CN114410787A - 一种用于***癌早期诊断、转移预警以及预后评估的引物探针组合、试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种用于***癌早期诊断、转移预警以及预后评估的引物探针组合、试剂盒及其应用。引物探针组合包括:用于检测PCA3基因的第一组引物对,具有SEQ ID NO:1~2所示的核苷酸序列;用于检测PSA基因的第二组引物对,具有SEQ ID NO:4~5所示的核苷酸序列;用于检测TMPRSS2‑ERG融合基因的第三组引物对,具有SEQ ID NO:7~8所示的核苷酸序列;以及与上述三组引物对相应的探针。本发明不仅实现了***癌的早期诊断,还实现了对确诊患者***癌转移以及恶化风险的有效评估,适用于大规模的人群筛选普查。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物技术领域,更具体地涉及一种用于***癌早期诊断、转移预警以及预后评估的引物探针组合、试剂盒及其应用。
背景技术
***癌是指发生在***的上皮性恶性肿瘤。WHO发布的《泌尿***及***官肿瘤病理学和遗传学》将***癌病理类型区分为腺癌(腺泡腺癌)、导管腺癌、尿路上皮癌、鳞状细胞癌、腺鳞癌。其中***腺癌占95%以上,因此,通常我们所说的***癌就是指***腺癌。
2020年***癌合计141万人发病并且38万人死亡,排全球肿瘤发病率第四位。***癌是世界各国也是我国死亡率和发病率靠前的恶性肿瘤,其起病隐匿,早期临床表现缺乏特异性,大部分患者在确诊时已处于局部晚期或发生远处转移,预后往往较差。因此,现在迫切的需要一种较为灵敏的诊断标记物,为发生远处转移的肺癌的早期诊断、早期治疗及预后判断提供客观依据。
现阶段主要的***癌筛查手段包括直肠指检(DRE)、***特异性抗原检查(PSA)、经直肠超声检查(TRUS)、***穿刺活检(Prostate Biopsy)、其他影像学检查(X-ray、Bone Scan)等都无法做到在临床早期发现。而且CT、MRI和PET-CT等检查,可以发现更小的肿瘤组织,但其特异性低而且也需要形成相应的病灶才可以检出,并且仍需要病理活检的辅助才能明确诊断。穿刺活检的使用虽然提高了***癌的诊断率,但均为介入性检查,对患者的损伤和痛苦大,且对操作者技术要求高因而不适用于大规模的人群筛选普查。尿液外泌体活检作为新型的检测手段,具有特异性高、无创、快捷等优点,是***癌检查发展的趋势与方向。
PCA3即新型***癌抗原3,是非编码信使核糖核酸(mRNA)片段,定位于第9号染色体上(9q21-22),其全长约25kb,包含4个外显子和3个内含子:1号内含子(20kb)、2号内含子(873bp)和3号内含子(227bp);4个外显子分别为外显子1、2、3、4。外显子2发生选择***替拼接,外显子4由4a、4b和4c 3个亚单位选择性多聚腺苷酸化组成。
PCA3在全部***癌中过度表达,可从癌变***细胞中无害测定,准确度接近100%。此外,在***外组织(良性和恶性)中尚未检测到PCA3转录,证明PCA3是目前已知***癌最具特异性的PCa标志物。不像血清PSA,PCA3不受年龄,***体积或其他***病(***炎)的影响。
PSA是***特异抗原的简称。是一种含有237个氨基酸的单链多肽,属于具有组织特异性的有糜蛋白酶样作用的丝氨酸蛋白酶族,可以分解***中的主要胶状蛋白,有稀释***的作用。PSA在正常和癌样上皮细胞中都可合成。大部分***特异性抗原迅速与蛋白水解酶抑制物结合,主要与α-1抗糜蛋白酶(ACT)和α-2巨球蛋白结合(MG),也有一部分被蛋白水解酶灭活后以游离状态存在。PSA具有组织特异性,只存在于人***腺泡及导管上皮细胞胞浆中,不表达于其它细胞。但它并无肿瘤特异性,***炎、良性***增生和***癌均可导致总PSA水平(游离PSA加复合PSA)升高。
TMPRSS2属于Ⅱ型跨膜丝氨酸蛋白酶家族,拥有单跨膜结构域,其N端在胞内而C端在胞外,胞外主要由低密度脂蛋白A类受体(Low density lipoprotein receptor classA,LDLa)结构域、清道夫受体富含半胱氨酸(Scavenger receptor cys-rich,SRCR)结构域和丝氨酸蛋白酶结构域构成。人的TMPRSS2基因定位于21号染色体(21q22.3),由14个外显子构成,最终表达3.8kb的转录本,该基因在***中表达量最高,同时还可被雄激素受体调节,而且在***癌中存在过表达现象。
