CN105925703A - 一种筛选肾癌外周血miRNA标志物的方法及肾癌诊断标志物miR-210 - Google Patents

一种筛选肾癌外周血miRNA标志物的方法及肾癌诊断标志物miR-210 Download PDF

Info

Publication number
CN105925703A
CN105925703A CN201610414010.9A CN201610414010A CN105925703A CN 105925703 A CN105925703 A CN 105925703A CN 201610414010 A CN201610414010 A CN 201610414010A CN 105925703 A CN105925703 A CN 105925703A
Authority
CN
China
Prior art keywords
serum
plasma
mirnas
renal
diagnosis
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201610414010.9A
Other languages
English (en)
Inventor
徐华
唐焜
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Tongji Medical College of Huazhong University of Science and Technology
Original Assignee
Tongji Medical College of Huazhong University of Science and Technology
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Tongji Medical College of Huazhong University of Science and Technology filed Critical Tongji Medical College of Huazhong University of Science and Technology
Priority to CN201610414010.9A priority Critical patent/CN105925703A/zh
Publication of CN105925703A publication Critical patent/CN105925703A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • G—PHYSICS
    • G06—COMPUTING; CALCULATING OR COUNTING
    • G06T—IMAGE DATA PROCESSING OR GENERATION, IN GENERAL
    • G06T7/00—Image analysis
    • G06T7/0002—Inspection of images, e.g. flaw detection
    • G06T7/0012—Biomedical image inspection
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/178—Oligonucleotides characterized by their use miRNA, siRNA or ncRNA

Landscapes

  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Radiology & Medical Imaging (AREA)
  • Quality & Reliability (AREA)
  • Computer Vision & Pattern Recognition (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Theoretical Computer Science (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

本发明公开了一种筛选肾癌血清/血浆miRNA标志物的方法及miRNA标志物。筛选方法是汇总与肾癌相关miRNAs资料并对其进行meta分析，筛选出综合分析结果最优的1种以上miRNAs作为候选miRNAs；然后采用TaqMan probe‑based qRT‑PCR方法，对候选miRNAs进行人群血清/血浆样本验证，筛选出肾癌患者相对健康人血清/血浆中表达阈值在3.12以上的miRNAs；最后验证其在肾癌组织和血清/血浆中的表达一致性，表达一致的，则为目标标志物。本发明还提供了一种肾癌血清/血浆miRNA标志物miR‑210，为肾癌的无创诊断提供新途径，具有重大的临床实用价值。

