CN101012473B

CN101012473B - 菌核青霉或者疣孢漆斑菌及用其制备人参皂苷f1的方法

Info

Publication number: CN101012473B
Application number: CN2006100823517A
Authority: CN
Inventors: 张怡轩; 王金辉; 吴春福; 何建勇; 吴秀丽
Original assignee: Shenyang Pharmaceutical University
Current assignee: Shenyang Pharmaceutical University
Priority date: 2006-05-26
Filing date: 2006-05-26
Publication date: 2011-09-14
Anticipated expiration: 2026-05-26
Also published as: CN101012473A

Abstract

本发明公开了生物转化制备人参皂苷F₁的两个菌株和用其改变三醇型人参皂苷糖基制备人参皂苷F₁的方法。选取具有水解人参皂苷的活性菌株，人参皂苷F₁采用需氧发酵生物转化技术、固定化细胞技术、固定化酶技术以及上述方法联合使用，转化人参三醇组皂苷和人参单体皂苷Rg₁，生成人参皂苷F₁及提取纯化F₁的过程，选取的具有水解人参皂苷的活性菌株为菌核青霉或疣孢漆斑菌。菌株命名为myrothecium verrucaria和Penicillium sclerotiorum，2006年04月17日送至CGMCC保藏，保藏编号为1676和1675。本发明生产工艺先进，原料成本低，适于大规模工业化生产，而且生产过程中无有害物质的排放，对周围环境无污染、无公害、符合环保要求。

Description

菌核青霉或者疣孢漆斑菌及用其制备人参皂苷F1的方法

技术领域：

本发明涉及药品技术领域，即利用生物催化剂转化人参皂苷生产稀有人参皂苷F₁的方法，即提供了生物转化制备人参皂苷F₁的两个菌株和用其改变三醇型人参皂苷糖基制备人参皂苷F₁的方法。菌株已送至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏。保藏日期：2006年04月17日，保藏编号为1675和1676，分类命名分别为myrothecium verrucaria，Penicillium sclerotiorum。。

背景技术：

人参在我国和东南亚地区已有数千年的药用历史，人参所具有的多种生理和药理作用闻名于世，如抗肿瘤、增强免疫、改善微循环、平稳血压、调节血糖、降血脂、安神、抗衰老、抗紧张、调节消化机能、预防消化道溃疡、提高生命质量、增强记忆及学习能力等。人参属于五加科人参属，有四个不同种和其他变种，如中国人参(Panax ginseng)、西洋参(P.quiqueflium L.)、三七人参(P.notoginseng Burk)、竹节参(P.uaponicus)等以及其他一些变种。经过近半个世纪的研究，从人参植物的根部和其它部位分离了人参皂甙、人参炔醇、人参多糖、多肽、有机酸及脂、甾醇、氨基酸和微量元素。而且，证明了人参皂苷(ginsenoside)是人参功效的主要成分。随着分离分析技术的进步，人参皂苷的分离、精制、分子结构及生物学功能已被逐一阐明。人参皂苷根据皂苷元的不同，可分为三种，即二醇类皂苷类(protopanaxdill-type Gisenosides)、三醇皂苷类(Protopanaxtriol-type GiseIlosides)、齐墩果酸类皂苷，其中二醇类皂苷占整个皂苷的50～60％，三醇类皂苷30～35％。占皂苷总量50-60％的二醇类皂苷包括Ra₁、Ra₂、Ra₃、fuB₁、。Rb₂、Rb₃·、Re、Rd及Rg₃和稀有人参皂苷Rh₂，它们只是糖链有所不同，皂甙元相同。其中Rb、Rc、Rd等皂苷在人参中含量高，容易得到。占皂苷总量30～35％三醇类皂苷Re、Rf、Rg₁、Rg₂、Rh₁等，也是糖链不同，皂苷元相同。其中Re和Rg₁在人参中含量相对较高，容易得到。

