CN103160466A - 由万能干细胞所分化的神经上皮细胞的培养方法及培养基 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种神经诱导培养基，它包含有Wnt信号激动剂（Wnt-signal agonist）、转化因子β信号抑制剂（TGFβ-signal inhibitor）及纤维母细胞生长因子信号激动剂（FGF-signal agonist）。使用该神经诱导培养基对万能干细胞进行培养，不仅可缩短万能干细胞分化为神经上皮细胞的分化时间，还可获得高纯度的神经上皮细胞而可高度表现神经标记，借此，可将该神经上皮细胞于临床上进一步分化为成熟神经细胞而应用于再生医学、筛选神经疾病药物等。
Description
技术领域
本发明涉及一种神经上皮细胞的分化方法及其使用的培养基，特别是指一种由万能干细胞所分化的神经上皮细胞的分化方法及其所使用的培养基。
背景技术
干细胞是指尚未完全分化，而具有自我更新能力，并可分化成两种以上成熟细胞的原始细胞。以分化能力将干细胞分类，可分为全能干细胞（totipotentstem cell）、万能干细胞（pluripotent stem cell）、多能干细胞（multipotent stemcell）及双能细胞（bipotent stem cell）；另依干细胞来源区分，则可分为胚胎干细胞（embryonic stem cell）、成体干细胞（somatic stem cell）及诱导型万能干细胞（induced pluripotent stem cell；iPSC）。其中，人类胚胎干细胞属于万能干细胞，来自于未着床前囊胚时期的内细胞团块，具有万能性而可分化为各种成体细胞；另外，诱导型万能干细胞则以强制表达（enforced expression）操作的方式，将特定基因或蛋白质导入已分化的体细胞，使该体细胞被重新程式化（reprogrammed）而成为类似胚胎干细胞。
由于干细胞具有细胞***、再生更新的能力，也可被诱导分化成为特定组织，因此，目前许多研究学者致力于干细胞分化的研究，希望干细胞分化成为特定细胞或是组织器官后，能够具有用于人类疾病治疗或再生医学等的用途，例如：可将分化培养的多巴胺神经元用以治疗帕金森氏症、分化后的器官用于器官损伤的病人。尤其是针对神经发育、神经损伤及神经退化性疾病、或是相关药物筛检等生物医学研究，更是需要借由经干细胞分化后的神经细胞来进行。
然而成熟的神经细胞来自于神经上皮细胞，因此，如何获得大量且高纯度的神经上皮细胞就显得非常重要。许多研究学者于胚胎干细胞分化初期利用加入纤维细胞生长因子-2（FGF2）（Li,X.J.et al.,2005；Timothy et al.,2009；Xu et al.,2005；Vallier,L.et al.,2005），以悬浮培养方式进行诱导神经分化，该种分化方法虽可获得具有类神经管表现的神经上皮细胞，然所需分化时间约需十四天以上，分化出来的细胞于贴附过程还夹杂有众多非神经细胞，需以酵素及人力操作于显微镜下将神经上皮细胞挑出，才可获得高纯度的神经细胞。另有学者于干细胞分化过程加入两种smad抑制剂（smad inhibitors）（Elkabetzet al.,2008；Lee et al.,2007；Chambers et al.,2009），包括Noggin和SB431542，用以缩短神经分化时间；也有学者利用基因操作诱导分化或是利用其他细胞共同培养诱导分化等（Pankratz et al.,2007；Chambers et al.,2009），然而上述方法虽可得到神经上皮细胞，但仍无法使大部分的胚胎干细胞分化成为神经细胞，并且具有生产成本昂贵、利用病毒进行基因操作的安全疑虑及与其他细胞共同培养的不确定因素等缺点。此外，倘若所生产的神经上皮细胞夹杂有其他非神经细胞或未分化细胞等，可能会影响后续神经的分化，且此未分化万能干细胞移植入动物体内也可能变成畸胎瘤。因此，有效率分化出高纯度并表现大部分神经标记的神经上皮细胞，未来将有助于成熟神经细胞的分化，而提升临床运用的可靠性及减少使用的危险。