而ERG基因,位于21号染色体q22上,属于ETS转录因子家族,含有一个高保守的85个氨基酸构成的结构域,可以结合5’-GGA(A/T)-3’序列。ERG基因主要表达于中胚层组织及少量外胚层组织,如泌尿生殖系细胞、神经嵴细胞。***器官特异性、含有雄激素调节促进子区域的TMPRSS2基因的5’端未转录区域与ETS家族成员、主要与ERG基因发生融合,导致原癌基因ERG过表达,可能与***癌的发生、发展相关。TMPRSS2和ERG基因同位于2l号染色体长臂上,相隔3Mb碱基单位,发生融合时,二者间的重排既可以是21号染色体问的易位,也可以是中间碱基的缺失。
外泌体是指包含了复杂RNA和蛋白质的小膜泡(30-150nm),现今,其特指直径在40-100nm的盘状囊泡。尿液中含有大量的外泌体,外泌体内也包含了待检测的相关的肿瘤靶标。
自2011年以来PCA3mRNA与PSA mRNA表达量的比值以及TMPRSS2-ERG基因融合作为***癌疑似者是否需要进行穿刺活检的依据一直被写入欧洲泌尿外科协会的***癌诊疗指南。
另外,国内虽然有通过尿液外泌体中PCA3、PSA、TMPRSS2-ERG mRNA的检测进行***癌早期诊断的专利,比如,公开号为CN102912030的发明专利申请公开了一种用于***癌早期诊断的引物对、探针和试剂盒,但是这些现有技术由于检测流程复杂(吖啶酯标记反应、病人尿液中mRNA的提取、转录介导扩增mRNA、杂交反应、结果计算)且杂交反应涉及开盖操作因而难免会导致实验室污染的风险,因而不适宜于大规模临床推广。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于***癌早期诊断、转移预警以及预后评估的引物探针组合、试剂盒及其应用,从而解决现有的***癌早期诊断技术存在检测流程复杂、污染风险高的问题,同时现有技术缺乏针对***癌进行转移预警以及预后评估的问题。
为了解决上述技术问题,本发明采用以下技术方案:
根据本发明的第一方面,提供一种用于***癌早期诊断、转移预警以及预后评估的引物探针组合,包括:用于检测人体体内PCA3基因的第一组引物对,其具有SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列;用于检测人体体内PSA基因的第二组引物对,其具有SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列;用于检测人体体内TMPRSS2-ERG融合基因的第三组引物对,其具有SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列;以及与上述三组引物对相应的探针。
优选地,所述引物探针组合还包括用于检测ACTB内参基因的第四组引物对,其具有SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列;以及相应的探针。
应当理解的是,本发明提供的引物探针组合并不仅限于ACTB内参基因,实际上也可选取其他基因作为内参,相应的核苷酸序列也有所不同,此处ACTB内参基因仅作为优选实施例提供。
优选地,所述探针分别具有SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列。
优选地,所述探针的报告荧光基团的标记包括FAM、HEX、VIC、ROX、TAMRA、CY5中的一种;其淬灭荧光基团的标记包括TAMRA、BHQ1、BHQ2、MGB、DABCYL、BHQ3中的一种。
根据本发明的第二方面,提供一种用于***癌早期诊断、转移预警以及预后评估的试剂盒,所述试剂盒包括如上面所述的用于***癌早期诊断、转移预警以及预后评估的引物探针组合。
根据本发明的第三方面,提供一种用于***癌早期诊断、转移预警以及预后评估的引物探针组合在制备***癌早期诊断、转移预警以及预后评估的试剂中的应用,所述***癌早期诊断、转移预警以及预后评估的方法包括以下步骤:S1:提取尿液中的外泌体;S2:提取外泌体的RNA;S3:将提取的RNA作为模板,加入根据权利要求1所述的4组引物对及其探针进行RT-qPCR检测;S4:通过计算PCA3mRNA与PSA mRNA表达量的比值以及TMPRSS2-ERG基因融合表达量,进行***癌早期诊断、转移预警以及预后评估。
根据本发明,步骤S4包括:在ACTB扩增曲线正常的前提下,根据公式:PCA3相对量=2^[(Ct(PCA3)-Ct(PSA))]*1000计算出PCA3相对表达量;在ACTB扩增曲线正常的前提下,根据公式:TMPRSS2-ERG相对量=2^[(Ct(TMPRSS2-ERG)-Ct(PSA))]*1000计算出TMPRSS2-ERG融合基因的相对表达量;根据公式:综合判断值=(PCA3相对量+TMPRSS2-ERG相对量)/2,计算综合判断值;根据上述综合判断值绘制ROC曲线并结合约登指数获得Cut-off值,进行***癌早期诊断、转移预警以及预后评估。