近年发现稀有人参皂苷起着重要的生理作用。如稀有人参皂苷Rg₃、Rg₅、Rh₂、Rh₃、Rh₁等具有抗癌活性。更重要的是，人们发现由于肠道菌群对糖键的水解能力极强，大多数天然皂苷入血成分为其次级或元。如多种天然二醇组人参皂苷均报道有抗肿瘤作用，包括：Rg₃，Rh₂，Rb₁等等。这些皂苷最终体内代谢产物均为Compound K(以下简称C-K)或原人参二醇(以下简称PPD)。由此，人们联想：是否C-K或原人参二醇为二醇型人参皂苷抗肿瘤的活性代谢产物。换言之，Rg₃，Rh₂可能为抗肿瘤天然前体药物。因此，探讨C-K或原人参二醇的抗肿瘤作用有可能会较Rg₃或Rh₂具有更大的价值。2001年11月份，在韩国召开人参皂苷抗肿瘤国际学术研究会，日本著名学者柴田承二作了有关人参皂及三萜皂苷抗肿瘤活性的综述报告。同年，韩国“一和”(ILHWA)公司对外公布了IH901即人参二醇型皂苷体内代谢产物人参皂C-K，作为抗肿瘤药物开发，并进入二期临床的信息。由此可见天然人参皂苷的体内活性代谢产物可能是人参发挥药理作用的最终物质。

越来越多的研究表明，人参皂苷在肠道细菌的转化下，可以将三醇型人参皂苷Re和Rg₁转化为稀有人参皂苷F₁，F₁在人参中含量极低甚至不存在。药理实验表明，稀有人参皂苷F₁可明显改善血管性痴呆大鼠空间记忆能力，且安全性好，显示出有预防与治疗血管性痴呆疾病的作用，可见将人参皂苷F₁开发成药物不仅具有重要的临床意义，也具有广阔的市场前景。

发明内容：

本发明提供一种生物转化平台，改变三醇型人参皂苷糖基制备稀有人参皂苷F₁的方法，它分别选用两种真菌(菌核青霉或者疣孢漆斑菌)中任一种，采用需氧发酵生物转化技术、固定化细胞技术固定化酶技术中的一种或者两种方法连用，直接以三醇型人参皂苷作为底物，转化制备人参皂苷F₁。以单体人参皂苷Rg₁为底物，也获得人参皂苷F₁，说明上述两种真菌产生了能专一性的水解三醇型人参皂苷C₆-葡萄糖的β-糖苷酶，与同时产生的α-鼠李糖苷酶联合作用，水解三醇型人参皂苷底物，可使皂苷分子苷元上的部分糖基被水解掉、获得稀有皂苷F₁。

本发明中产生专一性的水解三醇型人参皂苷C₆-葡萄糖的β-糖苷酶以及α-鼠李糖苷酶的真菌，指的是下列两种菌种中的任一种：(1)菌核青霉Penicillium glabrum(Wehmer)；(2)疣孢漆斑菌Myrothecium verrucaria(Alb.et S chw.)Ditm.ex Fr.。

本发明提供一种微生物转化三醇型人参皂苷获得稀有人参皂苷F₁的方法，包括原始菌种的活化、摇瓶种子培养、生物转化培养、以及后提取的各种步骤。其生产工艺包括：

脱脂牛奶冻干管菌种→斜面活化→摇瓶种子→生物转化瓶，投入三醇型人参皂进行生物转化→终止转化，提取纯化获得人参皂苷F₁。

本发明所述的摇瓶种子培养是指采用菌株生长所需要的碳源、氮源、无机盐等，经过灭菌后，挖取适量菌体斜面，转移到种子摇瓶中，在自动旋转摇瓶机上震荡培养，200rpm，27-28℃，培养20-24小时获得摇瓶种子。

本发明所述的生物转化是指采用菌株生长所需要的碳源、氮源、无机盐等，经过灭菌后，按照一定比例(10-15％)转入种子液，在自动旋转摇瓶机上震荡，220-240rpm，27-28℃培养24小时后，按照一定投入人参三醇型皂苷，继续培养72-96小时，获得转化产物人参皂F₁。其中三醇型人参皂苷混合物以1-10％比例投料，单体人参皂苷Rg1以0.01-5％比例投料。

本发明所述的生物转化产物-人参皂苷F₁的提取、分离、纯化过程如下：离心浓缩转化上清液，采用石油醚、氯仿、正丁醇混合溶剂萃取，正丁醇部分为粗提取物，再经硅胶柱色谱法，用氯仿-甲醇梯度洗脱薄层色谱跟踪人参皂F₁组分，进行纯化。进一步经重结晶，得到高纯度产物。

