JP5833126B2

JP5833126B2 - ウマ科動物の羊水由来の多分化能幹細胞及びそれを製造する方法

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Publication number: JP5833126B2
Application number: JP2013528119A
Authority: JP
Inventors: キュンスンカン; ミンソオソ; サンプムパク
Original assignee: KANGSTEM BIOTECH CO., LTD
Current assignee: KANGSTEM BIOTECH CO., LTD
Priority date: 2010-09-08
Filing date: 2011-09-07
Publication date: 2015-12-16
Anticipated expiration: 2031-09-07
Also published as: EP2615166A2; JP2013541329A; WO2012033352A3; KR20120026014A; EP2615166B1; EP2615166A4; US20130230924A1; WO2012033352A2; US9290739B2; KR101380561B1

Description

本発明は、ウマ科動物の羊水由来多分化能幹細胞（eAF-MSC）及びその製造方法に関するものである。より詳細には、ヒトマーカーであるCD19、CD20、CD28、CD31、CD34、CD38、CD41a、CD62L、CD62P及びCD200に対して全て陰性の免疫学的特性を示し、ヒトマーカーであるCD44、CD90及びCD105に対して全て陽性の免疫学的特性を示し、外胚葉、中胚葉又は内胚葉由来細胞に分化する能力及び未分化状態で14継代以上の培養能力を持つ、ウマ科動物の羊水由来多分化能幹細胞に関するものである。

21世紀のバイオテクノロジーは、人間の福祉を目的として食料、環境、健康上の問題に新たな解決策の可能性を提示しており、特に近年では、幹細胞の利用技術が難病治療に新たな一章として浮上してきた。これまでは難病治療のために臓器移植や遺伝子治療などが提示されてきたが、免疫拒否反応及び臓器の供給不足、遺伝子に関する知識不足などによりその実用化が充分になされなかった。

よって、幹細胞の研究に関心が高まり、増殖と分化を介してすべての器官を形成する能力を持つ万能幹細胞が、大部分の病気の治療は言うまでもなく、臓器の損傷を根本的に解決することができるものと認識されている。また、多くの科学者がほぼ全ての臓器再生は勿論のこと、難病とされてきたパーキンソン病、各種癌、糖尿病及び脊髄損傷などの治療に至るまで、幹細胞の適用の可能性を様々な形で提示してきた。

幹細胞とは自己複製能力を持ちながら、二つ以上の細胞に分化する能力を持つ細胞で、万能性幹細胞（totipotent stem cell）、多能性幹細胞（pluripotent stem cell）、多分化能幹細胞（multipotent stem cell; MSC）に分類することが出来る。

万能性幹細胞は、一つの完全な固体に発生していくことができる万能の性質を持つ細胞で、卵子と***の受精後8細胞期までの細胞がこのような性質を持ち、この細胞を分離して子宮に移植すると、一つの完全な個体に発生していくことが出来る。多能性幹細胞は、外胚葉、中胚葉、内胚葉層由来の様々な細胞や組織に発生することが出来る細胞で、受精4-5日後に現れる胚盤胞（blastocyst）の内側に位置する内細胞塊（inner cell mass）に由来し、これを胚性幹細胞といい、様々な他の組織細胞に分化はするが、新しい生命体を形成することは出来ない。

多分化能幹細胞は、成体骨髄から最初に分離され（Y. Jiang et al．、Nature、418:41、2002（非特許文献1））、その後、他のいくつかの成体の組織でも確認された（CM Verfaillie、Trends Cell Biol．、12:502、 2002（非特許文献2））。つまり、骨髄は最も広く知られている幹細胞の供給源であるが、多分化能幹細胞は、皮膚、血管、筋肉及び脳からも確認された（JG Toma et al．、Nat. Cell Biol．、3:778、2001（非特許文献3）; M ．Sampaolesi et al．、Science、301:487、2003（非特許文献4）; Y. Jiang et al．、Exp．Hematol．、30:896、2002（非特許文献5））。しかし、骨髄のような成体組織内の幹細胞は、極めて稀に存在し、これらの細胞は分化誘導せず培養するのが難しいので、特異的にスクリーニングされた培地がなければ、この細胞の培養は困難である。

ウマ科動物はウマ科（Equidae; Genus Equus）に属する哺乳類の動物で、犬や猫と共に人間と馴染み深い、極めて稀な種類の動物である。ウマ科の動物に関連する産業は競馬産業のように凡世界的な産業を形成している。競馬産業においては、優れた血統のウマが非常に高い価値を持つ。そのような優れた血統を持つ競馬用のウマが負傷した場合、その治療が問題となり細胞治療剤の開発の重要性が浮き彫りにされてきた。また、ウマの大きさを考慮すると、多くの細胞を安定的に供給することも重要な技術的課題であった。

したがって、ウマの様々な組織由来の幹細胞を分離して特性化することが幹細胞研究分野の主な課題となってきた。ヒト及びマウス由来の幹細胞は、幾通りかの従来の技術によって試みられてきたが、ウマ科動物の場合、特に競馬市場に関連して、ウマの筋肉、骨、軟骨、腱又は筋の治療のための細胞治療剤としての必要性が高いにもかかわらず、未だその研究が不十分な状況にある。

ウマ科動物の脂肪組織から幹細胞を分離するという報告があるが、（Armando de Mattos Carvalho et al．、Veterinary Immunology and Immunopathology、132:303、2009（非特許文献6））、ウマ科動物の場合は、他の哺乳類とは異なり、その特性上、脂肪組織が個体に多量に存在しないため、得ることが極めて難しいという問題があった。また、脂肪を個体から得る方法は侵襲的であり（invasive）、痛みを誘発する。ウマ科骨髄由来幹細胞の場合も骨髄獲得の方法が脂肪と同様に侵襲的な方法を用いるという点、競走馬として用いられるウマ科動物の性質上、脂肪又は骨髄由来幹細胞は、細胞の獲得において明らかに限界がある。

