CN103119442A - 抗体和免疫偶联物的免疫peg成像及其用途 - Google Patents

抗体和免疫偶联物的免疫peg成像及其用途 Download PDF

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M.丹尼斯
J.马里克
P.波拉基斯
B.鲁宾菲尔德
S.威廉斯
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Abstract

提供了抗STEAP-1抗体及其免疫偶联物。提供了使用抗STEAP-1抗体及其免疫偶联物的方法。提供了检测和测定STEAP-1蛋白的存在的方法。

Description

抗体和免疫偶联物的免疫PEG成像及其用途
相关申请
本申请要求2010年6月3日提交的美国临时专利申请流水号61/351,195的权益，通过述及将该申请完整收入本文。
发明领域
本发明涉及抗STEAP-1抗体及其免疫偶联物。本发明进一步涉及使用抗STEAP-1抗体及其免疫偶联物的方法。
发明背景
就人类而言，***癌是男性当中最常被诊断的恶性肿瘤之一，并且是男性中与癌症相关的第二大死因。据美国癌症协会估计，2000年将会有180,400例***癌新增病例被确诊，其中31,900例死于该病。在疾病的晚期阶段，***癌向骨骼转移。尽管在局部受限制肿瘤的早期诊断和治疗上已经有所进展，但***癌一旦转移了还是无法治愈的。接受激素疗法的转移性***癌患者最终将形成雄激素不应的（不受雄激素控制的(androgenindependent)）状态，这将导致疾病进展和死亡。目前，***特异性抗原（PSA）是最广泛使用的，筛查、诊断和监测***癌的肿瘤标记物。然而，将PSA广泛用作筛查工具是有争议的，因为PSA不能准确区分良性和恶性***疾病。
根据癌症的阶段而定，***癌和膀胱癌的治疗涉及以下疗法之一或组合：手术去除癌性组织、放射疗法、化疗、在***癌情况下的雄激素剥夺（例如，激素疗法）。尽管手术或放射疗法显著改善了该病早期患者的存活，但是对于晚期病例而言治疗选择还是非常有限的，特别是对于激素消除后的肿瘤复发而言。大多数经历激素疗法的患者进展形成不受雄激素控制的疾病。目前，对于20-40%手术或放射疗法后形成疾病复发的***癌患者，或对于那些在诊断时癌症已转移的***患者而言没有有效的治疗方法。化疗具有毒副作用，尤其是对于上了年纪的患者而言。开发新的治疗形式（尤其是针对雄激素剥夺不应的疾病）是应对***癌所急需的。
已记载了新的细胞表面抗原STEAP-1的鉴定（参见美国专利No.6,329,503）。STEAP-1是细胞表面蛇形(serpentine)跨膜抗原的成员。它在***癌中优势表达，因此该家族成员已被称为“STEAP”（***的6次跨膜上皮抗原，Six Transmembrane Epithelial Antigens of the Prostate）。人的STEAP蛋白在家族内展示出高度的结构保守但未显示出与任何已知的人类蛋白质有显著的结构同源性。STEAP-1表现为在正常人组织中优势表达于***细胞中的IIIa型膜蛋白。在结构上，STEAP-1是339个氨基酸的蛋白质，其特征在于6个跨膜结构域和胞内N-和C-末端的分子拓扑，提示它以“蛇形”方式折叠成三个胞外和两个胞内环。STEAP-1蛋白质表达在各种状态的***癌中都保持高水平。STEAP-1在其它人类癌症诸如肺癌和结肠癌中高度过表达。已制备出针对人STEAP-1片段的鼠抗体，而且这些抗体显示出结合细胞表面上的STEAP-1（参见美国专利申请No.20040253232A1）。
基于抗体的疗法已被证明在各种癌症的治疗中是非常有效的。例如，
Figure BDA00002807843500021
（两者均来自Genentech,S.San Francisco）已成功地分别用于治疗乳腺癌和非何杰金氏淋巴瘤。是重组DNA衍生的人源化单克隆抗体，它选择性地结合人表皮生长因子受体2(HER2)原癌基因的胞外结构域。在25-30%的原发性乳腺癌中观察到了HER2蛋白质过表达。
Figure BDA00002807843500023
是针对在正常和恶性B淋巴细胞表面上发现的CD20抗原的遗传工程嵌合鼠/人单克隆抗体。这两种抗体均在CHO细胞中生产。
抗体-药物偶联物用于局部投递细胞毒剂或细胞抑制剂（即在癌症治疗中杀死或抑制肿瘤细胞的药物）的应用(Syrigos和Epenetos(1999)AnticancerResearch19:605-614;Niculescu-Duvaz和Springer(1997)Adv.Drg Del.Rev.26:151-172;美国专利4975278)）容许将药物模块靶向投递至肿瘤并在其中进行胞内蓄积，而***施用这些未偶联的药物可导致在试图消除肿瘤细胞的同时也对正常细胞产生了不可接受的毒性水平(Baldwin等(1986)Lancet pp.