本发明所述的生物转化产物-人参皂苷F₁也可采用另外一种提取分离方法，其特征在于：离心浓缩转化上清液，经大孔树脂吸附，水洗后，高浓度乙醇洗脱，得乙醇洗脱物，即为粗提取物，再经硅胶柱色谱法，用氯仿-甲醇梯度洗脱、薄层色谱跟踪人参皂苷F₁组分，进行纯化，色谱组分可进一步经重结晶，得到高纯度产物。其中大孔树脂为各种苯乙烯型和衍生物。

本发明利用上述两种真菌中的任一种，使用生物转化发酵技术、固定化细胞技术或者固定化酶技术，水解各种参中含量较高的三醇型人参皂苷的部分糖基，从而获得稀有人参皂苷F₁。含原人参三醇型皂苷来源于包括中国人参、高丽人参、西洋、三七植物，包括植株根、茎、叶、花、果实各部位提取物。本发明生产工艺先进，原料成本低，适于大规模工业化生产，而且生产过程中无有害物质的排放，对周围环境无污染、无公害、符合环保要求。

两种菌株已于2006年4月17日送至北京市海淀区中关村北一条13号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏编号分别为：1675和1676，分类命名分别为：myrothecium verrucaria，Penicillium sclerotiorum，并已存活。

具体实施方式：

下面结合优选实施例对本发明做进一步叙述，但保护范围不受所述实施例的限制。

实施例1：本发明所述用于生物转化的两种真菌的特征

(1)菌核青霉Penicillium glabrum(Wehmer)在不同培养基上的培养特征

培养时间	CA (察氏琼脂培养基)	MEA (麦芽汁琼脂培养基)	PDA (马铃薯葡萄糖培养基)
				第一天	直径 0.35-0.4cm，半透明椭圆形，质地呈致密绒状，菌落紧贴培养基，白色气生菌丝	大小约同前，但中心部位气生菌丝更致密	直径0.4～0.5cm，圆形，质地呈白色绒状
第四天	直径约 1.8-2.0cm，质地呈致密颗粒状，黄色与白色颗粒相间，有同心圆，	直径2.0～2.2cm，质地呈细小颗粒状，深绿色孢子，孢子量很多，有同心圆，中央白色菌	直径约2.1～2.4cm，质地呈颗粒状，深绿色孢子，正反均有同心圆，中央呈白色菌丝突出，反

	中央呈颗粒状突起，绿色孢子，反面有同心圆，中心黄色，边缘乳白色	丝稍突起，反面有同心圆，橙红色，	面有同心圆，红色，
				第七天	直径约3.8cm质地呈黄色致密颗粒状，绿色孢子，中央呈黄色絮状突起，边缘白色，反面橙红色，边缘白色菌丝	直径4.0～4.2cm，质地呈绿色致密绒状，中央白色絮状，边缘黄色，菌落与培养基紧贴，反面橙红色，中央微凹陷，边缘黄色	直径约3.5～3.7cm 菌落呈致密绿色绒状，边缘黄色，菌落与培养基紧贴，反面橙红色，呈辐射状，边缘黄色，无渗泌物

(2)疣孢漆斑菌Myrothecium verrucaria(Alb.et Schw.)Ditm.ex Fr.在不同培养基上的培养特征。

培养时间	CA(察氏琼脂培养基)	MEA(麦芽汁琼脂培养基)	PDA(马铃薯葡萄糖培养基)
				第一天	未生长	菌落太小无法观察	全部长出直径约 0.15cm，白色气生菌丝
第四天	未生长	直径约1.6cm，质地呈白色绒状，圆形，菌落突起，无皱褶，反面黄色	直径约1.6～1.8cm，质地呈纯白色绒状菌落整体突起，中心更突起，反面有不明显的同心圆，黄色
				第七天	菌落直径 1.0～1.2cm呈纯白色、致密绒状，突起，反面乳白色，边缘白色透明菌丝	直径约3.1cm，呈圆形、纯白色、致密绒状突起，偶尔有黑色颗粒状孢子，边缘白色透明菌丝反面乳黄色，有同心圆	直径约3.4cm，质地呈纯白色致密绒状突起，同心圆不十分圆，反面乳黄色，无渗泌物

