O。
所述引物包括特异扩增如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列和对照GAPDH两对引物。
(4)***正常组织cDNA：作为阴性对照与检测样本cDNA共同定量PCR检测，每个反应体系使用与检测样本cDNA相同量。
进一步地，本发明提供了FAM13AOS在制备***癌早期诊断试剂中的应用。
优选的，所述应用是利用本发明的诊断试剂检测被试者血清、尿液或组织样本中FAM13AOS的含量，并与正常水平FAM13AOS的含量相比较，以进行***癌高危人群筛选和诊断。
本发明的有益效果如下：
本发明公开了一种与***癌相关的分子标记物FAM13AOS，并进一步证实FAM13AOS在***癌组织中表达下调。利用该分子标记物制备***癌早期诊断试剂或试剂盒，能够更早期、更便捷地检测***癌高危人群中***癌变发生、发展趋势。同时利用该分子标记物检测***癌还为基因治疗、药物治疗等临床应用提供了治疗靶点和重要依据。
附图说明
图1本发明实施例2中***癌组织样本中FAM13AOS表达下调。
图2本发明实施例2中SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列与lncRNA LOC100129066序列比对结果。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用的试剂可以商业购买得到。
本发明的发明人对10例***癌组织样本及对应癌旁组织样本进行高通量测序，结合生物信息学方法进行基因筛选，挑选出候选lncRNA FAM13AOS，现有研究中并没有FAM13AOS和***癌相关的报道，进一步，发明人进行了分子生物学方法验证，证实了FAM13AOS在***癌组织中表达下调，其相关制剂可用于治疗***癌。
本发明的FAM13AOS是在本发明之前的已知lncRNA，其基本信息如下：
Genbank登录号：Gene ID:285512，来源于人类基因组。
本发明采用RT-PCR方法检测上述lncRNA在***癌患者和正常人群中的表达，并验证了该lncRNA在***癌患者中表达下调。
荧光定量PCR法是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度。荧光定量PCR的出现，极大地简化了定量检测的过程，而且真正实现了绝对定量。多种检测***的出现，使实验的选择性更强。自动化操作提高了工作效率，反应快速、重复性好、灵敏度高、特异性强、结果清晰。
本发明FAM13AOS的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据已公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA作为模板，扩增而得到有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次扩增，然后再将多次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
实施例1 高通量测序筛选差异表达基因
1、取样
选取10例新鲜***癌组织及对应癌旁组织，取样来源于北京协和医院2012年10月到2015年12月期间行根治性***切除并双侧盆腔***清扫术的***癌病人，手术切除***后在病理科医生的指导下立即取***癌及癌旁组织放入液氮，编号后置-80℃低温冰箱保存。
2、对组织样本进行总RNA提取
采用 Reagent(invitrogen，货号15596-018)进行样本RNA提取，实验操作按产品说明书进行，具体操作如下：
收集样本后冻存于液氮，取出后把组织样本放入已预冷的研钵中进行研磨，待组织样本成粉末状后：
①入1mL Trizol，室温保存5分钟；
②加氯仿0.2mL，用力振荡离心管，充分混匀，室温下放置5分钟-10分钟；
③12000rpm高速离心15分钟后吸取上层水相(吸70％)到另一新离心管管中，注意不要吸到两层水相之间的蛋白物质。移入新管，加入等体积的-20℃预冷异丙醇，充分颠倒混匀，置于冰上10分钟；
④12000rpm高速离15分钟后小心弃掉上清液，按1mL/mL Trizol的比例加入75％DEPC乙醇洗漆沉淀(4℃保存)，洗漆沉淀物，振荡混合，4℃下12000rpm高速离心5分钟；
⑤弃去乙醇液体，室温下放置5分钟以充分晾干沉淀，加入DEPC处理过的水溶解沉淀；
⑥用Nanodrop2000紫外分光光度计测量RNA纯度及浓度，冻存于-80℃。RNA质量判定标准：RNA样本的OD260/OD280值为1.7-2.2之间；总RNA电泳图谱有清晰的28S、18S条带；70℃水浴保温1小时后的电泳图谱与水浴保温前的图谱无明显差异。
3、RNA样品的质量分析
RNA提取后琼脂糖凝胶电泳，从电泳结果可以初步判定提取的RNA样品质量合格与否，是否可以用于进一步的转录组分析。进而通过NanoDrop1000分光光度计检测RNA样品的提取情况，RNA-seq测序的样品要求：OD260/OD280为1.8-2.2。