(Mar.15,1986):603-05;Thorpe,(1985)"Antibody Carriers Of Cytotoxic AgentsIn Cancer Therapy:A Review",于Monoclonal Antibodies'84:Biological AndClinical Applications,A.Pinchera等编,pp.475-506)。由此寻求最高的功效与最低的毒性。已经报道多克隆抗体和单克隆抗体在这些策略中都是有用的(Rowland等(1986)Cancer Immunol.Immunother.,21:183-87)。用于这些方法的药物包括柔红霉素、多柔比星、甲氨蝶呤和长春地辛(Rowland等,CancerImmunol.Immunother.21:183-87(1986))。用于抗体-毒素偶联物的毒素包括细菌毒素（诸如白喉毒素）、植物毒素（诸如蓖麻毒蛋白）、小分子毒素（诸如格尔德霉素）(Kerr等(1997)Bioconjugate Chem.8(6):781-784;Mandler等(2000)Journal of the Nat.Cancer Inst.92(19):1573-1581;Mandler等(2000)Bioorganic&Med.Chem.Letters10:1025-1028;Mandler等(2002)Bioconjugate Chem.13:786-791)、美登木素生物碱(EP1391213;Liu等(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA93:8618-8623)和加利车霉素(Lode等(1998)CancerRes.58:2928;Hinman等(1993)Cancer Res.53:3336-3342)。毒素可以通过包括微管蛋白结合、DNA结合或拓扑异构酶抑制在内的机制实现其细胞毒性和细胞抑制性效果(Meyer,D.L.和Senter,P.D.,“Recent Advances in AntibodyDrug Conjugates for Cancer Therapy”,于Annual Reports in MedicinalChemistry,卷38(2003)章23,页229-237)。有些细胞毒性药物在偶联至大的抗体或蛋白质受体配体时趋于失活或活性降低。
Figure BDA00002807843500031
(ibritumomab tiuxetan,Biogen/Idec)是由针对在正常和恶性B淋巴细胞表面上发现的CD20抗原的鼠IgG1κ单克隆抗体与111In或90Y放射性同位素通过硫脲接头-螯合剂相结合而构成的抗体-放射性同位素偶联物(Wiseman等(2000)Eur.Jour.Nucl.Med.27(7):766-77;Wiseman等(2002)Blood99(12):4336-42;Witzig等(2002)J.Clin.Oncol.20(10):2453-63;Witzig等(2002)J.Clin.Oncol.20(15):3262-69)。尽管ZEVALIN具有针对B细胞非何杰金氏淋巴瘤(NHL)的活性，然而施药在大多数患者中导致严重且持久的血细胞减少。MYLOTARGTM(gemtuzumab ozogamicin,Wyeth Pharmaceuticals)（由hu CD33抗体与加利车霉素连接而构成的抗体-药物偶联物）在2000年批准用于经注射治疗急性骨髓性白血病(Drugs of the Future(2000)25(7):686;美国专利No.4,970,198;5,079,233;5,585,089;5,606,040;5,693,762;5,739,116;5,767,285;5,773,001)。Cantuzumab mertansine(Immunogen,Inc.)（由huC242抗体与美登木素生物碱药物模块DM1经二硫化物接头SPP连接而构成的抗体-药物偶联物）正开发用于治疗表达CanAg抗原的癌症，诸如结肠癌、胰腺癌、胃癌和其它癌。MLN-2704(Millennium Pharm.,BZL Biologics,ImmunogenInc.)（由抗***特异膜抗原(PSMA)单克隆抗体与美登木素生物碱药物模块DM1连接而构成的抗体-药物偶联物）正在开发用于***肿瘤的潜在治疗。相同的美登木素生物碱药物模块DM1经非二硫化物接头SMCC与小鼠鼠单克隆抗体TA.1连接(Chari等(1992)Cancer Research52:127-131)。据报道，该偶联物的效力比相应的二硫化物接头偶联物的效力低200倍。其中认为SMCC接头是“不可切割的”。