上述两种真菌在光学显微镜下的特征：

(1)菌核青霉没有顶囊分生孢子长在分生孢子梗上，成毛笔状

(2)疣孢漆斑菌分生孢子梗长约70μm左右，平滑、直立、分隔。上部有类似青霉的帚状枝，紧密排列形成分生孢子层，分生孢子直接由指状的小梗生出，成链。分生孢子链彼此胶粘成团，孢子长卵形，光滑，绿黑色约7×2μm。

采用分子生物学手段，提取上述两株真菌的染色体，使用ITS引物(ITS 1：5’-TCC GTC GGT GAA CCT GCG G-3’；ITS 4：5’-TCCTCC GCT TAT TGA TAT GC-3’)、以该菌体的染色体为模版，进行PCR扩增，并对其PCR产物进行回收、克隆和测序，将所获序列在Genbank中进行比对、分析。分别与菌核青霉Penicillium glabrum(Wehmer)和疣孢漆斑菌Myrothecium verrucaria(Alb.et Schw.)Ditm.ex Fr.的相似性达到99％以上。结合培养特征、菌丝形态特征，确定上述两株菌的分类归属。

实施例2：需氧发酵法生物转化生产人参皂F₁的方法

一、培养基

1、斜面培养基：

葡萄糖10g/L，马铃薯(去皮)200g/L，琼脂15g/L，用蒸馏水配置，pH7.2-7.4，121℃30min。

马铃薯浸汁的制备：取200g去皮马铃薯，切成小块，置于1000ml水中煮一个小时后过滤，用冷开水将滤液补足1000ml。

2、摇瓶种子培养基

葡萄糖10g/L，蔗糖10g/L，花生饼粉5g/L，蛋白胨10g/L，NH₄Cl 10g/L，KH₂PO₄ 3g/L，MgSO₄ 7H₂O3g/L，常水配置，PH自然，分装40ml/250ml三角瓶，灭菌115℃×20min

3、生物转化培养基

葡萄糖 10g/L 锰(Mn²⁺) 1mg/L

天冬氨酸 2g/L 锌(Zn²⁺) 1mg/L

磷酸二氢钾 1g/L 铁(Fe³⁺) 2mg/L

七水硫酸镁 0.5g/L 维生素B₁ 1mg/L

生物素(V_H) 5ug/L 灭菌前pH 6.0

分装50ml/250ml 三角瓶115℃，20min

以上组成中花生饼粉、蛋白胨要求新鲜不发霉且过160目筛。

二、需氧发酵生物转化过程

1、菌种的斜面活化：打开菌种脱脂牛奶冻干管，挑取少量粉末均匀涂布在上述灭菌后的斜面上，在28℃温度下培养5-7天，待菌苔生长致密、布满斜面、无杂菌，冰箱4℃保存。

2、摇瓶种子培养：将活化好的斜面菌种挖块1*1cm²接种到每个种子培养瓶中，在27-28℃温度下恒温震荡培养，200rpm，20-24小时，镜检菌丝生长舒展、染色深、无杂菌即可。

3、生物转化：生物转化培养基配方如上，灭菌后，将培养好的种子，按照10-15％的转种量，转入生物转化瓶中，220-240rpm，28℃，培养24小时后，待菌体生长旺盛、舒展，按照1-10％量投入三醇型人参皂苷或单体皂苷Rg₁，继续培养72-96小时。

三、固定化技术

(1)收集生物转化菌体搅成糊状，海藻酸钠包埋法制备固定化细胞。

(2)纯化C6-β-葡萄糖苷酶，以聚乙烯氧化物为载体制备固定化人参皂苷β-葡萄糖苷酶。

四、人参皂苷F₁的鉴定与纯化

(1)将生物转化产物液在室温、常压下，使用转速为4000rpm的离心机离心30分钟，收集上清液。采用TLC、HPLC方法，进行人参皂苷F₁定性与定量分析。

(2)TLC检测条件：硅胶GF₂₅₄；展开剂：正丁醇∶乙酸乙酯∶水＝4∶1∶5；显色剂：5％硫酸乙醇溶液。105℃烘烤10分钟，显***。检测结果表明，菌核青霉和疣孢漆斑菌能够不同程度的转化三醇型人参皂苷产生稀有人参皂苷F₁。