根据本发明的一个优选方案,通过对临床样本分析计算Cut-off值为35,其中,综合判断值≤35,即为***癌高风险人群,综合判断值>35,即为***癌低风险人群。
根据本发明的一个优选方案,通过对确认***癌患者样本分析计算Cut-off值为32,其中,综合判断值≤32,即为***癌转移或者预后不良人群,综合判断值>32,即为***癌未转移或者预后良好人群。
根据本发明的一个优选方案,步骤S3的扩增程序为:50℃10分钟;95℃5min预变性;然后依次在95℃10s,58℃15s,72℃60s*进行40个循环,其中,72℃60s*为荧光信号收集步骤。
综上所述,根据本发明提供的一种用于***癌早期诊断、转移预警以及预后评估的引物探针组合、试剂盒及其应用,相比现有技术具有以下有益效果:
1)本发明选择尿液外泌体中的PCA3mRNA、PSA mRNA以及TMPRSS2-ERG基因融合为靶标,同时采用CTAB为内参基因,通过设计筛选最终获得四组引物对及其特异性探针,PCR效率高,特异性强,稳定性好,为***癌早期诊断及转移预警提供了准确性保证;
2)本发明将检测的靶标PCA3、PSA、TMPRSS2-ERG基因融合以及内参基因的检测在一管中的闭管操作,大大降低了实验室污染的风险,保证该试剂盒以及方法适宜于大规模临床推广;
3)本发明基于从受检者尿液中提取外泌体并提取该外泌体的总RNA,通过RT-qPCR检测PCA3mRNA与PSA mRNA表达量的比值以及TMPRSS2-ERG基因融合,实现了***癌的早期诊断;
4)本发明还同时实现了对确诊患者的***癌转移以及恶化风险的有效评估;
5)根据本发明方法所获得的检测结果还可作为早筛患者是否需要进行穿刺活检的依据;
6)本发明取材方便,无任何创伤、辐射等伤害,且对操作者技术无需太高要求,因而更加适用于大规模的人群筛选普查。
附图说明
图1A和图1B示出了高风险人群的ACTB、PCA3mRNA、PSA mRNA、TMPRSS2-ERG扩增曲线,扩增曲线从左向右依次为ACTB、PSA、PCA3、TMPRSS2-ERG,其中,图1A示出了TMPRSS2-ERG未发生基因融合;图1B示出了TMPRSS2-ERG发生基因融合。
具体实施方式
以下结合具体实施例,对本发明做进一步说明。应理解,以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。
实施例1引物、探针的设计
在本实施例中,发明人根据PCA3mRNA、PSA mRNA、TMPRSS2-ERG、ACTB的序列特点,分别设计了用于检测PCA3mRNA、PSA mRNA、TMPRSS2-ERG、ACTB基因的引物以及探针,所有引物及探针的具体序列如下表1所示。
表1
引物探针名称 | 序列以及修饰方式 |
PCA3-F(SEQ ID NO:1) | AAAGGAAGCACAGAGATCCCTG |
PCA3-R(SEQ ID NO:2) | GGGCGAGGCTCATCGAT |
PCA3-P(SEQ ID NO:3) | FAM-AGAAATGCCCGGCCGCCATC-BHQ1 |
PSA-F(SEQ ID NO:4) | GACCACCTGCTACGCCTCA |
PSA-R(SEQ ID NO:5) | GGAGGTCCACACACTGAAGTTTC |
PSA-P(SEQ ID NO:6) | HEX-CAGCATTGAACCAGAGGAGTTCTTGACCC-BHQ1 |
TMPR-ERG-F(SEQ ID NO:7) | GCCGCCTGGAGCGCGGCA |
TMPR-ERG-R(SEQ ID NO:8) | CTGCCGCACATGGTCTGTACTCC |
TMPR-ERG-P(SEQ ID NO:9) | ROX-ACTCTGCGCTCGTTCGTGGTCAT-BHQ2 |
ACTB-F(SEQ ID NO:10) | GGCACCCAGCACAATGAAG |
ACTB-R(SEQ ID NO:11) | GCCGATCCACACGGAGTACT |
ACTB-P(SEQ ID NO:12) | Cy5-TCAAGATCATTGCTCCTCCTGAGCGCAA-BHQ2 |
但是应当理解的是,探针的报告荧光基团的标记包含但不限于FAM、HEX、VIC、ROX、TAMRA、CY5中的一种;其淬灭荧光基团的标记包含但不限于TAMRA、BHQ1、BHQ2、MGB、DABCYL、BHQ3中的一种。
实施例2核酸样本的提取
2.1尿液外泌体提取