Description

一种筛选肾癌外周血miRNA标志物的方法及肾癌诊断标志物miR-210
技术领域
本发明涉及基因工程及肿瘤学领域，具体涉及一种筛选肾癌血清/血浆miRNA标志物的方法及miRNA标志物。
背景技术
肾癌是起源于肾小管上皮细胞的一种常见肾脏恶性肿瘤，占成人全部恶性肿瘤的2％～3％，占肾脏原发恶性肿瘤的85％～90％(Siegel R,Naishadham D,Jemal A.Cancer statistics.CA Cancer J Clin,2012,62:10–29)。肾癌组织分型较多，根据2004年WHO分类标准，肾癌在病理上可分为透明细胞癌、***状肾细胞癌、嫌色细胞癌、集合管癌和未分类肾细胞癌，其中以透明细胞癌为主，约占60％～85％(Mulders P,Figlin R,deKeon JB et al.Renal cell carcinoma:recent Progress and futuredirections.Caneer Res.1997,57(22):5189-5195)。每年全世界约有90000人因肾癌而死亡。国内外的流行病学资料显示肾癌的发病率和死亡率均有增高的趋势。2000年中国上海标准化发病率男性为5.8/10万人，女性为3.8/10万人。在过去的60余年中肾癌发病率每年以2％的速度增长，每年死于肾癌患者近10万例(全国肿瘤防治研究办公室、***卫生统计信息中心.中国试点市、县恶性肿瘤的发病与死亡.(1993-1997)第2卷.北京：中国医药科技出版社,2002,271-279)。
肾细胞癌是一种泌尿***独特的恶性肿瘤，临床表现及肾外表现极为丰富，临床病理学高度多样，很难做到早期诊断和治疗。血尿、疼痛和腹部包块称为肾肿瘤的三联征。值得注意的是目前肾癌中有30％～50％病例系偶然发现的无症状患者。三联征齐全时多已属晚期，且30％的肾癌在诊断时已有或将发生转移病变(Jonasch E,Gao J,Rathmell WK.Renal cell carcinoma.BMJ.2014,10:349:g4797)。肾癌的主要治疗方法是外科手术根治，但即使早期肾癌患者手术后，仍有30.40％将发生转移。转移性肾癌预后较差，对放化疗等治疗不敏感，平均生存时间仅3.33个月，3年存活率低于5％(MacLennan SM,Imamura M,Lapitan C.Systematic review of oncological outcomes following surgicalmanagement of localised renal cancer.Eur Urol,2012:61:972-993)。随着影像学的发展，尤其是超声的广泛应用和CT检测的普及，越来越多的肾癌被早期诊断。但是依然有相当多的患者发现时已经是晚期或者局部晚期，单纯手术预后差。肾癌的组织病理类型较多，尚有形态学不明确的病理亚型，而且不同病理类型的肾癌具有不同的临床特点、治疗方案和预后。肾癌恶性程度决定其手术方式，术前影像学技术只能判别其临床分期，尚不能提示肿瘤恶性程度。目前国内肾癌一线化疗药索拉非尼对于肾癌的辅助治疗和新辅助治疗有显著的效果，但是部分患者出现化疗耐药(Poprach A,Bortlicek Z,Melichar B,et al.Efficacyof sunitinib in patients with metastatic or unresectable renal cell carcinoma and renalinsufficiency.Eur J Cancer,2015,51(4):507-513)。晚期或局部晚期的肾癌预后较差。所以对肾癌患者的早期诊断对于该病的鉴别病理分型、提示恶性程度、监测化疗耐药以及预后复发判断的十分重要，但是目前对于肾癌乃至多数实体瘤来说尚未找到合适的早期诊断和预后随访生物标志物。而目前已有的研究显示微小RNA(microRNA,miRNA)有可能会成为一种潜在的早期诊断和治疗肾癌的新途径。
miRNA是近年来发现的一类约有22个核苷酸(nt)的非编码的小RNA分子。这些小RNA分子在基因转录后水平上，通过与靶mRNA的3’非翻译区(3’UTR)完全或不完全的互补配对，促进目标mRNA降解或抑制蛋白翻译，对基因的表达起着负调节作用或基因沉默(Garzon R,et al.MicroRNA gene expression duringretinoic acid-induced differentiation of human acute promyelocytic leukemia.Oncogene,2007,26:4148–4157)。miRNA参与细胞生长，分化和凋亡等多种生理病理过程，在肿瘤等多种疾病的发生和发展中发挥了重要的调节作用(CullenBR.Transcription and processing of human microRNA precursors.Mol Cell,2004,16:861–865)。循环中miRNA分子具有较好的抗RNA酶降解能力，在血清中可长期稳定存在，甚至在煮沸、反复冻融、酸碱环境等情况下仍能保持稳定(Mitchell PS,et al.Circulating microRNAs as stable blood-based markers forcancer detection.Proc Natl Acad Sci USA,2008:105,10513–10518)。