一方、成体幹細胞を細胞治療剤として使用するために現在の技術段階では、未分化状態が維持され得る培養条件が規格化されなければならず、それに伴い組織から分離した成体幹細胞は、多種類の細胞が混在した状態であるため、均質な成体幹細胞を多量に培養できる技術もまた解決すべき問題点の一つである。特に組織又は血液から成体幹細胞を分離する方法は、通常、多数の表面抗原に対する抗体を用いた細胞選別を例に挙げることができる。前記の方法は、成体幹細胞の表面抗原を把握しなければならないという限界があり、問題点としては成体幹細胞の共通の表面抗原（以下、マーカーとする）が明確になっておらず、また成体幹細胞のマーカーが多様に開発されていない状態であり、公知のマーカーも分化状態によって発現の程度が異なり、特に選別装置が高価であるという点で活用にあたり制約が多い。

また、羊水には成体幹細胞だけでなく、その他の単核細胞及び他の幹細胞が混合している可能性があり、このような混合した細胞培養条件では、栄養素（nutrient）の分配の程度が異なる場合があり、それによって細胞の分化状態に非均質性を引き起こす可能性がある。結局のところ、均質な細胞群に製造できないという問題は、治療剤として使用する場合、予想される効果と異なる場合があるという致命的な短所となるので、均質な成体幹細胞を多量に得られる効果的な培養技術の開発が急務となっている。

よって、本発明者らは容易に得られる新しい細胞供給源の雌馬の羊水から初めて均質性が改善された幹細胞群を分離して、他の幹細胞に比べて効果が速くて持続的な自己再生能力（成長能）、多分化能幹細胞の免疫特性及び他の細胞への優れた分化能力、特に骨細胞への分化能が顕著に優れていることを確認することによって、本発明を完成するに至った。

Y. Jiang et al．、Nature、418:41、2002 CM Verfaillie、Trends Cell Biol．、12:502、 2002 JG Toma et al．、Nat. Cell Biol．、3:778、2001 M ．Sampaolesi et al．、Science、301:487、2003 Y. Jiang et al．、Exp．Hematol．、30:896、2002 Armando de Mattos Carvalho et al．、Veterinary Immunology and Immunopathology、132:303、2009

本発明の目的は、ウマ科動物の羊水由来成体幹細胞である多分化能幹細胞を提供することである。

本発明の他の目的は、ウマ科動物の羊水由来多分化能幹細胞の製造方法を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、前記ウマ科動物の羊水由来多分化能幹細胞を、様々な細胞に分化させる方法を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、前記ウマ科動物の羊水由来多能幹細胞又はそれから分化した細胞を有効成分として含有する、細胞治療剤を提供することである。

前記の目的を達成するために、本発明は、ヒトマーカーのCD19、CD20、CD28、CD31、CD34、CD38、CD41a、CD62L、CD62P及びCD200に対して全て陰性の免疫学的特性を示し、ヒトマーカーのCD44、CD90、及びCD105に対して全て陽性の免疫学的特性を示し、外胚葉、中胚葉又は内胚葉由来細胞に分化する能力及び未分化状態で14継代以上培養される能力を持つ、ウマ科動物の羊水由来多分化能幹細胞を提供する。

本発明において、前記ウマ科動物の羊水由来多分化能幹細胞は、特に軟骨細胞、骨細胞又は脂肪細胞に分化する能力を持つことを特徴とすることができる。

本発明は、また、ウマ科動物の羊水から分離した幹細胞をEGM-2培地（Endothelial cell Growth Medium-2）で培養する第1ステップと、培養された細胞を回収する第2ステップを含み、前記と同様の特性を示し培養前の幹細胞より均質化度が改善されたウマ科動物の羊水由来多分化能幹細胞の製造方法を提供する。

本発明はまた、前記ウマ科動物の羊水由来多分化能幹細胞または該幹細胞が軟骨細胞、骨細胞、脂肪細胞、腱細胞、または筋肉細胞に分化した細胞を有効成分として含有する、細胞治療剤を提供する。