发明内容
本发明的主要目的，在于提供一种将万能干细胞分化成神经上皮细胞的分化方法。
本发明的另一目的，在于提供一种神经诱导培养基，其含有Wnt信号激动剂（Wnt-signal agonist）、转化生长因子β信号抑制剂（TGFβ-signal inhibitor）及纤维母细胞生长因子信号激动剂（FGF-signal agonist），用以使干细胞得以分化出高纯度的神经上皮细胞。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种神经诱导培养基，它包含有Wnt信号激动剂（Wnt-signal agonist）、转化因子β信号抑制剂（TGFβ-signal inhibitor）及纤维母细胞生长因子信号激动剂（FGF-signal agonist）。
如上所述的神经诱导培养基，优选地，所述Wnt信号激动剂选自Wntligands和肝醣合成酶激酶-3β抑制剂（glycogen synthase kinase 3βinhibitor）如药物Bio（6-bromoindirubin-3’-oxime）中的一种或多种。
如上所述的神经诱导培养基，优选地，所述Wnt信号激动剂为浓度介于0.05μM（即0.05μmol/L，下同）至50μM间的药物Bio（6-bromoindirubin-3’-oxime）。
如上所述的神经诱导培养基，优选地，所述转化因子β信号抑制剂选自骨形态发生蛋白质抑制剂（bone morphogenetic protein inhibitor）、chordin蛋白质、noggin蛋白质、dorsomorphin蛋白质、Smad1抑制剂（Smad1 inhibitor）、Activin/Nodal受体抑制剂药物如SB431542、及Smad2/3抑制剂（Smad2/3-inhibitor）中的一种或多种。
如上所述的神经诱导培养基，优选地，所述转化因子β信号抑制剂为浓度介于1μM至100μM间的药物SB431542。
如上所述的神经诱导培养基，优选地，所述纤维母细胞生长因子信号激动剂选自纤维母细胞生长因子2（FGF2）、纤维母细胞生长因子受体的配体（ligand）、活化胞外信号调控激酶（extracellular signal-related kinases；ERK）的促进剂、活化c-jun N端蛋白质激酶（c-jun N-terminal kinase kinase；JNK）的促进剂及活化磷脂酰肌醇3激酶（phosphoinosital-3kinase；PI3K）的促进剂中的一种或多种。
如上所述的神经诱导培养基，优选地，所述纤维母细胞生长因子信号激动剂为浓度介于1ng/mL至100ng/mL间的纤维母细胞生长因子2（FGF2）。
一种如上所述的神经诱导培养基的用途，是将该培养基用于将万能干细胞培养分化成神经上皮细胞。
一种将万能干细胞分化成神经上皮细胞的分化方法，它包含有下列步骤：
步骤a：将万能干细胞悬浮培养形成类胚体（embryoid body）；
步骤b：将该类胚体培养于第一神经诱导培养基中，分化形成神经上皮细胞；
其特征在于：
所述第一神经诱导培养基选自如权利要求1至7中任意一项所述的神经诱导培养基。
如上所述的将万能干细胞分化成神经上皮细胞的分化方法，优选地，所述方法还包含有一步骤c，将所述第一神经诱导培养基更换为第二神经诱导培养基，使该被培养细胞继续分化为神经上皮细胞。
如上所述的将万能干细胞分化成神经上皮细胞的分化方法，优选地，所述第二神经诱导培养基至少由神经干细胞培养基、N2神经细胞生长添加剂、非必须胺基酸及肝素所组成。
如上所述的将万能干细胞分化成神经上皮细胞的分化方法，优选地，所述步骤a的万能干细胞为人类的胚胎干细胞株及诱导型万能干细胞中的一种或多种。
本发明的有益效果在于：
本发明提供的将万能干细胞分化成神经上皮细胞的分化方法，使用添加有Wnt信号激动剂、转化因子β信号抑制剂及纤维母细胞生长因子信号激动剂的该神经诱导培养基，不仅可缩短万能干细胞分化为神经上皮细胞的分化时间，还可获得高纯度的神经上皮细胞而可高度表现神经标记，借此，可将该神经上皮细胞于临床上进一步分化为成熟神经细胞而应用于再生医学、筛选神经疾病药物等。
