ES2893469T3

ES2893469T3 - Puntuaciones de riesgo basadas en la expresión de la variante 7 de la fosfodiesterasa 4D humana

Info

Publication number: ES2893469T3
Application number: ES17816528T
Authority: ES
Inventors: Ralf Hoffmann; Strijp Dianne Arnoldina Margaretha Wilhelmina Van; Brussel Anne Godefrida Catharina Van; Janneke Wrobel; Zon Joannes Baptist Adrianus Dionisius Van; Biezen Eveline Catharina Anna Clasina Den; De Inda Márcia Alves
Original assignee: Koninklijke Philips NV
Current assignee: Koninklijke Philips NV
Priority date: 2016-12-01
Filing date: 2017-11-28
Publication date: 2022-02-09
Anticipated expiration: 2037-11-28
Also published as: RU2019120046A; WO2018099884A1; CN110062811A; KR102546357B1; JP2020500527A; KR20190086551A; US20210277479A1; RU2766885C2; DK3548631T3; RU2019120046A3; CA3045710A1; JP7184771B2; EP3548631A1; EP3548631B1; BR112019011031A2

Abstract

Método de estratificación de riesgos, que comprende: determinar un perfil expresión génica normalizada para un único gen marcador que consiste en fosfodiesterasa 4D variante 7 (PDE4D7) con respecto a un conjunto de uno o más genes de referencia seleccionados del grupo que consiste en: hipoxantina fosforibosiltransferasa 1 (HPRT1) de Homo sapiens, tubulina-alfa-Ib (TUBA1B), miembro de la familia de proteínas de unión a ARN Pumilio (PUM1) de Homo sapiens y proteína de unión a caja TATA (TBP) de Homo sapiens, y combinaciones de las mismas, determinar una puntuación de riesgo pronóstico con una función de puntuación, basada en el perfil de expresión génica normalizada, en el que la función de puntuación se ha obtenido a partir de los genes de expresión génica para muestras biológicas obtenidas de sujetos que han sido monitorizados para cáncer de próstata, y determinar una puntuación combinada de riesgo pronóstico basada en la puntuación de riesgo pronóstico y una segunda determinación de riesgo que es la clasificación de la National Comprehensive Cancer Network (NCCN).

Description

DESCRIPCIÓN

Puntuaciones de riesgo basadas en la expresión de la variante 7 de la fosfodiesterasa 4D humana

Antecedentes

El cáncer es una clase de enfermedades en la que un grupo de células muestra un crecimiento no controlado, invasión y, en ocasiones, metástasis. Estas tres propiedades malignas de los cánceres los diferencian de los tumores benignos, que son autolimitados y no invaden ni metastizan. El cáncer de próstata (CaP) es la neoplasia maligna no cutánea más común en hombres. Debido al envejecimiento de la población, se espera que la incidencia de CaP se incremente drásticamente en el futuro. El diagnóstico rutinario mediante determinación de los niveles sanguíneos del antígeno específico de la próstata (AEP), el examen rectal digital (ERD) y el análisis transrectal de ultrasonidos (ATRU) conducen a un sobrediagnóstico significativo de las condiciones prostáticas benignas, no cancerosas. Del aproximadamente 1 millón de biopsias de próstata realizadas cada año en EE.UU. para encontrar aproximadamente 250.000 nuevos casos, aproximadamente el 75% se llevan a cabo innecesariamente, incurriendo tanto en complicaciones sustanciales (tales como urosepsis, sangrado y retención urinaria) en los pacientes y como en un coste elevado. Por lo menos 4 de cada 100 hombres con una biopsia negativa es probable que sean hospitalizados debido a efectos secundarios y 9 de cada 10.000 pacientes biopsiados están en riesgo de morir del procedimiento actualmente utilizado.

De los aproximadamente 250.000 casos de CaP de nueva detección en los EE.UU. cada año, aproximadamente 200.000 se caracterizan inicialmente como enfermedad localizada, es decir, como cáncer confinado al órgano prostático. Dicha condición es, en cierta medida, curable mediante enfoques de tratamiento primario, tales como la terapia de radiación o la extirpación parcial o total de la próstata mediante cirugía (prostatectomía). Sin embargo, dichas intervenciones típicamente comportan efectos secundarios graves, particularmente incontinencia urinaria y/o disfunciones eréctiles como consecuencias muy frecuentes de la prostatectomía. Además, los tratamientos aplicados rutinariamente para el CaP localizado son caros.

Entre los aproximadamente 200.000 hombres en Estados Unidos con enfermedad clínicamente localizada en el diagnóstico, hasta 50% presentan cáncer de riesgo muy bajo o bajo. Por consiguiente, la National Comprehensive Cancer Network (NCCN) recientemente ha revisado sus directrices de tratamiento del CaP a fin de expandir la vigilancia activa (VA) como alternativa de tratamiento suave y conveniente para pacientes con dicha enfermedad de riesgo bajo. Mediante la referencia de los pacientes apropiados a VA, se mejora significativamente la calidad de vida de dichos pacientes en comparación con hombres que han sido sometidos a tratamiento primario y se informa que el coste a 5 años para la VA es significativamente inferior, por cada paciente.

Además, en el caso de que se seleccione la cirugía (vs. VA) como tratamiento de elección para un paciente dado, resulta una ventaja significativa estratificar según el grado de la cirugía según la potencial agresividad del tumor del paciente. Por ejemplo, podrían aplicarse más generalmente técnicas operativas preservadoras de los nervios en hombres con enfermedad predicha de bajo riesgo a fin de minimizar los efectos adversos relacionados con la potencia de la prostatectomía radical. De manera similar, según las últimas directrices para el cáncer de próstata de la European Association of Urology (EAU), se recomienda la disección extendida de ganglios linfáticos en el caso de un cáncer predicho de alto riesgo a pesar del hecho de que el procedimiento es complejo, laborioso y se asocia a tasas de complicación más altas que en procedimientos más limitados. En consecuencia, aunque se ha observado que una disección menos limitada de los ganglios linfáticos omite aproximadamente 50% de las metástasis de ganglios linfáticos, el control del tratamiento en hombres con cáncer de próstata localizado resultaría beneficiado por predicciones prequirúrgicas altamente precisas del potencial de agresividad de los tumores individuales, a fin de proporcionar un cuidado óptimo para cada paciente.

Los efectos secundarios de las opciones de tratamiento activo (p.ej., cirugía, terapia de radiación, etc.) pueden evitarse o reducirse mediante la selección de la vigilancia activa como alternativa del tratamiento. Sin embargo, debido a que el tumor no se tratar mientras se encuentra en vigilancia activa, la probabilidad de progresión de la enfermedad debe ser muy baja para garantizar que pacientes que podrían progresar bajo vigilancia activa todavía presenten una buena probabilidad de curación mediante el cambio de vigilancia activa a intervención activa. Los métodos tradicionales de determinación del riesgo del paciente de progresión de la enfermedad tienden a asignar muchos pacientes a las categorías de intervención activa en lugar de VA, reduciendo de esta manera la calidad de vida del paciente y sometiendo innecesariamente dichos pacientes a los efectos secundarios adversos de tratamientos invasivos. De esta manera, resultan deseables nuevos métodos de estratificación del riesgo del paciente y proporcionar mejores recomendaciones a los pacientes respecto a si seleccionar la vigilancia activa frente a la intervención activa.

El documento n° WO 2010/131194 A1 da a conocer un método para el diagnóstico o la detección de cáncer de próstata sensible a hormonas maligno mediante la determinación del nivel de expresión de la fosfodiesterasa 4D, variante PDE4D7. El documento da a conocer además la utilización de un índice PDE para discriminar eficazmente entre enfermedades benignas y malignas, en las que la expresión de PDE4D7 se normaliza frente a PDE4D5 como control interno.

El documento n° WO 2010/131195 A1 describe un método para diagnosticar el cáncer de próstata resistente a hormonas frente al sensible a hormonas mediante la determinación del nivel de expresión de PDE4D7. El nivel de expresión de PDE4D7 se normaliza respecto a un gen de referencia, que puede ser PDE4D5.

En Henderson, et al., "The cAMP phosphodiesterase-4D7 (PDE4D7) is downregulated in androgen-independent prostate cancer cells and mediates proliferation by compartmentalizing cAMP at the plasma membrane of VCaP prostate cancer cells", British Journal of Cancer, 110(5) 1278-1287 (2014), se presenta evidencia de que PDE4D7 se expresa a nivel elevado en células de cáncer de próstata sensibles a andrógenos, mientras que se encuentra significativamente regulado negativamente en las células de cáncer de próstata insensible a andrógenos, y sugiere una potencial aplicación como biomarcador del cáncer de próstata insensible a andrógenos, así como posibilidades terapéuticas.

El documento n° EP 1471153 A2 describe un ensayo de actividad transcripcional para determinar la actividad biológica de un compuesto mediante el análisis de su capacidad de modular la expresión génica. Entre los posibles productos de expresión diana se encuentran los isoenzimas de PDE4D. Los compuestos identificados en los cribados indicados pueden ser anticuerpos, que presentan un valor terapéutico en el tratamiento del cáncer de mama.

El documento n° WO 2010/059838 A2 describe inhibidores de la fosfodiesterasa-4 (PDE4) y su utilización en el tratamiento y prevención de ictus, infarto de miocardio, enfermedades y trastornos inflamatorios cardiovasculares, así como trastornos del sistema nervioso central.

El documento n° WO 2004/090157 A1 da a conocer la utilización de PDE4D, en particular PDE4D5 o PDE4D7, como diana para la identificación de compuestos que pueden utilizarse para el tratamiento de la ateroesclerosis o para el tratamiento de la restenosis.

El documento n° US 2003/220273 A1 describe compuestos antisentido, composiciones y métodos para modular la expresión de la fosfodiesterasa 4D y la utilización de dichos compuestos para el tratamiento de enfermedades asociada a la expresión de la fosfodiesterasa 4D.

Merkle, et al., "Roles of cAMP and cAMP-dependent protein kinase in the progression of prostate cancer: Cross-talk with the androgen receptor" Cellular Signalling, 23(3) 507-515, (2011) describe un estudio sobre las funciones de AMPc y la proteína quinasa dependiente de AMPC en la progresión del cáncer de próstata. En el contexto de dicho estudio se indica que la expresión de PDE4D se encuentra incrementada en los tejidos de cáncer.

Breve descripción

La presente invención se refiere a métodos para el diagnóstico, monitorización o pronóstico del cáncer de próstata o del estado de progresión del cáncer de próstata. En particular, se refiere a un método para la estratificación del riesgo para la selección de terapia en un paciente con cáncer de próstata basado en el nivel de expresión de una variante de PDE4D, tal como PDE4D7, y a un kit diagnóstico utilizado para determinar una puntuación de riesgo para hombres con cáncer de próstata. PDE4D7 se refiere a una fosfodiesterasa (PDE) de nucleótido cíclico de la familia de la adenosín monofosfato cíclico (AMPc) (4), isoforma D, variante 7.

Según un aspecto de la realización ejemplar, el método de estratificación del riesgo incluye determinar un perfil normalizado de la expresión génica para un único gen marcador que consiste en fosfodiesterasa 4D variante 7 (PDE4D7) con respecto a un conjunto de genes de referencia seleccionado del grupo que consiste en hipoxantina fosforibosiltransferasa 1 (HPRT1) de Homo sapiens, tubulina-alfa-1b (TUBA1B), miembro de la familia de unión a ARN de Homo sapiens (PUM1) y proteína de unión a caja TATA (TBP) de Homo sapiens, y combinaciones de los mismos. El método incluye además la determinación de una puntuación de riesgo pronóstico con una función de puntuación, basada en el perfil de expresión génica normalizada, en el que la función de puntuación se ha obtenido de los genes de expresión génica para muestras biológicas obtenidas de sujetos que han sido monitorizados para cáncer de próstata. El método incluye además la determinación de una puntuación combinada de riesgo pronóstico basada en la puntuación de riesgo pronóstico y una segunda determinación de riesgo que es la clasificación de la National Comprehensive Cancer Network (NCCN).

Según otro aspecto, un kit diagnóstico incluye por lo menos un cebador y/o sonda para la determinación del nivel de expresión de por lo menos una variante de fosfodiesterasa 4D (PDE4D), en la que la variante o variantes de PDE4D comprende PDE4D7 y por lo menos un cebador y/o sonda para la determinación del nivel de expresión génica de por lo menos un gen de referencia. El kit incluye instrucciones para calcular una puntuación de riesgo basándose en los niveles de expresión determinados. Las instrucciones se almacenan en un producto de software informático que, al ser ejecutado en un ordenador, lleva a cabo un método que incluye determinar un perfil normalizado de expresión génica para la fosfodiesterasa 4D, variante 7 (PDE4D7) con respecto a por lo menos un gen de referencia y determinar una puntuación de riesgo pronóstico con una función de puntuación, basada en el perfil de expresión génica normalizada, y determinar una puntuación combinada de riesgo pronóstico basada en la puntuación de riesgo pronóstico y una segunda determinación de riesgo que es una clasificación de la National Comprehensive Cáncer Network (NCCN).

Según otro aspecto, un método para proporcionar una recomendación de terapia para un sujeto con cáncer de próstata incluye determinar el perfil de expresión génica de una muestra biológica del sujeto. El perfil de expresión génica incluye un nivel de expresión de la fosfodiesterasa 4D, variante 7 (PDE4D7). El perfil de expresión génica se normalizó respecto al nivel de expresión de por lo menos un gen de referencia seleccionado de entre HPRT1, TUBA1B, PUM1 y TBP. Se determinó una puntuación de riesgo pronóstico para el sujeto basándose en el perfil de expresión génica normalizado. El sujeto se categorizó en un grupo de riesgo de PDE4D7, basándose en la puntuación de riesgo pronóstico. El método comprende además la determinación de una puntuación combinada de riesgo pronóstico para el sujeto basada en la puntuación de riesgo pronóstico y una segunda determinación de riesgo que es la clasificación de la National Comprehensive Cancer Network (NCCN). El sujeto se categorizó en un grupo de riesgo basándose en la puntuación de riesgo pronóstico. Se proporcionó una recomendación de terapia para el sujeto basándose en el grupo de riesgo.

Según otro aspecto, un producto de software informático incluye un medio de grabación no transitorio que almacena instrucciones, que al ejecutarse en un ordenador causan que éste lleve a cabo un método que incluye el cálculo de un perfil de expresión génica normalizado para la fosfodiesterasa 4D, variante 7 (PDE4D7), con respecto a un juego de genes de referencia seleccionados del grupo que consiste en: hipoxantina fosforibosiltransferasa 1 (HPRT1) de Homo sapiens, tubulina-alfa-1 (TUBA1B), miembro de la familia de proteínas de unión a ARN Pumilio (PUM1) de Homo sapiens y proteína de unión a caja TATA (TBP) de Homo sapiens, y combinaciones de los mismos, y el cálculo de una puntuación de riesgo pronóstico para el sujeto basada en el perfil de expresión génica con una función de puntuación. La función de puntuación puede derivarse de perfiles de expresión génica para muestras biológicas obtenidas de sujetos que han sido monitorizados para cáncer de próstata. El método incluye además el cálculo de una puntuación combinada de riesgo pronóstico basada en la puntuación de riesgo pronóstico y una segunda determinación de riesgo que es la clasificación de la National Comprehensive Cancer Network (NCCN).

Tal como se ha indicado anteriormente, la segunda determinación de riesgo es una clasificación de la National Comprehensive Cancer Network (NCCN), tal como uno o más de entre riesgo muy bajo (RMB), riesgo bajo (RB), riesgo intermedio favorable (RIF), riesgo intermedio desfavorable (RID) y riesgo alto (RA). La puntuación combinada de riesgo pronóstico puede determinarse con una función de regresión derivada de sujetos que han sido monitorizados para cáncer de próstata.

En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos anteriormente indicados, el perfil de expresión génica se convierte en por lo menos una puntuación de riesgo de PDE (puntuación de riesgo pronóstico) de cáncer de próstata indicativa de la presencia y/o ausencia de cáncer de próstata y/o del estado de progresión del cáncer de próstata. La introducción de la puntuación de riesgo de PDE proporciona una buena predicción en el diagnóstico o pronóstico de cáncer de próstata. Específicamente, la puntuación de riesgo de PDE4D7 puede utilizarse para estratificar los sujetos con cáncer de próstata basándose en el nivel medido de dicha puntuación de riesgo, que indica si someter dichos sujetos a vigilancia activa (VA) en lugar de tratamiento activo (p.ej., cirugía, terapia de radiación, etc.), que es el estándar de cuidado para estos sujetos.

El perfil de expresión génica puede incluir además un nivel de expresión para otra u otras variantes de PDE4D. Por ejemplo, la otra variante o variantes de PDE4D pueden incluir uno o más de entre PDE4D1, PDE4D2, PDE4D3, PDE4D4, PDE4D5, PDE4D6, PDE4D8 y PDE4D9.

El perfil de expresión génica puede ser un perfil de expresión génica de una muestra biológica de un individuo, tal como una biopsia de la próstata de un individuo.