本発明によれば、ウマ科動物の羊水がウマ科動物の成体多分化能幹細胞の供給源として使用可能であることが確認され、かつ本発明によって製造されたウマ科動物の羊水由来多分化能幹細胞が優れた増殖能と分化能を示すことから、大量に必要とされるウマ科動物の細胞治療剤の有効成分として幹細胞を使用することができ、かつ特に、成長能及び分化能に優れた本発明の幹細胞は、競走馬などの骨、腱、および筋肉の損傷および欠失疾患の治療に有用である。
[本発明1001]
ウマ科動物の羊水から分離した幹細胞をEGM-2（Endothelial cell Growth Medium-2）培地で培養する第1のステップと
培養された細胞を回収する第2のステップ
を含み、
次のような特性を示しかつ培養前の幹細胞より均質度が改善されたウマ科動物の羊水由来多分化能幹細胞の製造方法：
（a）ヒトマーカーのCD19、CD20、CD28、CD31、CD34、CD38、CD41a、CD62L、CD62P及びCD200に対して全て陰性の免疫学的特性を示し、ヒトマーカーのCD44、CD90及びCD105に対して全て陽性の免疫的特性を示し、
（b）外胚葉、中胚葉又は内胚葉由来細胞に分化する能力を持ち、かつ
（c）未分化の状態で14継代以上培養される能力を持つ。
[本発明1002]
第1のステップにてウマ科動物の羊水から分離された幹細胞が、密度勾配溶液を用いて遠心分離した後、中間層である細胞層から抽出されることが特徴である、本発明1001の製造方法。
[本発明1003]
第1のステップが、ウマ科動物の羊水から分離した幹細胞をEGM-2（内皮細胞成長培地-2）培地で付着培養するのが特徴である、本発明1001の製造方法。
[本発明1004]
第1のステップにてEGM-2培地にウシ胎児血清（FBS）を添加して培養するのが特徴である、本発明1001の製造方法。
[本発明1005]
第1のステップにて培養した細胞を、DMEM（ダルベッコ変法イーグル培地）に交換して培養するステップをさらに追加することが特徴である、本発明1001の製造方法。
[本発明1006]
前記DMEM培地が、ウシ胎児血清（FBS）を含有する低グルコースDMEM培地であることが特徴である、本発明1001の製造方法。
[本発明1007]
ウマ科動物の羊水を準備する第1のステップと、
前記羊水から、ヒトマーカーのCD19、CD20、CD28、CD31、CD34、CD38、CD41a、CD62L、CD62P及びCD200に対して全て陰性の免疫学的特性を示し、ヒトマーカーのCD44、CD90及びCD105に対して全て陽性の免疫学的特性を示す多分化能幹細胞を分離する第2のステップ
を含み、次のような特性を示す均質なウマ科動物の羊水由来多分化能幹細胞の製造方法：
（a）外胚葉、中胚葉又は内胚葉由来細胞に分化する能力を持ち、かつ
（b）未分化の状態で14継代以上培養される能力を持つ。
[本発明1008]
第2のステップにて免疫学的分離が、前記ヒトマーカーに対して異なる種（species）の間でも交差反応する抗体を用いることが特徴である、本発明1007の製造方法。
[本発明1009]
次のような特性を持つウマ科動物の羊水由来多分化能幹細胞：
（a）ヒトマーカーのCD19、CD20、CD28、CD31、CD34、CD38、CD41a、CD62L、CD62P及びCD200に対して全て陰性の免疫学的特性を示し、ヒトマーカーのCD44、CD90及びCD105に対して全て陽性の免疫的特性を示し、
（b）外胚葉、中胚葉又は内胚葉由来細胞に分化する能力を持ち、かつ
（c）未分化状態で14継代以上培養される能力を持つ。
[本発明1010]
前記中胚葉由来細胞が、軟骨細胞、骨細胞、脂肪細胞、腱細胞又は筋細胞であることが特徴である、本発明1009の多分化能幹細胞。
[本発明1011]
前記ウマ科動物が、シマウマ、ウマ、ラバ、およびロバよりなる群から選択される一つであることが特徴である、本発明1009の多分化能幹細胞。
[本発明1012]
本発明1009〜1011のいずれかの多分化能幹細胞を軟骨細胞分化培地で培養することを特徴とする、多分化能幹細胞を軟骨細胞に分化させる方法。
[本発明1013]
本発明1009〜1011のいずれかの多分化能幹細胞をデキサメタゾン、β-グリセロリン酸及びアスコルビン酸-2-リン酸を含有した培地で培養することを特徴とする、多分化能幹細胞を骨細胞に分化させる方法。
[本発明1014]
本発明1009〜1011のいずれかの多分化能幹細胞をデキサメタゾン、インドメタシン、3-イソブチル-メチルキサンチン及びインスリンを含有した培地で培養することを特徴とする、多分化能幹細胞を脂肪細胞に分化させる方法。
[本発明1015]
本発明1001〜1008のいずれかの方法によって製造された多分化能幹細胞、又は本発明1009〜1011のいずれか一項に記載された多分化能幹細胞、又はこれから分化した細胞を有効成分に含有する、細胞治療剤。
[本発明1016]
ウマ科動物の骨関節炎の治療用、ウマ科動物の骨欠失疾患治療用、ウマ科動物の脂肪組織形成用、ウマ科動物の腱組織形成用及びウマ科動物の筋肉組織の形成用の、本発明1015の細胞治療剤。

分離したeAF-MSCの写真（1A、1B）及び成長曲線（1C）を示したグラフである。 eAF-MSCのフローサイトメトリー（FACs）の結果である。 eAF-MSCの軟骨細胞分化誘導のペレットの写真（3A）とトルイジンブルー染色の結果である。 eAF-MSCの骨細胞分化誘導のアリザリンレッドS染色の結果（4A、4B：対照群; 4C、4D：実験群）及び染色の結果を定量したグラフ（4E）である。 eAF-MSCの脂肪細胞分化誘導に対するオイルレッドO染色の結果（5A、5B：対照群; 5C、5D：実験群）と染色の結果を定量したグラフ（5E）である。

羊水は、羊膜嚢の中に存在する液体を意味し、胎児を保護し、外部からの刺激を和らげる働きをし、細菌感染の遮断膜となり得る役割を果たす液体である。

幹細胞は、自己複製能力を持ちながら、２個以上の細胞に分化する能力を持つ細胞をいい、成体幹細胞は、発生過程が進み、胚芽の各臓器が形成される段階、あるいは成体段階で表示される幹細胞を意味する。

本発明で使用される用語、「ウマ科動物」とは、ウマ科（Genus Equus）に属する動物を意味し、その種類としては、代表的には、シマウマ（Subgenus Hippotigris）、ウマ（Subgenus Equus）、ロバ（Subgenus Asinus）、ラバ（Subgenus Hippotigris + Asinus）が属している。

別途に定義しない限り、本明細書で使用される全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって通常理解されるものと同一の意味を持つ。一般的に、本明細書で使用されている命名法及び以下に記述する実験方法は本技術分野に公知されており、通常的に使用されるものである。

以下、本発明について詳細に説明する。

MSCは、主に不均質な細胞群（heterogeneous population）に培養される。増殖しているうちに、細胞群は、自己再生と分化能（plasticity）面で多様化する。したがって、より均質な細胞群（homogenous cell population）を分離することが必要である。

従来のウマ科動物の脂肪細胞から分離した多分化能幹細胞は、ヒトマーカーのCD13（4.27％）に対して陰性の免疫学的特性を示し、ヒトマーカーのCD44（73.68％）及びヒトマーカーのCD44、CD90（92.14 ％）に対して陽性の免疫学的特性を示すことが報告されている（Armando de Mattos Carvalho et al.、Veterinary Immunology and Immunopathology、132:303、2009）。

しかし、本発明は、ウマ科動物の羊水から分離した幹細胞をEGM-2で培養し、次にDMEMで培養した細胞に対して、特定のヒトマーカーに対する各抗体を用いてフローサイトメトリー分析した結果、ヒトマーカーのCD19、CD20、CD28、CD31、CD34、CD38、CD41a、CD62L、CD62P及びCD200には、狭い範囲（2.81％以下）の結果が確認され、並びにCD44、CD90及びCD105に対して広い範囲（95.10％以上）の結果が確認された。この結果から、従来の技術に比べて均質性の改善された幹細胞群を得ることができる方法を確認した。ここで、前記抗体は、異なる種（species）の間でも交差反応する抗体を用いた。