在一些疾病中miRNA的表达谱改变具有明显的特征，尤其是在恶性肿瘤中存在着不同于正常机体的特征性miRNA表达谱(Calin GA,Croee MC.MicroRNA signatures inhuman cancers.Nat Rev Caneer,2006,6(11):857-866.Redova,M.et al.CirculatingmiR-378and miR-451in serum are potential biomarkers for renal cell carcinoma.JTransl Med,2012,10:1–8.Hauser S,et al.Analysis of serum microRNAs(miR-26a-2*,miR-191,miR-337-3p and miR-378)as potential biomarkers in renalcell carcinoma.Cancer Epidemiol,2012,36:391–394.Zhai Q,et al.Identificationof miR-508-3p and miR-509-3p that are associated with cell invasion and migrationand involved in the apoptosis of renal cell carcinoma.Biochem Biophys ResCommun,2012,419:621–626.Zhao A,Li G,Pe oc’h M,Genin C,Giqante M.Serum miR-2100as a novel biomarker for molecular diagnosis of clear cell renalcell carcinoma.Exp Mol Pathol,2013,94:115–120)。miRNA在不同肿瘤中具有特定的表达水平的模式，而测定这些miRNA的表达将成为恶性肿瘤早期诊断和预后判断的重要手段。由于肿瘤组织标本来源的限制，使得组织miRNA在临床上的应用存在一定的局限性。外周血标本的获得十分简便，如果能在血液中检出肾癌特异性的miRNA并将其作为肾癌的生物学标志物经具有至关重要的意义。循环中miRNA获取的便利和稳定性将拓宽其在实验研究和临床中的作用。
目前已有研究证实血清/血浆中存在几百种的miRNAs，这些小分子RNAs性质稳定、含量丰富、易于定量检测，且存在显著的疾病特异性，有可能会成为一种潜在的早期诊断和监测预后的新标志。但是，由于血清/血浆中miRNA的表达量较低，寻找一种灵敏度高、操作简便且成本低廉的检测方法是目前血清/血浆miRNA在肿瘤临床检测中亟待解决的问题。另一方面，仅仅采用一种血清/血浆miRNA作为肿瘤标志物往往特异性不足，若将多种miRNA组合使用并与其他类型肿瘤标志物检测相结合，可有望显著提高诊断的准确性。然而，目前还没有用于肾癌诊断的较为稳定的生物标志物的报道，若能筛选出肾癌异常表达的血清/血浆miRNAs作为生物标志物，并研制相应的诊断试剂盒，对我国肾癌的诊断现状必将是一次有力的推动。因此，开发miRNA检测试剂盒产品和优化精确而高通量的表达谱技术服务，研制和生产基于循环中miRNA的新型肾癌早期诊断和监测预后的检测试剂盒将有着重要的临床意义。
发明内容
为了解决现有技术中对于肾癌的诊断仍然需要组织学检查，给患者造成痛苦并且不能及早诊断的缺陷，本发明提供了一种筛选肾癌血清/血浆miRNA标志物的方法。基于这种方法，本发明提供了一种肾癌血清/血浆miRNA标志物。
本发明提供的筛选肾癌血清/血浆miRNA标志物的方法，包括以下步骤：
(1)搜集汇总与肾癌相关miRNAs资料；
(2)对汇总的miRNAs分别进行诊断性meta分析，meta分析包括ROC曲线下面积、灵敏度、特异性、阳性似然比、阴性似然比和诊断比值比；采用Q检验和计算I2值进行异质性分析；筛选出综合分析结果最优的1种或多种miRNAs作为候选miRNAs；
(3)采用TaqMan probe-based qRT-PCR方法，对候选miRNAs进行人群血清/血浆样本验证，筛选出肾癌患者相对健康人血清/血浆中表达阈值3.12以上的miRNAs；
(4)检验步骤(3)筛选出的miRNAs在肾癌组织和血清/血浆中的表达一致性，表达一致的，则该miRNA标志物为目标标志物。
灵敏度是指由金标准确诊患病组内所检测出阳性病例数的比率(％)。即本试验(所涉及的标志物)诊断的真阳性率，灵敏度越高，漏诊的机会就越少。
特异性是指由金标准确诊为无病组内所检测出阴性人数的比率(％)。即本诊断试验(所涉及的标志物)的真阴性率。特异性越高，发生误诊的机会就越少。
阳性似然比(positive likelihood ratio，PLR)是指临床诊断检测出的真阳性率与假阳性率之间的比值，即阳性似然比＝灵敏度/(1-特异性)。
阴性似然比(negative likelihood ratio，NLR)是指临床诊断检测出的假阴性率与真阴性率之比值，值越小说明该诊断方法(或所涉及的标志物)越好。
诊断比值比(diagnostic odds ratio，DOR)是阳性似然比与阴性似然比的比值，数值越大表明诊断试验(所涉及的标志物)区分患者与非患者的能力越大。
其中，步骤(2)的meta分析，具体是通过将ROC曲线下面积、灵敏度、特异性、阳性似然比、阴性似然比和诊断比值比变量进行合并，采用层次综合受试者工作特征曲线模型拟合SROC曲线图，分析汇总的miRNAs在区分肾癌患者和健康人方面的优势大小，进而结合异质性分析筛选出最优的1种或多种作为候选miRNAs。
目前研究认为，血清/血浆miRNAs主要来源于肿瘤组织分泌的或者是肿瘤细胞死亡游离所致，但是，组织内差异表达的miRNAs在血清/血浆中并不一定就差异表达，有的miRNAs甚至相反。本发明首次将所有已知、具有潜在肾癌早期诊断价值的循环miRNAs进行综合性meta分析评估，以判断其真实诊断价值；并在血清/血浆和组织生物样本中，进一步验证其表达差异和诊断价值，以达到最优评价体系，以此筛选出的循环miRNAs生物指标更具有临床指导性，为今后开发早期诊断肾癌非侵入性生物标志物提供理论依据，具有重大的临床实用价值。