附图说明
图1A至C为人类胚胎干细胞培养于无喂养细胞环境下的mTESR1培养基中的生长形态图。
图2为分化过程中加入药物Bio、药物SB431542及纤维母细胞生长因子2的第一神经诱导培养液进行悬浮培养的细胞形态图。
图3A为以显微镜倍率为100倍的显微镜下观察的细胞形态图。
图3B为以显微镜倍率为200倍的显微镜下观察的细胞形态图。
图3C为以显微镜倍率为400倍的显微镜下观察的细胞形态图。
图4A为将分化后的神经上皮细胞贴附后神经管状细胞呈现的细胞形态图。
图4B为图4A培养两天后细胞伸展的形态图。
图5A-1a及图5A-1b为神经上皮细胞以一级抗体Oct4表现的免疫荧光表现图。
图5A-2a及图5A-2b为神经上皮细胞以一级抗体Sox2表现的免疫荧光表现图。
图5A-3a及图5A-3b为神经上皮细胞以一级抗体Nanog表现的免疫荧光表现图。
图5A-4a及图5A-4b为神经上皮细胞以一级抗体Zo-1表现的免疫荧光表现图。
图5A-5为神经上皮细胞以一级抗体Nestin表现的免疫荧光表现图。
图5B-1a及图5B-1b为神经上皮细胞以一级抗体Sox1表现的免疫荧光表现图。
图5B-2a及图5B-2b为神经上皮细胞以一级抗体Pax6表现的免疫荧光表现图。
图5B-3a及图5B-3b为神经上皮细胞以一级抗体Zic1表现的免疫荧光表现图。
图5B-4a及图5B-4b为神经上皮细胞以一级抗体N-cadherin表现的免疫荧光表现图。
图5C-1及图5C-2为神经上皮细胞以一级抗体BF1表现的免疫荧光表现图。
图5D为神经上皮细胞经贴附后以一级抗体Tuj1表现神经轴突的免疫荧光表现图。
具体实施方式
本发明提供了一种将万多能干细胞分化成神经上皮细胞的分化方法，其是取一万多能干细胞而将之聚集成为类胚体，再利用包含有Wnt信号激动剂、转化生长因子β信号抑制剂及纤维母细胞生长因子信号激动剂的神经诱导培养基，作用于该万多能干细胞，使该万多能干细胞分化形成神经上皮细胞。
借由本发明所提供的将万多能干细胞分化成神经上皮细胞的分化方法及所使用的神经诱导培养基，可使超过90%的未分化万多能干细胞于一周内成功地分化形成神经上皮细胞，并可高度表达神经标记与前脑标记分子。
关于本发明专利申请所使用的名词，其核心含义如下所述，但其含义的范围并不为此所限：
万多能干细胞：包含有哺乳类动物的胚胎干细胞、经由基因或蛋白质的外来表现而形成的诱导性万多能干细胞或是其他具有分化为所有体细胞特性的万多能型细胞。于以下实施例中所使用的万多能干细胞为人类胚胎干细胞TW1（由李茂盛妇产科诊所提供；En-Hui Cheng et al,2008），如图1A至C所示，其是由人类胚胎干细胞培养于无喂养细胞（non-feeder cells）环境下的mTESR1培养基中的生长形态图。
神经标记：如Nestin、Sox1、Pax6、Zic-1和N-cadherin等基因，在神经上皮细胞内所表达，因此，通过分析该神经标记即可鉴定万多能干细胞是否已经分化形成神经上皮细胞。
前脑标记分子：如脑因子1（brain factor 1；BF1），表达于神经前脑细胞的转录因子，因此，通过分析该前脑标记分子是否表达，用以鉴定万多能干细胞是否以分化形成神经上皮细胞。
胚胎干细胞标记分子：如Oct4及nanog等转录因子，于胚肽干细胞中大量表达，因此，借由分析胚胎干细胞标记分子的表达，可用以鉴定万多能干细胞分化为神经上皮细胞的效率。
神经上皮细胞：其细胞呈球型结构，而边缘逐渐成管状紧密规则排列结构，排列如花瓣状，又称neural rossettes。
Wnt信号激动剂：可为一种肝醣合成酶激酶-3β的抑制剂，稳定β-连结蛋白质（β-catenin），包括：Wnt1、Wnt3a、肝醣合成酶激酶-3β抑制剂如药物Bio。其中，下列实施例中所使用的Wnt信号激动剂为药物Bio，其化学式为C16H10BrN3O2，结构式为
