CN101139562A - 一种链霉菌发酵三七皂苷制备稀有人参皂苷Compound K的工艺 - Google Patents
一种链霉菌发酵三七皂苷制备稀有人参皂苷Compound K的工艺 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于生物、医药技术领域，涉及一株保藏编号为CGMCC No.2074的弗氏链霉菌(Streptomyces fradiae NTGA－334)菌株，以及该菌株发酵转化各种三七皂苷中的二醇组人参皂苷，制备20－O－β－D－吡喃葡萄糖基－20(S)－原人参二醇(人参皂苷Compound K)的工艺。培养基选用高氏一号、ISP2、腐质酸(HSG培养基)以及天门冬酰胺培养基。发酵过程中，各种三七皂苷投料比例为0.1－10％(w/v)，发酵温度18－50℃，0.1－35％(w/v)氨水动态调节pH＝2－8，通气比0.1－10(v/v)，搅拌速率10－900r/min，发酵时间5h－120h，大孔吸附树脂添加量0.1－30％(w/v)。本发明为规模化发酵转化各种三七皂苷、制备Compound K提供一株性状稳定、营养要求简单、生长良好的链霉菌菌株，以及实用简便的全自动发酵罐发酵、分离提取工艺。用该菌株及该工艺来制备Compound K，生产成本低、杂质少，产物得率高。
Description
技术领域
本发明属于生物、医药技术领域，涉及一种链霉菌发酵转化各种三七皂苷中的二醇组人参皂苷、制备20-O-β-D-吡喃葡萄糖基-20(S)-原人参二醇(人参皂苷Compound K，以下简称Compound K)的工艺。特别提供一株人工驯化的弗氏链霉菌(Streptomyces fradiaeNTGA-334)菌株，以及用该菌株在全自动发酵罐中发酵转化各种三七皂苷、分离提取Compound K的工艺。
背景技术
Rb1、Rb2、Rc、Rg3和Rh2等多种天然二醇组人参皂苷均报道有抗肿瘤作用(SteveHelms ND：Alternat.Med.Rev.，2004，9(3)，259-274；Shoji S：J.Korean Med.Sci.，2001，16(Suppl.)，S28-37.)。人体代谢实验表明，口服后的人参皂苷在胃液、胆汁的作用下仅发生了轻微的氧化作用，不能被降解，只有在肠内菌的作用下，糖苷键才发生断裂，形成一系列代谢产物。最新的药理学研究表明：被吸收入血并发挥抗肿瘤活性的不是二醇组人参皂苷本身，而是经肠道菌群代谢转化后的代谢产物Compound K(C36H64O8)(Tawab MA et al：DrugMetab.Dispos.，2003，31(8)，1065-1071)。自Yosioka I等1972年用土壤细菌水解Rb1、Rb2和Rc时首次发现Compound K以来(Yosioka I et al：Chem.Pharm.Bull.，1972，20(11)，2418-2421)，目前普遍认为Compound K是天然二醇组人参皂苷抗肿瘤的活性代谢产物，而Rb、Rc、Rd等可能是抗肿瘤天然前体药物。近年来的体内体外试验研究发现，Compound K除了抑制肿瘤细胞的增殖、浸润和转移，诱导肿瘤细胞凋亡，抑制化学致癌剂诱导的染色体基因突变，以及逆转肿瘤细胞的多重耐药外(Hasegawa H et al：Planta Med.，1994，60(3)，240-243；1995，61(5)，409-413；1998，84(8)，696-700；Pharm.Res.，1997，20(6)，539-544；Wakabayashi C et al：Oncol.Res.，1997，9(8)，411-417；Biochem Biophys Res Commun.，1998，246(3)，725-730；Lee BH et al：Planta Med.，1998，64(6)，500-503；Lee SJ et al：Cancer Lett.，1999，144(1)，39-43；Biochem.Pharmacol.，2000，60(5)，677-685；Kang J et al：Reprod.Toxicol.，2002，16(3)，291-298；Choi HH et al：Int.J.Oncol.，2003，23(4)，1087-1093；Oh SH et al：Arch.Pharm.Res.，2004，27(4)，402-406；Toxicol.Appl.Pharmacol.，2004，194(3)，221-229；Lee JY et al：Carcinogenesis，2005，26(2)，359-367；Kang KA et al：Arch.Pharm.Res.，2005，28(6)，685-690；Yim HW et al：Cancer Res.