1)收集尿液样品,2-8℃3000×g离心30min,收集上清以除去样品中的残留的细胞以及碎片;
2)取0.9mL上述样品,加入0.3mL EPS-U溶液,颠倒混匀,2-8℃静置过夜;
3)将样品置于离心机内12000×g离心30min,弃去上清;
4)用100-200μL ERS-U重悬沉淀并储存于2-8℃或者直接进行核酸提取。
2.2核酸样本的提取
1)实验前试剂材料准备与检查工作如下:
检查核酸试剂盒(试剂盒品名)保质期以及确保Wash Buffer 1和2中已添加乙醇,并在瓶上相应标识处打勾√;(2)异丙醇(如无,可用无水乙醇替代)和75%乙醇;(3)高压灭菌有效期内的1.5mL Eppendorf管和各类移液枪头;
2)从4℃冰箱中取出提取好的尿液外泌体,上下颠倒数次混匀;
3)在1.5mL Eppendorf管对应标本唯一性标识做好标记;
4)分别移取900μL Cell Lysis Solution加至灭菌的1.5mL Eppendorf管;
5)小心移取300μL全血转移至上述加有Cell Lysis Solution的1.5mL EP管;
6)盖上Eppendorf管盖,室温孵育10min;
7)13,000rpm室温离心20秒;
8)取出Eppendorf管,观察白色沉淀;
9)开Eppendorf管盖,手持管底部,倾斜EP管口弃去部分红色上清,尽量将红色上清吸尽;
10)盖上Eppendorf管,用手指弹击Eppendorf管底部,使白色沉淀重悬;
11)移取300μL Nuclei Lysis Solution入上述Eppendorf管中,盖上管,上下颠倒数次混匀;
12)打开Eppendorf管,移取100μL Protein Precipitation Solution入上述Eppendorf管中,盖上管盖,振荡器上剧烈振荡20秒;13,000rpm室温离心3min;
13)移取上清转移到新的已灭菌1.5mL Eppendorf管;
14)移取300μL异丙醇入Eppendorf管,盖上管盖,上下颠倒数次混匀,可见白色絮状gDNA析出;
15)13,000rpm室温离心1min;
16)打开Eppendorf管,手捏管底部,倾斜管口弃去上清;
17)移取300μL 75%乙醇加入Eppendorf管,盖上管盖,轻柔上下颠倒洗涤沉淀;
18)13,000rpm室温离心1min;
19)打开Eppendorf管,手持管底部,倾斜管口弃去上清;
20)在实验台上放置新滤纸,倒扣Eppendorf管,吸干液体,将Eppendorf管开盖侧放风干;
21)目测沉淀大小,加入50~100μL DNA Rehydration Solution至沉淀;
22)过夜溶解后用NanoDrop紫外分光光度计进行核酸浓度测定,核酸浓度大于等于20ng/μL且OD260/OD280为1.9±0.2视为合格,如浓度不够,加入乙醇再次沉淀DNA,然后重新加适量的DNA Rehydration Solution溶解核酸;
23)在管壁和管盖上再次标清样本唯一性编号,并用透明胶带缠绕保护;
24)保存核酸标本至-20或者-80℃冰箱。
案例一
1.1临床样本盲筛
收集年龄50岁以上盲样300例,按照流程依次进行尿液外泌体提取以及外泌体中RNA提取,备用。
1.2配制反应体系
将1.1中提取的RNA作为模板,加入上表1所示的引物及其探针,具体按照下表2所列成分配置反应体系。
表2
成分 | 用量 |
E-mix | 10μL |
10×buffer | 2 |
PCA3-F | 0.4μL |
PCA3-R | 0.4μL |
PCA3-P | 0.2μL |
ACTB-F | 0.4μL |
ACTB-R | 0.4μL |
ACTB-P | 0.2μL |
PSA-F | 0.4μL |
PSA-R | 0.4μL |
PSA-P | 0.2μL |
TMPR-ERG-F | 0.4μL |
TMPR-ERG-R | 0.4μL |
TMPR-ERG-P | 0.2μL |
ddH<sub>2</sub>O | 补足至18μL |
模板 | 2μL |
1.3进行RT-qPCR检测
将1.2配制完成的反应体系按照以下反应程序进行RT-qPCR检测。
反应程序:50℃10分钟;95℃5min预变性;然后依次在95℃10s,58℃15s,72℃60s*进行40个循环。其中,72℃60s*为荧光信号收集步骤。
1.4统计学分析并确定Cut-off值
1)在ACTB扩增曲线正常的前提下,根据公式:PCA3相对量=2^[(Ct(PCA3)-Ct(PSA))]*1000计算出PCA3相对表达量;