转化因子β信号抑制剂：使胚胎干细胞减少自我更新的能力，使Oct4表现量降低，包括：骨形态发生蛋白质抑制剂（bone morphogenetic proteininhibitor）、chordin蛋白质、noggin蛋白质、dorsomorphin蛋白质、Smad1抑制剂（Smad1 inhibitor）、Activin/Nodal受体抑制剂药物如SB431542，或Smad2/3抑制剂（Smad2/3-inhibitor）。其中，下列实施例中所使用的转化因子β信号抑制剂为药物SB431542，化学式为：C22-H16-N4-O3，结构式为
其为Activin/Nodal受体的抑制剂。
纤维母细胞生长因子信号激动剂：包括：纤维母细胞生长因子2（FGF2）、纤维母细胞生长因子受体的配体（ligand）、活化胞外信号调控激酶（extracellularsignal-related kinases；ERK）、活化c-jun N端蛋白质激酶（c-jun N-terminal kinasekinase；JNK）的促进剂及活化磷脂酰肌醇3激酶（phosphoinosital-3 kinase；PI3K）的促进剂，其中，下列实施例中所使用的纤维母细胞生长因子信号激动剂为纤维母细胞生长因子2，可活化细胞内Ras/Erk信号。
为了更进一步验证本发明，以下将通过若干实施例，并配合附图进行详细说明。
实施例1：使胚胎干细胞成为类胚体
取人类胚胎干细胞TW1培养于37℃、5%CO2的条件下，而后将所培养的该胚胎干细胞以小细胞团块，悬浮培养于含有20%血清替代品（knock-outreplacement serum；KSR；Invitrogen，USA）的DMEM-F12培养基中，并以37℃，5%CO2的条件，培养2天，使该胚胎干细胞聚结成为类胚体(embryoidbodies)的细胞团块。
实施例2：神经上皮细胞诱导分化期
将实施例1中该类胚体的细胞团块移至15毫升的离心管中，于室温下让细胞沉降后吸除上清液。制备第一神经诱导培养基500mL，其组成如下表一所示，并添加浓度为0.5μM（即0.5μmol/L，下同）的药物Bio、浓度为10μM的药物SB431542及浓度为10ng/mL的纤维母细胞生长因子2；需特别指出的是，该第一神经诱导培养基组成成分的个别浓度并不以上开说明者为限，具体来说，即该药物Bio浓度范围可介于0.05μM至50μM间，该药物SB431542的浓度范围则介于1μM至100μM间，而该纤维母细胞生长因子2的浓度范围则介于1ng/mL至100ng/mL间。
将细胞加入该第一神经诱导培养基中进行悬浮培养2天，使细胞分化形成神经上皮细胞，如图2所示，可知细胞呈球型结构，且边缘渐成管柱紧密规则结构。
表一第一神经诱导培养基的组成
实施例3：神经上皮细胞诱导分化期
取实施例2中的神经上皮细胞，将第一神经诱导培养基更换为第二神经诱导培养基，并再添加浓度为10ng/mL的纤维母细胞生长因子2，且于每2天更新该第二神经诱导培养基，使该神经上皮细胞继续分化，其中，该第二神经诱导培养基的成份如下表二所示。
将培养分化完成的细胞置于显微镜倍率为100、200及400倍的显微镜下观察，结果如图3及图4所示，其中，由图3A可知细胞的均一形态及球型结构周围呈紧密管柱状形态；由图3B可知细胞的球型结构，且其周围为紧密管柱状形态及其中心部分有玫瑰环状的类神经管细胞形成；由图3C可知细胞的球型结构中心部分为玫瑰环状的类神经管细胞；图4A为神经上皮细胞贴附后神经管状细胞呈现的形态；图4B为图4A培养两天后细胞伸展的形态图。因此，可由细胞形态观察分析，而可确认由实施例1至实施例3所所分化培养而成的为神经上皮细胞。
表二第二神经诱导培养基的组成
| 组成 | 含量 |
| 神经干细胞培养基(Neurobasal medium;GIBCO) | 500mL |
| N2神经细胞生长添加剂(GIBCO) | 5mL |
| 非必须胺基酸(Sigma) | 5mL |
| 肝素(1mg/mL) | 1mL |
实施例4：处理神经上皮细胞