，2005，65(5)，1952-1960；Jung SH et al：Int.J.Cancer，2006，118(2)，490-497；Park EJ et al：Planta Med.，2006，72(13)，1250-1253；Zhou W et al：J.Asian Nat.Prod.Res.，2006，8(6)，519-527.)，还具有抗炎、抗过敏、抗紧张和免疫调节等许多生物学活性(PopovAM et al：Dokl.Biochem.Biophys.，2001，380，309-312；Bae EA et al：Biol.Pharm.Bull.，2002，25(6)，743-747；Kim DH et al：Biol.Pharm.Bull.，2003，26(7)，1035-1038；Tachikawa E et al：Biochem.Pharmacol.，2003，66(11)，2213-2221；Kim S et al：Biochem.Biophys.Res.Commun.，2004，316(2)，348-355；Lee HU et al：Liver Int.，2005，25(5)，1069-1073；Shin YW et al：J.Pharmacol Sci.，2005.99(1)，83-88；Int.Immunopharmacol.，2005，5(7-8)，1183-1191；Park EK etal：Biol.Pharm.Bull.，2005，28(4)，652-656；Chang TC et al：J.Agric.Food Chem.，2007，55(5)，993-998；Choi K et al：Neurosci.Lett.，2007，421(1)，37-41.)，因此对它的研究越来越受到重视。
由于Compound K在天然人参、三七和西洋参中并不存在，以往国内外学者主要通过人体肠道菌代谢、其它微生物或酶转化二醇组人参皂苷单体来制备。人体肠道菌群代谢作用存在显著的个体差异，不同的种族、身体状况、饮食方式、压力和***。涉及链霉菌发酵转化各种三七皂苷中的二醇组人参皂苷、大批量制备Compound K的研究，国内外尚未见文献报道。
表1.发酵法制备Compound K的现状
| 菌株 | 底物 | 转化率％ | 参考文献 |
| Human fecal microfloraBacteroides JY-6Bifidobacterium K-506Eubacterium A-44Fusobacterium K-60 | Rc | 65.210.810.45.31.2 | Bae EA et al：Biol.Pharm.Bull.，2002，25(6)，743-747 |
| Sphingomonas echinoids GP50 | Rb1 | - | Kim MK et al：J.Microbiol.，2005，43(5)，456-462 |
| Aspergillus niger | 三七叶总皂苷 | 12.0 | 周佩等：一种制备人参皂苷Compound-K的方法。中国专利申请号：200410018000.0。公开号：CN 1570133A。 |
| Aspergillus nigerAbsidic corymbiferaYeast A8 | 人参总皂苷西洋参总皂苷三七叶总皂苷 | 8.06.8- | 韩颖等：中药研究与信息，2005，7(2)，17-19 |
| Aspergillus nigerr var.Tiegh | Rb1Rd | 59.476.1 | 杨凌等：一种黑曲霉及用其酵解人参皂苷制备稀有低极性人参皂苷的方法。中国专利号：CN02132403.4。 |
表2.酶法制备Compound K的现状
| 酶 | 底物 | 转化率％ | 参考文献 |
| 从Bifidobacterium sp.Int57提取的粗酶从Bifidobacterium sp.SJ32提取的粗酶从Aspergillus niger KCTC 6906提取的粗酶从Aspergillus usamii var.shirousamii KCTC 6956提取的粗酶 | Rb1 | 96.793.995.655.2 | Chi H et al：Biotechnol.Lett.，2005，27(11)，765-771 |
| 从Bifidobacterium sp.Int57提取的粗酶从Bifidobacterium sp.SJ32提取的粗酶从Aspergillus niger KCTC 6906提取的粗酶从Aspergillus usamii var.shirousamii KCTC 6956提取的粗酶 | Rb2 | 92.587.39.710.4 | Chi H et al：Biol Pharm.Bull.，2005，28(11)，2102-2105 |