已经从海洋软体动物耳状截尾海兔（Dolabella auricularia）中分离出数种短肽化合物，并发现它们具有生物学活性(Pettit等(1993)Tetrahedron49:9151;Nakamura等(1995)Tetrahedron Letters36:5059-5062;Sone等(1995)Journal Org Chem.60:4474)。还制备出这些化合物的类似物，并且发现有些具有生物学活性(对于综述,参见Pettit等(1998)Anti-Cancer Drug Design13:243-277)。例如，auristatin E(US5635483)是海洋天然产物多拉司他汀10（一种通过结合至微管蛋白上与抗癌药长春新碱(G.R.Pettit(1997)Prog.Chem.Org.Nat.Prod.70:1-79)相同的位点来抑制微管蛋白聚合的药剂）的合成类似物。多拉司他汀10、auristatin PE和auristatin E是具有四个氨基酸（其中三个对于多拉司他汀类化合物是独特的）和C末端酰胺的线性肽。
将auristatin肽，auristain E(AE)和单甲基auristatin(MMAE)，多拉司他汀的合成类似物偶联至：(i)嵌合单克隆抗体cBR96（对癌瘤上的Lewis Y特异性的）；(ii)对血液学恶性肿瘤上的CD30特异性的cAC10(Klussman等(2004),Bioconjugate Chemistry15(4):765-773;Doronina等(2003)NatureBiotechnology21(7):778-784;“Monomethylvaline Compounds Capable ofConjugation to Ligands”;Francisco等(2003)Blood102(4):1458-1465;US2004/0018194)；(iii)抗CD20抗体，诸如（利妥昔单抗）(WO04/032828)，用于治疗表达CD20的癌症和免疫病症；(iv)抗EphB2抗体2H9和抗IL-8，用于治疗结肠直肠癌(Mao等(2004)Cancer Research64(3):781-788)；(v)E-选择蛋白抗体(Bhaskar等(2003)Cancer Res.63:6387-6394)；和(vi)其它抗CD30抗体(WO03/043583)。还已经将单甲基auristatin(MMAE)偶联至2H9，即一种针对EphB2R的抗体，EphB2R是小鼠和人之间具有密切同源性的1型TM酪氨酸激酶受体，而且在结肠直肠癌细胞中过表达(Mao等(2004)Cancer Res.64:781-788)。
已经报道单甲基auristatin MMAF（一种在C末端具有苯丙氨酸的auristatin E(MMAE)变体）(US5767237;US6124431)具有比MMAE低的效力，但在偶联至单克隆抗体时具有更高的效力(Senter等,Proceedings of theAmerican Association for Cancer Research,卷45,摘要号623,2004年3月28日)。经1F6的C末端通过苯二胺间隔物将Auristatin F苯二胺(AFP)（MMAE的一种苯丙氨酸变体）连接至抗CD70单抗1F6(Law等,Proceedings of theAmerican Association for Cancer Research,卷45,摘要号625,2004年3月28日)。
本领域中需要别的药物以治疗各种癌症，诸如***、肺和结肠中的癌症和癌症转移。对于该目的特别有用的药物包括靶向***、肺和结肠细胞的抗STEAP-1抗体-药物偶联物，其具有显著更低的毒性，但仍具有有用的治疗功效。本发明解决了过去的这些和其它限制和问题。
分子成像是新药物开发和评估中的一种重要工具。免疫正电子发射断层成像（免疫PET）是一种正在快速兴起的用于在体内跟踪和量化单克隆抗体(mAb)的方法，因为它有效组合PET的高灵敏度与mAb的高特异性。免疫PET有望成为临床方法，作为非侵入性诊断的选项，提供“体内综合免疫组织化学染色”(van Dongen GA等,“Immuno-PET:a navigator in monoclonal antibodydevelopment and applications”Oncologist2007;12:1379-89;Williams等(2001)Cancer Biother Radiopharm16:25-35;Holliger等(2005)Nat Biotechnol23:1126-36))。基于89Zr的免疫PET的开发使得能够测量小鼠和人中的靶物表达和抗体分布；使用89Zr-曲妥单抗的临床免疫PET显示肝和骨Met中的异质性(Dijkers et al.,Nature Vol.87Number5(May2010))。
PET成像***基于患者组织中发射正电子的同位素的分布来产生图像。通常通过注射共价附着于易于在身体中代谢或定位（例如葡萄糖）或化学结合身体内受***点的分子、包含发射正电子的同位素（诸如F-18、C-11、N-13、或O-15）的探针分子来将同位素施用于患者。在一些情况中，作为离子溶液或通过吸入来将同位素施用于患者。小免疫PET成像剂，诸如Fab抗体片段(50kDa)或双抗体，共价联合的Mab VH-VL区的配对二聚体55kDa(Shively等(2007)J Nucl Med48:170-2),可能是特别有用的，因为它们展现短循环半衰期、高组织渗透性，而且在注射后2-4小时达到最佳肿瘤对背景比，推动短半衰期同位素诸如广泛可得的18F（109.8分钟）的使用。