2)在ACTB扩增曲线正常的前提下,根据公式:TMPRSS2-ERG相对量=2^[(Ct(TMPRSS2-ERG)-Ct(PSA))]*1000计算出TMPRSS2-ERG融合基因的相对表达量;
3)根据公式综合判断值=(PCA3相对量+TMPRSS2-ERG相对量)/2,计算出综合判断值;
4)根据上述综合判断值绘制300个样本的ROC曲线并结合约登指数获得Cut-off值,并对低于Cut-off值的高风险人群进行3-5年的回访,通过***穿刺确认其***癌患病情况并与同期的qPCR的综合判断值进行对比分析。
1.5结果与分析
Cut-off值为35,综合判断值≤35,即为***癌高风险人群;综合判断值>35,即为***癌低风险人群。
在随后的3-5年回访中,低于Cut-off值的受检者中超过97%经过***穿刺确诊患上***癌。同期的综合判断值与***穿刺结论一致。
案例二
确诊早期患者随访
2.1收集临床上经过***穿刺确认患上***癌的样本300例,按照流程依次进行尿液外泌体提取以及外泌体中RNA提取,备用。
2.2配制反应体系
将1.1中提取的RNA作为模板,加入上表1所示的引物及其探针,具体按照上表2所列成分配置反应体系。
1.3进行RT-qPCR检测
将1.2配制完成的反应体系按照以下反应程序进行RT-qPCR检测:
反应程序:50℃10分钟;95℃5min预变性;然后依次在95℃10s,58℃15s,72℃60s*进行40个循环。其中,72℃60s*为荧光信号收集步骤。
1.4统计学分析并确定Cut-off值
1)在ACTB扩增曲线正常的前提下,根据公式:PCA3相对量=2^[(Ct(PCA3)-Ct(PSA))]*1000计算出PCA3相对表达量;
2)在ACTB扩增曲线正常的前提下,根据公式:TMPRSS2-ERG相对量=2^[(Ct(TMPRSS2-ERG)-Ct(PSA))]*1000计算出TMPRSS2-ERG融合基因的相对表达量;
3)根据公式:综合判断值=(PCA3相对量+TMPRSS2-ERG相对量)/2,计算综合判断值。
4)根据上述综合判断值绘制300个样本的ROC曲线并结合约登指数获得Cut-off值,并对低于Cut-off值的高风险人群在接受临床上常规治疗后进行3-5年的回访,通过***穿刺确认其***癌患病情况并与同期的qPCR的综合判断值进行对比分析。
1.5结果与分析
Cut-off值为35,综合判断值≤32,即为***癌转移或者预后不良人群;综合判断值>32,即为***癌未转移或者预后良好人群。
在随后的3-5年的回访中,低于Cut-off值的受检者超过94%经过临床确认转移或者预后不良。同期的综合判断值与临床数据结论一致。
以上所述的,仅为本发明的较佳实施例,并非用以限定本发明的范围,本发明的上述实施例还可以做出各种变化。凡是依据本发明申请的权利要求书及说明书内容所作的简单、等效变化与修饰,皆落入本发明专利的权利要求保护范围。本发明未详尽描述的均为常规技术内容。
SEQUENCE LISTING
<110> 上海康黎医学检验所有限公司
<120> 一种用于***癌早期诊断、转移预警以及预后评估的引物探针组合、试剂
盒及其应用
<160> 12
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
aaaggaagca cagagatccc tg 22
<210> 2
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gggcgaggct catcgat 17
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
agaaatgccc ggccgccatc 20
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gaccacctgc tacgcctca 19
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
ggaggtccac acactgaagt ttc 23
<210> 6
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
cagcattgaa ccagaggagt tcttgaccc 29
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
gccgcctgga gcgcggca 18
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
ctgccgcaca tggtctgtac tcc 23