4、高通量测序
测序平台为Illumina公司的HiSeq 2500高通量测序平台，进行高通量转录组深度测序，测序后我们运用Fast-QC(http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/)软件对测序数据的质量进行整体评估，包括碱基的质量值分布，质量值的位置分布，GC含量，PCR duplication含量，kmer的frequency等。在差异基因表达分析时，根据得到的FPKM值，采用国际公认算法EBSeq进行差异筛选。其中，筛选时，LOG2FC>1或<-1,FDR<0.05。为了更好的理解差异表达基因的功能，我们对差异表达基因进行了Gene Ontology和信号通路分析，并对差异表达基因进行功能注释，鉴于以上数据分析的结果，结合文献我们筛选了差异表达FAM13AOS，FAM13AOS在***癌样本组织中表达下调。
实施例2 RT-PCR验证***癌组织中FAM13AOS表达情况
1、材料
选取10例***癌患者，取样来源于北京协和医院2012年10月到2015年12月期间行根治性***切除并双侧盆腔***清扫术的***癌病人，手术切除***后在病理科医生的指导下立即取***癌及癌旁组织放入液氮，编号后置-80℃低温冰箱保存。
2、方法
2.1对被试者组织样本进行总RNA提取，同实施例1的提取方法。
2.2逆转录合成cDNA
采用 III Reverse Transcriptase(invitrogen，货号18080-044)进行cDNA反转录，实验操作按产品说明书进行，具体操作如下：
使用逆转录试剂盒，用逆转录缓冲液对lμg总RNA进行逆反录合成cDNA。采用25μL反应体系，每个样品取1μg总RNA作为模板RNA。获得的cDNA保存放-20℃冰箱备用。
2.3、Real-Time PCR
2.3.1仪器及分析方法
用ABI 7500型荧光定量PCR仪，采用2-△△Ct法进行数据的相对定量分析。
2.3.2引物设计
采用在线引物设计软件，基因序列参照NCBI:NR_002806.2，内参选GAPDH，引物设计后由invitrogen公司合成。具体引物序列如表1所示：
表1 引物序列
操作过程如下：
(一)反应体系：用Power Green PCR Master Mix(invitrogen，货号4367659)进行扩增，实验操作按产品说明书进行。扩增程序为：95℃5min，(95℃15sec，60℃45sec，72℃35sec)×40个循环。
表2 RealTime反应体系
组分 加入量
2×mix 10μL
上游引物(10μM) 0.5μL
下游引物(10μM) 0.5μL
模板 2μL
加入灭菌蒸馏水 至25μL
(二)引物筛选
将各样本cDNA混合后，以此为模板进行5倍梯度稀释，稀释后样品各取2μL作模板，分别用目的基因引物和内参基因引物进行扩增，同时在60-95℃进行融解曲线分析，根据扩增效率高和溶解曲线单峰原则进行引物筛选。
(三)样品RealTime-PCR检测
将各样品cDNA 10倍稀释后取2μL作模板，分别对目的基因引物和内参基因引物进行扩增。同时在60-95℃进行溶解曲线分析。
(四)琼脂糖电泳
上述反应结束后，取5μL的PCR产物进行2％琼脂糖电泳，用快速胶回收试剂盒(invitrogen公司)将大小为265bp的片段进行切胶回收，取部分测序，结果用blast软件进行同源性分析。
(五)实验结果
实时定量PCR扩增曲线拐点清楚，扩增曲线整体平行性好，表明各反应管的扩增效率相近，极限平而无上扬现在，曲线指数期斜率较大，说明扩增效率较高；样本扩增产物溶解曲线都是单峰，说明扩增产物只有一条，为特异性扩增；根据qRT-PCR的相对定量公式：2-ΔΔCt×100％，比较FAM13AOS在***癌组织和癌旁组织中的表达水平。结果显示：qRT-PCR扩增结果稳定，其中FAM13AOS在***癌组织中的表达水平仅为对照组织的32％，如图1所示。以上结果验证了高通量转录组表达数据的整合分析FAM13AOS在***癌患者中表达下调的结果。
RT-PCR产物经回收后，在ABI3730全自动测序仪上测序，该265bp的片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。用Vector NTI advance 10软件(Invitrogen公司)将该序列与FAM13AOS整个mRNA序列进行比对，比对结果显示，如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列为FAM13AOS的一部分序列，符合率为100％，如图2所示。
实施例3 试剂盒的制备