首先，以1%基底膜基质（matrigel，Becton-Dickinson）覆盖于预先放有盖玻片的4孔盘约6小时后，移除基底膜基质，再以磷酸盐缓冲液清洗一次。而后，将实施例三中所分化的神经上皮细胞以机械力处理为较小团块细胞，接种于经上述处理的4孔盘上，于37℃、5%CO2培养一天，使该神经上皮细胞贴附并向外伸展而呈玫瑰环状的类神经管细胞形态。
实施例5：配制一级抗体及二级抗体
为了进一步验证所培养分化出的细胞为神经上皮细胞，需分别利用不同的一级抗体及二级抗体，以免疫细胞染色法进行观察。
因此，将欲使用的一级抗体配制于3%马血清并储存于4℃，反应时间为24小时；而相对应于一级抗体的二级抗体系配制于磷酸盐缓冲液，浓度为1：500，于室温避光环境下作用1小时，其中，于所使用的一级抗体、配置浓度及其相对应的二级抗体如下表三所示。
表三抗体
| 一级抗体 | 一抗宿主 | 稀释浓度 | 二级抗体 |
| Oct4 | Goat | 1:200 | Cy3,FITC |
| Sox2 | Rabbit | 500 | Cy3,FITC |
| Nanog | Rabbit | 500 | Cy3,FITC |
| Nestin | Rabbit | 1:200 | Cy3,FITC |
| Pax6 | Rabbit | 1:200 | Cy3,FITC |
| Sox1 | Goat | 1:200 | Cy3,FITC |
| Zic-1 | Rabbit | 1:200 | Cy3,FITC |
| N-cadherin | Mouse | 1:200 | Cy3,FITC |
| ZO-1 | Rabbit | 1:100 | Cy3,FITC |
| BF-1 | Rabbit | 1:100 | Cy3,FITC |
| Tuj1 | mouse | 1:500 | Cy3,FITC |
实施例6：以免疫细胞染色法鉴定神经上皮细胞
取实施例4中经处理的细胞，并移除细胞培养基，以磷酸盐缓冲液清洗。用4%三聚甲醛200μL加于细胞上，4℃作用5分钟进行细胞固定后移除，以磷酸盐缓冲液清洗。再加入0.3%萃取剂（Triton）的磷酸盐缓冲液200μL于4℃作用5~10分钟，进行细胞膜打洞后移除磷酸盐缓冲液清洗3次，每次5分钟。加入5%马血清，室温下作用1小时进行封闭（blocking），而后移除。分别加入实施例5中所配置的一级抗体，而后移除并清洗，再加入相对应的二级抗体，而后移除并清洗。
再取浓度为1μg/mL的DAPI荧光染色剂200μL加入细胞，室温避光反应10分钟，移除后进行清洗，加入磷酸盐缓冲液，进行封片。于正立式荧光显微镜下观察并以AlphaEaseFC软体计算表现量。
以显微镜观察结果如图5A至C所示，其中，图5A-1a及图5A-1b分别依序为分化第10天的神经上皮细胞以一级抗体Oct4表现的蓝色及红色免疫荧光表现图；图5A-2a及图5A-2b分别依序为分化第10天的神经上皮细胞以一级抗体Sox2表现的蓝色及红色免疫荧光表现图；图5A-3a及图5A-3b分别依序为分化第10天的神经上皮细胞以一级抗体Nanog表现的蓝色及红色免疫荧光表现图；图5A-4a及图5A-4b分别依序为分化第10天的神经上皮细胞以一级抗体Zo-1表现的蓝色及红色免疫荧光表现图；图5A-5为分化第10天的神经上皮细胞以一级抗体Zo-1表现的免疫荧光表现图；图5B-1a及图5B-1b分别依序为分化第10天的神经上皮细胞以一级抗体Sox1表现的蓝色及红色免疫荧光表现图；图5B-2a及图5B-2b分别依序为分化第10天的神经上皮细胞以一级抗体Pax6表现的蓝色及红色免疫荧光表现图；图5B-3a及图5B-3b分别依序为分化第10天的神经上皮细胞以一级抗体Zic1表现的蓝色及红色免疫荧光表现图；图5B-4a及图5B-4b分别依序为分化第10天的神经上皮细胞以一级抗体N-cadherin表现的蓝色及红色免疫荧光表现图；图5C-1及图5C-2分别依序为分化第10天的神经上皮细胞以一级抗体BF1表现的蓝色及红色免疫荧光表现图；图5D为神经上皮细胞经贴附后以一级抗体Tuj1表现神经轴突的免疫荧光表现图。而经软体分析后各基因的表现量如下表四所示可知，经培养分化10天的细胞皆能高度表现神经标记与前脑标记因子。