El perfil de expresión génica puede ser un perfil de expresión génica normalizada que se obtiene mediante normalización del nivel de expresión de por lo menos la variante de PDE4D7 respecto a la expresión de por lo menos un gen de referencia. El método puede incluir la determinación del nivel de expresión de uno o más genes de referencia en una muestra antes de la normalización del nivel de expresión de por lo menos la variante PDE4D7.

El gen o genes de referencia pueden seleccionarse de entre hipoxantina fosforibosiltransferasa 1 (HPRT1) de Homo sapiens, tubulina-alfa-Ib (TUBA1B), miembro de la familia de proteínas de unión a ARN Pumilio (PUM1) de Homo sapiens y proteína de unión a caja TATA (TBP) de Homo sapiens, y combinaciones de los mismos, tal como por lo menos dos, o por lo menos tres, o la totalidad de los mismos.

La puntuación de riesgo pronóstico puede basarse en el perfil de expresión génica normalizado que incluye el nivel de expresión de PDE4D7.

El nivel de expresión génica puede determinarse mediante detección de la expresión de ARNm utilizando uno o más cebadores y/o sondas, y/o uno o más juegos de los mismos.

El nivel de expresión génica puede determinarse mediante un método basado en la amplificación y/o análisis de micromatrices y/o secuenciación del ARN.

La determinación del perfil de expresión génica puede incluir la realización de una reacción en cadena de la polimerasa cuantitativo en tiempo real (RT-qPCR) del ARN extraído de la muestra biológica. En otras realizaciones, el nivel de expresión génica se determina mediante secuenciación del ARN, PCR convencional (utilizando, p.ej., análisis de punto final mediante electroforesis en gel) o PCR multiplex.

En el caso de la RT-qPCR, la determinación del perfil de expresión génica puede incluir determinar un valor del ciclo umbral (Ct) para PDE4D7 y cada uno de uno o más genes de referencia.

La determinación de la puntuación de riesgo pronóstico puede incluir normalizar el valor de PDE4D7, utilizando el valor de cada uno de por lo menos un gen de referencia. La determinación de la puntuación de riesgo pronóstico puede incluir el cálculo de la puntuación de riesgo como función, tal como una función lineal, del valor normalizado. La función puede derivarse basándose en los resultados de pacientes después de la adquisición de una muestra biológica.

La PCR puede llevarse a cabo con por lo menos un cebador y/o sonda para la medición de un gen de referencia seleccionado de entre HPRT1, TUBA1B, PUM1 y TBP.

La puntuación de riesgo pronóstico para el sujeto puede ser un valor en un intervalo predefinido.

El método puede incluir además categorizar el sujeto en uno de un juego predefinido de grupos de riesgo, basándose en la puntuación combinada de riesgo pronóstico. Puede haber por lo menos dos o por lo menos tres grupos de riesgo basándose en la puntuación combinada de riesgo pronóstico.

El método puede incluir además por lo menos uno de: a) una propuesta de una terapia para el sujeto basándose en el grupo de riesgo asignado, en el que por lo menos dos de los grupos de riesgo están asociados a diferentes terapias potenciales, b) cálculo de una predicción de riesgo de progresión de enfermedad del sujeto antes o después de la cirugía de próstata, y c) cálculo de una predicción de respuesta a terapia del sujeto antes o después de la cirugía de próstata. En el caso de proponer una terapia, las terapias propuestas pueden seleccionarse de: a) por lo menos una prostatectomía parcial, b) una terapia activa seleccionada de entre tratamiento de radiación, terapia hormonal, quimioterapia y una combinación de las mismas, y c) observación se in realizar a) o b). Entre las terapias propuestas pueden incluirse: cirugía de próstata, extirpación de la próstata, quimioterapia, radioterapia, terapia hormonal y disección limitada o extendida de ganglios linfáticos, o una combinación de los mismos.

La terapia propuesta basada en el grupo de riesgo asignado puede ser diferente de la terapia propuesta basándose únicamente en la segunda determinación de riesgo.

El método y kit puede incluir una matriz de ácidos nucleicos que incluye una o más sondas oligonucleótidas complementarias e hibridables a una secuencia codificante de por lo menos una variante de PDE4D seleccionada de entre PDE4D1, PDE4D2, PDE4D3, PDE4D4, PDE4D5, PDE4D6, PDE4D7, PDE4D8 y PDE4D9, y que puede incluir además una o más sondas oligonucleótidas complementarias e hibridables con por lo menos uno de los genes de referencia seleccionados de entre TBP, HPRT1, PUM1 y TUBA1B para la determinación de una puntuación de riesgo tal como se define en la presente memoria.

Otro aspecto de la realización ejemplar se refiere a una utilización de la variante de PDE4D7 y genes de referencia para la estratificación del riesgo.

Un aspecto adicional de la invención se refiere a un método implementado por ordenador para el diagnóstico, monitorización o pronóstico del cáncer de próstata o la estratificación del riesgo de progresión del cáncer de próstata, que comprende las etapas del método definidas en la presente memoria.

Un aspecto adicional de la invención se refiere a un producto de software informático que incluye un medio de grabación no transitorio con instrucciones almacenadas en el mismo, que al ejecutarse en un ordenador causan que éste lleve a cabo un método que incluye el cálculo de un perfil de expresión génica normalizado para la fosfodiesterasa 4D, variante 7 (PDE4D7), con respecto a un juego de genes de referencia seleccionados del grupo que consiste en: hipoxantina fosforibosiltransferasa 1 (HPRT1) de Homo sapiens, tubulina-alfa-1 (TUBA1B), miembro de la familia de proteínas de unión a ARN Pumilio (PUM1) de Homo sapiens y proteína de unión a caja TATA (TBP) de Homo sapiens, y combinaciones de los mismos, y el cálculo de una puntuación de riesgo pronóstico para el sujeto basada en el perfil de expresión génica con una función de puntuación que se deriva de los perfiles de expresión génica para muestras biológicas obtenidas de sujetos que han sido monitorizados para cáncer de próstata. El método puede incluir además el cálculo de una puntuación combinada de riesgo pronóstico basada en la puntuación de riesgo pronóstico y una segunda determinación de riesgo.

Breve descripción de los dibujos

La FIG. 1 es un gráfico de flujo que ilustra un método de estratificación del riesgo para la selección de terapia en un paciente con cáncer de próstata.

La FIG. 2 muestra el perfil de expresión génica normalizada de PDE4D7 (izquierda) y la transformación de la puntuación de riesgo de PDE4D7 (derecha).

La FIG. 3 es un gráfico de bosque de cocientes de riesgo (CR) e intervalos de confianza al 95% (IC al 95%) tras el análisis multivariante de regresión de Cox de la cohorte total de pacientes (que incluía 503 pacientes), en el que el punto final clínico sometido a ensayo era el tiempo de recurrencia bioquímica (RBQ) después de la cirugía. La FIG.4 muestra un análisis de Kaplan-Meier de tiempo hasta recaída de antígeno específico de la próstata (AEP) tras prostatectomía para los grupos de puntuación de riesgo de PDE4D7. También se muestra el número de pacientes (es decir, hombres) en riesgo en cada intervalo de tiempo de 20 meses por grupo de puntuación de riesgo y una comparación por grupos de los cocientes de riesgo.

La FIG. 5 es un gráfico de bosque de cocientes de riesgo (CR) e intervalos de confianza al 95% (IC al 95%) tras el análisis multivariante de regresión de Cox de la cohorte total de pacientes (503 pacientes), en el que el punto final clínico sometido a ensayo era el tiempo de recurrencia bioquímica (RBQ) después de la cirugía.

La FIG. 6 muestra un gráfico de bosque de cocientes de riesgo e intervalos de confianza al 95% (IC al 95%) para múltiples puntos finales clínicos postquirúrgicos, incluyendo la recurrencia bioquímica, la terapia de radiación de rescate, la terapia de privación de andrógenos de rescate, la recurrencia clínica, la mortalidad específica de cáncer de próstata y la mortalidad global.

La FIG. 7 muestra un gráfico del riesgo a 5 años de recurrencia bioquímica (RBQ) en los grupos de riesgo de NCCN frente a los grupos de puntuación de riesgo de PDE4D7.

La FIG. 8 muestra un gráfico del riesgo a 10 años de recurrencia clínica (RC) en los grupos de riesgo de NCCN frente a los grupos de puntuación de riesgo de PDE4D7.

La FIG. 9 muestra un gráfico del riesgo a 10 años de la mortalidad específica de cáncer de próstata (MECP) en los grupos de riesgo NCCN frente a los grupos de puntuación de riesgo de PDE4D7.

La FIG. 10 muestra un gráfico del riesgo a 10 años de mortalidad global (MG) en los grupos de riesgo de NCCN frente a los grupos de puntuación de riesgo de PDE4D7.

La FIG. 11 ilustra una matriz de progresión de riesgos en los grupos de riesgo clínico de NCCN frente a los grupos de riesgo de PDE4D7.

La FIG. 12 muestra un análisis de Kaplan-Meier de la puntuación de Gleason de biopsia para la recurrencia bioquímica en el grupo de riesgo intermedio favorable de NCCN (128 pacientes). Las puntuaciones de Gleason de biopsia se categorizan en grupos de grado Gleason 3+3 (la fila inferior en la figura) y 3+4 (la fila superior en la figura). Se ilustra además una comparación de grupos de riesgo por pares de los cocientes de riesgo (CR). La FIG. 13 muestra un análisis de Kaplan-Meier de los grupos de puntuación de riesgo de PDE4D7 para la recurrencia bioquímica en el grupo de riesgo intermedio favorable de NCCN (128 pacientes). Se ilustra además una comparación de grupos de riesgo por pares de los cocientes de riesgo (CR).

La FIG. 14 muestra un análisis de Kaplan-Meier de la puntuación de Gleason de biopsia para la recurrencia bioquímica en el grupo de riesgo intermedio desfavorable y grupo de alto riesgo de NCCN (164 pacientes). La puntuación Gleason de biopsia se categoriza en grupos de grado Gleason 3+3, 3+4, 4+3 y >4+4. Se ilustra además una comparación de grupos de riesgo por pares de los cocientes de riesgo (CR).

La FIG. 15 muestra un análisis de Kaplan-Meier de los grupos de puntuación de riesgo de PDE4D7 para la recurrencia bioquímica en los grupos de riesgo intermedio desfavorable y de alto riesgo de NCCN (164 pacientes). Se ilustra además una comparación de grupos de riesgo por pares de los cocientes de riesgo (CR).

La FIG. 16 muestra un gráfico de calibración del modelo de regresión logística de las puntuaciones de NCCN y PDE4D7 para predecir la recaída bioquímica a 5 años tras cirugía basado en una tabla de contingencia tras ensayos de Hosmer-Lemeshow de la cohorte de 449 pacientes con un seguimiento completo de 5 años.

La FIG. 17 muestra un gráfico de calibración del modelo de regresión logística de las puntuaciones de NCCN y PDE4D7 para predecir la recaída bioquímica a 5 años tras cirugía basado en una tabla de contingencia tras ensayos de Hosmer-Lemeshow de la cohorte de 449 pacientes con un seguimiento completo de 5 años.

La FIG. 18 muestra un análisis ROC de la recaída bioquímica (RBQ) a los 2 años de cirugía del modelo de regresión logística de las puntuaciones de NCCN y PDE4D7 en una cohorte de pacientes (449 pacientes) con seguimiento de 5 años completo.

La FIG. 19 muestra un análisis ROC de la recaída bioquímica (RBQ) a los 5 años de cirugía del modelo de regresión logística de las puntuaciones de NCCN y PDE4D7 en una cohorte de pacientes (449 pacientes) con seguimiento de 5 años completo.

La FIG. 20 muestra un análisis ROC de la recaída bioquímica (RBQ) a los 10 años de cirugía del modelo de regresión logística de las puntuaciones NCCN y PDE4D7 en una cohorte de pacientes (379 pacientes) con seguimiento de 10 años completo.

La FIG. 21 muestra un análisis de riesgo predicho por cada grupo de NCCN como función de la puntuación de riesgo de PDE4D7 que revela una distribución heterogénea del riesgo de progresión (RBQ) a 5 años incluso dentro de los grupos de riesgo clínico de NCCN más bajo.

La FIG. 22 muestra los resultados de un análisis de Kaplan-Meier de la supervivencia libre de recurrencia bioquímica (RBQ) en la subcohorte de pacientes con seguimiento de 5 años completo (449 pacientes). Se definen cuatro categorías de riesgo basándose en la probabilidad a 5 años p calculada con el modelo de regresión logístico de experimentar recurrencia bioquímica: grupo de riesgo 1 (0 a <0,1, 139 pacientes), grupo de riesgo 2 (0,1 a <0,25, 170 pacientes), grupo de riesgo 3 (0,25 a <0,5, 112 pacientes), grupo de riesgo 4 (0,5 a 1,0, 28 pacientes).

Descripción detallada

Algunos aspectos de la realización ejemplar se refieren a la identificación y utilización de perfiles de expresión génica, firmas o patrones de genes biomarcadores de interés (también denominados genes marcadores o GDI (genes de interés)) con relevancia clínica para el cáncer de próstata. En particular, el método utiliza el análisis de expresión génica de ácidos nucleicos, tales como transcritos de genes biomarcadores, obtenidos de muestras biológicas. El análisis de expresión de dichos genes marcadores puede utilizarse para proporcionar una puntuación de riesgo de PDE4D7 de cáncer de próstata para estratificar el riesgo del paciente de alcanzar determinados resultados clínicos.

Más específicamente, se describe un método para la determinación de una puntuación de riesgo basado en el perfil de expresión de PDE4D7, que se ha encontrado que proporciona un medio único para estratificar el riesgo del paciente de desarrollar puntos finales prequirúrgicos y postquirúrgicos particulares, incluyendo la recurrencia bioquímica, la recurrencia clínica, la mortalidad específica de cáncer de próstata y la mortalidad global. La puntuación de riesgo de PDE proporciona un parámetro muy útil para la medicina personalizada relacionada con el diagnóstico, pronóstico y tratamiento de los pacientes de cáncer de próstata. La puntuación de riesgo de PDE puede utilizarse sola o en combinación con otros medios y métodos que proporcionan información sobre el estado de enfermedad o estadio de enfermedad personal del paciente.

Los médicos y/o patólogos pueden utilizar ventajosamente la puntuación de riesgo de PDE para confirmar los resultados obtenidos en otros métodos de diagnóstico, identificación y pronóstico de los pacientes. Por lo tanto, los métodos y medios proporcionados por la invención ayudan a establecer un mejor diagnóstico, pronóstico, etc. para encontrar el mejor tratamiento para el paciente y para evitar una cirugía innecesaria u otros tratamientos que resultan peligrosos debido a efectos secundarios y resultan en ahorro de costes.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "variante de transcrito de PDE4D" o "isoforma de PDE4D" o "variante de PDE4D" se refiere a cualquiera de las variantes de corte y empalme de PDE4D de la fosfodiesterasa humana PDE4D, es decir, el gen de la fosfodiesterasa PDE4D humana, por ejemplo, PDE4D1, PDE4D2, PDE4D3, PDE4D4, PDE4D5, PDE4D6, PDE4D7, PDE4D8 y PDE4D9.

Los términos "marcador", "gen marcador", "GDI", "marcador variante de PDE4D" pueden utilizarse intercambiablemente y se refiere a un gen, unidad genética o secuencia (una secuencia de nucleótidos o una secuencia de aminoácidos o proteica) tal como se define en la presente memoria anteriormente, cuyo nivel de expresión se encuentra incrementado o reducido en células o tejidos malignos o benignos, de cáncer de próstata, o en cualquier tipo de muestra que incluye dichas células o tejidos, o partes o fragmentos de los mismos, en la comparación respecto a un nivel de control, durante la comparación con la expresión en tejido normal. El término se refiere además a cualquier producto de expresión de dicha unidad o secuencia genética, en particular a un transcrito de ARNm variante de PDE4D, un polipéptido o una proteína codificado por el transcrito variante de PDE4D o fragmentos del mismo, así como derivados homólogos de los mismos tal como se ha indicado anteriormente en la presente memoria. En particular, los términos "marcador", "gen marcador", "GDI" o "marcador variante de PDE4D" se refieren a cualquiera de las variantes de corte y empalme de PDE4D de la fosfodiesterasa humana PDE4D, es decir, el gen de la fosfodiesterasa humana PDE4D, por ejemplo, PDE4D1, PDE4D2, PDE4D3, PDE4D4, PDE4D5, PDE4D6, PDE4D7, PDE4D8 y PDE4D9.

La expresión "fosfodiesterasa 4D1" o "PDE4D1" se refiere a la variante de corte y empalme 1 de la fosfodiesterasa humana PDE4D, es decir, el gen de fosfodiesterasa humana PDE4D1, por ejemplo, a la secuencia tal como se define en la secuencia de referencia de NCBI: NM_001197222.1, específicamente a la secuencia de nucleótidos indicada en SEC ID n° 1, que corresponde a la secuencia de la secuencia de referencia de NCBI indicada anteriormente del transcrito de PDE4D1 y se refiere además a la secuencia de aminoácidos correspondiente, por ejemplo tal como se indica en la SEC ID n° 2, que corresponde a la secuencia proteica definida en la secuencia de referencia de proteínas de NCBI n° de acceso NP_001184l51.1 codificante del polipéptido PDE4D1. El término "fosfodiesterasa 4D1" o "PDE4D1" se refiere además al amplicón que puede generarse mediante la pareja de cebadores PDE1D1D2_forward (SEC ID n° 3) y PDE1D1D2_reverse (SEC ID n° 4) y puede detectarse mediante la sonda SEC ID n° 5.