| 从Bifidobacterium sp. Int57提取的粗酶从Bifidobacterium sp.SJ32提取的粗酶从Aspergillus niger KCTC 6906提取的粗酶从Aspergillus usamii var.shirousamii KCTC 6956提取的粗酶 | Rc | 77.060.99.752.0 | |
| 从Rhizopus nigricans提取的粗酶从Trichonderma viride提取的粗酶 | 人参总皂苷 | -- | 杨凌等：一种黑曲霉及用其酵解人参皂苷制备稀有低极性人参皂苷的方法。中国专利号：CN02132403.4。 |
| β-葡聚糖苷酶 | 三七叶总皂苷 | - | 姜彬慧等：中草药，2004，35(9)，986-988。 |
发明内容
为了简便、高效、规模化发酵制备Compound K，本发明首先提供一株由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏的弗氏链霉菌(Streptomyces fradiae NTGA-334)菌株，菌株保藏编号为CGMCCNo.2074，保藏日期为2007年6月7日。
从采自云南省文山县的三七茎梗组织中分离得到本发明所用的链霉菌菌株。该菌株通过七叶苷-柠檬酸铁培养基的筛选，反复接种于含三七皂苷的培养基，经过68代的驯化和筛选，得到能够将各种三七皂苷中的二醇组人参皂苷转化为Compound K的菌株-“NTGA-334”。经16S rDNA、形态学，细胞化学以及生理生化指标考察，将该菌株鉴定为弗氏链霉菌(Streptomyces fradiae NTGA-334)菌株(见图1)。该菌株的菌落呈圆形、白色；基内菌丝浅黄色，不规则分支，不断裂；气生菌丝上形成灰黄色孢子链，直形或螺旋形，孢子椭圆形，表面光滑。细胞壁化学组成为I型(含有L，L-2，6二氨基庚二酸)；全细胞糖组成为C型(无特征性糖)；菌株能液化明胶，牛奶胨化，水解淀粉，不产生黑色素和H2S，在ISP2培养基上分泌浅黄色水溶性色素；具有β-糖苷酶活性；能利用的碳源有：蔗糖、D-葡萄糖、L-***糖、D-木糖、L-鼠李糖以及各种三七皂苷。该菌株与弗氏链霉菌标准菌株Streptomyces.fradiaeNBRC 12215在16S rDNA上的相似度为99.83％。
在本发明弗氏链霉菌(Streptomyces fradiae NTGA-334)发酵转化各种三七皂苷、制备Compound K的工艺中，弗氏链霉菌(Streptomyces fradiae NTGA-334)菌株经过长时间的驯化培养后对营养的要求不高，可在高氏一号、ISP2、腐质酸或天门冬酰胺培养基上生长。
在本发明弗氏链霉菌(Streptomyces fradiae NTGA-334)发酵转化各种三七皂苷、制备Compound K的工艺中，各种三七皂苷投料量比例为0.1-10％(w/v)；发酵温度18-50℃，通气比0.1-10(v/v)，搅拌速率10-900r/min，发酵时间5h-120h。产物提取过程中添加0.1-30％(w/v)的Amberlite XAD-16或DH101大孔吸附树脂，10-900r/min，18-50℃处理1h～10h。
在本发明弗氏链霉菌(Streptomyces fradiae NTGA-334)发酵转化各种三七皂苷、制备Compound K的工艺中，弗氏链霉菌(Streptomyces fradiae NTGA-334)在全自动发酵罐中发酵转化各种三七皂苷产生Compound K，经过柱层析分离及有机溶剂结晶后得到Compound K的单晶，通过测定其波谱数据(表3)和X-单晶衍射，确证其结构与文献报道Compound K的结构一致(见图2)。
表3.Compound K核磁共振分析数据表(溶剂：吡啶-d5)
| No | δC(mult.)(125MHz) | δH(int.，mult.，JHH Hz)(500MHz) | No | δC(mult.)(125MHz) | δH(int.，mult.，JHH Hz)(500MHz) |
| 123456789101112131415161718 | 39.6(t)28.4(t)78.4(d)39.7(s)56.5(d)18.9(t)35.3(t)40.2(s)50.5(d)37.5(s)30.9(t)70.4(d)49.6(d)51.6(s)31.1(t)26.8(t)51.9(d)16.5(q) | 3.41(1H，dd，10.7，5.4)0.79(1H，d，11.5)3.92(1H，ddd)0.92(3H，s) | 192021222324252627282930313233343536 | 16.2(q)83.5(s)22.5(q)36.3(t)23.4(t)126.1(d)131.1(s)25.9(q)17.9(q)28.8(q)16.5(q)17.5(q)98.4(d)75.3(d)79.4(d)71.8(d)78.2(d)63.0(t) | 0.86(3H，s)1.61(3H，s)5.25(1H，t，6.7)1.21(3H，s)1.02(3H，s)0.96(3H，s)5.17(1H，d，7.8) |