フローサイトメトリーに使用されるウマ科動物に特異的な抗体が多様に存在しない状況の下で、本発明は、ウマ科動物の羊水に存在する様々な種類の細胞から、ヒトマーカーのCD19、CD20、CD28、CD31、CD34、CD38、CD41a、CD62L、CD62P、CD200、CD44、CD90及びCD105のそれぞれの抗体を用いてウマ科動物の羊水由来のMSC表現型を区別することができることを確認したところに特徴がある。

また、本発明は、ヒトマーカーのCD19、CD20、CD28、CD31、CD34、CD38、CD41a、CD62L、CD62P及びCD200に対して全て陰性の免疫学的特性を示し、ヒトマーカーのCD44、CD90及びCD105について全て陽性の免疫学的特性を示す幹細胞群（population）が、ウマ科動物の羊水に存在することを確認し、このような免疫学的特徴の究明を介して特定の幹細胞群をウマ科動物の羊水から分離することができ、これらの幹細胞群は外胚葉、中胚葉又は内胚葉由来細胞に分化する能力を持つだけでなく、未分化状態で14継代以上培養される能力を持つことを確認したところに特徴がある。

ここで、ヒトマーカーのCD44は、細胞表面糖蛋白質として、MSCの移動（migration）に関与する。ヒトマーカーのCD90は、Thy-1とも呼ばれる数種類（皮膚由来幹細胞、内皮由来幹細胞、間葉系幹細胞）の幹細胞のマーカーである（Masson NM.et al.、Am.J. Phsiol.Gastrointest Liver Physiol.、Jul; 290（1）：G45-54、2006）。ヒトマーカーのCD105はエンドグリンとも知られているMSCマーカーである（Dominici M. et al.）。

一方、本発明によって製造された幹細胞群は、免疫細胞のマーカーのCD19、CD20、CD28、CD38、CD62L、CD200、内皮細胞マーカーのCD31、CD62P、血球細胞マーカーのCD34、CD45、及び血小板マーカーのCD41aに対応するウマ科動物のマーカーは発現していないので、得られた細胞は純粋な幹細胞集団であることが分かる。

本発明は、第1の観点から、ウマ科動物の羊水から分離した幹細胞をEGM-2培地（内皮細胞成長培地-2）で培養する第１ステップと;培養された細胞を回収する第２ステップを含み、次のような特性を示しかつ培養前の幹細胞より均質度が改善されたウマ科動物の羊水由来多分化能幹細胞の製造方法を提供する：
（a）ヒトマーカーのCD19、CD20、CD28、CD31、CD34、CD38、CD41a、CD62L、CD62P及びCD200に対して全て陰性の免疫学的特性を示し、ヒトマーカーのCD44、CD90及びCD105に対して全て陽性の免疫的特性を示し、
（b）外胚葉、中胚葉又は内胚葉由来細胞に分化する能力を持ち、かつ
（c）未分化状態で14継代以上培養される能力を持つ。

また、本発明は、第2の観点から、ウマ科動物の羊水を準備する第１のステップと;前記羊水からヒトマーカーのCD19、CD20、CD28、CD31、CD34、CD38、CD41a、CD62L、CD62P及びCD200について全て陰性の免疫学的特性を示し、ヒトマーカーのCD44、CD90及びCD105に対して全て陽性の免疫学的特性を示す多分化能幹細胞を分離する第２のステップを含み、次のような特性を示す均質なウマ科動物の羊水由来多分化能幹細胞の製造方法を提供する：
（a）外胚葉、中胚葉又は内胚葉由来細胞に分化する能力を持ち、かつ
（b）未分化状態で14継代以上培養される能力を持つ。

さらに、本発明は、第3の観点から、次のような特性を持つウマ科動物の羊水由来多分化能幹細胞を提供する：
（a）ヒトマーカーのCD19、CD20、CD28、CD31、CD34、CD38、CD41a、CD62L、CD62P及びCD200に対して全て陰性の免疫学的特性を示し、ヒトマーカーのCD44、CD90及びCD105に対して全て陽性の免疫的特性を示し、
（b）外胚葉、中胚葉又は内胚葉由来細胞に分化する能力を持ち、かつ
（c）未分化状態で14継代以上培養される能力を持つ。

本発明は、ウマ科動物の羊水から幹細胞の供給源を抽出するために、遠心分離を行うことができ、特に密度勾配溶液を使用して遠心分離することが望ましい。遠心分離は、特定の細胞密度に応じて分離するためのもので、ウマ科動物の羊水に対して密度勾配溶液を使用して遠心分離した後、中間層である細胞層から幹細胞の供給源を抽出することができる。さらに好ましくはFicoll-Paque密度勾配溶液を使用して遠心分離できる。最も好ましくは、密度勾配が顕著に表れるようしてバフィーコート層が明確に区別されるようにするために、ウマ科動物の羊水をPBSで1:1（v：v）の割合で希釈した後、Ficoll-Paque勾配溶液を使用して遠心分離することができる。その結果、幹細胞の供給源からその他の浸出物及び残骸を分離することができる。

一方、ウマ科動物の羊水から分離した幹細胞の供給源は、DMEM培地では、付着及び成長ができず、EGM-2培地でのみ付着培養できる。そして、EGM-2培地で付着培養した細胞は、その後DMEM（ダルベッコ変法イーグル培地）でも分化せずに培養が可能であった。

本発明で使用するEGM-2培地は、EBM培地（内皮細胞基礎培地）に内皮細胞成長培地-2 SingleQuotを添加して得ることができ、好ましくは、Lonza社（スイス）の製品を利用することができる。EGM-2培地は、血管に関連する細胞（例えば、HUVEC細胞）の培養時に使用される培地である。

EGM-2培地は、様々な成長因子（ヒト塩基性線維芽細胞成長因子; h-bFGF、血管内皮増殖因子; VEGF、長鎖R3インスリン様成長因子; R3-IGF、ヒト上皮成長因子;h-EGF）を含有し、細胞の成長を促進することができ、FBSを10〜20％の割合で豊富に含んでいることが望ましい。