优选地，上述筛选肾癌血清/血浆miRNA标志物的方法，步骤(1)中资料的纳入标准包括：①患者为经组织病理学确诊的肾癌患者；②用于检测miRNAs的外周血(即血清/血浆)在进行临床治疗前采集；③纳入检测循环miRNAs并探讨其与肾癌诊断相关性的研究；④所纳入的研究必须提供足以进行meta分析提取的数据；⑤对照组为良性疾病人群或健康个体；排除标准包括：①综述或致编者函；②重复报道论文中排除较小样本量或较早发表的文献(也就是说，如果查到论文有重复报道的，排除样本量小的和时间早的那些，留下最新样本量最大的那一篇就可以了)。
优选地，上述筛选肾癌血清/血浆miRNA标志物的方法，步骤(2)中采用Q检验和计算I2值进行异质性分析时，Q检验结果，当P>0.05时，认为研究是同质的，反之不能认为各研究间同质；I2>50％判断为研究间存在异质性；
若各研究间是同质的，采用Mantel–Haenszel方法计算固定效应模型；若存在异质性，则采用DerSimonian and Laird的随机效应模型；发表偏倚采用Deeks’漏斗图不对称检验，P<0.10认为有统计学意义。
本发明提供的一种肾癌血清/血浆miRNA标志物，其为miR-210。
虽然在肾癌组织中已经确定miR-210可作为标志物，但是在外周血清/血浆样本的报道中结果不一致，本发明的创新在于确定了血清/血浆miR-210与组织miR-210表达趋势一致性，血清/血浆miR-210可作为诊断标志物，而且是无创的，可以用于未来的临床诊断。
本发明还提供了上述肾癌血清/血浆miRNA标志物在制备肾癌诊断试剂中的应用。
本发明还提供了一种肾癌诊断试剂盒，其包括血清/血浆RNA提取试剂、miR-210检测探针、PCR逆转录试剂和PCR荧光定量试剂。
其中，RNA提取试剂以及PCR逆转录试剂可以直接选用现有市售商品，为现有常规技术，miR-210检测探针则可以根据公开的miR-210序列(SEQ IDNO.1:agccccugcccaccgcacacug)自行设计，探针序列的5’端需标记荧光基团，3’端需标记淬灭基团，以适合进行TaqMan probe-based qRT-PCR方法检测。PCR荧光定量试剂用于进行TaqMan probe-based qRT-PCR反应，使用常规市售的商品试剂即可。
本发明还提供了血清/血浆miR-210作为标志物在筛查诊断肾癌中的应用。
本发明还提供了含有miR-210检测试剂的试剂盒在筛查诊断肾癌中的应用。
本发明具有以下有益效果：
本发明基于诊断性meta分析，优化出简约而恰当的分析策略，结合qRT-PCR方法验证及组织同血清/血浆表达一致性验证，筛选出适用于血清/血浆诊断的标志物，是一种简单有效的筛选方法。
本发明提供的肾癌血清/血浆miRNA标志物，其在肾癌组织和血清/血浆中的表达一致，均表现异常显著增高，是血清/血浆样本诊断肾癌的非常可靠的标志物，为临床诊断提供了新途径。
本发明提供的试剂盒，使肾癌的临床诊断简便快捷、诊断结果可靠。
附图说明
图1.综合评价循环miR-210对肾癌的诊断价值示意图。图中A为合并受试者工作特征曲线模型对循环中miR-210在肾癌患者和健康对照人群的诊断意义；B为合并诊断OR评价血浆miR-210甄别肾癌患者和健康对照人群的森林图；C为合并敏感性评价血浆miR-210甄别肾癌患者和健康对照人群的森林图；D合并特异性评价血浆miR-210甄别肾癌患者和健康对照人群的森林图；E合并阳性似然比评价血浆miR-210甄别肾癌患者和健康对照人群的森林图；F合并阴性似然比评价血浆miR-210甄别肾癌患者和健康对照人群的森林图。
图2.独立验证人群中血浆miR-210对于肾癌诊断价值评价。图中A为血浆miR-210在肾癌患者和健康对照人群的表达差异；B为受试者工作特征曲线评价血浆miR-210甄别肾癌患者和健康对照人群的能力图示。
图3.miR-210在肾癌组织中的表达模式图。图A为miR-210在肾癌组织中的表达显著高于癌旁正常组织；图B为肾癌组织和血清中的miR-210表达水平相关性分析。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。实施例中未注明的条件和方法等均按照常规或者制造厂商所建议的条件进行。
实施例1筛选肾癌外周血miRNA标志物
1、汇总所有与肾癌相关、且具有潜在早期诊断价值的循环miRNAs
截至2015年12月，在已有的开放数据库PubMed中检索与肾癌相关、并涉及到循环miRNAs的所有已发表文献，主题词或关键词如下：“circulating”或“serum”或“plasma”，“miRNA”或“microRNA”或“miR”，“kidney”或“renal”，以及“cancer”或“carcinoma”或“neoplasm”，并结合手工检索方式参考会议纪要或引用文献获得符合纳入标准的文献。文献的纳入标准包括：①患者为经组织病理学确诊的肾癌患者；②用于检测miRNAs的外周血(包括血浆、血清)在进行临床治疗前采集；③纳入检测循环miRNAs并探讨其与肾癌诊断相关性的研究；④所纳入的研究必须提供足以进行meta(表1)分析的数据；⑤对照组为良性疾病人群或健康个体。排除标准包括：①综述或致编者函；②重复论文中排除较小样本量或较早发表的文献。该部分由双人独立完成，待双人仔细校正后无争议文献纳入后续分析。
参照以上文献纳入标准和排除标准，共有11篇文献满足要求。其中有4篇文献报道的miRNAs为一组miRNAs，5篇非miR-210的，2篇只有差异表达没有ROC曲线的，无法进行后续的诊断性meta分析。因此，最终共4项关于miR-210的研究纳入诊断性meta分析，见表1。
表1候选4篇循环中的miR-210对肾癌诊断价值的文章
2、对候选循环中miR-210的诊断价值进行诊断性meta分析