La expresión "fosfodiesterasa 4D2" o "PDE4D2" se refiere a la variante de corte y empalme 2 de la fosfodiesterasa humana PDE4D, es decir, el gen de fosfodiesterasa humana PDE4D2, por ejemplo, a la secuencia tal como se define en la secuencia de referencia de NCBI: NM_001197221.1, específicamente a la secuencia de nucleótidos indicada en SEC ID n° 6, que corresponde a la secuencia de la secuencia de referencia de NCBI indicada anteriormente del transcrito de PDE4D2 y se refiere además a la secuencia de aminoácidos correspondiente, por ejemplo tal como se indica en la SEC ID n° 7, que corresponde a la secuencia proteica definida en la secuencia de referencia de proteínas de NCBI n° de acceso NP_001184150.1 codificante del polipéptido PDE4D2.

La expresión "fosfodiesterasa 4D3" o "PDE4D3" se refiere a la variante de corte y empalme n° 3 de la fosfodiesterasa humana PDE4D, es decir, el gen de fosfodiesterasa humana PDE4D3, por ejemplo, a la secuencia tal como se define en la secuencia de referencia de NCBI: NM_006203.4, específicamente a la secuencia de nucleótidos indicada en SEC ID n° 8, que corresponde a la secuencia de la secuencia de referencia de NCBI indicada anteriormente del transcrito de PDE4D3 y se refiere además a la secuencia de aminoácidos correspondiente, por ejemplo tal como se indica en la SEC ID n° 9, que corresponde a la secuencia proteica definida en la secuencia de referencia de proteínas de NCBI n° de acceso NP_006194.2 codificante del polipéptido PDE4D3.

La expresión "fosfodiesterasa 4D4" o "PDE4D4" se refiere a la variante de corte y empalme n° 4 de la fosfodiesterasa humana PDE4D, es decir, el gen de fosfodiesterasa humana PDE4D4, por ejemplo, a la secuencia tal como se define en la secuencia de referencia de NCBI: NM_001104631.1, específicamente a la secuencia de nucleótidos indicada en SEC ID n° 10, que corresponde a la secuencia de la secuencia de referencia de NCBI indicada anteriormente del transcrito de PDE4D4 y se refiere además a la secuencia de aminoácidos correspondiente, por ejemplo tal como se indica en la SEC ID n° 1 l, que corresponde a la secuencia proteica definida en la secuencia de referencia de proteínas de NCBI n° de acceso NP_001098l0l.1 codificante del polipéptido PDE4D4.

La expresión "fosfodiesterasa 4D5" o "PDE4D5" se refiere a la variante de corte y empalme n° 5 de la fosfodiesterasa humana PDE4D, es decir, el gen de fosfodiesterasa humana PDE4D5, por ejemplo, a la secuencia tal como se define en la secuencia de referencia de NCBI: NM_001197218.1, específicamente a la secuencia de nucleótidos indicada en SEC ID n° 12, que corresponde a la secuencia de la secuencia de referencia de NCBI indicada anteriormente del transcrito de PDE4D5 y se refiere además a la secuencia de aminoácidos correspondiente, por ejemplo tal como se indica en la SEC ID n° 13, que corresponde a la secuencia proteica definida en la secuencia de referencia de proteínas de NCBI n° de acceso n P_001184147.1 codificante del polipéptido PDE4D5. El término "fosfodiesterasa 4D5" o "PDE4D5" se refiere además al amplicón que puede generarse mediante la pareja de cebadores PDE4D5_forward (SEC ID n° 14) y PDE4D5_reverse (SEC ID n° 15) y puede detectarse mediante la sonda SEC ID n° 16.

La expresión "fosfodiesterasa 4D6" o "PDE4D6" se refiere a la variante de corte y empalme n° 6 de la fosfodiesterasa humana PDE4D, es decir, el gen de fosfodiesterasa humana PDE4D6, por ejemplo, a la secuencia tal como se define en la secuencia de referencia de NCBI: NM_001197223.1, específicamente a la secuencia de nucleótidos indicada en SEC ID n° 17, que corresponde a la secuencia de la secuencia de referencia de NCBI indicada anteriormente del transcrito de PDE4D6 y se refiere además a la secuencia de aminoácidos correspondiente, por ejemplo tal como se indica en la SEC ID n° 18, que corresponde a la secuencia proteica definida en la secuencia de referencia de proteínas de NCBI n° de acceso NP_001184152.1 codificante del polipéptido PDE4D6.

La expresión "fosfodiesterasa 4D7" o "PDE4D7" se refiere a la variante de corte y empalme n° 7 de la fosfodiesterasa humana PDE4D, es decir, el gen de fosfodiesterasa humana PDE4D7, por ejemplo, a la secuencia tal como se define en la secuencia de referencia de NCBI: NM_001165899.1, específicamente a la secuencia de nucleótidos indicada en SEC ID n° 19, que corresponde a la secuencia de la secuencia de referencia de NCBI indicada anteriormente del transcrito de PDE4D7 y se refiere además a la secuencia de aminoácidos correspondiente, por ejemplo tal como se indica en la SEC ID n° 2o, que corresponde a la secuencia proteica definida en la secuencia de referencia de proteínas de NCBI n° de acceso n P_001159371.1 codificante del polipéptido PDE4D7. El término "fosfodiesterasa 4D7" o "PDE4D7" se refiere además al amplicón que puede generarse mediante la pareja de cebadores PDE4D7_forward (SEC ID n° 21) y PDE4D7_reverse (SEC ID n° 22) y puede detectarse mediante la sonda SEC ID n° 23.

El polipéptido PDE4D7 también puede detectarse con la pareja de cebadores PDE4D7-2_forward (SEC ID n° 24) y PDE4D7_reverse (SEC ID n° 25) y puede detectarse con la sonda SEC ID n° 26.

La expresión "fosfodiesterasa 4D8" o "PDE4D8" se refiere a la variante de corte y empalme n° 8 de la fosfodiesterasa humana PDE4D, es decir, el gen de fosfodiesterasa humana PDE4D8, por ejemplo, a la secuencia tal como se define en la secuencia de referencia de NCBI: NM_001197219.1, específicamente a la secuencia de nucleótidos indicada en SEC ID n° 27, que corresponde a la secuencia de la secuencia de referencia de NCBI indicada anteriormente del transcrito de PDE4D8 y se refiere además a la secuencia de aminoácidos correspondiente, por ejemplo tal como se indica en la SEC ID n° 28, que corresponde a la secuencia proteica definida en la secuencia de referencia de proteínas de NCBI n° de acceso NP_001184148.1 codificante del polipéptido PDE4D8.

La expresión "fosfodiesterasa 4D9" o "PDE4D9" se refiere a la variante de corte y empalme n° 9 de la fosfodiesterasa humana PDE4D, es decir, el gen de fosfodiesterasa humana PDE4D9, por ejemplo, a la secuencia tal como se define en la secuencia de referencia de NCBI: NM_001197220.1, específicamente a la secuencia de nucleótidos indicada en SEC ID n° 29, que corresponde a la secuencia de la secuencia de referencia de NCBI indicada anteriormente del transcrito de PDE4D9 y se refiere además a la secuencia de aminoácidos correspondiente, por ejemplo tal como se indica en la SEC ID n° 3o, que corresponde a la secuencia proteica definida en la secuencia de referencia de proteínas de NCBI n° de acceso n P_001184149.1 codificante del polipéptido PDE4D9. El término "fosfodiesterasa 4D9" o "PDE4D9" se refiere además al amplicón que puede generarse mediante la pareja de cebadores PDE4D9_forward (SEC ID n° 31) y PDE4D9 (SEC ID n° 32) y puede detectarse mediante la sonda SEC ID n° 33.

Los términos "PDE4D1," "PDE4D2," "PDE4D3," "PDE4D4," "PDE4D5," "PDE4D6," "PDE4D7," "PDE4D8" y "PDE4D9" comprenden además secuencias de nucleótidos que muestran un grado elevado de homología respecto a PDE4D1, PDE4D2, PDE4D3, PDE4D4, PDE4D5, PDE4D6, PDE4D7, PDE4D8 y PDE4D9, respectivamente, p.ej., secuencias de ácidos nucleicos que son por lo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idénticas a las secuencias indicadas en SEC ID n° 1, 6, 8, 10, 12, 17, 19, 27 o 29, respectivamente o secuencias de aminoácidos que son por lo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idénticas a la secuencia indicada en la SEC ID n° 2, 7, 9, 11, 13, 18, 20, 28 o 30, respectivamente, o secuencias de ácidos nucleicos codificantes de las secuencias de aminoácidos que son por lo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idénticas a la secuencia indicada en SEC ID n° 2, 7, 9, 11, 13, 18, 20, 28 o 30, o secuencias de aminoácidos codificadas por secuencias de aminoácidos que son por lo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idénticas a la secuencia indicada en SEC ID n° 1, 6, 8, 10, 12, 17, 19, 27 o 29.

La expresión "nivel de expresión" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a la cantidad de transcrito de variante de PDE4D y/o de proteína PDE4D derivable de un número definido de células o de una parte de tejido definida, en particular, a la cantidad de transcrito de variante de PDE4D y/o proteína de PDE4D variante obtenible en un ácido nucleico estándar (p.ej., ARN) o procedimiento de extracción de proteína. Dichos métodos de extracción adecuados son conocidos por el experto en la materia.

La expresión "nivel de control" (o "estado de control"), tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a un nivel de expresión que puede determinarse simultáneamente y/o bajo condiciones similares o comparables a la muestra de ensayo mediante la utilización de una o más muestras recogidas y almacenadas previamente de un sujeto/sujetos cuya condición o estado de enfermedad, p.ej., tumor prostático normal o benigno, no canceroso, cáncer de próstata avanzado, etc. es conocido. La expresión "estado de enfermedad" o "estado de enfermedad cancerosa" se refiere a cualquier estado o tipo de condición celular o molecular entre un estado celular no canceroso e (incluyendo) un estado celular canceroso terminal. En particular, la expresión incluye diferentes estadios de proliferación/desarrollo canceroso o niveles de desarrollo tumoral en el organismo entre (y excluyendo) un estado celular no canceroso e (incluyendo) un estado celular canceroso terminal. Dichos estadios de desarrollo pueden incluir todos los estadios del sistema de clasificación TNM (tumor, nódulo, metástasis) de los tumores malignos tal como define la UICC, p.ej., estadios 0 y I a IV. El término incluye además estadios antes del estadio TNM 0, p.ej., estadios de desarrollo en los que los biomarcadores de cáncer conocidos por el experto en la materia muestran una expresión o patrón de expresión modificado.

El nivel de expresión indicado anteriormente puede ser el nivel de expresión de variantes de PDE4D tal como se ha definido anteriormente en la presente memoria. Alternativa o adicionalmente, el nivel de expresión también puede ser el nivel de expresión de cualquier otro gen o elemento genético adecuado que se expresa en una célula, p.ej., el nivel de expresión de un gen de referencia o el nivel de expresión de una combinación de genes de referencia, p.ej., uno o más de entre hipoxantina fosforibosiltransferasa 1 (HpRT1) de Homo sapiens, tubulina-alfa-Ib (TUBA1B), miembro de la familia de proteínas de unión a ARN Pumilio (PUM1) de Homo sapiens y proteína de unión a caja TATA (TBP) de Homo sapiens. En una realización, el nivel de expresión se determina para una combinación de genes de referencia.

El término "canceroso" se refiere a un estado de enfermedad cancerosa tal como se define en la presente memoria. La expresión "no canceroso" se refiere a una condición en la que no puede detectarse proliferación benigna ni maligna. Los medios adecuados para la detección son conocidos de la técnica.

La expresión "cáncer de próstata" se refiere a un cáncer de la glándula prostática en el sistema reproductor masculino, que se produce cuando las células de la próstata mutan y empiezan a multiplicarse sin control. Típicamente, el cáncer de próstata se asocia a un nivel elevado de antígeno específico de la próstata (AEP). En una realización de la presente invención, la expresión "cáncer de próstata" se refiere a un cáncer que muestra niveles de AEP superiores a 4,0. En otra realización, la expresión se refiere a cáncer que muestra niveles de AEP superiores a 2,0. La expresión "nivel de AEP" se refiere a la concentración de AEP en la sangre, en ng/ml.

La expresión "estado de cáncer de próstata no progresivo" se refiere a que una muestra de un individuo no muestra valores de parámetros que indiquen "recurrencia bioquímica" y/o "recurrencia clínica".

La expresión "estado de cáncer de próstata progresivo" se refiere a que una muestra de un individuo muestra valores de parámetros que indican "recurrencia bioquímica" y/o "recurrencia clínica".

La expresión "recurrencia bioquímica" se refiere de manera general a valores biológicos recurrentes de AEP incrementado que indican la presencia de células de cáncer de próstata en una muestra. Sin embargo, también resulta posible utilizar otros marcadores que pueden utilizarse en la detección de la presencia o que levantan sospechas de dicha presencia.

La expresión "recurrencia clínica" se refiere a la presencia de signos clínicos que indican la presencia de células tumorales tal como se mide, por ejemplo, utilizando las imágenes in vivo.

El término "incrementado" o "nivel de expresión incrementada" o "nivel de expresión regulada positivamente" o "incremento del nivel de expresión" (que pueden utilizarse como sinónimos) denota una elevación del nivel de expresión entre una situación que debe analizarse, p.ej., una situación derivable de una muestra del paciente, y un punto de referencia, que podría ser un nivel de control normal o un nivel de control canceroso derivable de cualquier tumor de próstata adecuado o estadio de cáncer conocido por el experto en la materia. Los niveles de expresión se considera que se encuentran "incrementados" en el caso de que la expresión génica de la variante de PDE4D, p.ej., en una muestra biológica que debe analizarse, difiera, es decir, se encuentre elevada, en, por ejemplo, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, o más de 50% respecto al nivel de control, o por lo menos 0,1 veces, por lo menos 0,2 veces, por lo menos 1 vez, por lo menos 2 veces, por lo menos 5 veces o por lo menos 10 veces o más respecto a un nivel de control. El nivel de control puede ser un nivel de control normal o un nivel de control canceroso tal como se ha definido anteriormente en la presente memoria. En el caso de que deba llevarse a cabo una comparación con un nivel de control canceroso, resulta preferente una comparación adicional con un nivel de control normal. Dicha comparación adicional permite la determinación de una tendencia de la modificación, p.ej., la magnitud del incremento del nivel de expresión puede observarse y/o extraerse las conclusiones correspondientes. Puede ser una comparación con un tumor de próstata benigno o con un tejido sano o una muestra obtenida de un individuo sano.

La expresión "monitorización de cáncer de próstata", tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere al acompañamiento de una enfermedad o trastorno de cáncer de próstata diagnosticado o detectado, p.ej., durante un procedimiento de tratamiento o durante un determinado periodo de tiempo, típicamente durante 2 meses, 3 meses, 4 meses, 6 meses, 1 año, 2 años, 3 años, 5 años, 10 años o cualquier otro periodo de tiempo. El término "acompañamiento" se refiere a estados de enfermedad tal como se han definido anteriormente en la presente memoria y, en particular, los cambios de dichos estados de enfermedad pueden detectarse mediante comparación del nivel de expresión del marcador de variante de PDE4D en una muestra con un nivel de control normal tal como se ha definido anteriormente en la presente memoria, en particular, un nivel de expresión de control derivado de un control de tumor progresivo, un control de tumor no progresivo o un control sano o con el nivel de expresión de unas células o línea celular de cáncer de próstata establecido, p.ej., independientemente establecido, en cualquier tipo de segmento temporal periódico, p.ej., cada semana, cada 2 semanas, cada mes, cada 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 meses, cada 1,5 años, cada 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 años, durante cualquier periodo de tiempo, p.ej., durante 2 semanas, 3 semanas, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 meses, o 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 o 20 años, respectivamente. Las células o línea celular de cáncer de próstata establecido, p.ej., establecido independientemente, dando lugar a un nivel de control adicional puede derivarse de muestras correspondientes a diferentes estadios de desarrollo del cáncer, p.ej., los estadios 0 y I a IV del sistema de clasificación TNM. En una forma de realización, el término se refiere al acompañamiento de un cáncer de próstata diagnosticado, en particular de un cáncer de próstata progresivo o no progresivo. La monitorización puede incluir además la detección de la expresión de genes o elementos genéticos adicionales, p.ej., genes de referencia.

La expresión "pronóstico de cáncer de próstata" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a la predicción del curso o resultado de un cáncer de próstata diagnosticado o detectado, p.ej., durante un determinado periodo de tiempo, durante un tratamiento o después de un tratamiento. La expresión se refiere además a la determinación de la probabilidad de supervivencia o recuperación de la enfermedad, así como a una predicción del tiempo de supervivencia esperado de un sujeto. Un pronóstico puede implicar específicamente establecer la probabilidad de supervivencia de un sujeto durante un periodo de tiempo en el futuro, tal como 6 meses, 1 año, 2 años, 3 años, 5 años, 10 años o cualquier otro periodo de tiempo.