基于实施例2得到的引物组，组装本发明所述的***癌诊断试剂盒，特异扩增如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列的引物对如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示，和特异扩增管家基因(GAPDH)的引物对如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示；还包括SYBR Green聚合酶链式反应体系，如PCR缓冲液、SYBR Green荧光染料、dNTPs。所述PCR缓冲液的成分为25mMKCl，2.5mM MgCl2，200mM(NH4)2SO4。
通过对引物浓度和退火温度的优化，最终确定***癌诊断试剂盒的组成包括：(1)组织样本、血液或尿液中总RNA提取试剂；(2)反转录试剂；(3)定量PCR试剂；(4)***正常组织cDNA:作为阴性对照与检测样本cDNA共同定量PCR检测，每个反应体系使用与检测样本cDNA相同量。具体组分和使用量如表3-5所示：
表3 组织样本、血液或尿液中总RNA提取试剂
每50mg组织或200μL血液或200μL尿液中使用：
表4 反转录试剂
组分 每个反应体系使用量
5xPrimeScript Buffer 2μL
PrimeScript RT Enzyme Mix I 0.5μL
Oligo dT Primer(50微摩尔) 0.5μL
Random6mers(100微摩尔) 0.5μL
RNase Free dH20 补齐至10μL
表5 定量PCR试剂
组分 每个反应体系使用量
SYBR Green聚合酶链式反应体系 12.5μL
Forward Primer(1μM) 1μL
Reverse Primer(1μM) 1μL
RNase Free dH2O 至25μL
最佳反应条件为：
95℃预变性5min，(95℃变性15sec，60℃退火45sec，72℃延伸35sec)×40个循环，72℃延伸15min。
实施例4 本***癌的诊断试剂盒的应用
1、病例
选取25例待筛查的***癌患者，取样来源于北京协和医院2012年10月到2015年12月期间泌尿科治疗的病人。获取所有研究对象的***癌组织样本，编号后置-80℃低温冰箱保存。本研究的所有临床样本，均对患者进行知情告知并经本医院伦理委员会通过。
2、方法
使用实施例3试剂盒中的总RNA提取试剂提取组织样品中的RNA，提取方法同实施例1的方法。再使用反转录试剂将RNA反转录成cDNA，使用定量PCR试剂以试剂盒中***正常组织cDNA作为QPCR定量检测中的对照cDNA，检测组织样本中的FAM13AOS相对***正常组织表达量变化。
3、结果
通过溶解曲线分析和电泳确定目的条带，ΔΔCt法进行相对定量，样本和对照间比较采用t检验，P<0.05为差异显著。结果显示，待筛查的25例***癌患者的组织样本中有4例患者组织样本中FAM13AOS的表达量和***癌正常组织表达量无显著差异；有21例患者组织样本中FAM13AOS的表达量是***癌正常组织表达量的65％以下，其中有18例患者组织样本中FAM13AOS的表达量是***癌正常组织表达量的35％以下。经临床进一步检测，25例待筛查的患者中确诊18例***癌，这18例***癌患者与本发明制备的试剂盒检测结果一致。据此推断，本***癌的诊断试剂盒可以明确区分出***癌患者，并以此为临床提供诊断线索。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (9)

1.一种与***癌相关的分子标记物，其特征在于，所述分子标记物为FAM13AOS，其核苷酸序列为SEQ ID NO:1所示。
2.如权利要求1所述的分子标记物，其特征在于，所述FAM13AOS包含如SEQ ID NO:2所示的特异核苷酸序列。
3.如权利要求1所述的分子标记物，其特征在于，所述FAM13AOS在***癌组织中表达下调。
4.一种用于检测***癌的诊断试剂盒，其特征在于，所述诊断试剂盒含有与***癌相关的分子标记物FAM13AOS。
5.如权利要求4所述的***癌诊断试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：特异性扩增***癌相关基因FAM13AOS的引物和说明书。
6.如权利要求5所述的***癌诊断试剂盒，其特征在于，所述引物具有如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列。
7.如权利要求5或6所述的***癌诊断试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括以下组分：
(1)组织样本、血液或尿液中总RNA提取试剂；
(2)反转录试剂；
(3)定量PCR试剂；
(4)***正常组织cDNA。
8.FAM13AOS在制备***癌早期诊断试剂中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，利用所述***癌早期诊断试剂检测被试者血清、尿液或组织样本中FAM13AOS的含量，并与正常水平FAM13AOS的含量相比较，以进行***癌高危人群的筛选和诊断。
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