Compound K的X-单晶衍射数据：Empirical formula：C36H64O8·2MeOH·H2O。Formulaweight：704.96。Crystal size：0.25×0.23×0.17mm。Colorless，at 293(2)K。Monoclinic：p2(1)，a＝11.484(2)_，b＝12.366(2)_，c＝14.060(3)_，α＝90°，β＝97.071(3)°，γ＝90°，V＝1981.5(6)_3，Z＝2，DX＝1.182Mg m-3，μ＝0.085mm-1。
本发明中采用的三七总皂苷中含Rb1 30％、Rg1 38％；三七叶总皂苷中含Rb1 5％，Rb2 30％；从三七总皂苷提取的二醇组人参皂苷中含Rb1 64％、Rg1 10.5％。
附图说明
图1是Streptomyces fradiae NTGA-334菌株16S rDNA聚类分析图及其16S rDNA序列图。图2是本发明获得的Compound K的X-单晶衍射图和平面结构图。
具体实施方式
在本发明实施例中所用的弗氏链霉菌(Streptomyces fradiae NTGA-334)发酵转化各种三七皂苷、制备Compound K的方法中，发酵步骤是：在100L全自动发酵罐中接种培养和投料5-24h后，调整通气比0.1-10(v/v)；之后根据Compound K含量的动态监测，将发酵温度调整为18-50℃，pH2-8，搅拌速率10-900r/min。产物收集步骤为：在100L全自动发酵罐中添加0.1-30％(w/v)的Amberlite XAD-16或DH101大孔吸附树脂，18-50℃、10-900r/min处理1h-10h。发酵液经过固液分离所得菌丝体和大孔吸附树脂在乙醇(95％)中超声提取1h～24h。提取液减压蒸去乙醇，经正相硅胶色谱分离，有机溶剂结晶，获得高含量的CompoundK产品。
实施例1 分离菌株：将采自云南省文山县的新鲜三七茎梗切成小段(3-4cm)，用70％的酒精浸泡0.5min，进行表面消毒，再以0.1％的氯化汞消毒8min，取出后用无菌水冲洗4～5次，接种于植物组织MS培养基，在三七茎梗切口周围首先出现直径0.1-0.5mm白色颗粒状菌丝，6d后菌丝上出现灰色粉状孢子并覆盖茎梗切口。挑取茎梗处灰色孢子于七叶苷-柠檬酸铁平板培养基，28℃培养12h后出现浅褐绿色不规则水解圈，表明该菌株具有胞外β-糖苷酶活性。将茎梗处灰色孢子接种到三七粉固体培养基中培养，待出现一定量孢子后再继续转接，直到该菌株生长速度逐渐加快且处理之后的三七粉药味消失，重量大幅度减轻；菌株随后转接到含有5％-10％(w/v)各种三七皂苷的液体培养基中进行持续驯化。经过68代驯化培养，获得能够将各种三七皂苷中的二醇组人参皂苷转化为Compound K的菌株-“NTGA-334”。该菌株被鉴定为弗氏链霉菌(Streptomyces fradiae)，已于2007年6月7日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，菌株保藏编号为CGMCC No.2074。
实施例2 将弗氏链霉菌(Streptomyces fradiae NTGA-334)从高氏1号斜面转接到含有1％(w/v)三七总皂苷的ISP2种子培养基中，28℃培养12h；然后接种到含有3000g三七总皂苷的60L腐质酸培养基中，在100L全自动发酵罐中28℃进行发酵。36h后调整提高通气比为1∶3(v/v)，搅拌速率调整为400r/min。48h后调整发酵温度至40℃，5％(w/v)氨水动态调整pH＝5.0。72h发酵结束，按3％(w/v)加入Amberlite XAD-16大孔吸附树脂，搅拌处理2h后放罐。发酵液经滤布过滤后得湿重5112g沉淀物，用30L乙醇(95％)超声提取沉淀物2h并经滤布过滤，滤渣再用1L乙醇(95％)洗涤5次。乙醇提取液经过减压浓缩干后得粗提取物1631g，通过硅胶柱层析分离，有机溶剂结晶，获得Compound K 367g(质量转化率35.2％；摩尔转化率62.7％)，HPLC检测其纯度为86.3％。