Los términos "diagnosticar" y "pronosticar" también se pretende que comprendan predicciones y análisis de probabilidad. Las variantes de PDE4D como marcadores de acuerdo con lo anterior pueden utilizarse clínicamente en la toma de decisiones referentes a modalidades de tratamiento, incluyendo la intervención terapéutica, o criterios diagnósticos, tal como la vigilancia para la enfermedad. Según la presente invención, puede proporcionarse un resultado intermedio de examen de la condición del sujeto. Dicho resultado intermedio puede combinarse con información adicional para ayudar al médico, enfermero u otro profesional sanitario a diagnosticar que un sujeto sufre de la enfermedad. Alternativamente, la presente invención puede utilizarse para detectar células cancerosas en un tejido derivado del sujeto, y proporcionar a un médico información útil para diagnosticar que el sujeto sufre de la enfermedad.

La expresión "gen de referencia" o "gen de control" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a cualquier gen adecuado, p.ej., a cualquier gen expresado constantemente y continuamente detectable, producto génico, producto de expresión, proteína o variante de proteína en el organismo seleccionado. La expresión incluye además productos génicos, tales como proteínas, péptidos y polipéptidos expresados, así como variantes modificadas de los mismos. La expresión gen de referencia por lo tanto también incluye proteínas de referencia derivadas de un gen de referencia, a menos que se indique lo contrario. También se encuentran comprendidos todos los tipos de transcritos derivables del gen de referencia, así como modificaciones de los mismos o parámetros secundarios asociados a los mismos. Alternativa o adicionalmente, otros parámetros de referencia también pueden utilizarse con fines de referencia, p.ej., concentraciones metabólicas, tamaños celulares, etc.

La expresión puede llevarse a cabo en la misma muestra, es decir, se determina en la misma muestra el nivel de una variante de PDE4D y del gen de referencia. En el caso de que los ensayos se lleven a cabo en la misma muestra, puede llevarse a cabo una única detección o un enfoque de detección multiplex tal como se indica en la presente memoria. Para la realización de una detección multiplex, puede modificarse la concentración de los cebadores y/o oligonucleótidos de sonda. Además, la concentración y presencia de ingredientes adicionales, tales como tapones, iones, etc. pueden modificarse, p.ej., incrementarse o reducirse en comparación con las indicaciones de los fabricantes.

En una realización específica, puede determinarse la expresión de más de un gen de referencia o gen de expresión constante. Por ejemplo, puede determinarse la expresión de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 30 o más genes de referencia. Los resultados de dichas mediciones pueden calcularse por separado o pueden combinarse a fin de obtener un índice de expresión media. Además, la expresión génica del patrón de referencia puede determinarse y/o utilizarse como base para etapas posteriores. Dicho patrón puede basarse en comportamientos de expresión conocidos de genes en determinados cánceres, en particular en estadios o etapas del cáncer de próstata.

Un sujeto, tal como un paciente o individuo en el que debe diagnosticarse, monitorizarse o pronosticarse el cáncer de próstata o el estado de progresión del cáncer de próstata es un animal, tal como un mamífero, p.ej., un ser humano.

El nivel de la variante de PDE4D puede determinarse a partir del nivel de ácido nucleico, el nivel de proteína o el nivel de actividad tal como se indica en la presente memoria. Resulta preferente la determinación de la cantidad de uno o más transcritos y/o proteína de variante de PDE4D. Además, puede determinarse el nivel de un gen de referencia en la muestra.

En una realización, el diagnóstico, monitorización, pronóstico, estratificación del riesgo y provisión de una recomendación tal como se mencionan en la presente memoria deben llevarse a cabo en una muestra biológica obtenida de un individuo. La expresión "muestra biológica" o "muestra obtenida de un individuo" se refiere a cualquier material biológico obtenido mediante métodos adecuados conocidos por el experto en la materia procedentes de un individuo. La muestra biológica utilizada puede recogerse de una manera clínicamente aceptable, p.ej., de manera en que los ácidos nucleicos (en particular el ARN) o proteínas sean conservados.

La muestra o muestras biológicas pueden incluir tejido y/o líquido corporal, tal como, aunque sin limitarse a ellos, sangre, sudor y orina. Además, la muestra biológica puede contener un extracto celular derivado de una población celular o una población celular, incluyendo una célula epitelial, tal como una célula epitelial cancerosa o una célula epitelial derivada de tejido que se sospecha que es canceroso. La muestra biológica puede contener una población celular derivada de un tejido glandular, p.ej., la muestra puede derivarse de la próstata de un individuo masculino. Además, las células pueden purificarse a partir de tejidos y líquidos corporales obtenidos, en caso necesario, y después utilizarse como la muestra biológica. En algunas realizaciones, la muestra es una muestra de tejido, una muestra de orina, una muestra de sedimento urinario, una muestra de sangre, una muestra de saliva, una muestra de semen, una muestra que incluye células tumorales circulantes, vesículas extracelulares, una muestra que contiene exosomas secretados por la próstata o líneas celulares o una línea celular de cáncer.

En una realización, pueden obtenerse y/o utilizarse muestras de biopsia o de resección. Dichas muestras pueden incluir células o lisados celulares.

En una realización específica, el contenido de una muestra biológica también puede someterse a una etapa de enriquecimiento. Por ejemplo, una muestra puede ponerse en contacto con ligandos específicos para la membrana celular u orgánulos de determinados tipos celulares, p.ej., células prostáticas, funcionalizadas, por ejemplo con partículas magnéticas. El material concentrado con las partículas magnéticas seguidamente puede utilizarse para etapas de detección y análisis, tal como se ha indicado anteriormente o se indica posteriormente en la presente memoria.

Además, las células, p.ej., células tumorales, pueden enriquecerse mediante procedimientos de filtración de muestras de fluido o líquidas, p.ej., sangre, orina, etc. Dichos procedimientos de filtración también pueden agruparse con etapas de enriquecimiento basadas en interacciones específicas de ligando tal como se ha indicado anteriormente en la presente memoria.

El control de los pacientes de cáncer de próstata es fuertemente dependiente del perfilado de riesgos. La National Comprehensive Cancer Network (NCCN) ha definido cinco categorías de riesgo (riesgo muy bajo, RMB; riesgo bajo, RB; riesgo intermedio favorable, RIF; riesgo intermedio desfavorable, RID; y riesgo alto, RA), basándose en parámetros pretratamiento, que se ilustran en las TABLAS 1 y 2.

TABLA 1: estratificación de riesgos clínicos para pacientes de cáncer de próstata tal como se indica de manera general en las directrices de la NCCN estadounidense.

TABLA 1 (continuación)

TABLA 2: parámetros para la asignación de riesgos

Para cada grupo de riesgo, desde muy bajo, bajo, intermedio, alto y muy alto riesgo, se presentan en las directrices varias opciones de intervención. Aunque dicha evaluación de riesgo del paciente resulta fácil de realizar y se basa en datos clínicos generalmente disponibles, su simplicidad también contribuye a su desventaja principal, que radical en la categorización de los pacientes en grupos no solapantes, en lugar de un riesgo individual por paciente con independencia de la clasificación en grupos de riesgo clínico. En consecuencia, un tratamiento recomendado podría resultar ideal para un paciente, aunque podría no resultar adecuado para otro paciente en el mismo grupo de riesgo clínico. De esta manera, un aspecto de la presente invención es la utilización de marcadores moleculares tales como PDE4D7 para añadir información ortogonal e independiente a la descripción del riesgo clínico para una selección más estratificada de la terapia.

En referencia a la figura 1, se ilustra un método de estratificación del riesgo para la selección de terapia en un paciente con cáncer de próstata. El método se inicia en S100.

En S102, se obtiene una muestra biológica de cada uno de un primer grupo de pacientes (individuos) diagnosticados con cáncer de próstata en los que se ha monitorizado el cáncer de próstata durante un periodo de tiempo, tal como por lo menos un año, o por lo menos dos años, o aproximadamente cinco años, tras la obtención de la muestra biológica.

En S104, se obtiene un perfil de la expresión génica para por lo menos un gen marcador (p.ej., PDE4D7) para cada una de las muestras biológicas obtenidas del primer grupo de pacientes, p.ej., mediante realización de RT-qPCR (PCR cuantitativa en tiempo real) en ARN extraído de cada muestra biológica. El perfil de expresión ejemplar incluye un nivel de expresión (p.ej., un valor) para PDE4D7 que puede normalizarse utilizando uno o más valores para cada uno de un grupo de genes de referencia, tales como HPRT1, TUBA1B, PUM1 y/o TBP. En una realización, el único gen marcador utilizado es PDE4D7 y los únicos genes de referencia utilizados se seleccionan del grupo que consiste en HPRT1, TUBA1B, PUM1 y TBP, p.ej., por lo menos uno o por lo menos dos o por lo menos tres o la totalidad de dichos genes de referencia.

En S106, se determina una función de puntuación para asignar una puntuación de riesgo pronóstico, basada en el perfil de expresión génica para el gen marcador (PDE4D7) obtenido para por lo menos algunas de las muestras biológicas obtenidas para el primer grupo de pacientes y los resultados correspondientes obtenidos de la monitorización.

En S108, se obtiene una muestra biológica de un paciente (individuo). El paciente puede ser un paciente nuevo o uno del primer grupo.

En S110, se obtiene un perfil de expresión génica para por lo menos un gen marcador (p.ej., PDE4D7), p.ej. mediante realización de PCR en la muestra biológica. El perfil de expresión génica incluye un nivel de expresión génica para la fosfodiesterasa 4D variante 7 (PDE4D7) y para uno o más genes de referencia. Entre los genes de referencia adecuados se incluyen HPRT1, TUBA1B, PUM1 y TBP. En una realización, el único gen marcador utilizado es PDE4D7 y los únicos genes de referencia utilizados se seleccionan del grupo que consiste en HPRT1, TUBA1B, PUM1 y TBP, p.ej., por lo menos uno o por lo menos dos o por lo menos tres o la totalidad de dichos genes de referencia. El gen marcador y genes de referencia son los mismos utilizados en S104.

Entre otros genes de referencia que pueden utilizarse adicional o alternativamente en las etapas S104 y S110 se incluyen actina de Homo sapiens, ARNm (ACTB), ARNm de fosfoproteína ribosómica ácida 60S P0 de Homo sapiens (RPLP0), polipéptido A de polimerasa (a Rn ) II (dirigido a ADN), 220 kDa (POLR2A), microglobulina beta-2 (b 2m ) y aminolevulinato-delta-sintasa (ALAS-1).

En S112, se determina una puntuación de riesgo pronóstico para el paciente, basada en el perfil de expresión génica, utilizando la función de puntuación derivada.

En S114, el paciente puede categorizarse en un juego predefinido de grupos de riesgo, basado en la puntuación de riesgo pronóstico.

En S116, puede proporcionarse una recomendación de terapia, p.ej., al paciente o a su tutor, al médico, a o otro profesional sanitario, basándose en el grupo de riesgo del paciente. Lo anterior puede incluir uno o más de a) una propuesta de una terapia para el paciente, basada en el grupo de riesgo asignado, en el que por lo menos dos de los grupos de riesgo están asociados a diferentes terapias, b) cálculo de una predicción de riesgo de progresión de enfermedad del paciente antes o después de la cirugía de próstata, y c) cálculo de una predicción de respuesta a terapia del sujeto antes o después de la cirugía de próstata. Entre las terapias de ejemplo se incluyen por lo menos una prostatectomía parcial, una terapia activa seleccionada de entre tratamiento de radiación, quimioterapia y una combinación de los mismos, y observación por sí sola, es decir, sin realizar prostatectomía o terapia activa (es decir, vigilancia activa).

El método finaliza en S118.

La función de puntuación ejemplar permite categorizar nuevos pacientes en un el respecto de un conjunto de grupos de riesgo al que ha sido asignado el primer grupo de pacientes, basándose en los resultados de su monitorización. Cada uno de los grupos de riesgo puede estar asociado a una terapia propuesta respectiva, que difiere en su agresividad. Cada terapia propuesta puede basarse en los resultados de los pacientes del primer conjunto que han sido asignados a ese grupo de riesgo y es uno que se predice que proporciona la terapia menos agresiva, que no excede un umbral de riesgo clínico de desarrollo de cáncer de próstata. En algunos casos, lo anterior permite asignar un nuevo paciente a un grupo de riesgo asociado a una terapia propuesta menos agresiva de la que sería el caso con otros métodos de perfilado de riesgo, tales como el que utiliza la puntuación de Gleason.

En una realización, el nivel de expresión génica en S104 y S110 se determina mediante detección de la expresión de ARNm utilizando uno o más cebadores y/o sondas, y/o uno o más juegos de los mismos.

En una variante del método, se determina adicionalmente una puntuación combinada de riesgo pronóstico para el paciente, en S112, basándose en la puntuación de riesgo pronóstico y una segunda determinación del riesgo.

En S114, el paciente puede categorizarse en un juego predefinido de grupos de riesgo, basándose en la puntuación combinada de riesgo pronóstico (en lugar de basándose en la puntuación de riesgo pronóstico).

La segunda determinación de riesgo es una determinación diferente de la puntuación de riesgo de PDE4D7 (puntuación de riesgo pronóstico), p.ej., puede basarse en una puntuación de Gleason. Preferentemente, la segunda determinación de riesgo es una clasificación de la National Comprehensive Cancer Network (NCCN), tal como uno o más de entre riesgo muy bajo (RMB), riesgo bajo (RB), riesgo intermedio favorable (RIF), riesgo intermedio desfavorable (RID) y riesgo alto (RA). La puntuación combinada de riesgo pronóstico puede determinarse con una función de regresión derivada de sujetos que han sido monitorizados para cáncer de próstata. Un aspecto adicional se refiere a un método implementado por ordenador para el diagnóstico, monitorización o pronóstico del cáncer de próstata o la estratificación del riesgo de progresión del cáncer de próstata, que comprende las etapas del método tal como se indican en la FIGURA 1.

En el contexto de la presente solicitud, la expresión "método implementado por ordenador para el diagnóstico, monitorización o pronóstico del cáncer de próstata o la estratificación del riesgo de progresión del cáncer de próstata", se refiere a un método en el que algoritmos de software calculan una puntuación de riesgo y basándose en ella proporcionan un pronóstico para el paciente que se analiza, en el que dicho método utiliza datos en bruto obtenidos con la medición del nivel de expresión génica de los genes a los que se hace referencia en la presente memoria y la conversión de los mismos en una puntuación de riesgo mediante la utilización de la ecuación indicada posteriormente.

Puede implementarse una o más etapas del método ilustrado en la FIGURA 1 en un producto de software informático que puede ejecutarse en un ordenador. El producto de software informático puede comprender un medio de grabación no transitorio legible por ordenador en el que se graba (almacena) un programa de control, tal como un disco, disco duro o similar. Entre las formas comunes de medios no transitorios legibles por ordenador se incluyen, por ejemplo, disquetes, discos flexibles, discos duros, cinta magnética o cualquier otro medio de almacenamiento magnético, CD-ROM, DVD o cualquier otro medio óptimo, un RAM, un PROM, un EPROM, un FLASH-EPROM u otro chip o cartucho de memoria, o cualquier otro medio no transitorio del que pueda leer o que pueda utilizar un ordenador.

Alternativamente, el método puede implementarse en medios transitorios, tales como una onda portadora transmisible en la que se encuentra materializado el programa de control en forma de una señal de datos mediante la utilización de medios de transmisión, tales como ondas acústicas o lumínicas, tales como las generadas durante las comunicaciones de datos mediante ondas de radio e infrarrojos, y similares.

El método ejemplar puede implementarse en uno o más ordenadores de uso más general, uno o más ordenadores de uso especial, un microprocesador o microcontrolador programado y elementos periféricos de circuito integrado, un ASIC u otro circuito integrado, un procesador de señales digitales, un circuito electrónico o lógico cableado, tal como un circuito de elemento discreto, un dispositivo lógico programable, tal como un PLD, PLA, FPGA, tarjeta gráfica, CPU (GPU) o PAL, o similar. En general, se ilustra cualquier dispositivo capaz de implementar una máquina de estado finito que, a su vez, sea capaz de implementar el gráfico de flujo mostrado en la FIGURA 1, puede utilizarse para implementar una o más etapas del método de estratificación de riesgos para la selección de terapia en un paciente con cáncer de próstata. Tal como se apreciará, aunque las etapas del método pueden implementarse todas en un ordenador, en algunas realizaciones una o más de las etapas puede llevarse a cabo por lo menos parcialmente de modo manual.

Las instrucciones de programa informático también pueden cargarse en un ordenador, otro aparato de procesamiento de datos programable, u otros dispositivos, para causar la realización de una serie de etapas operativas en el ordenador, otro aparato programable u otros dispositivos, para producir un proceso implementado por ordenador, de manera que las instrucciones que se ejecutarán en el ordenador u otro aparato programable proporcionarán procesos para implementar las funciones/actos especificados en la presente memoria.