(3)HPLC检测条件如下。在生物转化液中投入0.5％人参皂苷Rg1时，菌核青霉能将90％以上的人参皂苷Rg1转化为稀有人参皂苷F₁。

色谱柱：C18(4.6×150mm，5um)；

柱温：30℃；

流动相：乙腈∶水(48∶52)；

检测波长：203nm；

流速：1ml/min。

(4)转化产物的分离纯化：采用正丁醇萃取生物转化离心上清液三次，浓缩；沉淀物用甲醇提取一次，提取液浓缩。两部分合并，水溶液经过D101大孔吸附树脂吸附，蒸馏水将水溶性杂质除去，使用95％乙醇将人参总皂苷洗脱。再经硅胶柱色谱法，用氯仿-甲醇梯度洗脱、薄层色谱跟踪人参皂苷F₁组分，进行纯化，色谱组分可进一步经重结晶，得到高纯度产物。纯化样品经过核磁共振碳谱检测，鉴定其转化产物为人参皂苷F₁。

Claims

1.一种制备人参皂苷F₁的方法，其特征在于：选取具有水解人参皂苷的活性菌株，采用需氧发酵生物转化技术、固定化细胞技术、固定化酶技术以及上述方法联合使用，转化人参三醇型皂苷和人参单体皂苷Rg₁，生成人参皂苷F₁及提取纯化F₁的过程，选取的具有水解人参皂苷的活性菌株为保藏编号为CGMCC No.1676的菌核青霉菌或保藏编号为CGMCC No.1675的疣孢漆斑菌。

2.根据权利要求1所述的一种制备人参皂苷F₁的方法，其特征在于：采用需氧发酵生物转化人参皂苷的步骤为：原始菌种的活化、摇瓶种子的制备、生物转化、转化液的后处理；步骤如下：

(1)培养基种子培养基和生物转化培养基中的营养采用碳源和氮源，其中碳源可为葡萄糖、淀粉、糊精、饴糖，氮源可为蛋白胨、花生饼粉、黄豆饼粉、牛肉膏、鱼粉，此外还需要添加一定比例的无机盐、生长因子、维生素，所述的无机盐为NH₄Cl、KH₂PO₄、MgSO₄.7H₂O或CaCO₃、生长因子为生物素、维生素为维生素B₁或维生素C；

(2)生物转化工艺通过摇瓶二级发酵可获得生物转化产物-人参皂苷F₁，培养方法包括：摇瓶种子的制备：灭菌前培养基pH6.0，灭菌后挖块接种生产菌株斜面菌苔后，于自动旋转摇瓶机上，转数200rpm，温度为27-28℃，培养时间为20-24小时，摇瓶生物转化：灭菌前培养基pH6.0，灭菌后按照10-15％的接种量转种，于自动旋转摇瓶机上，转数200-240rpm，温度为27-28℃，培养时间24小时后，人参皂苷以1-10％比例投料，继续培养72-96小时，人参单体皂苷Rg1以0.01-5％比例投料，继续培养72-96小时。

3.根据权利要求1所述的制备人参皂苷F₁的方法，其特征在于：采用固定化细胞技术包埋生物转化菌，转化生产人参皂苷F₁，海藻酸钠法；采用固定化酶技术，从生物转化菌的培养液中纯化水解人参皂苷糖苷酶；采用共价法，以聚乙烯氧化物为载体制备固定糖苷酶，转化生产人参皂苷F₁。

4.根据权利要求2所述的一种制备人参皂苷F1的方法，其特征在于：将所述的生物转化液离心，将上清液浓缩，正丁醇萃取，浓缩；沉淀物用甲醇提取一次，提取液浓缩；两部分合并，合并液经大孔树脂吸附，水洗后，高浓度乙醇洗脱，得乙醇洗脱物，即为粗提取物，再经硅胶柱色谱法，用氯仿-甲醇梯度洗脱、薄层色谱跟踪人参皂苷F₁组分，进行纯化，色谱组分可进一步经重结晶，得到高纯度产物，其中大孔树脂为各种苯乙烯型和衍生物。

5.根据权利要求1所述的一种制备人参皂苷F₁的方法，其特征在于：所述的人参三醇型皂苷来源于包括中国人参、高丽人参、西洋、三七植物，包括植株根、茎、叶、花、果实各部位提取物。