また、本発明は、細胞が付着培養可能な培養皿を使用することができる。培養のため、フィブロネクチンがコーティングされた培養皿を使用することができる。

一方、DMEM培地は、数社で生産されており、販売先から容易に入手でき、当業界で一般的に使用される細胞培養培地との交換が可能である。即ちMEM、α-MEM、DMEM、基本培地(basal medium)であることができ、ウシ胎児血清(FBS)などの栄養成分を含んでいることが望ましい。また、DMEM培地は、低ブドウ糖DMEMであることが望ましい。

本発明の好ましい様態は、ウマ科動物の羊水をPBSで1:1（v：v）の割合で希釈し、その後Ficoll-Paque密度勾配溶液を使用して遠心分離した幹細胞の供給源を、一次的に20％のFBS(ウシ胎児血清)及び内皮細胞成長培地-2（EGM-2 Single Quot; Lonza社、スイス）を含有する内皮細胞の基礎培地（Endothelial cell Basal Medium）で培養し、次に10％FBS-DMEM培地（低ブドウ糖-DMEM）に培地を交換して底に届かない細胞を除去して純粋な多分化能幹細胞を得ることである。

一方、特定の細胞表面抗原的、免疫学的特徴を持つ成体幹細胞の分離は、例えば抗体処理による分離は、蛍光、磁石、ナノ粒子の検出手段を利用することができる。

前記蛍光、磁石、ナノ粒子の検出手段は、抗体に付着して、蛍光利用細胞ソーター（FACS）又は磁気活性化セルソーター(MACS)などの細胞の免疫学的特性を用いた方法で分離することができるが、これに限定されず、当該技術分野において通常の技術を有する者によって容易に選択され得る。

本発明によりウマ科動物の羊水から分離された幹細胞は、フローサイトメトリーを用いたFACS法で、この免疫学的特性を明らかにした。

ここで、得られた幹細胞溶液を収集し、遠心分離などの方法で細胞を分離し、その後直接抗体で染色する方法及び一度適切な培地で培養、増殖を行った後に抗体を染色する方法を用いることができる。

細胞の染色は、初めに表面の抗原を認識する一次抗体と目的とするサンプルを混合し、氷上で30分〜1時間インキュベーションする。一次抗体が蛍光で標識されている場合には、洗浄後に分離する。一次抗体が蛍光標識されていない場合には、洗浄後、一次抗体に対して結合活性を有する蛍光標識された二次抗体と一次抗体が反応した細胞を混合して、再度氷水で30分〜1時間インキュベーションする。洗浄後、一次抗体と二次抗体で染色された細胞を分離することができる。

本発明の一実施態様によれば、本方法によって製造されたウマ科動物の羊水由来多分化能幹細胞は、12継代に至るまでCPDL指数が徐々に増加し、優れた増殖率を持つことがわかった。また、多分化能幹細胞は、12継代後も継続的に着実に増殖が可能で、14継代まで依然として増加していることが確認された。これは、従来報告されたウマ脂肪由来多分化能幹細胞が約10継代まで培養されたものと比較して確実に増加した成長能を示すことを確認するものである。

したがって、本発明によって分離されたウマ科動物の羊水由来多分化能幹細胞は、未分化状態で少なくとも14継代以上培養されることを特徴とすることができる。

本発明において、前記のウマ科動物はシマウマ、ウマ、ラバ、およびロバで構成される群から選択される一つであることができる。

本発明は、第4の観点から、本発明による前記多分化能幹細胞を軟骨細胞分化培地で培養することを特徴とする、多分化能幹細胞を軟骨細胞に分化させる方法を提供する。一般的に公知されている軟骨細胞への分化誘導培地の組成は、トランスフォーミング増殖因子β1（TGF-β1）10ng/ml、L-アスコルビン酸-2-リン酸塩50uM、インスリン6.25 ug / mlである。

また、本発明は、第5の観点から、本発明による前記多分化能幹細胞をデキサメタゾン、β‐グリセロリン酸及びアスコルビン酸-2-リン酸塩を含有した培地で培養することを特徴とする、多分化能幹細胞を骨細胞に分化させる方法を提供する。

本発明は、第6の観点から、本発明による前記多分化能幹細胞をデキサメタゾン、インドメタシン、3-イソブチル-メチルキサンチンとインスリンを含有した培地で培養することを特徴とする、多分化能幹細胞を脂肪細胞に分化させる方法を提供する。

本発明の一実施態様によれば、前記ウマ科動物の羊水由来多分化能幹細胞は、適切な誘導培地で培養する場合には、それぞれ中胚葉由来の細胞である軟骨細胞（chondrocyte）、骨細胞（osteocyte）又は脂肪細胞（adipocyte）に優れた効率で分化が可能であることを確認した。したがって、適切な刺激が与えられる場合、中胚葉由来の細胞である腱細胞（tenocyte）、筋細胞（myocyte）に優れた効率で分化が可能であることは当業者にとって自明のことであろう。一方、本発明の多分化能幹細胞の場合、表面抗原や自己再生能力、形態で幹細胞の特徴を示しており、適切な刺激が与えられる場合、外胚葉または内胚葉由来の細胞に分化できることは、当業者には自明であろう。

また、本発明の一実施態様では、上記の多分化能幹細胞を骨細胞に分化するように誘導する10％FBS、0.1μMデキサメタゾン、10 mM β-グリセロリン酸、50μMアスコルビン酸-2-リン酸塩を含むDMEM培地に培養する場合、一般的な培養培地で培養した対照群に比べて分化する程度を定量した値が13倍高いことを確認し、骨細胞への分化能力が非常に優れていることを確認した。