La expresión "determinar el nivel de gen o genes marcadores o los GDI" o "determinar el nivel de expresión génica" o "determinar el nivel de expresión de las variantes de PDE4D" se refiere a la determinación de la presencia o cantidad de uno o más genes marcadores o GOI, o productos de expresión de variantes de PDE4D. La expresión "nivel de uno o más genes marcadores o GDI" significa de esta manera la presencia o cantidad de uno o más genes marcadores o productos de expresión, p.ej., uno o más transcritos, y/o la determinación de la presencia o cantidad de uno o más genes marcadores o GDI. La determinación de la presencia o cantidad de uno o más genes marcadores o productos de expresión de GDI puede llevarse a cabo mediante cualesquiera medios conocidos de la técnica.

La determinación de la presencia o cantidad de uno o más genes marcadores o productos de expresión de GDI puede llevarse a cabo mediante la medición de ácidos nucleicos. De esta manera, el nivel o niveles de expresión pueden determinarse mediante un método que implica la detección de un ARNm codificado por el gen.

Por ejemplo, la medición del nivel de ácidos nucleicos de uno o más genes marcadores o la expresión de GDI puede evaluarse mediante purificación de las moléculas de ácidos nucleicos (p.ej., ARN o ADNc) obtenidas de la muestra, seguido de la hibridación con sondas oligonucleótidas específicas tal como se ha definido anteriormente en la presente memoria. La comparación de los niveles de expresión puede llevarse a cabo visualmente o mediante un dispositivo apropiado. Los métodos para la detección de ARNm o productos de expresión son conocidos por el experto en la materia.

Alternativamente, el nivel de ácidos nucleicos de uno o más genes marcadores o de expresión de GDI puede detectarse en un enfoque de matrices o micromatrices de ADN. Típicamente, los ácidos nucleicos de la muestra derivada de los pacientes que deben someterse a ensayo se procesan y se marcan, p.ej. con un marcaje fluorescente. Seguidamente, dichas moléculas de ácidos nucleicos pueden utilizarse en un enfoque de hibridación con sondas de captura inmovilizadas correspondientes a los genes marcadores ejemplares. Los métodos adecuados para llevar a cabo análisis de micromatrices son conocidos por el experto en la materia.

En una configuración estándar, una matriz o micromatriz de ADN comprende sondas de alta densidad inmovilizadas para la detección de varios genes. Las sondas en la matriz son complementarias a una o más partes de la secuencia de los genes marcadores. Típicamente, los ADNc, productos de PCR y oligonucleótidos resultan útiles como sondas.

Un método de detección basado en matrices o micromatrices de ADN típicamente comprende las etapas siguientes: (1) aislar ARNm a partir de una muestra y opcionalmente convertir el ARNm en ADNc, y posteriormente marcar dicho ARN o ADNc. Los métodos para aislar ARN, convertirlo en ADNc y para marcar los ácidos nucleicos se describen en manuales de tecnología de micromatrices. (2) Hibridar los ácidos nucleicos de la etapa 1 con sondas para los genes marcadores. Los ácidos nucleicos de una muestra pueden marcarse con un pigmento, tal como el pigmento fluorescente Cy3 (rojo) o Cy5 (azul). Generalmente, se marca una muestra de control con un pigmento diferente. (3) Detectar la hibridación de los ácidos nucleicos de la muestra con las sondas y determinar por lo menos cualitativamente, y más particularmente de manera cuantitativa, las cantidades de ARNm en la muestra para los genes marcadores investigados. La diferencia en el nivel de expresión entre muestra y control puede estimarse basándose en una diferencia en la intensidad de la señal. Dichas diferentes pueden medirse y analizarse mediante software apropiado, tal como, aunque sin limitación, software proporcionado por, por ejemplo, Affymetrix.

No existe limitación respecto al número de sondas correspondientes a los genes marcadores utilizados, que se aplican por puntos sobre una matriz de ADN. Además, un gen marcador puede estar representado por dos o más sondas, en el que las sondas se hibridan con partes diferentes de un gen. Las sondas están diseñadas para cada gen marcador seleccionado. Dicha sonda es típicamente un oligonucleótido que comprende 5 a 50 residuos nucleótidos. Pueden sintetizarse moléculas de ADN más largas mediante PCR o químicamente. Los métodos para sintetizar dichos oligonucleótidos y aplicarlos sobre un sustrato son bien conocidos en el campo de las micromatrices. También pueden aplicarse por puntos sobre la matriz de ADN genes diferentes de los genes marcadores. Por ejemplo, una sonda para un gen cuyo nivel de expresión no resulta significativamente alterado puede aplicarse por puntos sobre la matriz de ADN para normalizar los resultados de ensayo o para comparar los resultados de ensayo de múltiples matrices o diferentes ensayos.

En una realización, el nivel de ácido nucleico de uno o más genes marcadores o la expresión de GDI puede detectarse en un enfoque de RT-PCR cuantitativo, p.ej., en un enfoque de reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-qPCR) después de la transcripción inversa de transcritos de interés. Típicamente, como primera etapa, se transcribe inversamente un transcrito en una molécula de ADNc según cualquier método adecuado conocido por el experto en la materia. Seguidamente puede llevarse a cabo un enfoque de PCR cuantitativa o en tiempo real basándose en una primera cadena de ADN obtenida tal como se ha indicado anteriormente.

En una realización, pueden utilizarse sondas Taqman o de baliza molecular como sondas a base de FRET principales de este tipo para la detección de PCR cuantitativa. En ambos casos, las sondas sirven de sondas internas que se utilizan junto con un par de cebadores contrarios que flanquean la zona de interés diana, tal como un juego de uno o más oligonucleótidos genes marcadores específicos tal como se han definido anteriormente en la presente memoria. Tras la amplificación de un segmento diana, la sonda puede unirse selectivamente a los productos en una secuencia identificadora entre los sitios de cebador, causando de esta manera incrementos de la señalización de FRET respecto a los incrementos de frecuencia de la diana.

La sonda Taqman para la utilización en un enfoque de PCR cuantitativa puede incluir un oligonucleótido específico tal como se ha definido anteriormente de entre aproximadamente 22 y 30 bases que se marca en ambos extremos con una pareja de FRET. Típicamente, el extremo 5' presentará un fluoróforo de longitud de onda más corta, tal como fluoresceína (p.ej., FAM) y el extremo 3' comúnmente se marca con un inhibidor fluorescente de longitud de onda más larga (p.ej., t Am RA) o un compuesto inhibidor no fluorescente (p.ej., un inhibidor Black Hole). En una realización, las sondas que deben utilizarse para la PCR cuantitativa, en particular sondas tal como se han definido anteriormente en la presente memoria, no presentan guanina (G) en el extremo 5' contiguas al pigmento informador a fin de evitar la inhibición de la fluorescencia del informador después de la degradación de la sonda.

Una sonda baliza molecular para la utilización para un enfoque de PCR cuantitativa puede utilizar interacciones FRET para detectar y cuantificar un producto de PCR, en el que cada sonda presenta un extremo 5' marcado fluorescentemente y un extremo 3' marcado con un inhibidor. Dicha horquilla o configuración de tallo-bucle de la estructura de la sonda puede incluir un tallo con dos extremos cortos autoligantes y un bucle con una zona específica de la diana interna larga de aproximadamente 20 a 30 bases.

Algunos mecanismos alternativos de detección que también pueden utilizarse en el contexto de la presente invención se refieren a una sonda fabricada con únicamente una estructura de bucle y con una región de tallo complementaria corta. También puede utilizarse un enfoque basado en FRET alternativo para la PCR cuantitativa basándose en la utilización de dos sondas de hibridación que se unen a sitios contiguos en la diana, en la que la primera sonda presenta un marcaje donante fluorescente en el extremo 3' y la segunda sonda presenta un marcaje aceptor fluorescente en su extremo 5'.

En una realización específica, se determina el nivel de expresión génica mediante un método basado en la amplificación y/o análisis de micromatrices y/o secuenciación del ARN.

El perfil de expresión génica ejemplar es un perfil de expresión génica normalizada que se obtiene mediante normalización del nivel de expresión de por lo menos la variante de PDE4D7 respecto a la expresión de por lo menos un gen de referencia.

Se muestra en la TABLA 3 una descripción detallada de los genes de referencia, incluyendo su ID de transcrito (NCBI RefSeq) y las secuencias de aminoácidos correspondientes para la pareja de cebadores y la sonda. La TABLA 3 también muestra, para cada gen de referencia, un cebador de sentido y un cebador antisentido, y una secuencia de sonda que se une específicamente al amplicón.

TABLA 3: secuencias de ácido nucleico de cebador y sonda ejemplares

TABLA 3 (continuación)

En realizaciones específicas, la puntuación de riesgo pronóstico se basa en el perfil de expresión génica normalizado que incluye el nivel de expresión normalizada para por lo menos PDE4D7. En algunas realizaciones, ninguna de las variantes de PDE4D se utiliza como gen de referencia. En otras palabras, la variante o variantes de PDE4D no se utiliza como gen de referencia para normalizar el nivel de expresión medido. Los resultados de expresión pueden normalizarse según cualquier método conocido por el experto en la materia. Típicamente, dichos ensayos o fórmulas correspondientes, que serían conocidas por el experto en la materia, se utilizarían para estandarizar los datos de expresión a fin de permitir la diferenciación entre variaciones reales de los niveles de expresión génica y variaciones debidas a los procedimientos de medición. Para las micromatrices, puede utilizarse la media multimatriz robusta (RMA, por sus siglas en inglés) como enfoque de normalización.

Los valores normalizados pueden generarse mediante aplicación de lo siguiente:

N(Cq^{gen de interés}) — Media(Cq^{gen de ref.)}— (Cq^{gen de interés}), (1)

en la que N(Cq^{gen de interés} ) es el valor normalizado de expresión génica (ciclo de cuantificación, Cq) para el gen de interés seleccionado,

media(Cq^{gen de ref.} ) es la media aritmética de los valores de Cq de la PCR del gen o genes de referencia, y Cq^{gen de interés} es el valor de Cq de la PCR del gen de interés.

En realizaciones particulares, el nivel de expresión de las variantes de PDE y de los genes de referencia se determinaron mediante PCR en tiempo real, tal como describen R. H. D. Bottcher, "Human phosphodiesterase 4D7 (PDE4D7) expression is increased in TMPRSS2-ERG positive primary prostate cancer and independently adds to a reduced risk of post-surgical disease progression", Br. J. Cancer, 113, 1502-1511, 2015, incorporado en la presente memoria (en lo sucesivo en la presente memoria, "Bottcher 2015").

En referencia a la FIG. 2, en realizaciones particulares, una vez se han determinado y normalizado los niveles de expresión de PDE4D7, puede determinarse una puntuación de riesgo pronóstico mediante la aplicación de lo siguiente:

Puntuación de riesgo de PDE4D7 — (((PDE4D7_norm A)*B)+1), (2)

en la que "puntuación de riesgo de PDE4D7" es la puntuación de riesgo pronóstico basada en el perfil de expresión génica de una muestra de un paciente, PDE4D7_norm es el valor de expresión normalizado de PDE4D7 (es decir, N(Cggen de interés)), y A y B son variables.

En realizaciones particulares, A puede ser aproximadamente 6 a 8, tal como 6,7167499999999, B puede ser 0,4 a 0,45, tal como 0,420780231744713. La puntuación de riesgo de PDE4D7, de esta manera, puede ser un valor de entre 1,0 y 5,0. La puntuación de riesgo de PDE4D7 a continuación puede clasificarse o categorizarse en uno de entre por lo menos dos grupos de riesgo, basándose en la puntuación de riesgo de PDE4D7. Por ejemplo, puede haber dos grupos de riesgo, o tres grupos de riesgo, o cuatro grupos de riesgo, o más de cuatro grupos de riesgo predefinidos. Cada grupo de riesgo cubre un intervalo respectivo de puntuaciones de riesgo de PDE4D7 (no solapantes). Por ejemplo, un grupo de riesgo puede incluir todas las puntuaciones de riesgo de PDE4D7 entre 1,0 y 2,0, otro grupo de riesgo entre 2,0 y 3,0, otro grupo de riesgo entre 3,0 y 4,0 y otro grupo de riesgo entre 4,0 y 5,0.

En algunas realizaciones, la terapia propuesta puede basarse en la puntuación de riesgo pronóstico y en una segunda determinación de riesgo. Por ejemplo, la segunda determinación de riesgo puede ser una puntuación de Gleason determinada por la histopatología. Ver, por ejemplo, Sperling, "Revisions of the Gleason grading system make it more accurate", Sperling Prostate Center, 2016. La segunda determinación de riesgo también puede ser un estadio de progresión definido clínicamente (valor cT), un estadio patológicamente definido (valor pT), una puntuación o agrupamiento de biopsia de Gleason, una puntuación o agrupamiento de Gleason de patología, una medición de antígeno específico de la próstata, una medición de densidad antigénica específica de la próstata o una combinación de las mismas.

La segunda determinación de riesgo puede ser una combinación de diferentes determinaciones de riesgo diferentes de la puntuación de riesgo de PDE4D7. Por ejemplo, la segunda determinación de riesgo puede ser una clasificación de NCCN, tal como una de entre riesgo muy bajo (RMB), riesgo bajo (RB), riesgo intermedio favorable (RIF), riesgo intermedio desfavorable (RID) y riesgo alto (RA).

En realizaciones particulares, la terapia propuesta basada en el grupo de riesgo de PDE4D7 asignado es diferente de una terapia propuesta potencial, basada únicamente en la segunda determinación de riesgo. Es decir, la terapia propuesta basada en el grupo de riesgo de PDE4D7 asignado es diferente de la terapia propuesta basada en la segunda determinación de riesgo sin el grupo de riesgo de PDE4D7.

En realizaciones adicionales, la determinación del grupo de riesgo de PDE4D7 estratifica los resultados y las terapias recomendadas basándose en la segunda determinación de riesgo. En otras palabras, la puntuación de riesgo de PDE4D7 puede identificar un paciente como que no requiere una intervención activa (es decir, un tratamiento activo) y puede someterse por el contrario a vigilancia activa, mientras que la segunda determinación de riesgo por sí sola indicaría que resulta necesaria la intervención activa. Alternativamente, la puntuación de riesgo de PDE4D7 puede identificar que el paciente requiere una intervención activa, en lugar de vigilancia activa, mientras que la segunda determinación de riesgo por sí sola indicaría que la intervención activa todavía no resultaba necesaria.

Un aspecto adicional se refiere a un producto que incluye cebadores y/o sondas para la determinación del nivel de expresión de por lo menos una variante de fosfodiesterasa 4D (PDE4D) seleccionada del grupo que consiste en PDE4D7, PDE4D1, PDE4D2, PDE4D3, PDE4D4, PDE4D5, PDE4D6, PDE4D8 y PDE4D9 y que comprende además cebadores y/o sondas para la determinación del nivel de expresión génica de un gen de referencia seleccionado de entre HPRT1, TUBA1B, PUM1, TBP y combinaciones de los mismos. En algunas referencias, se proporciona una composición que comprende un juego de moléculas de ácidos nucleicos cada una de las cuales comprende por lo menos un cebador oligonucleótido y/o una secuencia de sonda para el análisis de la expresión génica de la variante o variantes de PDE4D y por lo menos un cebador oligonucleótido y/o una secuencia de sonda para el análisis de la expresión génica de genes de referencia. En algunas realizaciones, se proporciona una matriz de ácidos nucleicos que comprende una o más sondas oligonucleótidas complementarias e hibridables con una secuencia codificante de la variante o variantes de PDE4D y una o más sondas oligonucleótidas complementarias e hibridables con el gen o genes de referencia para la determinación de una puntuación de riesgo pronóstico tal como se define en la presente memoria.

Una "micromatriz" es una matriz lineal o bidimensional de zonas discretas, cada una de las cuales presenta una superficie definida, formada sobre la superficie de un soporte generalmente sólido, tal como, aunque sin limitación, vidrio, plástico o membrana sintética. La densidad de las zonas discretas en una micromatriz se determina como el número total de oligonucleótidos inmovilizados que debe detectarse sobre la superficie de un único soporte de fase sólida, tal como por lo menos aproximadamente 50/cm2, por lo menos aproximadamente 100/cm2, por lo menos aproximadamente 500/cm2, aunque inferior a aproximadamente 1,000/cm2 en algunas realizaciones. Las matrices pueden contener menos de aproximadamente 500, aproximadamente 1000, aproximadamente 1500, aproximadamente 2000, aproximadamente 2500 o aproximadamente 3000 oligonucleótidos inmovilizados en total. Tal como se utiliza en la presente memoria, una micromatriz de ADN es una matriz de oligonucleótidos u oligonucleótidos aplicados sobre un chip u otras superficies utilizadas para hibridarse con oligonucleótidos amplificados o clonados procedentes de una muestra. Debido a que la posición de cada grupo particular de oligonucleótidos en la matriz es conocida, pueden determinarse las identidades de los oligonucleótidos de una muestra basándose en su unión a una posición particular en la micromatriz.

Un "oligonucleótido" es una forma polimérica de nucleótidos, sean ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos. Dicho término se refiere únicamente a la estructura primaria de la molécula. De esta manera, dicho término incluye ADN y ARN de doble cadena y de cadena sencilla. Además, incluye tipos conocidos de modificaciones, incluyendo marcajes conocidos de la técnica, metilación, "caperuzas", la sustitución de uno o más nucleótidos naturales por un análogo, y modificaciones internucleótido, tales como enlaces no cargados (p.ej., fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.), así como formas no modificadas del oligonucleótido.