本申请中的任何参考文献的叙述不是承认该参考文献是本申请的现有技术。将本文中所引用的所有参考文献（包括专利、专利申请和出版物）完整收入本文作为参考。
发明概述
本发明提供了抗STEAP-1抗体及其使用方法。
在一个方面，提供了一种结合STEAP-1的抗体，其中该抗体包含：轻链可变域，该轻链可变域包含图2A所示的氨基酸序列（SEQ ID NO:6）；或重链可变域，该重链可变域包含图2B所示的氨基酸序列（SEQ ID NO:9）。在一个方面，提供了一种结合STEAP-1的抗体，其中该抗体包含：轻链可变域，该轻链可变域包含图2A所示的氨基酸序列（SEQ ID NO:6）；和重链可变域，该重链可变域包含图2B所示的氨基酸序列（SEQ ID NO:9）。
在一个方面，提供了一种结合STEAP-1的抗体，其中该抗体包含与SEQID NO:9或10的氨基酸序列具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%序列同一性的重链可变域。在一个实施方案中，该抗体包含SEQ ID NO:9或10的重链可变域。在一个实施方案中，该抗体包含SEQ ID NO:25的重链可变域框架区1或SEQ ID NO:75或76或77的重链可变域框架区2或SEQ ID NO:78或79的重链可变域框架区3。
在一个方面，该抗体包含与SEQ ID NO:6的氨基酸序列具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%序列同一性的轻链可变域。在一个实施方案中，该抗体包含SEQ ID NO:6的轻链可变域。
在一个方面，提供了一种结合STEAP-1的抗体，其中该抗体包含与SEQID NO:9或10的氨基酸序列具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%序列同一性的重链可变域。在一个实施方案中，该抗体包含SEQ ID NO:9或10的重链可变域。在一个实施方案中，该抗体包含SEQ ID NO:25的重链可变域框架区1或SEQ ID NO:75或76或77的重链可变域框架区2或SEQ ID NO:78或79的重链可变域框架区3。在一个实施方案中，该抗体进一步包含与SEQ ID NO:6的氨基酸序列具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%序列同一性的轻链可变域。在一个实施方案中，该抗体包含SEQ ID NO:6的轻链可变域。
在某些实施方案中，提供了编码任何上述抗体的多核苷酸。在一个实施方案中，提供了包含该多核苷酸的载体。在一个实施方案中，提供了包含该载体的宿主细胞。在一个实施方案中，该宿主细胞是真核的。在一个实施方案中，该宿主细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。在一个实施方案中，提供了制备抗STEAP-1抗体的方法，其中该方法包括在适于编码该抗体的多核苷酸表达的条件下培养该宿主细胞，和分离该抗体。
在一个方面，提供了一种结合在细胞表面上表达的STEAP-1的抗体。在一个实施方案中，该抗体结合人或小鼠STEAP-1的一个区域内的表位。在一个实施方案中，该细胞是哺乳动物细胞。在一个实施方案中，该细胞是人细胞。在一个实施方案中，该细胞是癌细胞。在一个实施方案中，该细胞是***、肺或结肠细胞。在一个实施方案中，该癌细胞是***癌细胞。在另一个实施方案中，该细胞是来自原发性***、肺或结肠癌的转移的细胞。
在某些实施方案中，任何上述抗体是单克隆抗体。在一个实施方案中，该抗体是抗体片段，其选自Fab、Fab’-SH、Fv、scFv、或(Fab’)2片段。在一个实施方案中，该抗体是人源化的。在一个实施方案中，该抗体是人的。
在一个方面，提供了一种检测STEAP-1在生物学样品中存在的方法，该方法包括使该生物学样品与任何上述抗体在容许该抗体结合至STEAP-1的条件下接触，和检测该抗体和STEAP-1之间是否形成复合物。在一个实施方案中，该生物学样品包含***细胞。在一个实施方案中，该生物学样品来自经历(experiencing)或怀疑经历***细胞病症和/或细胞或组织的细胞增殖性病症的哺乳动物，该病症包括但不限于***、肺、结肠、膀胱、和卵巢癌和尤因氏(Ewing)肉瘤以及原发性***、肺、结肠、膀胱、和卵巢癌和尤因氏(Ewing)肉瘤的转移。参见例如美国专利No.6,329,503;及Rodeberg,D.A.等,Clin.Cancer Res.11(12):4545-4552(2005)。