本発明は、第7の観点から、本発明による多分化能幹細胞又はこれから分化した細胞を有効成分として含有する、細胞治療剤を提供する。

軟骨細胞に分化することができる本発明による多分化能幹細胞又はこれから分化した軟骨細胞はウマ科動物の骨関節炎の治療用細胞治療剤の有効成分として用いることができる。

骨細胞に分化することができる本発明による多分化能幹細胞又はこれから分化した骨細胞は、ウマ科動物の骨欠失疾患治療用の細胞治療剤の有効成分として用いることができる。また、ウマ科動物の骨損傷治療用の細胞治療剤としても並行して使用が可能であることは当業者には自明であろう。

脂肪細胞に分化することができる本発明による多分化能幹細胞又はこれから分化した脂肪細胞は、ウマ科動物の脂肪組織形成用細胞治療剤の有効成分として用いることができる。

腱細胞に分化することができる本発明による多分化能幹細胞又はこれから分化した腱細胞は、ウマ科動物の腱組織形成用細胞治療剤の有効成分として用いることができる。

筋細胞に分化することができる本発明による多分化能幹細胞又はこれから分化した筋細胞は、ウマ科動物の筋肉組織の形成用細胞治療剤の有効成分として用いることができる。

前記で調べたように、本発明による多分化能幹細胞は、骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、腱細胞、筋細胞などの中胚葉由来細胞に分化する能力に優れているので、本発明による多分化能幹細胞又は、それから分化した細胞を有効成分として含有する細胞治療剤の効能が優れていることも、当業者には自明であろう。また、本発明による多分化能幹細胞又はそれから分化した細胞は、その由来がウマ科動物の羊水であり、他の動物由来の幹細胞又はそれから分化した細胞に比べて拒否反応が少ないことが明らかであり、ウマ科動物の細胞治療剤に特に有用に用いることができる。

以下、実施例を通じて本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は本発明をより具体的に説明するためのもので、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されるものではないことは、当業者には自明であろう。

eAF-MSC（ウマ科動物の羊水由来多分化能幹細胞）の収得
1-1：ウマの羊水収集
ウマの羊水は韓国所在の馬舎にある馬小屋で、サラブレッドの雌馬（thoroughbred mares）が分娩した際に獲得した。分娩時の雌馬は非常に鋭敏で、胎盤を包んでいる皮膚は雌馬が容易に破裂させることが出来るので、雌馬を刺激しないように慎重に羊水を採取した。採取した全ての羊水は、皮膚の破裂前に30mlの注射器、18-ゲージの注射針で収集した。汚染を防ぐために、注射器、手袋を使用し、全ての手順は迅速に行われた。サンプルは12時間の間、摂氏4度を維持して研究室に移した。平均的に得られた羊水の量は約30mlであった。

1-2：単核細胞の分離
MSCは、単核細胞から分離されることが従来の研究で知られており、（Colter DC et al.、Proc.Natl.Acad.Sci.USA.97（7）:3213-8、2000）単核細胞（MNC）は、次のような方法で分離した。初めに、明確なバフィーコート層を得るために、ウマの羊水にリン酸緩衝塩類溶液（PBS）を1:1（v：v）の割合で補充して希釈した。希釈されたサンプルをFicoll-Paque密度勾配溶液（GE Healthcare社、米国）を用いて、2500rpmで20分間遠心分離した。単核細胞を得た後、血球及び血小板を除去するためにPBSで数回洗浄して単核細胞を分離した。

1-3：単核細胞の培養とMSCの収得
実施例１−２による単核細胞をフィブロネクチンでコーティングされた100mm培養皿（Nunc社、米国）に分注して5％CO₂、37℃の条件で培養した。フィブロネクチンは、細胞がプレートによく付着できるように使用した。培養培地は、20％FBS（ウシ胎児血清、Gibco-BRL、米国）及び内皮細胞成長培地-2 SingleQuot（EGM-2 Single Quot; Lonza社、スイス）を含有する内皮細胞の基礎培地（Endothelial cell Basal Medium; EBM 、Lonza社、スイス）を使用した。基礎培地に含有されている数種類の成長因子（ヒト塩基性線維芽細胞成長因子; h-bFGF、血管内皮増殖因子; VEGF、長鎖R3インスリン様成長因子; R3-IGF、ヒト上皮成長因子;h-EGF）は、初期の細胞の成長を促進させる役割を果たした。

7日後、10％FBS成長培地（低ブドウ糖ダルベッコ変法イーグル培地、低グルコース-DMEM、Gibco-BRL社、米国）に培地を交換した。底につかない細胞及び浮遊物を除去してMSCを得た。底に付着した細胞だけが皿に残り、その形態を観察した。成長培地は、付着細胞が70〜80％の培養密度に到達するまで2週間に1回交換した。

その結果、図１A及びBに示すように、細胞の成長する形状はスピンドルの型であり、これはBM-MSC（骨髄間葉系幹細胞）や、UCB-MSC（臍帯血間葉系幹細胞）の形状と類似していたことが観察され、これによってeAF-MSCを得た。

eAF-MSCの継代数の観測を介した自己再生能力の検証
多分化能幹細胞（MSC）を始めとする幹細胞は、自己再生能力があり、多くの場合、自己再生能力は胚性幹細胞（ESC）、造血幹細胞（HSC）、癌幹細胞（CC）のような継続的で安定した増殖率と関連している（Reya T. et al.、Nature、Nov 1、414（6859）:105-11、2001）。したがって、eAF-MSCの成長効率と増殖の潜在性を測定するために、実施例1-3で得られた幹細胞のCPDL（累積集団倍加数）の値を測定した。

CPDLは、細胞の増殖率を示す指数として、
次のような式で表される。
CPDL = ln（Nf / Ni）/ ln2
（Ni：初期に分注した細胞数、Nf：最終細胞数）

実施例1-3により得られた細胞を6ウェル培養プレート（Nunc）に5 x 10⁴個分注し、5〜7日後に継代培養した。最終細胞数を数え、5 x 10⁴個を再度分注した。CPDLを得るために、各継代別に計算した後、その前継代の値に加えた。増殖率の減少が観察されるまで継代培養した。

その結果、図1Cに表されるように、CPDL曲線はeAF-MSCが14継代まで育っていることを示している。12継代からCPDL指数は減少し始めていることが確認できる。しかし14継代の増殖レベルがその前の継代細胞よりも低いものの、依然として増加しており、12継代まではCPDL指数の減少がないことを観察したが、このような結果は、eAF-MSCが、自己再生能があることを示唆するものである。