El término "amplificar" se utiliza en el sentido amplio para referirse a la creación de un producto de amplificación que puede producirse enzimáticamente con ADN o ARN polimerasas. El término "amplificación", tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere generalmente al procedimiento de producción de múltiples copias de una secuencia deseada, particularmente las de una muestra. La expresión "múltiples copias" se refiere a por lo menos 2 copias. Una "copia" no se refiere necesariamente a una complementariedad o identidad de secuencias perfecta con la secuencia molde. Resulta posible utilizar además cualquier método de secuenciación conocido de la técnica para identificar las secuencias de GDI.

El término "correspondiente" puede referirse, en caso apropiado, a una molécula de ácido nucleico que comparte una cantidad sustancial de identidad de secuencia con otra molécula de ácido nucleico. Cantidad sustancial significa por lo menos 95%, habitualmente por lo menos 98%, y más habitualmente por lo menos 99%, y la identidad de secuencia se determina mediante la utilización del algoritmo BLAST, tal como se indica en Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990 (utilizando la configuración por defecto publicada, es decir, los parámetros w=4, t=17). Los métodos para amplificar el ARNm son generalmente conocidos de la técnica e incluyen la PCR de transcripción inversa (RT-PCR) y los indicados en la patente US n° 6.794.141, así como en el documento n° PCT(US01/50340. Otro método que puede utilizarse es la PCR cuantitativa (o Q-PCR). Alternativamente, el ARN puede marcarse directamente como el ADNc correspondiente mediante métodos conocidos de la técnica.

Basándose en la identificación de genes (o secuencias expresadas) que están sobreexpresadas o infraexpresadas, una realización implica determinar la expresión mediante hibridación del ARNm o una versión amplificada o clonada del mismo (tal como ADN o ADNc) de una célula de la muestra con un oligonucleótido que es único de una secuencia génica particular. Los oligonucleótidos de dicho tipo pueden contener por lo menos aproximadamente 20, por lo menos aproximadamente 22, por lo menos aproximadamente 24, por lo menos aproximadamente 26, por lo menos aproximadamente 28, por lo menos aproximadamente 30, o por lo menos aproximadamente 32 pares de bases consecutivos de una secuencia génica que no se encuentra en otras secuencias génicas. El término "aproximadamente" tal como se ha utilizado en la oración anterior se refiere a un incremento o reducción de 1 respecto al valor numérico indicado. Otras realizaciones pueden utilizar oligonucleótidos de por lo menos o de aproximadamente 50, de por lo menos o de aproximadamente 100, de por lo menos aproximadamente o de 150, de por lo menos o de aproximadamente 200, de por lo menos o de aproximadamente 250, de por lo menos o de aproximadamente 300, de por lo menos o de aproximadamente 350, o de por lo menos o de aproximadamente 400 pares de bases de una secuencia génica que no se encuentra en otras secuencias génicas. El término "aproximadamente" tal como se ha utilizado en la oración anterior se refiere a un incremento o reducción de 10% respecto al valor numérico indicado. Dichos oligonucleótidos también pueden denominarse sondas oligonucleótidas que son capaces de hibridarse con secuencias de los genes, o partes únicas de las mismas, indicadas en la presente memoria. En muchos casos, las condiciones de hibridación son condiciones restrictivas de formamida a aproximadamente 30% p/v a aproximadamente 50% y sal de aproximadamente 0,01 M a aproximadamente 0,15 M para la hibridación y sal de aproximadamente 0,01 M a aproximadamente 0,15 M para condiciones de lavado a una temperatura de entre aproximadamente 55°C y aproximadamente 65°C o superior, o condiciones equivalentes a las mismas.

En otras realizaciones, las sondas oligonucleótidas útiles en la presente memoria pueden presentar una identidad de aproximadamente 95%, de aproximadamente 96%, de aproximadamente 97%, de aproximadamente 98% o de aproximadamente 99% respecto a las secuencias de gen marcador la expresión del cual se determinará. La identidad se determina mediante la utilización del algoritmo BLAST, tal como se ha indicado anteriormente. Dichas sondas también pueden describirse basándose en la capacidad de hibridarse de los genes marcadores expresados que se utilizan en el método ejemplar bajo condiciones restrictivas tal como se ha indicado anteriormente o condiciones equivalentes a las mismas.

En muchos casos, las secuencias son de ARNm codificado por los genes marcadores, el ADNc correspondiente a dichos ARNm y/o versiones amplificadas de dichas secuencias. En algunas realizaciones, las sondas oligonucleótidas se inmovilizan sobre una matriz, otros dispositivos o en puntos individuales que localizan las sondas.

Entre los marcajes adecuados que pueden utilizarse según la invención se incluyen isótopos radioactivos, nucleótidos cromóforos, enzimas, sustratos, moléculas fluorescentes, fracciones quimioluminiscentes, partículas magnéticas, fracciones bioluminiscentes y similares. De esta manera, un marcaje es cualquier composición detectable mediante medios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, inmunoquímicos, eléctricos, ópticos o químicos. El término "soporte" se refiere a soportes convencionales, tales como perlas, partículas, varillas de inmersión, fibras, filtros, membranas y soportes de silano o silicato, tales como portaobjetos de vidrio.

En algunas realizaciones, el producto se proporciona como kit utilizado para determinar una puntuación de riesgo para un sujeto con cáncer de próstata localizado, que incluye: a) por lo menos un cebador y/o sonda para determinar el nivel de expresión de por lo menos una variante de fosfodiesterasa 4D (PDE4D), en la que por lo menos una variante de PDE4D comprende PDE4D7, b) por lo menos un cebador y/o sonda para determinar el nivel de expresión génica de por lo menos un gen de referencia, y c) instrucciones para calcular una puntuación de riesgo basándose en las expresiones determinadas, p.ej., sobre papel o un disco.

El kit diagnóstico puede contener uno o más agentes que permiten la detección específica de uno o más genes marcadores o GDI tal como se ha definido anteriormente en la presente memoria. Los agentes o ingredientes de un kit diagnóstico pueden estar contenidos en uno o más recipientes o entidades separadas. La naturaleza de los agentes se determina mediante el método de detección para el que está destinado el kit.

Además, el kit puede incluir una cantidad de una molécula de ácido nucleico conocida, que puede utilizarse para la calibración del kit o a modo de control interno. Típicamente, un kit diagnóstico para la detección de uno o más genes marcadores o productos de expresión de GDI puede comprender ingredientes accesorios, tales como tampones de PCR, dNTP, una polimerasa, iones, tales como cationes bivalentes o cationes monovalentes, soluciones de hibridación, etc. Dichos ingredientes son conocidos por el experto en la materia y pueden variar dependiendo del método de detección llevado a cabo. Adicionalmente, el kit puede comprender un impreso con instrucciones y/o puede proporcionar información sobre la relevancia de los resultados obtenidos.

Un aspecto adicional se refiere a un sistema que comprende los productos y/o kits anteriormente indicados y los productos de software informático anteriormente indicado. En realizaciones particulares, los sistemas, los productos y/o kits indicados anteriormente y los productos de programa informático anteriormente indicados pueden utilizarse en el tratamiento del cáncer de próstata.

Sin pretender limitar el alcance de la realización ejemplar, los ejemplos siguientes ilustran aspectos del método.

Ejemplos

Selección de genes y muestras de cohortes utilizadas para construir la puntuación de riesgo de PDE4D7 de cáncer de próstata

Con el fin de seleccionar genes candidatos para construir la puntuación de riesgo de PDE4D7, se examinó la expresión de PDE4D7 dentro de una cohorte con más de 500 pacientes y se comparó con los resultados longitudinales de pacientes clínica y biológicamente relevantes después del tratamiento primario. Se recogió una pequeña punción de biopsia (de aproximadamente 1 milímetro por 2 milímetros) de tejido de una zona tumoral representativa de la próstata resecada de 500 pacientes que habían sido operados consecutivamente entre los años 2000 y 2004. Dicha cohorte de pacientes representa una mezcla de todos los grupos de riesgo clínico según la definición de, por ejemplo, las directrices de cáncer de próstata de la NCCN americana. Tras la extracción de las muestras que no cumplían los criterios de calidad predefinidos para la cuantificación de biomarcadores mediante qPCR y la eliminación de los pacientes sometidos a terapia hormonal adyuvante posterior a cirugía, un total de 503 muestras de paciente eran elegibles para el análisis, tal como se observa en la TABLA 4.

TABLA 4: datos demográficos de la cohorte de pacientes de estudio

TABLA 4 (continuación)

Para la edad del paciente, ASP preoperatorio, porcentaje de tumor en biopsia, volumen de próstata y densidad de ASP, se muestran los valores mínimo y máximo en la cohorte, mientras que los valores de mediana e IQR se ilustran entre paréntesis. Para las categorías de riesgo de NCCN, se muestra el número de pacientes por grupo de riesgo. En el caso de la patología prequirúrgica, se indican los grupos de grado Gleason de las biopsias, así como los estadios clínicos (mediante el porcentaje en número de pacientes). La patología postquirúrgica se representa mediante los grupos de grado Gleason de patología, los estadios de patología, el estado del margen quirúrgico tras prostatectomía, el estado de invasión tumoral de las vesículas seminales y de los ganglios linfáticos pélvicos (mediante porcentaje en número de pacientes).

El seguimiento demuestra la media y mediana de los periodos de seguimiento en meses posteriores a la cirugía para todos los pacientes. La categoría de resultado ilustra la recurrencia bioquímica (RBQ) acumulada a los 5 y 10 años y la recurrencia clínica de metástasis (RC) posterior al tratamiento primario. El tratamiento lista el inicio a los 5 y a los 10 años de la terapia de radiación de rescate (TRR) o la terapia de privación de andrógenos de rescate (TPAR) posterior a cirugía. Se muestra la mortalidad como mortalidad específica de cáncer de próstata (MECP), así como la mortalidad total (MT).

Métodos de laboratorio

Los cebadores y sondas utilizados para la PCR en tiempo real cuantitativa para medir los genes de interés, así como los genes de referencia, se indican en la TABLA 3. Todos los métodos de biología molecular utilizados en la presente memoria fueron descritos anteriormente en Bottcher 2015.

Análisis de los datos y estadísticas

Para permitir la comparación de los datos de qPCR en diferentes experimentos, se normalizó el valor de Cq para PDE4D7 frente a la media de los valores de Cq para los genes de referencia a fin de generar un valor de expresión normalizado de PDE4D7 según la Ecuación (1), en la que los genes de referencia utilizados eran HPRT1, TUBA1B, PUM1 y TBP.

Con el fin de determinar la correlación de PDE4D7 con los resultados clínicos, se convirtió la expresión normalizada de PDE4D7 en la puntuación de riesgo de PDE4D7 mediante transformación lineal (Ecuación 2), tal como se observa en la FIG. 2.

A continuación, se definieron las categorías de riesgo de PDE4D7 mediante la fusión de todas las puntuaciones de riesgo de PDE4D7 entre 1 y 2, entre 2 y 3, entre 3 y 4 y entre 4 y 5.

A continuación, se sometieron a ensayo las categorías de riesgo de PDE4D7 frente a los diversos resultados biológicos y relacionados con el tratamiento disponibles. Para el análisis estadístico, se utilizó el paquete de software MedCalc (MedCalc software BVBA, Ostend, Bélgica).

Resultados

En referencia a la TABLA 5, la expresión diferencial de la puntuación de riesgo de PDE4D7 se evaluó en un subgrupo de la cohorte de pacientes que cubría 446 y 347 pacientes con seguimiento completo a 5 años y a 10 años para la recaída bioquímica posterior a la cirugía, respectivamente. Como referencia, se determinaron dos puntuaciones de riesgo pronóstico adicionales basándose en dos otros transcritos de PDE4D: PDE4D5 y PDE4D9, que también es conocido que se expresan en la próstata.

TABLA 5: resultados de una prueba U de Mann-Whitney para determinar la expresión diferencial de PDE4D5, PDE4D7 y PDE4D9 en una subcohorte de pacientes con resultado completo y seguimiento a los 5 años (446 pacientes) o a los 10 años posterior a la cirugía (347 pacientes).

Tal como se observa en la TABLA 5, la puntuación de riesgo de PDE4D7 se expresaba a un nivel significativamente diferente entre pacientes con o sin una recaída bioquímica a los 5 o a los 10 años; sin embargo, ni PDE4D5 ni PDE4D9 fueron capaces de discriminar entre estos dos subgrupos de la cohorte de pacientes. Lo anterior demuestra la capacidad única de la puntuación de riesgo de PDE4D7 de diferenciar entre resultados clínicos.

En referencia a la TABLA 6 y la FIG. 3, los análisis de regresión de Cox univariante y multivariante demuestran una correlación muy significativa de la puntuación de riesgo de PDE4D7 continua con el tiempo hasta la recaída bioquímica (RBQ) posterior a la cirugía (CR=0,5, IC al 95%=0,4-0,7, p=2,5x10-7). Además, ajustado a parámetros clínicos postquirúrgicos pronósticos, PDE4D7 continuó añadiendo valor independiente significativo al modelo de regresión (CR=0,5, IC al 95%=0,4-0,7, p=9,7x10-6). Al utilizar el grupo de riesgo de PDE4D7 más bajo (es decir, PDE4D7 (1-2)) como referencia, las categorías de riesgo de PDE4D7 con un nivel de expresión más alto de PDE4D7 mostraron una reducción más fuerte del riesgo de recaída bioquímica durante el tiempo en el análisis multivariante en comparación con la categoría de riesgo de referencia de PDE4D7 (PDE4D7 (4-5): c R=0,1; IC al 95%=0,1-0,5; p=1,4x10-4; PDE4D7 (3-4): CR=0,3; IC al 95%=0,1-0,8; p=1,4x10'2).

TABLA 6: análisis de regresión de Cox univariante y multivariante de la puntuación de riesgo de PDE4D7 continua y categorizada en la cohorte total de pacientes (503 pacientes), con el resultado final clínico de recurrencia bioquímica, en el que la puntuación de riesgo de PDE4D7 se ajustó según parámetros clínicos postquirúrgicos en el análisis multivariante.

TABLA 6 (continuación)

Lo anterior fue confirmado por el análisis de Kaplan-Meier realizado en las categorías de riesgo de PDE4D7 con el tiempo hasta la recurrencia de ASP como resultado final clínico, tal como se observa en la FIG. 4. La categoría de riesgo más alto de PDE4D7 incluía hombres con una probabilidad inferior a 5% de un RBQ a 5 años, mientras que la probabilidad de experimentar una recurrencia de ASP se incrementó a más de 50% en el grupo de pacientes con los niveles más bajos de la puntuación de riesgo de PDE4D7. Especialmente, todos los sucesos de RBQ en la cohorte de pacientes con las puntuaciones de riesgo de PDE4D7 más bajo se produjeron en aproximadamente los 3,5 años posteriores a la cirugía, mientras que no se produjo ningún suceso adicional después de dicho periodo de tiempo. En referencia a la TABLA 7 y la FIG. 5, se determinó el valor independiente de la puntuación de riesgo de PDE4D7 en el análisis multivariante una vez ajustado a parámetros clínicos prequirúrgicos pronósticos conocidos. Tal como puede observarse, en la comparación con el análisis multivariante con datos clínicos prequirúrgicos para la puntuación de riesgo de PDE4D7 continuo, se observaron resultados similares.

TABLA 7: análisis de regresión de Cox univariante y multivariante de la puntuación de riesgo de PDE4D7 continua y categorizada en la cohorte total de pacientes (503 pacientes), con el resultado final clínico de recurrencia bioquímica, en el que la puntuación de riesgo de PDE4D7 se ajustó según parámetros clínicos prequirúrgicos en el análisis multivariante.

TABLA 7 (continuación)

En referencia a la TABLA 8 y la FIG. 6, se muestra la correlación de la puntuación de riesgo de PDE4D7 continua en un análisis univariante del tiempo hasta los resultados finales clínicos posteriores a cirugía aparte de la recurrencia bioquímica, en la que los resultados finales incluyen: inicio de radioterapia de rescate (RTR), inicio de la terapia de privación de andrógenos de rescate (TPAR), recurrencia clínica (RC), mortalidad específica de cáncer de próstata (MECP) y mortalidad total (MT). Tal como puede observarse, PDE4D7 estaba correlacionado de manera significativamente negativa con el punto temporal de todos los resultados finales, con cocientes de riesgos de entre 0,2 y 0,5. Además, la probabilidad de experimentar un resultado clínico grave, tal como metástasis (RC) o muerte debido a cáncer de próstata (MECP) se incrementa en particular con niveles decrecientes de PDE4D7. Adicionalmente, la puntuación de riesgo de PDE4D7 aparentemente presenta una correlación significativa con la supervivencia total.

TABLA 8: puntuación de riesgo de PDE4D7 continua en un análisis variante de tiempo hasta resultados clínicos posteriores a la cirugía

De esta manera, tal como puede observarse en las FIGS. 3, 5 y 6, no sólo presenta la expresión de PDE4D7 en el tejido tumoral una correlación negativa significativa con los resultados biológicos, tales como RBQ, sino que dicha correlación negativa se ha mostrado que proporciona un valor independiente en el modelado multivariante al ajustar a un abanico de parámetros clínicos pronósticos prequirúrgicos y postquirúrgicos. Además, los niveles de expresión de PDE4D7 también pueden predecir otros resultados clínicos finales, tales como el inicio del tratamiento de rescate, así como resultados finales relacionados con la progresión de enfermedad y la muerte específica de cáncer.