在一个方面，提供了一种诊断与STEAP-1表达升高有关的细胞增殖性病症的方法，该方法包括使测试细胞与任何上述抗体接触；通过检测该抗体对STEAP-1的结合来测定STEAP-1的表达水平；和比较测试细胞的STEAP-1表达水平与对照细胞的STEAP-1表达水平，其中测试细胞的STEAP-1表达水平高于对照细胞表明存在与STEAP-1表达升高有关的细胞增殖性病症。在一个实施方案中，该测试细胞是来自怀疑患有细胞增殖性病症（诸如***增殖性病症）的患者的细胞。在一个实施方案中，该细胞增殖性病症选自***细胞病症，包括但不限于***癌。在一个实施方案中，该方法包括测定该测试细胞（诸如例如***癌细胞）表面上的STEAP-1表达水平，和比较测试细胞表面上的STEAP-1表达水平与对照细胞（诸如例如与异常增殖的***细胞不同的正常***细胞）表面上的STEAP-1表达水平。
在一个方面，提供了一种诊断与表达STEAP-1的细胞（诸如***细胞）增加有关的细胞增殖性病症的方法，该方法包括使生物学样品中的测试细胞与任何上述抗体接触；通过检测该抗体对STEAP-1的结合来测定结合至该样品中测试细胞的抗体的水平；和比较结合至对照样品中细胞的抗体的水平，其中将所结合的抗体的水平相对于测试和对照样品中STEAP-1表达细胞数进行标准化，且其中测试样品中所结合的抗体的水平高于对照样品表明存在与表达STEAP-1的细胞有关的细胞增殖性病症。
在一个方面，提供了一种检测血液或血清中的可溶性STEAP-1的方法，该方法包括使来自怀疑经历***细胞增殖性病症的哺乳动物的血液或血清测试样品与本发明的抗STEAP-1抗体接触，和检测测试样品中可溶性STEAP-1相对于来自正常哺乳动物的血液或血清对照样品的升高。在一个实施方案中，该检测方法作为诊断与哺乳动物血液或血清中可溶性STEAP-1升高有关的***细胞增殖性病症的方法是有用的。
在一个方面，本发明的抗体包括半胱氨酸改造抗体(cysteine engineeredantibodies)，其中亲本抗体的一个或多个氨基酸被游离半胱氨酸氨基酸所替换，正如WO2006/034488中所披露的（完整收入本文作为参考）。半胱氨酸改造抗体包含一个或多个游离半胱氨酸氨基酸，其具有范围为0.6至1.0的硫醇反应性值(thiol reactivity value)。游离的半胱氨酸氨基酸指已经被改造入亲本抗体且不是二硫桥的一部分的半胱氨酸残基。半胱氨酸改造抗体可用于在改造的半胱氨酸位点处附着细胞毒性化合物和/或成像化合物，例如经由马来酰亚胺或卤代乙酰基。Cys残基的硫醇官能度对马来酰亚胺基团的亲核反应性比蛋白质中任何其它氨基酸官能度（诸如赖氨酸残基的氨基或N末端氨基）高大约1000倍。碘代乙酰基和马来酰亚胺试剂中的硫醇特异性官能度可以与胺基团起反应，但要求较高的pH(>9.0)和较长的反应时间(Garman,1997,Non-Radioactive Labelling:A Practical Approach,Academic Press,London)。
半胱氨酸改造抗体可用于治疗癌症，并包括对细胞表面和跨膜受体及肿瘤相关抗原(TAA)特异性的抗体。此类抗体可以以裸抗体（未偶联至药物或标记物模块）或抗体-药物偶联物(ADC)的形式使用。本发明的半胱氨酸改造抗体可以位点特异性地且高效地偶联硫醇反应性试剂。该硫醇反应性试剂可以是多功能接头试剂、捕获标记物试剂、荧光团试剂、或药物-接头中间体。半胱氨酸改造抗体可以用可检测标记物标记，在固相支持物上固定化和/或与药物模块偶联。可以将硫醇反应性普及至任何抗体，其中可以用反应性半胱氨酸氨基酸进行氨基酸替代，这发生在轻链中选自下列氨基酸范围的范围内：L-10至L-20；L-38至L-48；L-105至L-115；L-139至L-149；L-163至L-173，及重链中选自下列氨基酸范围的范围内：H-35至H-45；H-83至H-93；H-114至H-127；和H-170至H-184，及Fc区中选自下组的范围内：H-268至H-291；H-319至H-344；H-370至H-380；和H-395至H-405，其中氨基酸位置的编号方式开始于Kabat编号***(Kabat等(1991)Sequences of Proteins ofImmunological Interest,第5版,Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,MD)的第1位并在其后顺序延续，正如WO2006/034488中所披露的。还可以将硫醇反应性普及至抗体的某些结构域，诸如轻链恒定域(CL)和重链恒定域（CH1、CH2和CH3）。可以进行导致0.6和更高的硫醇反应性值的半胱氨酸替换，这分别发生在完整抗体：IgA、IgD、IgE、IgG、和IgM（包括IgG亚类：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4，IgA1和IgA2）的重链恒定域α、δ、ε、γ、和μ中。此类抗体及其用途在WO2006/034488中有披露。
本发明的半胱氨酸改造抗体优选地保留它们野生型、亲本抗体对应物的抗原结合能力。如此，半胱氨酸改造抗体能够结合（优选特异性地）抗原。此类抗原包括例如肿瘤相关抗原(TAA)、细胞表面受体蛋白和其它细胞表面分子、跨膜蛋白、信号传导蛋白、细胞存活调节因子、细胞增殖调节因子、与组织发育或分化有关的（例如已知或怀疑在功能上促进的）分子、淋巴因子、细胞因子、涉及细胞周期调控的分子、涉及脉管发生(vasculogenesis)的分子和与血管发生(angiogenesis)有关的（例如已知或怀疑在功能上促进的）分子。