フローサイトメトリー分析によるeAF-MSCの免疫表現型特性を確認
一般的に、ヒトMSCは区別される表面抗原マーカーを示す。細胞治療国際協会（International Society of Cellular Therapy）によると、一般的にヒトMSCはヒトマーカーのCD73、CD44、CD90及びCD105に陽性発現を示し、ヒトマーカーのCD11b、CD14、CD18、CD79a、CD34、CD45、及びHLA-DRに陰性発現を示す（Dominici M. et al.、Cytoherapy、8（4）:315-7、2006）。したがって、eAF-MSCに対してフローサイトメトリー分析をして、免疫表現型を調べるために以下の実験を行った。

実施例1-3によって得られた5継代のeAF-MSCについて、フローサイトメトリーに使用されるウマ科動物に特異的な抗体が多様に存在しないので、ヒトマーカーである13枚のCDマーカー（CD19、CD20、CD28、CD31、CD34、CD38、CD41a、CD62L、CD62P、CD200、CD44、CD90及びCD105）のフローサイトメトリー分析を行った。

細胞をBD Biosciences社（米国）のプロトコルに従って染色した。つまり、eAF-MSCをPBSで2回洗浄し、その後0.25％トリプシン / EDTAを用いて得た。それぞれのグループに応じて分け、分けられたグループは、約1 x 10⁵個の細胞を含有した。マウス抗ヒトCD19、マウス抗ヒトCD20、マウス抗ヒトCD28、マウス抗ヒトCD31、マウス抗ヒトCD34、マウス抗ヒトCD38、マウス抗ヒトCD41a、マウス抗ヒトCD44、マウス抗ヒトCD62L、マウス抗ヒトCD62P、マウス抗ヒトCD200、マウス抗ヒトCD90はBD Biosciences社の製品を、マウス抗ヒトCD105はSerotec社（米国）製品を用いて表面抗原の検出を行った。全ての抗体はFITC（フルオレセインイソチオシアネート）又はPE（フィコエリトリン）と結合させた。

細胞を4℃で30分間染色した。抗体との結合が終わった後、細胞をPBSで洗浄し、500μlのPBSに再度浮遊させた。分析は、FACS Calibur（商標）（BD Biosciences社）の機器およびCell Quest Pro（商標）（BD Biosciences社）のソフトウェアを使用して行った。

その結果、図2及び表1に示されるように、間葉系幹細胞と類似した発現パターンが観察された。CD44、CD90、及びCD105は、陽性発現パターンを示した。この結果によってeAF-MSCが幹細胞であることが確認された。

その一方で、免疫細胞マーカーのCD19、CD20、CD28、CD38、CD62L、CD200、内皮細胞マーカーのCD31、CD62P、血球細胞マーカーのCD34及び血小板マーカーのCD41aは発現されなかった。この結果により、eAF-MSCが典型的なMSCの免疫表現型を示す純粋な幹細胞の集団であるということを確認した。

（表１）eAF-MSCのフローサイトメトリー分析

eAF-MSCの三血球系（Trilineage）分化の分析を介した分化能の検証
eAF-MSCの特性を検証するために、三血球系分化の分析を行った。一般的にMSCは生体外(in vitro)で軟骨細胞、骨細胞及び脂肪細胞に分化することができる。したがって、eAF-MSCの分化が可能か否かを検証するために、それぞれの系統に合った培地で培養した。

4-1：軟骨細胞への分化が可能か否かについて
軟骨細胞への分化が可能か否かを調べるために、実施例1-3の方法で得られたeAF-MSCを15ml ポリプロピレン・チューブに分注して、遠心分離しペレットにした。ペレットは外観が白く透明であるが、そのペレットを37℃、5％二酸化炭素の条件下でインキュベーターにおいて1mlの軟骨細胞分化誘導培地（Lonza社、Wakersville社、MD社、米国）で培養した（実験群）。3日毎に培地を交換して3週間培養した。また、対照群として軟骨細胞の分化誘導培地の代わりに、成長培地を用いて同様の条件で培養した。

また、実験群ペレットの内部構造を確認するために、実験群ペレットを3μmサイズに切り出し、脱パラフィンされたスライドに処理した。その後蒸留水で水和し、軟骨組織形態を調べるため、主に使用されるトルイジンブルー（塩化トロニウム）で1分間処理して染色分析した。過度染色は、蒸留水で数回洗浄しその後乾燥した。スライドはキシレンできれいにし、カナダバルサム(Canada balsam)とカバースリップで覆った。

その結果、図3Aに示されるように時間の経過に伴い実験群ペレットは凝集し、チューブの下に丸い形の構造を形成することが確認された。しかし、対照群ペレットは凝集せず、全ての細胞は培地を交換する毎に浮遊した。したがって、対照群の細胞は、軟骨細胞への分化が起こらないことが確認された。

また、図3Bに示されるように、実験群ペレットはトルイジンブルー染色に陽性反応を示し、ペレットの形状もまた一般的な軟骨組織と類似していることが確認された。丸い形の構造を形成したペレットは、ピペット操作やボルテックスミキサーによっても凝集が解けなかった。これにより本発明のウマ科動物の羊水由来幹細胞が正常に軟骨細胞に分化したことが確認された。

4-2：骨細胞への分化が可能か否かについて
骨細胞への分化が可能か否かを調べるために、実施例1-3で得られたeAF-MSCを骨細胞分化誘導培地で培養した。また、対照群として骨細胞分化誘導培地の代わりに、成長培地を用いて同様の条件で培養した。3日ごとに培地を交換して２週間培養した。

骨細胞への分化（骨形成）の場合、1 x 10⁵個の細胞を6ウェルプレートに分注して、70〜80％培養密度を示すまで培養し、その後骨細胞分化誘導培地に処理した（10％FBS、0.1μMデキサメタゾン、10 mM β-グリセロリン酸、50μMアスコルビン酸-2-リン酸塩を含むDMEM培地; Sigma-Aldrich社、米国）。対照群は、FBSのみを含むDMEM培地を使用した。