Estratificación - análisis de las puntuaciones de riesgo de PDE4D7 en grupos de riesgo definidos clínicamente

En referencia a las FIGS. 7 a 10, se ilustra el valor añadido por la puntuación de riesgo de PDE4D7 a los grupos de riesgo definidos clínicamente tal como ejemplifican las definiciones de grupo de riesgo de las directrices de NCCN sobre cáncer de próstata. Se compararon cuatro grupos de riesgo de PDE4D7 definidos con los grupos de riesgo de NCCN para: la probabilidad a 5 años de experimentar el resultado final de recurrencia bioquímica (RBQ) posterior a cirugía (FIG. 7); la probabilidad a 10 años de alcanzar el resultado final de recurrencia clínica (RC) (FIG. 8); la probabilidad a 10 años de alcanzar el resultado final de mortalidad específica de cáncer de próstata (MECP) (FIG. 9) y la probabilidad a 10 años de alcanzar el resultado final de mortalidad total (MT) (FIG. 10). Los grupos de riesgo de NCCN incluían: (1) grupo de riesgo muy bajo y bajo (MB B), (2) el grupo de riesgo intermedio favorable (RIF), (3) el grupo de riesgo intermedio desfavorable (RID), y (4) el grupo de riesgo alto (RA). Dichos grupos de riesgo de NCCN se compararon con cuatro grupos de riesgo de PDE4D7, respectivamente, que incluían: (1) PDE4D7 (4-5); (2) PDE4D7 (3-4); (3) PDE4D7 (2-3) y (4) PDE4D7 (1-2).

Tal como puede observarse en las FIGS. 7 a 10, mientras que un grupo de riesgo creciente contribuye a una probabilidad incrementada de alcanzar uno de los resultados finales investigados, la distribución del riesgo en los esquemas de riesgo bajo es diferente en las cuatro categorías de riesgo, respectivamente. Lo anterior se muestra especialmente en las FIGS. 9 y 10, en las que el incremento del riesgo a lo largo de los grupos de riesgo de NCCN es muy lineal y el incremento de la pendiente no es muy acusado. En contraste, el riesgo a 10 años de metástasis o muerte relacionada con el cáncer de próstata es pequeño en las dos categorías de riesgo de PDE4D7 más alto (3-4 y 4-5), mientras que el incremento de la pendiente en los grupos con las puntuaciones de riesgo de PDE4D7 más bajo (2-3 y 1-2) se incrementa fuertemente, alcanzando un nivel de riesgo final de 25% en la categoría de riesgo de PDE4D7 más bajo, en comparación con 10-15% en el grupo de riesgo alto de NCCN.

Dichas diferencias entre los grupos de riesgo de NCCN y los grupos de riesgo de PDE4D7 pueden ayudar a estratificar los pacientes con un diagnóstico de cáncer de próstata en, por ejemplo, pacientes que pueden retrasar la intervención activa inmediata y por el contrario ser tratados con vigilancia activa, y pacientes que no deberían ser tratados con una terapia de intervención activa. En otras palabras, la puntuación de riesgo de PDE4D7 y los grupos de riesgo pueden ayudar al profesional sanitario a recomendar al paciente terapias diferentes o alternativas basándose en la información adicional proporcionada por la puntuación de riesgo de PDE4D7. Es decir, la puntuación de riesgo de PDE4D7 puede ayudar al profesional sanitario a recomendar que el paciente se somete a vigilancia activa en lugar de someterlo a terapia de intervención activa debido a que, basándose en PDE4D7, el riesgo del paciente de experimentar uno o más resultados clínicos finales particulares es reducida o inferior a un umbral particular, incluso al clasificar el paciente como de riesgo más alto según otras métricas clínicas.

En referencia a la FIG. 11, se ilustra la probabilidad de RBQ a 5 años en todas las combinaciones de los cuatro grupos de riesgo de NCCN frente a todas las categorías de riesgo de PDE4D7. Tal como se esperaba de los análisis anteriores, los grupos de pacientes que presentan la categoría de riesgo de PDE4D7 más alta (4-5) presentan una menor probabilidad de experimentar uno de los resultados longitudinales medidos que el grupo clínico de NCCN de riesgo muy bajo y bajo, y viceversa para la cohorte de pacientes con el riesgo de PDE4D7 más bajo (1-2) en comparación con el grupo de riesgo clínicamente alto de NCCN. Especialmente existe una cohorte de hombres definida por niveles elevados de expresión de PDE4D7 en sus tumores que presentan un riesgo >50% inferior de RBQ a los 5 años posterior a la cirugía en comparación con el grupo de riesgo clínico muy bajo y bajo (4,2% vs. 9,5%, respectivamente). Este es el caso al considerar únicamente el grupo de riesgo clínico muy bajo (4,2% vs. 6,6%, respectivamente; no mostrado). Además, dicha cohorte de expresión elevada de PDE4D7 está compuesta de hombres de todos los grupos de riesgo clínico, incluyendo el grupo de riesgo intermedio desfavorable y alto.

De esta manera, tal como puede observarse en la FIG. 11, la puntuación de riesgo de PDE4D7 puede utilizarse en combinación con una segunda determinación de riesgo, tal como el grupo de riesgo de NCCN, a fin de determinar una terapia o tratamiento recomendado o propuesto. Además, la información adicional de la puntuación de riesgo de PDE4D7 puede ayudar a estratificar los pacientes a fin de proporcionar tratamientos diferentes, alternativos o más apropiados. Por ejemplo, tal como se observa en la FIG. 17, existen 148 pacientes clasificados en los grupos de riesgo ID (intermedio desfavorable) y RA (riesgo alto) de la NCCN. Basándose en ese análisis exclusivamente, dichos pacientes pueden elegir una intervención activa inmediata debido a que hay una probabilidad de 34,4% y 46,5% de una RBQ a 5 años. Sin embargo, mediante consideración de la puntuación de riesgo de PDE4D7, dichos pacientes pueden estratificarse de una manera que diferencie entre su riesgo real de una RBQ a 5 años. Como resultado, los 14 pacientes con una probabilidad de 14,3% de una RBQ a 5 años, los 10 pacientes con una probabilidad de 10% de una RBQ a 5 años e incluso los 59 pacientes con una probabilidad de 28,8% de una RBQ a 5 años por el contrario puede elegir la vigilancia activa en lugar de una terapia de intervención activa, retrasando de esta manera los muchos efectos secundarios graves de las terapias de intervención activa y mejorando la calidad de vida de estos pacientes. En otras palabras, el profesional sanitario puede recomendar a dichos 24 o 83 pacientes que se sometan a vigilancia activa en lugar de intervención activa, aunque el grupo de riesgo de NCCN sugeriría que deberían someterse a algún tratamiento de intervención activa.

En referencia a las FIGS. 12 a 15, el impacto de la puntuación de Gleason de biopsia frente a la categoría de riesgo de PDE4D7 en los subgrupos de riesgo clínico de riesgo muy bajo y bajo (RMB RB), riesgo intermedio favorable (RIF) y riesgo intermedio desfavorable y riesgo alto (RID RA), se midió mediante análisis de supervivencia de Kaplan-Meier del tiempo hasta la recaída bioquímica y clínica. En el caso del grupo de riesgo MB+B (no mostrado), no se produjo ningún impacto significativo de las categorías de riesgo de PDE4D7 para estratificar la subcohorte de pacientes adicionalmente en diferentes grupos de riesgo. Lo anterior podría indicar que el riesgo total en dicho grupo ya es muy bajo y, en consecuencia, que resulta difícil subestratificar adicionalmente esta cohorte de pacientes. En otras palabras, el grupo de bajo riesgo clínico (ASP <10 ng/ml, biopsia Gleason < 3+3; cT < T2) es un grupo diferente con pocas alteraciones genómicas que incluye un riesgo bajo de futura agresividad de la enfermedad y que se refleja en una probabilidad <10% de una recaída bioquímica a 5 años, una probabilidad <1% de una progresión a 10 años a metástasis y sin riesgo de muerte específica de cáncer de próstata en los 10 años posteriores al tratamiento primario.

Sin embargo, tal como se observa en las FIGS. 12 y 13, al analizar el grupo de riesgo intermedio favorable, resultó evidente que la biopsia Gleason no estratifica el riesgo de este grupo adicionalmente de manera significativa (FIG. 12, p=0,19), mientras que las categorías de riesgo de PDE4D7 definen claramente diversos subgrupos de pacientes con diferentes perfiles de riesgo longitudinal (FIG. 13, p=0,01).

De manera similar, tal como se observa en la FIG. 14, el análisis de los pacientes de riesgo intermedio desfavorable y de riesgo alto muestra que, aunque la puntuación de Gleason de biopsia sí estratifica los pacientes según diferencias en los resultados de recurrencia clínica, este parámetro indica mayoritariamente los hombres en riesgo elevado de recurrencia bioquímica posterior a cirugía. Lo anterior es cierto en particular para el pequeño grupo de hombres con una puntuación de Gleason de biopsia 4+4.

En contraste, en referencia a la FIG. 15, las categorías de riesgo de PDE4D7 subestratifican los pacientes en dos grupos de riesgo con puntuaciones de PDE4D7 más altas (3-5) con un riesgo muy bajo de recurrencia clínica durante los 10 años posteriores a la cirugía (únicamente 1 suceso en 114 pacientes; 0,9%). Por otra parte, los sucesos en la categoría de riesgo de PDE4D7 más bajo (2 de 6) se producen en los 20 meses posteriores a la cirugía, indicando no sólo un elevado riesgo de recurrencia en este grupo de pacientes (33,3%), sino también una recaída rápida posterior a la cirugía en el caso de que se produzca una recurrencia.

De esta manera, la cuantificación de PDE4D7 en una puntuación de riesgo para los pacientes con cáncer de próstata añade un valor independiente y complementario a la estratificación del riesgo de las poblaciones definidas por parámetros clínicos. En particular, los niveles elevados de expresión de PDE4D7 podrían proporcionar un poder de decisión adicional para seleccionar los pacientes con un riesgo más bajo en comparación con la información clínica por sí sola en todos los grupos de riesgo clínico. Simultáneamente, una expresión de PDE4D7 baja podría contribuir a la reestratificación de los pacientes con riesgo muy alto de fallo rápido en resultados finales como la recaída de ASP. Además, la puntuación de riesgo de PDE4D7 determinada tal como se da a conocer en la presente memoria puede subestratificar los pacientes en diferentes riesgos de supervivencia libres de progreso, lo que no resultaba posible con las otras determinaciones de riesgo.

Combinación de la puntuación de riesgo de PDE4D7 con una segunda determinación de riesgo

Los datos presentados en la presente especificación indican que el riesgo de progresión de la enfermedad proporcionado por la puntuación de riesgo de PDE4D7 ofrece nuevos conocimientos sobre las subpoblaciones de cáncer de próstata y, de esta manera, podría ser complementario a los riesgos proporcionados por los criterios actuales de práctica clínica (segunda determinación de riesgo). Por lo tanto, se planteó la hipótesis de que la combinación de ambas puntuaciones de riesgo mediante modelado informático podría predecir los resultados a largo plazo de la enfermedad de manera más eficaz que utilizando cualquier puntuación individual por sí sola. Con el fin de evaluar dicha hipótesis, se seleccionó una subcohorte de 449 pacientes (92 sucesos, 20,5%) con historias completas de resultado a 5 años y se generó un modelo de regresión logística a fin de predecir el riesgo a 5 años de recurrencia bioquímica posterior a la cirugía. El modelado demostró un valor predictivo independiente de la puntuación de riesgo de PDE4D7 (cociente de riesgos=0,42, IC al 95%=0,28-0,63, p<1,0x 10-4, TA^bL^a3). La función logit del modelo de regresión que se utilizó para predecir el riesgo de progresión a 5 años individual (RBQ) para la totalidad de los 449 pacientes era:

iogítfp) - A (B RB) (C * RIF)

(D * RID) (E * RA) (F * puntuacióri_PDE4D7)l (3)

en la que RB=riesgo bajo de NCCN, RIF=riesgo intermedio favorable de NCCN, RID=riesgo intermedio desfavorable de NCCN, RA=riesgo alto de NCCN; A, B, C, D, E y F son los pesos y puntuación_PDE4D7 es la puntuación de PDE4D7 continua.

En realizaciones particulares, A puede ser aproximadamente (-0,5)-0,5, tal como 0,16. B puede ser aproximadamente 0,0-1,0, tal como 0,59. C puede ser aproximadamente 0,0-2,0, tal como 1,07. D puede ser aproximadamente 1,0-3,0, tal como 2,03. E puede ser aproximadamente 2,0-3,0, tal como 2,52, y F puede ser aproximadamente (-1,5)-(-0,5), tal como -0,87. En el cálculo del modelo de regresión, se insertó un valor de 1 en la función logit para la categoría de riesgo de NCCN en la que caía el paciente y se insertó un valor de 0 para las otras categorías de riesgo de NCCN. Por ejemplo, en el caso de que un paciente se categorizase como de riesgo alto de NCCN, se insertaba un valor de 1 en la función logit para RA y se insertaba un valor de 0 para cada uno de RB, RIF y RID.

La probabilidad p para un paciente de experimentar el suceso predicho era:

p = 1 / (1 e(4ogit(p)) . (4)

La probabilidad p proporcionar una puntuación combinada de riesgo pronóstico que se basa en la puntuación de riesgo de PDE4D7 y una segunda determinación de riesgo, en la presente memoria, una clasificación de NCCN (a continuación, también la puntuación de riesgo de NCCN y PDE4D7). La puntuación combinada de riesgo pronóstico puede clasificarse o categorizarse en uno de por lo menos dos grupos de riesgo. Por ejemplo, puede haber dos grupos de riesgo, o tres grupos de riesgo, o cuatro grupos de riesgo, o más de cuatro grupos de riesgo predefinidos. Cada grupo de riesgo cubre un intervalo respectivo de probabilidades (no solapantes) p. Por ejemplo, un grupo de riesgo puede incluir todas las probabilidades p entre 0,0 y <0,1; otro grupo de riesgo entre 0,1 y <0,25; otro grupo de riesgo entre 0,25 y <0,5 y otro grupo de riesgo entre 0,5 y <1,0.

La TABLA 9 muestra datos adicionales del modelo de regresión logística. Tal como se ha indicado anteriormente, como las variables de entrada del modelo se utilizó la puntuación de riesgo de PDE4D7 en combinación con las categorías de riesgo clínico de la NCCN: riesgo muy bajo (RMB), riesgo bajo (RB), riego intermedio favorable (RIF), riesgo intermedio desfavorable (RID) y riesgo alto (RA) de progresión de la enfermedad. El grupo con riesgo clínico muy bajo se definió como el grupo de referencia, es decir, para un paciente que cae en la categoría RMB de riesgo clínico de NCCN, la puntuación de riesgo NCCN PDE4D7 se calcula únicamente mediante el peso A de la ecuación (3) (es decir, el coeficiente de regresión para "Constante" en la tabla) y la puntuación de riesgo de PDE4D7 continua ponderada F*puntuación_PDE4D7 de la ecuación (3) (en el que el peso F es el coeficiente de regresión para "puntuación_PDE4D7" en la tabla). Los parámetros respectivos del modelado de regresión logística se indican en la tabla. Los coeficientes de regresión (pesos) para construir la función logit(p) también se proporcionan como los cocientes de probabilidades, intervalos de confianza al 95% (IC al 95%) y valores de p. Además, se muestran los errores estándares y los estadísticos de Wald.

TABLA 9: modelo de regresión logística para predecir la recurrencia bioquímica a 5 años posterior a cirugía (449 pacientes)

El ensayo del modelo de regresión mostró una buena calibración de sucesos esperados vs. observados en los grupos tanto de sucesos como de no sucesos:

La FIG. 16 muestra un gráfico de calibración del modelo de regresión logística de las puntuaciones NCCN y PDE4D7 para predecir la recaída bioquímica a 5 años posterior a la cirugía basado en una tabla de contingencia tras ensayos de Hosmer-Lemeshow (Chi cuadrado 3,9, p=0,87) de la cohorte de 449 pacientes con un seguimiento completo de 5 años. El gráfico muestra el número observado vs. esperado (es decir, predicho con el modelo de regresión logística) de pacientes que no presentaron recaída de ASP en los 5 años posteriores al tratamiento primario en los diez subgrupos de deciles de la cohorte total. La determinación del coeficiente fue de 0,9336; los datos de la ecuación para la línea de regresión representada y = ordenada en el origen Pendiente*x (recta discontinua) fue la siguiente: Ordenada en el origen=0,7006 con error estándar=3,3621, IC al 95%=-7,0525-8,4537, t=0,2084 y p=0,8401; pendiente=0,9804 con error estándar=0,09243, IC al 95%=0,7672-1,1935, t=10,6072 y p<0,0001. Las curvas discontinuas indican el intervalo de confianza al 95%.