本发明的抗体可以偶联至其它硫醇反应性试剂，其中该反应性基团是例如马来酰亚胺、碘乙酰胺、吡啶基二硫化物(pyridyl disulfide)、或其它硫醇反应性偶联配偶(Haugland,2003,Molecular Probes Handbook of FluorescentProbes and Research Chemicals,Molecular Probes,Inc.;Brinkley,1992,Bioconjugate Chem.3:2;Garman,1997,Non-Radioactive Labelling:A PracticalApproach,Academic Press,London;Means(1990)Bioconjugate Chem.1:2;Hermanson,G.于Bioconjugate Techniques(1996)Academic Press,San Diego,pp.40-55,643-671)。该配偶可以是细胞毒剂（例如毒素，诸如多柔比星或百日咳毒素）、荧光团（诸如荧光染料，像荧光素或罗丹明）、用于成像或放射治疗性金属的螯合剂、肽基或非肽基标记物或检测标签、或清除调节剂(clearance-modifying agent)（诸如聚乙二醇的各种异构体）、与第三成分结合的肽、或另一种碳水化合物或亲脂剂。
在一个方面，本发明的抗体可以与任何标记物模块偶联，所述标记物模块可以通过反应性模块、活化的模块或反应性半胱氨酸硫醇基团共价附着至抗体(Singh等(2002)Anal.Biochem.304:147-15;Harlow E.和Lane,D.(1999)Using Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Springs Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY;Lundblad R.L.(1991)Chemical Reagents for ProteinModification,第2版,CRC Press,Boca Raton,FL)。所附着的标记物可以发挥下列功能：(i)提供可检测信号；(ii)与第二标记物相互作用以修饰由第一或第二标记物所提供的可检测信号，例如以给出FRET（荧光共振能量转移）；(iii)稳定与抗原或配体的相互作用或提高与抗原或配体结合的亲和力；(iv)通过电荷、疏水性、形状、或其它物理参数来影响迁移率，例如电泳迁移率或细胞通透性；或(v)提供捕获模块以调控配体亲和力、抗体/抗原结合、或离子络合。
经过标记的半胱氨酸改造抗体可以用于诊断测定法，例如用于在特定细胞、组织、或血清中检测感兴趣抗原的表达。为了诊断应用，典型地用可检测模块标记抗体。许多标记物是可获得的，一般可将它们分组成下列种类：
放射性同位素（放射性核素），诸如3H、11C、14C、18F、32P、35S、64Cu、68Ga、86Y、89Zr、99Tc、111In、123I、124I、125I、131I、133Xe、177Lu、211At、或213Bi。放射性同位素标记的抗体可用于受体靶向成像实验。使用Current Protocols inImmunology,卷1和2,Coligen等编,Wiley-Interscience,New York,NY,Pubs.(1991)中记载的技术，可以用结合、螯合或以其它方式络合放射性同位素金属的配体试剂来标记抗体，其中该试剂与该抗体的改造的半胱氨酸硫醇具有反应性。可以络合金属离子的螯合配体包括DOTA、DOTP、DOTMA、DTPA和TETA(Macrocyclics,Dallas,TX)。放射性核素可以通过与本发明的抗体-药物偶联物络合来靶向(Wu等(2005)Nature Biotechnology23(9):1137-1146)。
接头试剂，诸如DOTA-马来酰亚胺（4-马来酰亚氨基丁酰氨基苄基-DOTA）(4-maleimidobutyramidobenzyl-DOTA)可以通过氨基苄基-DOTA与用氯甲酸异丙酯(isopropylchloroformate)(Aldrich)活化的4-马来酰亚氨基丁酸(Fluka)反应来制备，其遵循Axworthy等(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA97(4):1802-1807的规程。DOTA-马来酰亚胺试剂与半胱氨酸改造抗体的游离半胱氨酸氨基酸起反应，并在该抗体上提供金属络合配体(Lewis等(1998)Bioconj.Chem.9:72-86)。螯合接头标记试剂，诸如DOTA-NHS（1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸单(N-羟基琥珀酰亚胺酯)）(1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid mono(N-hydroxysuccinimideester))是商品化的(Macrocyclics,Dallas,TX)。用放射性核素标记的抗体进行的受体靶物成像可以通过检测和定量抗体在肿瘤组织中的逐渐积累来提供途径活化的标志(Albert等(1998)Bioorg.Med.Chem.Lett.8:1207-1210)。在溶酶体降解后，所偶联的放射性金属可以保留在细胞内。