1週間に2回培地を交換しながら2週間培養した後、骨細胞への分化はカルシウム堆積を測定するために、アリザリンレッドS染色を介して測定した。細胞をPBSで洗浄し、70％氷冷エタノールで1時間固定した。その後、蒸留水で3回洗浄した後、40mMのアリザリン・レッドS（pH 4.2; Sigma-Aldrich社）を使用して、常温で10分間染色した。

定量するために、蒸留水で5回洗浄した後、1時間の間100mMの塩化セチルピリジニウム（Sigma-Aldrich社）を使用してアリザリン・レッドS染色を可溶化させた。可溶化したアリザリン・レッドS染色はスペクトロフォトメーターを用いて570nmで発現を観察した。

その結果、図4Aないし4Dに示されるように、アリザリン・レッドS染色によるカルシウム堆積を確認することができた。図4C及び4Dに示されるように、骨細胞分化誘導培地で培養した細胞は、アリザリン・レッドS染色に陽性反応を示した。しかし、図4A及び4Bに示されるように、対照群の細胞は染色されないことが確認された。また、図4Eに示されるように、塩化セチルピリジニウム（Sigma-Aldrich）を使用して定量化を試みた結果、対照群に比べて骨細胞分化誘導培地で培養した細胞は、13倍以上の高い値を示した。これにより本発明によるウマの羊水由来幹細胞が正常に骨細胞に分化したことが確認された。

4-3：脂肪細胞への分化が可能か否かについて
脂肪細胞への分化（脂肪生成）の場合、1 x 10⁵個の細胞を6ウェルプレートに分注して、90〜100％の培養密度を示すまで培養した後、脂肪細胞分化誘導培地（低グルコース、10％FBS、100nMデキサメタゾン、10μg/mlのインスリン、0.5 mM 3-イソブチル-1-メチルキサンチン、0.2 mMインドメタシンの条件を持つDMEM培地）で培養した。

3日に1回培地を交換しながら、2週間培養した後、脂肪滴検出は、脂溶性の染料であるオイルレッドO染色を介して検出した。光学密度は500nmで測定し、写真を撮った。詳細には、約1時間の間10％ホルマリンで固定した後、60％イソプロパノールを使用して溶かして分離した。その後、オイルレッドO染色を10分間行った。

過度染色されたものは5回水で洗浄して除去し、1時間の間100％イソプロパノールを使用して、オイルレッドO染色を可溶化させた。可溶化したオイルレッドO染色はスペクトロフォトメーターを用いて500nmで発現を観察した。

その結果、図5Aないし5Dに示されるように、対照群では脂肪滴を示していないが、脂肪細胞分化誘導培地で培養された細胞は、1週間後に脂肪滴を形成した。図5C及び5Dに示されるように、脂肪細胞分化誘導培地で培養された細胞は2週間後にオイルレッドO染色に陽性反応を示した。図5Dに黒矢印で示されているような脂肪滴を明確に確認することができた。

また、図5Eに示されるように、イソプロパノールに定量化した結果、対照群に比べて脂肪細胞分化誘導培地で培養した細胞は、さらに5倍高い値を示した。これにより、本発明のウマの羊水由来幹細胞が正常に脂肪細胞へ分化したことが確認された。したがって、実施例4において、本発明によるウマの羊水由来幹細胞が中胚葉由来の細胞に分化可能であることが確認され、その分化の程度が優れていることを確認した。

以上、本発明の内容の特定の部分を詳細に記述したとおり、当技術分野における当業者にとって、これらの具体的な技術は単に好ましい実施様態であり、これにより本発明の範囲が制限されることがない点を明確にするものである。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付の特許請求の範囲とそれらの等価物によって定義されるであろう。

Claims

ウマ科動物の羊水から分離した幹細胞をEGM-2（Endothelial cell Growth Medium-2）培地で培養する第1のステップと
第1のステップで培養した細胞をDMEM（ダルベッコ変法イーグル培地）で培養する第2のステップと、
培養された細胞を回収する第3のステップ
を含み、
次のような特性を示しかつ培養前の幹細胞より均質度が改善されたウマ科動物の羊水由来多分化能幹細胞の製造方法：
（a）ヒトマーカーのCD19、CD20、CD28、CD31、CD34、CD38、CD41a、CD62L、CD62P及びCD200に対して全て陰性の免疫学的特性を示し、ヒトマーカーのCD44、CD90及びCD105に対して全て陽性の免疫的特性を示し、
（b）中胚葉由来細胞に分化する能力を持ち、かつ
（c）未分化の状態で14継代以上培養される能力を持つ。
第1のステップにてウマ科動物の羊水から分離された幹細胞が、密度勾配溶液を用いて遠心分離した後、中間層である細胞層から抽出されることが特徴である、請求項1に記載の製造方法。
第1のステップが、ウマ科動物の羊水から分離した幹細胞をEGM-2（内皮細胞成長培地-2）培地で付着培養するのが特徴である、請求項1に記載の製造方法。
第１のステップにてEGM-2培地にウシ胎児血清（FBS）を添加して培養するのが特徴である、請求項１に記載の製造方法。
前記DMEM培地が、ウシ胎児血清（FBS）を含有する低グルコースDMEM培地であることが特徴である、請求項1に記載の製造方法。
ウマ科動物の羊水を準備する第1のステップと、
前記羊水から、ヒトマーカーのCD19、CD20、CD28、CD31、CD34、CD38、CD41a、CD62L、CD62P及びCD200に対して全て陰性の免疫学的特性を示し、ヒトマーカーのCD44、CD90及びCD105に対して全て陽性の免疫学的特性を示す多分化能幹細胞を、異なる種の間で交差反応を示す前記ヒトマーカーに対する抗体を用いて分離する第2のステップ
を含み、次のような特性を示す均質なウマ科動物の羊水由来多分化能幹細胞の製造方法：
（a）中胚葉由来細胞に分化する能力を持ち、かつ
（b）未分化の状態で14継代以上培養される能力を持つ。