La FIG. 17 muestra un gráfico de calibración del modelo de regresión logística de las puntuaciones NCCN y PDE4D7 para predecir la recaída bioquímica a 5 años posterior a la cirugía basado en una tabla de contingencia tras ensayos de Hosmer-Lemeshow (Chi cuadrado 3,9, p=0,87) de la cohorte de 449 pacientes con un seguimiento completo de 5 años. El gráfico muestra el número observado vs. esperado (es decir, predicho con el modelo de regresión logística) de pacientes que no presentaron recaída de ASP en los 5 años posteriores al tratamiento primario en los diez subgrupos de deciles de la cohorte total. La determinación del coeficiente fue de 0,9291; los datos de la ecuación para la línea de regresión representada y = ordenada en el origen Pendiente*x (recta discontinua) fue la siguiente: Ordenada en el origen=0,2083 con error estándar=1,0895, IC al 95%=-2,3041-2,7207, t=0,1912 y p=0,8532; pendiente=0,9774 con error estándar=0,09544, IC al 95%=0,7573-1,1975, t=10,2405 y p<0,0001. Las curvas discontinuas indican el intervalo de confianza al 95%.

A continuación, se llevó a cabo un análisis de ROC (por sus siglas en inglés, curva característica de receptor-operador) para calcular los AUC (área bajo la curva ROC) a los 2, 5 y 10 años como 0,779, 0,749 y 0,748, respectivamente. La FIG. 18 muestra un análisis ROC de la recaída bioquímica (RBQ) a los 2 años de la cirugía del modelo de regresión logística de las puntuaciones NCCN y PDE4D7 en una cohorte de 449 pacientes con seguimiento de 5 años completo. El gráfico muestra la curva ROC de los falsos positivos (sensibilidad) vs. el gráfico de los falsos negativos (especificidad). Los datos estadísticos del análisis r Oc son los siguientes: grupo de positivos=47 (10,47%), grupo de negativos=402 (89,53%), prevalencia de la enfermedad=10,5%, AUC=0,779, error estándar=0,0334, IC al 95%=0,738-0,817, estadístico z=8,368, p (superficie=0,5) <0,0001.

La FIG. 19 muestra un análisis ROC de la recaída bioquímica (RBQ) a los 5 años de la cirugía del modelo de regresión logística de las puntuaciones NCCN y PDE4D7 en una cohorte de 449 pacientes con seguimiento de 5 años completo. El gráfico muestra la curva ROC de los falsos positivos (sensibilidad) vs. el gráfico de los falsos negativos (especificidad). Los datos estadísticos del análisis r Oc son los siguientes: grupo de positivos=92 (20,49%), grupo de negativos=357 (79,51%), prevalencia de la enfermedad=desconocida, AUC=0,749, error estándar=0,0284, IC al 95%=0,706-0,788, estadístico z=8,739, p (superficie=0,5) <0,0001.

La FIG. 20 muestra un análisis ROC de la recaída bioquímica (RBQ) a los 10 años de la cirugía del modelo de regresión logística de las puntuaciones NCCN y PDE4D7 en una cohorte de 379 pacientes con seguimiento de 10 años completo. El gráfico muestra la curva ROC de los falsos positivos (sensibilidad) vs. el gráfico de los falsos negativos (especificidad). Los datos estadísticos del análisis ROC son los siguientes: grupo de positivos=134 (35,36%), grupo de negativos=245 (64,64%), prevalencia de la enfermedad=desconocida, AUC=0,748, error estándar=0,0259, IC al 95%=0,701-0,791, estadístico z=9,549, p (superficie=0,5) <0,0001.

Tal como se muestra en la FIG. 21, un análisis del riesgo predicho para cada categoría de riesgo clínico de la NCCN como función de la puntuación de riesgo de PDE4D7 reveló una distribución heterogénea del riesgo de progresión a 5 años (RBQ) incluso dentro de los grupos de riesgo clínico de NCCN más bajo. En la figura, la probabilidad p predicha a 5 años se representa gráficamente frente a las puntuaciones de riesgo de PDE4D7 para cada categoría de riesgo de NCCN individual.

Basándose en el riesgo predicho por cada paciente, se definieron cuatro grupos de riesgo con probabilidad baja a 5 años (<10%) o a 10 años (<15%) de RBQ posterior al tratamiento primario (grupo de riesgo 0 a <0,1) en la FIG. 22) o con un riesgo postquirúrgico a 5 años muy considerable (>70%) de fallo de ASP (grupo de riesgo (0,5 a 1,0) en la FIG.

22) con una mediana de riesgo de suceso de sólo 27,1 meses. La mediana de riesgo para el grupo de riesgo (0,25 a <0,5) era de 149,7 meses, mientras que la mediana de supervivencia libre de progresión no se alcanzó en los grupos de riesgo (0 a <0,1) y (0,1 a <0,25). Al utilizar el grupo de riesgo (0 a <0,1) como referencia en el análisis de Kaplan-Meier, los cocientes de riesgos para el grupo de riesgo (0,1 a <0,25), (0,25 a <0,5) y (0,5 a 1,0) eran de 2,2 (IC al 95% 1,7-3,5), 4,3 (IC al 95% 2,8-6,6) y 11,5 (IC al 95% 4,6-28,8), respectivamente (FIG. 22; TABLA 10).

TABLA 10: Table de cocientes de riesgos para el modelo de regresión logística de puntuaciones NCCN PDE4D7 en el análisis de supervivencia de Kaplan-Meier del resultado clínico de supervivencia libre de recurrencia bioquímica

Comentario

Con el fin de evaluar un riesgo individual paciente por paciente, se desarrolló un modelo de regresión basado en los grupos de riesgo de NCCN y la puntuación de riesgo de PDE4D7. El modelo de regresión mostró que la puntuación de riesgo de PDE4D7 define distribuciones ampliamente solapantes de los riesgos individuales en las categorías de riesgo de NCCN contemporáneas. Con independencia del grupo de riesgo de NCCN que se determinó para un paciente individual, una puntuación de riesgo de PDE4D7 más alto definió un riesgo más bajo de progresión, mientras que una puntuación de riesgo de PDE4D7 más bajo indicó un riesgo más alto de enfermedad progresiva para un paciente dado.

Muy recientemente, se publicaron los resultados a largo plazo de la cohorte de vigilancia activa dentro del ensayo de cribado de cáncer de próstata aleatorizado de Goteborg. Este ensayo indicó que los hombres con una enfermedad de riesgo clínicamente bajo podrían presentar un riesgo considerable de experimentar una enfermedad progresiva bajo un régimen de tratamiento diferido. Por lo tanto, los autores cuestionaban si los hombres aparte de los que presentan una enfermedad de muy bajo riesgo, serían elegibles para estrategias de gestión preventivas. La publicación reciente de los resultados a 10 años del estudio ProtecT llega a conclusiones similares en el brazo de monitorización activa del ensayo. Aunque hay cierto debate sobre la validez de estos resultados para la práctica actual, podrían sugerir que sólo los pacientes con el riesgo más bajo están seguros frente a cualquier progresión durante la gestión de tratamiento diferido. Aunque la utilización de criterios clínicos permite la selección de dicho riesgo muy bajo, excepto una cohorte de pacientes pequeña (p.ej., 62 de 449 pacientes en la cohorte de los presentes inventores; 13,8%), los inventores esperan que la adición de marcadores moleculares incremente este grupo de pacientes de riesgo muy bajo (p.ej., a 122 de 449 en la cohorte al combinar la puntuación de riesgo de PDE4D7 con la categoría de riesgo de la NCCN, correspondiente a 27,2%).

Tal como se utiliza en la presente especificación y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares “un”, “una” y “el” o “la” incluyen los referentes plurales, a menos que el contexto indique claramente lo contrario.

El término "aproximadamente" denota un intervalo de precisión que el experto en la materia en tenderá que todavía garantiza el efecto técnico de la característica en cuestión. El término típicamente indica una desviación respecto al valor numérico indicado de ±20%, o ±15%, o ±10%, o ±5%.

Debe entenderse que la expresión "que comprende" no es limitativa. Para los fines de la presente invención, la expresión "que consiste" se considera que es una realización preferente de la expresión "que comprende". En el caso de que en lo sucesivo en la presente memoria un grupo se defina como que comprende por lo menos un número determinado de realizaciones, se hace referencia a que también comprende un grupo que consiste en dichas realizaciones únicamente.

Además, los términos "primer", "segundo", "tercero" o "(a)", "(b)", "(c)", "(d)", etc. y similares, en la descripción y en las reivindicaciones, se utilizan para distinguir entre elementos similares y no necesariamente para describir un orden secuencial o cronológico. Debe entenderse que los términos utilizados de esta manera son intercambiables bajo circunstancias apropiadas y que las realizaciones de la invención indicadas en la presente memoria son capaces de funcionar en otras secuencias diferentes de las indicadas o ilustradas en la presente memoria.

En el caso de que los términos "primer", "segundo", "tercer" o "(a)", "(b)", "(c)", "(d)", etc. se refieren a las etapas de un método o utilización, no hay coherencia temporal o de intervalos temporales entre las etapas, es decir, las etapas pueden llevarse a cabo simultáneamente o pueden existir intervalos temporales de segundos, minutos, horas, días, semanas, meses o incluso años entre dichas etapas, a menos que se indique lo contrario en la solicitud tal como se ha proporcionado anteriormente o se proporciona posteriormente en la presente memoria. Debe entenderse que la presente invención no se encuentra limitada a la metodología, protocolos, proteínas, bacterias, vectores, reactivos, etc. particulares indicados en la presente memoria, ya que estos pueden variar. También debe entenderse que la terminología utilizada en la presente memoria presenta el propósito de describir realizaciones particulares únicamente, y que no pretende ser limitativa del alcance de la presente invención, que se encuentra limitada exclusivamente por las reivindicaciones adjuntas. A menos que se indique lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente memoria presentan los mismos significados entendidos comúnmente por el experto ordinario en la materia.

El listado de secuencias adjunto, titulado 2014PF01672_Sequence Listing_ST25 se incorpora en la presente memoria como referencia en su totalidad.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Método de estratificación de riesgos, que comprende:

determinar un perfil expresión génica normalizada para un único gen marcador que consiste en fosfodiesterasa 4D variante 7 (PDE4D7) con respecto a un conjunto de uno o más genes de referencia seleccionados del grupo que consiste en: hipoxantina fosforibosiltransferasa 1 (HPRT1) de Homo sapiens, tubulina-alfa-Ib (TUBA1B), miembro de la familia de proteínas de unión a ARN Pumilio (PUM1) de Homo sapiens y proteína de unión a caja TATA (TBP) de Homo sapiens, y combinaciones de las mismas,

determinar una puntuación de riesgo pronóstico con una función de puntuación, basada en el perfil de expresión génica normalizada, en el que la función de puntuación se ha obtenido a partir de los genes de expresión génica para muestras biológicas obtenidas de sujetos que han sido monitorizados para cáncer de próstata, y

determinar una puntuación combinada de riesgo pronóstico basada en la puntuación de riesgo pronóstico y una segunda determinación de riesgo que es la clasificación de la National Comprehensive Cancer Network (NCCN).

2. Método según la reivindicación 1, que se caracteriza además porque la puntuación combinada de riesgo pronóstico se determina con una función de regresión derivada de sujetos que han sido monitorizados para cáncer de próstata.

3. Método según cualquier reivindicación anterior, que se caracteriza además porque por lo menos un gen de referencia incluye por lo menos dos o por lo menos tres o la totalidad de HPRT1, TUBA1B, PUM1 y TBP.

4. Método según cualquier reivindicación anterior, que se caracteriza además porque la puntuación de riesgo pronóstico se basa en el perfil de expresión génica normalizada que incluye el nivel de expresión para PDE4D7 como único gen marcador.

5. Método según cualquier reivindicación anterior, que se caracteriza además por la determinación del perfil de expresión génica, que comprende la realización de RT-qPCR de ARN extraído de una muestra biológica.

6. Método según la reivindicación 5, que se caracteriza además porque determinar el perfil de expresión génica incluye determinar un valor Cq para PDE4D7 y cada uno de por lo menos un gen de referencia y por la determinación de la puntuación de riesgo pronóstico que incluye normalizar el valor de PDE4D7 mediante la utilización del valor de cada uno de los genes de referencia en el grupo y calcular la puntuación de riesgo como función lineal de la puntuación normalizada.

7. Método según cualquier reivindicación anterior, que se caracteriza además por la categorización de un sujeto en uno de un conjunto predefinido de por lo menos dos o por lo menos tres grupos de riesgo, basándose en la puntuación combinada de riesgo pronóstico.

8. Método según la reivindicación 7, que comprende además por lo menos uno de:

proponer una terapia para un sujeto basándose en el grupo de riesgo asignado, en la que por lo menos dos de los grupos de riesgo están asociado a terapias diferentes,

calcular una predicción de riesgo de progresión de la enfermedad del sujeto antes o después de la cirugía de próstata, y

calcular una predicción de respuesta a la terapia para el sujeto antes o después de la cirugía de próstata.

9. Método según la reivindicación 8, que se caracteriza adicionalmente porque la terapia propuesta se selecciona del grupo que consiste en:

a) por lo menos una prostatectomía parcial,

b) una terapia activa seleccionada de entre tratamiento de radiación, terapia hormonal, quimioterapia y una combinación de las mismas,

c) la observación sin llevar a cabo a) o b).

10. Método según la reivindicación 9, que se caracteriza además porque la terapia propuesta se basa en que el grupo de riesgo asignado puede ser diferente de la terapia propuesta basándose únicamente en la segunda determinación de riesgo.

11. Producto de software informático que almacena instrucciones que, al ser ejecutadas en un ordenador, llevan a cabo las etapas implementadas por ordenador según cualquier reivindicación anterior.

12. Kit diagnóstico, en el que el kit comprende:

por lo menos un cebador y/o sonda para determinar el nivel de expresión de la fosfodiesterasa 4D variante 7 (PDE4D7), por lo menos un cebador y/o sonda para determinar el nivel de expresión génica de por lo menos un gen de referencia seleccionado del grupo que consiste en: hipoxantina fosforibosiltransferasa 1 (HPRT1) de Homo sapiens, tubulinaalfa-Ib (TUBA1B), miembro de la familia de proteínas de unión a ARN Pumilio (PUM1) de Homo sapiens y proteína de unión a caja TATA (TBP) de Homo sapiens, y combinaciones de las mismas, e

instrucciones para calcular una puntuación de riesgo basada en los niveles de expresión determinados, en el que las instrucciones se almacenan en un producto de software informático que, al ser ejecutado por un ordenador, lleva a cabo un método que comprende:

determinar un perfil de expresión génica normalizada para la fosfodiesterasa 4D variante 7 (PDE4D7), con respecto a por lo menos un gen de referencia,

determinar una puntuación de riesgo pronóstico con una función de puntuación, basándose en el perfil de expresión génica normalizado, y

determinar una puntuación combinada de riesgo pronóstico basándose en la puntuación de riesgo pronóstico y una segunda determinación de riesgo que es la clasificación de la National Comprehensive Cancer Network (NCCN).

13. Utilización de un perfil de expresión génica para la estratificación de riesgos, que comprende:

determinar un perfil de expresión génica de una muestra biológica obtenida de un sujeto, en el que el perfil de expresión génica es un nivel de expresión para la fosfodiesterasa 4D variante 7 (PDE4D7) normalizado respecto a un grupo de uno o más genes de referencia seleccionados del grupo que consiste en: hipoxantina fosforibosiltransferasa 1 (HPRT1) de Homo sapiens, tubulina-alfa-Ib (TUBA1B), miembro de la familia de proteínas de unión a ARN Pumilio (PUM1) de Homo sapiens y proteína de unión a caja TATA (TBP) de Homo sapiens, y combinaciones de las mismas, determinar una puntuación de riesgo pronóstico para el sujeto basándose en el perfil de expresión génica normalizada con una función de puntuación que se obtiene a partir de los perfiles de expresión génica para muestras biológicas obtenidas de sujetos que han sido monitorizados para cáncer de próstata, y

14. Producto de software informático que comprende instrucciones de almacenamiento de un medio de grabación no transitorio, que, al ser ejecutadas en un ordenador, causan que éste lleve a cabo un método que comprende:

calcular un perfil expresión génica normalizada para la fosfodiesterasa 4D variante 7 (PDE4D7) con respecto a un conjunto de uno o más genes de referencia seleccionados del grupo que consiste en: hipoxantina fosforibosiltransferasa 1 (HPRT1) de Homo sapiens, tubulina-alfa-Ib (TUBA1B), miembro de la familia de proteínas de unión a ARN Pumilio (PUM1) de Homo sapiens y proteína de unión a caja TATA (TBP) de Homo sapiens, y combinaciones de las mismas,

determinar una puntuación de riesgo pronóstico para el sujeto basada en el perfil de expresión génica normalizada con una función de puntuación que se obtiene opcionalmente a partir de los perfiles de expresión génica para muestras biológicas obtenidas de sujetos que han sido monitorizados para cáncer de próstata, y

calcular una puntuación combinada de riesgo pronóstico basándose en la puntuación de riesgo pronóstico y una segunda determinación de riesgo que es la clasificación de la National Comprehensive Cancer Network (NCCN).