使用Stata 8.2和Meta-Disc 1.4软件完成诊断性meta分析。对ROC曲线下面积(area under ROC curve，AUC)、灵敏度、特异性、诊断比值比(diagnosticodds ratio，DOR)、阳性似然比(positive likelihood ratio，PLR)和阴性似然比(negative likelihood ratio，NLR)变量进行合并。采用层次综合受试者工作特征曲线模型(hierarchical summary ROC model，HSROC)拟合SROC(symmetricreceiver operator characteristic，SROC)曲线图。采用Q检验和计算I2值进行异质性分析。Q检验结果，当P>0.05时，认为研究是同质的；反之不能认为各研究间同质。I2值计算结果，I2>50％提示研究间存在异质性。另外，若各研究间是同质的，采用Mantel–Haenszel方法计算固定效应模型；若存在异质性，则采用DerSimonian and Laird的随机效应模型。发表偏倚采用Deeks’漏斗图不对称检验，P<0.10认为有统计学意义。
严格遵循以上meta分析流程，对4项循环miR-210的研究进行诊断性meta分析，结果发现循环miR-210能够较好地区分肾癌患者和健康人(合并AUC＝0.86(0.82-0.90))见图1。为此，后续对miR-210进行独立人群样本验证。
3、在独立人群样本中验证循环miR-210对肾癌的诊断价值
(1)采集血浆样本
收集92例血浆样本，包括46例肾癌患者、46例健康个体(性别、年龄与肾癌样本频数匹配，基本信息见表2)，每位提供5ml新鲜血液，采用EDTA真空抗凝采血管采集血样，离心机3000rpm，离心5min离心，后收集上层血浆，吸取上层血浆于1.5ml去RNA酶EP塑料管中，-80℃保存。所有肾癌病人都经过两名病理医生的病理诊断，纳入本研究前未患其它肿瘤，且未经放射或化学药物治疗。病例和对照都使用统一的健康状况调查表，以面对面的方式对病例和对照进行现场流行病学调查。调查内容包括一般人口学特征、患者组织病理类型、临床分级、分期等临床相关信息。所有调查人员均经过统一培训。
表2独立验证人群基本信息
(2)血浆miRNAs的提取
使用LS Reagent(Invitrogen)处理血浆，加入人工合成的线虫cel-miR-39作为内参，采用miRNeasy Mini Kit(Qiagen)试剂盒提取血浆总miRNAs，-80℃贮存备用。
(3)逆转录血浆RNA
采用TaqMan miRNA逆转录试剂盒(Applied Biosystems)和miRNA特异性茎环结构(stem-loop)逆转录引物进行miRNA逆转录反应，具体操作参照ABI公司推荐的程序，其中部分进行调整，反应体系包括3μL 5×的逆转录引物(同时加入5个逆转录引物，每次包含内参的逆转录引物)、1.5μL 10×的逆转录缓冲液、0.15μL 100mmol/L的dNTP和dTTP混合物、1μL逆转录酶(50U/μl)、0.19μL的RNA抑制剂，共5.84μl，每个反应体系中加入9.16μLRNA，总反应体系为15μl。该方法的反应条件为：16℃反应30min，42℃反应30min，最后85℃孵育5min。
(4)实时荧光定量PCR
采用TaqMan探针法进行实时荧光定量PCR，具体操作参照ABI公司推荐的程序，其中部分进行调整，反应体系包括：0.25μL 20×miRNA检测探针、2.5μL 2×Master Mix、1.25μL双蒸水、1μL稀释后的cDNA，共5μl，每个miRNA检测实施4平行，以人工合成的线虫cel-miR-39为内参。使用ABIPrism 7900荧光定量PCR仪检测，其反应条件：95℃反应10min、95℃反应15sec、60℃反应1min，40个循环。
(5)结果分析
实时荧光定量PCR技术是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，Ct值系指每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值所经历的循环数。目的miRNAs起始拷贝数越多，则Ct值越小，反之则越大。在目的miRNAs与内参扩增效率相同的情况下可以直接得到目的miRNAs相对于内参的定量△Ct＝Ct目的-Ct内参，△△Ct＝△Ct病例-△Ct对照。使用SDS 2.4软件分析qRT-PCR数据，采用SPSS 16.0软件做进一步的统计分析。采用风险评分***、绘制ROC曲线和计算AUC评价目标miRNAs对肾癌诊断价值。
在46例肾癌患者和46例健康人群血浆中发现，miR-210在肾癌患者血浆中的表达远远高于健康人群(P<0.001，图2中A)。ROC曲线分析显示，肾癌患者血清中miR-210能够显著甄别患者人群，其AUC＝0.86(0.82-0.90)，见图2中B；另外，miR-210表达阈值为3.12时，诊断肾癌的灵敏度和特异性分别为83.6％和87.0％。
4、检验miR-210在肾癌组织和血浆中表达一致性
同时检测46病肾癌和癌旁正常组织miR-210的相对表达量，结果显示，miR-210在肾癌组织中的表达显著高于癌旁正常组织(图3中A)，进一步相关性分析发现肾癌组织和血清中的miR-210表达水平相关(图3中B)。因此可以判断，无论在肾癌组织还是血浆样本中，miR-210表达模型一致，均表现异常显著增高。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 华中科技大学同济医学院附属同济医院
<120> 一种筛选肾癌外周血miRNA标志物的方法及肾癌诊断标志物miR-210
<130>
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 22
<212> RNA
<213> miR-210
<400> 1
agccccugcc caccgcacac ug 22