适合作为用于成像实验的抗体标记物的金属-螯合剂复合体披露于：US5,342,606;US5,428,155;US5,316,757;US5,480,990;US5,462,725;US5,428,139;US5,385,893;US5,739,294;US5,750,660;US5,834,456;Hnatowich等(1983)J.Immunol.Methods65:147-157;Meares等(1984)Anal.Biochem.142:68-78;Mirzadeh等(1990)Bioconjugate Chem.1:59-65;Meares等(1990)J.Cancer1990,Suppl.10:21-26;Izard等(1992)Bioconjugate Chem.3:346-350;Nikula等(1995)Nucl.Med.Biol.22:387-90;Camera等(1993)Nucl.Med.Biol.20:955-62;Kukis等(1998)J.Nucl.Med.39:2105-2110;Verel等(2003)J.Nucl.Med.44:1663-1670;Camera等(1994)J.Nucl.Med.21:640-646;Ruegg等(1990)Cancer Res.50:4221-4226;Verel等(2003)J.Nucl.Med.44:1663-1670;Lee等(2001)Cancer Res.61:4474-4482;Mitchell等(2003)J.Nucl.Med.44:1105-1112;Kobayashi等(1999)Bioconjugate Chem.10:103-111;Miederer等(2004)J.Nucl.Med.45:129-137;DeNardo等(1998)Clinical Cancer Research4:2483-90;Blend等(2003)Cancer Biotherapy&Radiopharmaceuticals18:355-363;Nikula等(1999)J.Nucl.Med.40:166-76;Kobayashi等(1998)J.Nucl.Med.39:829-36;Mardirossian等(1993)Nucl.Med.Biol.20:65-74;Roselli等(1999)Cancer Biotherapy&Radiopharmaceuticals,14:209-20。
(b)荧光标记物，诸如稀土螯合物（铕螯合物）；荧光素类，包括FITC、5-羧基荧光素、6-羧基荧光素；罗丹明类，包括TAMRA；丹酰(dansyl)；丽丝胺(Lissamine)；花青(cyanines)；藻红蛋白；德克萨斯红(Texas Red)；和它们的类似物。使用例如Current Protocols in Immunology（见上文）中披露的技术，可以将荧光标记物偶联至抗体。荧光染料和荧光标记物试剂包括那些可购自Invitrogen/Molecular Probes(Eugene,OR)和Pierce Biotechnology,Inc.(Rockford,IL)的。
(c)各种酶-底物标记物是可获得的或有披露的(US4275149)。该酶一般催化显色底物的化学改变，其可以使用各种技术来测量。例如，该酶可以催化底物的颜色变化，其可以用分光光度法来测量。或者，该酶可以改变底物的荧光或化学发光。用于定量荧光变化的技术在上文有描述。化学发光底物通过化学反应而成为电子激发的，然后可以发射可测量的光（例如使用化学发光计）或给荧光受体贡献能量。酶标记物的例子包括萤光素酶（例如萤火虫萤光素酶和细菌萤光素酶；US4,737,456）、萤光素、2,3-二氢酞嗪二酮、苹果酸脱氢酶、脲酶、过氧化物酶诸如辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(AP)、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶（例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶、和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶）、杂环氧化酶（诸如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶）、乳过氧化物酶、微过氧化物酶等。用于将酶偶联至抗体的技术披露于：O'Sullivan等(1981)“Methods for the Preparation of Enzyme-AntibodyConjugates for use in Enzyme Immunoassay”,于Methods in Enzym.(J.Langone和H.Van Vunakis编),Academic Press,New York,73:147-166。