表四各基因的表现量
| Oct4 | nanog | Sox2 | Nestin | Zo-1 | N-cadherin | Sox1 | Pax6 | Zic-1 | BF1 |
| 6.7% | 0% | 98% | 93.3% | 98% | 98% | 87.9% | %67 | 89% | 95.6% |
因此，由图5A~D及表4的结果可知，由实施例1至3所培养分化的细胞中确实可以表现神经标记以及前脑标记因子，而降低胚胎干细胞标记分子的表现量，且确实具有神经轴突的表现，因此，由实施例1至3所培养分化的细胞的确为神经上皮细胞，并且借由该实施例1至3的培养分化方法确可获得高纯度的神经上皮细胞。
由上述各该实施例可知，本发明提供的将万多能干细胞分化成神经上皮细胞的分化方法，使用添加有Wnt信号激动剂、转化因子β信号抑制剂及纤维母细胞生长因子信号激动剂的该第一神经诱导培养基，不仅可缩短万多能干细胞分化为神经上皮细胞的分化时间，还可获得高纯度的神经上皮细胞而可高度表现神经标记，借此，可将该神经上皮细胞于临床上进一步分化为成熟神经细胞而应用于再生医学、筛选神经疾病药物等。
以上仅是借由较佳实施例详细说明本发明，对于各该实施例所做的任何简单修改或是变化，均应属于本发明保护范围之内。
Claims (12)
1.一种神经诱导培养基，其特征在于，它包含有Wnt信号激动剂、转化因子β信号抑制剂及纤维母细胞生长因子信号激动剂。
2.如权利要求1所述的神经诱导培养基，其特征在于，所述Wnt信号激动剂选自Wnt ligands和肝醣合成酶激酶-3β抑制剂中的一种或多种。
3.如权利要求1或2所述的神经诱导培养基，其特征在于，所述Wnt信号激动剂为浓度介于0.05μM至50μM间的药物Bio。
4.如权利要求1所述的神经诱导培养基，其特征在于，所述转化因子β信号抑制剂选自骨形态发生蛋白质抑制剂、chordin蛋白质、noggin蛋白质、dorsomorphin蛋白质、Smad1抑制剂、Activin/Nodal受体抑制剂药物及Smad2/3抑制剂中的一种或多种。
5.如权利要求1或4所述的神经诱导培养基，其特征在于，所述转化因子β信号抑制剂为浓度介于1μM至100μM间的药物SB431542。
6.如权利要求1所述的神经诱导培养基，其特征在于，所述纤维母细胞生长因子信号激动剂选自纤维母细胞生长因子2、纤维母细胞生长因子受体的配体、活化胞外信号调控激酶的促进剂、活化c-jun N端蛋白质激酶的促进剂及活化磷脂酰肌醇3激酶的促进剂中的一种或多种。
7.如权利要求1或6所述的神经诱导培养基，其特征在于，所述纤维母细胞生长因子信号激动剂为浓度介于1ng/mL至100ng/mL间的纤维母细胞生长因子2。
8.一种如权利要求1所述的神经诱导培养基的用途，其特征在于，其是将该培养基用于将万能干细胞培养分化成神经上皮细胞。
9.一种将万能干细胞分化成神经上皮细胞的分化方法，它包含有下列步骤：
步骤a：将万能干细胞悬浮培养形成类胚体；
步骤b：将该类胚体培养于第一神经诱导培养基中，分化形成神经上皮细胞；
其特征在于：
所述第一神经诱导培养基选自如权利要求1至7中任意一项所述的神经诱导培养基。
10.如权利要求9所述的将万能干细胞分化成神经上皮细胞的分化方法，其特征在于，所述方法还包含有一步骤c，将所述第一神经诱导培养基更换为第二神经诱导培养基，使该被培养细胞继续分化为神经上皮细胞。
11.如权利要求9所述的将多能干细胞分化成神经上皮细胞的分化方法，其特征在于，所述第二神经诱导培养基至少由神经干细胞培养基、N2神经细胞生长添加剂、非必须胺基酸及肝素所组成。
12.如权利要求9、10或11所述的将万能干细胞分化成神经上皮细胞的分化方法，其特征在于，所述步骤a的万能干细胞为人类的胚胎干细胞株及诱导型万能干细胞中的一种或多种。
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