Claims (8)

1.一种筛选肾癌血清/血浆miRNA标志物的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)搜集汇总与肾癌相关miRNAs资料；
(2)对汇总的miRNAs分别进行诊断性meta分析，meta分析包括ROC曲线下面积、灵敏度、特异性、阳性似然比、阴性似然比和诊断比值比；采用Q检验和计算I2值进行异质性分析；筛选出综合分析结果最优的1种或多种miRNAs作为候选miRNAs；
(3)采用TaqMan probe-based qRT-PCR方法，对候选miRNAs进行人群血清/血浆样本验证，筛选出肾癌患者相对健康人血清/血浆中表达阈值3.12以上的miRNAs；
(4)检验步骤(3)筛选出的miRNAs在肾癌组织和血清/血浆中的表达一致性，表达一致的，则该miRNA标志物为目标标志物。
2.根据权利要求1所述的筛选肾癌血清/血浆miRNA标志物的方法，其特征在于，步骤(1)中资料的纳入标准包括：①患者为经组织病理学确诊的肾癌患者；②用于检测miRNAs的外周血在进行临床治疗前采集；③纳入检测循环miRNAs并探讨其与肾癌诊断相关性的研究；④所纳入的研究必须提供足以进行meta分析提取的数据；⑤对照组为良性疾病人群或健康个体；排除标准包括：①综述或致编者函；②重复论文中排除较小样本量或较早发表的文献。
3.根据权利要求1所述的筛选肾癌血清/血浆miRNA标志物的方法，其特征在于，步骤(2)中采用Q检验和计算I2值进行异质性分析时，Q检验结果，当P>0.05时，认为研究是同质的，反之不能认为各研究间同质；I2>50％判断为研究间存在异质性；
若各研究间是同质的，采用Mantel–Haenszel方法计算固定效应模型；若存在异质性，则采用DerSimonian and Laird的随机效应模型；发表偏倚采用Deeks’漏斗图不对称检验，P<0.10认为有统计学意义。
4.一种肾癌血清/血浆miRNA标志物，其特征在于，为miR-210。
5.权利要求4所述的肾癌血清/血浆miRNA标志物在制备肾癌诊断试剂中的应用。
6.一种肾癌诊断试剂盒，其特征在于，包括血清/血浆RNA提取试剂、miR-210检测探针、PCR逆转录试剂和PCR荧光定量试剂。
7.血清/血浆miR-210作为标志物在筛查诊断肾癌中的应用。
8.含有miR-210检测试剂的试剂盒在筛查诊断肾癌中的应用。
CN201610414010.9A 2016-06-13 2016-06-13 一种筛选肾癌外周血miRNA标志物的方法及肾癌诊断标志物miR-210 Pending CN105925703A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610414010.9A CN105925703A (zh) 2016-06-13 2016-06-13 一种筛选肾癌外周血miRNA标志物的方法及肾癌诊断标志物miR-210