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
actctgcgct cgttcgtggt cat 23
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
ggcacccagc acaatgaag 19
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
gccgatccac acggagtact 20
<210> 12
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
tcaagatcat tgctcctcct gagcgcaa 28
Claims (10)
1.一种用于***癌早期诊断、转移预警以及预后评估的引物探针组合,其特征在于,包括:用于检测人体体内PCA3基因的第一组引物对,其具有SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列;用于检测人体体内PSA基因的第二组引物对,其具有SEQ ID NO:4和SEQID NO:5所示的核苷酸序列;用于检测人体体内TMPRSS2-ERG融合基因的第三组引物对,其具有SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列;以及与上述三组引物对相应的探针。
2.根据权利要求1所述的引物探针组合,其特征在于,所述引物探针组合还包括用于检测ACTB内参基因的第四组引物对,其具有SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列;以及相应的探针。
3.根据权利要求2所述的引物探针组合,其特征在于,与所述四组引物对相应的探针依次具有SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列。
4.根据权利要求3所述的引物探针组合,其特征在于,所述探针的报告荧光基团的标记包括FAM、HEX、VIC、ROX、TAMRA、CY5中的一种;其淬灭荧光基团的标记包括TAMRA、BHQ1、BHQ2、MGB、DABCYL、BHQ3中的一种。
5.一种用于***癌早期诊断、转移预警以及预后评估的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括根据权利要求1~4中任意一项所述的用于***癌早期诊断、转移预警以及预后评估的引物探针组合。
6.一种用于***癌早期诊断、转移预警以及预后评估的引物探针组合在制备***癌早期诊断、转移预警以及预后评估的试剂中的应用,其特征在于,所述***癌早期诊断、转移预警以及预后评估的方法包括以下步骤:
S1:提取尿液中的外泌体;
S2:提取外泌体的RNA;
S3:将提取的RNA作为模板,加入根据权利要求1~4所述的引物探针组合进行RT-qPCR检测;
S4:通过计算PCA3 mRNA与PSA mRNA表达量的比值以及TMPRSS2-ERG基因融合表达量,进行***癌早期诊断、转移预警以及预后评估。
7.根据权利要求6所述的应用,其特征在于,步骤S4包括:
S41:在ACTB扩增曲线正常的前提下,根据公式:PCA3相对量=2^[(Ct(PCA3)-Ct(PSA))]*1000计算出PCA3相对表达量;
S42:在ACTB扩增曲线正常的前提下,根据公式:TMPRSS2-ERG相对量=2^[(Ct(TMPRSS2-ERG)-Ct(PSA))]*1000计算出TMPRSS2-ERG融合基因的相对表达量;
S43:根据公式:综合判断值=(PCA3相对量+TMPRSS2-ERG相对量)/2,计算综合判断值;
S44:根据上述综合判断值绘制ROC曲线并结合约登指数获得Cut-off值,进行***癌早期诊断、转移预警以及预后评估。
8.根据权利要求7所述的应用,其特征在于,通过对临床样本分析计算Cut-off值为35,其中,综合判断值≤35,即为***癌高风险人群,综合判断值>35,即为***癌低风险人群。
9.根据权利要求7所述的应用,其特征在于,通过对确认***癌患者样本分析计算Cut-off值为32,其中,综合判断值≤32,即为***癌转移或者预后不良人群,综合判断值>32,即为***癌未转移或者预后良好人群。
10.根据权利要求6所述的应用,其特征在于,步骤S3的扩增程序为:50℃ 10分钟;95℃5min预变性;然后依次在95℃ 10s,58℃ 15s,72℃ 60s*进行40个循环,其中,72℃ 60s*为荧光信号收集步骤。
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