实施例3 将弗氏链霉菌(Streptomyces fradiae NTGA-334)从高氏1号斜面转接到含有1％(w/v)三七叶总皂苷的ISP2培养基中，28℃培养12h；然后接种到含有3000g三七叶总皂苷的60L腐质酸培养基中，在100L全自动发酵罐中28℃进行发酵。36h后调整提高通气比为1∶2(v/v)，搅拌速率调整为350r/min。48h后调整发酵温度至38℃，5％(w/v)氨水动态调整pH＝5.0。96h发酵结束，按4％(w/v)加入DH101大孔吸附树脂，搅拌处理4h后放罐。发酵液经滤布过滤后得湿重5909g沉淀物，用20L乙醇(95％)超声提取沉淀物3h并经滤布过滤，滤渣再用1L乙醇(95％)洗涤5次。乙醇提取液经过减压浓缩干后得粗提物1407g，通过硅胶柱层析分离，有机溶剂结晶，获得Compound K 462g(质量转化率37.5％；摩尔转化率66.8％)，HPLC检测其纯度为85.2％。
实施例4 将弗氏链霉菌(Streptomyces fradiae NTGA-334)从高氏1号斜面转接到含有1％(w/v)二醇组人参皂苷的ISP2培养基中，28℃培养12h；然后接种到含有1440g二醇组人参皂苷的60L腐质酸培养基中，在100L全自动发酵罐中28℃进行发酵。36h后调整提高通气比为1∶2，搅拌速率调整为300r/min。48h后调整发酵温度至42℃，5％(w/v)氨水动态调整pH＝5.0。60h发酵结束，按2％(w/v)加入Amberlite XAD-16大孔吸附树脂，搅拌处理1h后放罐。发酵液经滤布过滤后得湿重2623g沉淀物，用20L乙醇(95％)超声提取沉淀物1h并经滤布过滤，滤渣再用1L乙醇(95％)洗涤5次。乙醇提取液经过减压浓缩干后得粗提物845g，通过硅胶柱层析分离，有机溶剂结晶，获得Compound K 413g(质量转化率39.5％；摩尔转化率70.3％)，HPLC检测其纯度为88.1％。
本发明所用Streptomyces fradiae NTGA-334菌株的16S rDNA序列如下：
CACATGCAAGTCGAACGATGAACCACCTTCGGGTGGGGATTAGTGGCGAACGGGTGAG
TAACACGTGGGCAATCTGCCCTGCACTCTGGGACAAGCCCTGGAAACGGGGTCTAATAC
CGGATACTGACCTGCCAAGGCATCTTGGCGGGTCGAAAGCTCCGGCGGTGCAGGATGA
GCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGACGGGTAGC
CGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGG
AGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTG
AGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGAAGAAGCGAAAGTGACG
GTACCTGCAGAAGAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGG
CGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGCTTGTCGCGTCGG
TTGTGAAAGCCCGGGGCTTAACCCCGGGTCTGCAGTCGATACGGGCAGGCTAGAGTTCG
GTAGGGGAGATCGGAA
Claims (2)
1.一株由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏的弗氏链霉菌(Streptomycesfradiae NTGA-334)菌株，菌株保藏编号为CGMCC No.2074，保藏日期为2007年6月7日。
2.一种用权利要求1所述菌株在100L全自动发酵罐中发酵转化各种三七皂苷中的二醇组人参皂苷、制备20-O-β-D-吡喃葡萄糖基-20(S)-原人参二醇(人参皂苷Compound K)的工艺，其特征在于：
(1)所述培养基为高氏一号、ISP2、腐质酸(HSG培养基)或天门冬酰胺培养基；
(2)培养基中各种三七皂苷投料量比例为0.1-10％(w/v)；发酵温度18-50℃，0.1-35％(w/v)氨水动态调节pH＝2-8，通气比0.1-10(v/v)，搅拌速率10-900r/min，发酵时间5h～120h；
(3)在产物提取过程中添加0.1-30％(w/v)的Amberlite XAD-16或DH101大孔吸附树脂，10-900r/min，18-50℃处理1h～10h。发酵液经过固液分离所得菌丝体和大孔吸附树脂在乙醇(95％)中超声提取1h～24h；
(4)弗氏链霉菌(Streptomyces fradiae NTGA-334)菌株发酵转化各种三七皂苷(三七总皂苷、三七叶总皂苷、从三七总皂苷提取的二醇组人参皂苷)中的二醇组人参皂苷，得到Compound K。
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