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610414010.9A CN105925703A (zh) 2016-06-13 2016-06-13 一种筛选肾癌外周血miRNA标志物的方法及肾癌诊断标志物miR-210

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN105925703A true CN105925703A (zh) 2016-09-07

Family

ID=56832748

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610414010.9A Pending CN105925703A (zh) 2016-06-13 2016-06-13 一种筛选肾癌外周血miRNA标志物的方法及肾癌诊断标志物miR-210

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105925703A (zh)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107663541A (zh) * 2017-10-31 2018-02-06 温州医科大学 一种用于诊断原发性肝癌的特异性生物标志物及其筛选方法与应用
CN111552776A (zh) * 2020-04-24 2020-08-18 周敬洋 一种基于人工智能的Meta分析生成方法
CN112980953A (zh) * 2021-02-08 2021-06-18 浙江大学 一种肾透明细胞癌circRNA生物标志物、筛选方法和诊断试剂盒
CN117126938A (zh) * 2023-10-08 2023-11-28 常州市第一人民医院 一种用于诊断膜性肾病的生物标志物及其应用方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103642914A (zh) * 2013-11-29 2014-03-19 李春英 与恶性黑素瘤相关的血浆/血清循环microRNA标志物及其应用
CN104718455A (zh) * 2012-09-07 2015-06-17 基诺麦因有限公司 肾癌血液生物标志物(Biomarker)的检测方法及试剂盒

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104718455A (zh) * 2012-09-07 2015-06-17 基诺麦因有限公司 肾癌血液生物标志物(Biomarker)的检测方法及试剂盒
CN103642914A (zh) * 2013-11-29 2014-03-19 李春英 与恶性黑素瘤相关的血浆/血清循环microRNA标志物及其应用

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
WEN-CHING CHAN ET.AL: "MetaMirclust：discovery of miRNA cluster patterns using a data-minig approach.", 《GENOMICS》 *
刘周强等: "MicroRNA与肾癌关系的研究进展", 《现代诊断与治疗》 *
周亮: "肾癌中miR-210的异常表达及意义", 《中国实验诊断学》 *
杜茂林主编: "《医学统计学》", 30 November 2015, 北京：人民军医出版社 *
王斌等: "miRNA-21表达水平与结直肠癌患者预后关系的Meta分析", 《肿瘤》 *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107663541A (zh) * 2017-10-31 2018-02-06 温州医科大学 一种用于诊断原发性肝癌的特异性生物标志物及其筛选方法与应用
CN111552776A (zh) * 2020-04-24 2020-08-18 周敬洋 一种基于人工智能的Meta分析生成方法
CN111552776B (zh) * 2020-04-24 2021-03-19 周敬洋 一种基于人工智能的Meta分析生成方法
CN112980953A (zh) * 2021-02-08 2021-06-18 浙江大学 一种肾透明细胞癌circRNA生物标志物、筛选方法和诊断试剂盒
CN112980953B (zh) * 2021-02-08 2022-07-08 浙江大学 一种肾透明细胞癌circRNA生物标志物、筛选方法和诊断试剂盒
CN117126938A (zh) * 2023-10-08 2023-11-28 常州市第一人民医院 一种用于诊断膜性肾病的生物标志物及其应用方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Wei et al. Serum microRNA-125b as a potential biomarker for glioma diagnosis
Laudadio et al. Fluorescence in situ hybridization for detecting transitional cell carcinoma: implications for clinical practice
CN105671181B (zh) 用于检测肺癌的基因标志物、引物、探针及试剂盒
US8637241B2 (en) MicroRNAs (miRNA) as biomarkers for diagnosing different grades of gliomas and pathways of glioma progression
CN105603101B (zh) 检测8个miRNA表达量的***在制备诊断或辅助诊断肝细胞癌产品中的应用
CN103937888B (zh) 鉴别胃癌的血浆microRNA标志物的筛选与应用
CN109777874A (zh) 一种适用于胰腺导管腺癌诊断及预后判断的血浆外泌体miRNA标志物及应用
CN105925703A (zh) 一种筛选肾癌外周血miRNA标志物的方法及肾癌诊断标志物miR-210
US9790557B2 (en) Methods and systems for determining a likelihood of adverse prostate cancer pathology
CN110628908B (zh) 用于***癌诊断分级和良恶性预测的生物标志物及检测试剂盒
CN104293919B (zh) 一种与非吸烟女性肺癌辅助诊断相关的snp标志物及其应用
CN105518154A (zh) 脑癌检测
CN105907875A (zh) 一种筛选肾癌外周血miRNA标志物的方法及肾癌标志物miR-378
CN104073569A (zh) 用于诊断手足口病极重症的分子标记物及其检测方法与试剂盒
CN106319038A (zh) 用于胃癌早期筛查的基因标志物及其应用
CN104450702B (zh) 一种血清miRNA生物标志物组合物与应用
CN106636440B (zh) 血浆microRNAs用于制备筛查诊断男性群体中肺腺癌患者的诊断试剂的用途
CN104630357A (zh) 一种与结直肠癌相关的血浆miRNA生物标志物及其应用
CN108424962A (zh) 系膜增生性肾小球肾炎的miRNA检测标志物及其诊断试剂盒
CN109735612A (zh) 川崎病冠状动脉瘤并发症的生物分子标志物及其试剂盒
CN115561468A (zh) 一种评估患有肿瘤或特定肿瘤风险的方法
EP1934367A4 (en) MOLECULAR METHOD FOR THE DIAGNOSIS OF PROSTATE CANCER
CN113416784A (zh) 一种与乳腺癌诊断相关的血清外泌体tsRNA标志物及其应用
CN107904309B (zh) 一种用于诊断预示三阴性型乳腺癌骨转移的基因诊断试剂盒
CN108088999A (zh) 一种与结直肠癌相关的miRNA标志物及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20160907

RJ01 Rejection of invention patent application after publication