酶-底物组合的例子包括例如：
(i)辣根过氧化物酶(HRP)与作为底物的过氧化氢，其中该过氧化氢氧化染料前体（例如邻苯二胺(OPD)或3,3',5,5'-四甲基联苯胺盐酸盐(TMB)）；
(ii)碱性磷酸酶(AP)与作为显色底物的对硝基苯基磷酸酯；和
(iii)β-D-半乳糖苷酶(β-D-Gal)与显色底物（例如对硝基苯基-β-D-半乳糖苷）或荧光底物4-甲基伞形基-β-D-半乳糖苷）。
许多其它的酶-底物组合对本领域技术人员而言是可获得的。一般综述参见US4275149和US4318980。
标记物可以间接地与氨基酸侧链、活化的氨基酸侧链、半胱氨酸改造抗体等偶联。例如，抗体可以与生物素偶联，并且任何上述三大类标记物可以与亲合素或链霉亲合素偶联，反之亦然。生物素选择性结合链霉亲合素，如此，标记物可以以该间接方式与抗体偶联。或者，为了实现标记物与多肽变体的间接偶联，多肽变体与小的半抗原（例如地高辛）偶联，并且上述不同类型的标记物之一与抗半抗原多肽变体（例如抗地高辛抗体）偶联。如此，可以实现标记物与多肽变体的间接偶联(Hermanson,G.(1996)于Bioconjugate Techniques Academic Press,San Diego)。
可以在任何已知的测定方法中使用本发明的抗体，诸如ELISA、竞争性结合测定法、直接和间接三明治式（或夹心式）测定法、和免疫沉淀测定法(Zola,(1987)Monoclonal Antibodies:A Manual of Techniques,pp.147-158,CRC Press,Inc.)。
检测标记物可用于对结合或识别事件进行定位、显现、和定量。经过标记的本发明抗体可检测细胞表面受体。经过可检测标记的抗体的另一种用途是基于珠子的免疫捕获方法，其包括使珠子与荧光标记的抗体偶联，和在配体结合后检测荧光信号。类似的结合检测方法学利用表面等离振子共振(SPR)效应来测量和检测抗体-抗原相互作用。
检测标记物（诸如荧光染料和化学发光染料）(Briggs等(1997)"Synthesisof Functionalised Fluorescent Dyes and Their Coupling to Amines and AminoAcids",J.Chem.Soc.,Perkin-Trans.1:1051-1058)提供可检测的信号，并且一般可用于标记抗体，优选具有下列性质：(i)经过标记的抗体应产生很高的信号但低的背景，使得在无细胞测定法和基于细胞的测定法中都能灵敏地检测出少量的抗体；和(ii)经过标记的抗体应是光稳定的，使得可以观察、监测、和记录到荧光信号，但没有显著的光漂白。对于涉及经标记抗体对膜或细胞表面（尤其是活细胞）的细胞表面结合的应用，标记物优选地(iii)具有优秀的水溶性以实现有效的偶联物浓度和检测灵敏度，和(iv)对活细胞是无毒性的，免得破坏细胞的正常代谢过程或引起过早的细胞死亡。
可以在用活细胞或珠子自动实施混合和读取(mix-and-read)、非放射性测定法的***(8100HTS System,Applied Biosystems,Foster City,Calif.)上进行细胞荧光强度的直接定量和荧光标记事件（例如肽-染料偶联物的细胞表面结合）的点查(Miraglia,"Homogeneous cell-and bead-based assays forhigh throughput screening using fluorometric microvolume assay technology",(1999)J.of Biomolecular Screening4:193-204)。经过标记的抗体的用途还包括细胞表面受体结合测定法、免疫捕获测定法、荧光连接的免疫吸附测定法(FLISA)、胱天蛋白酶切割(Zheng,"Caspase-3controls both cytoplasmic andnuclear events associated with Fas-mediated apoptosis in vivo",(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA95:618-23;US6,372,907)、凋亡(Vermes,"A novel assay forapoptosis.Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on earlyapoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V"(1995)J.Immunol.Methods184:39-51)和细胞毒性测定法。可以使用荧光计量微体积测定法(fluorometric microvolume assay)技术鉴定由靶向细胞表面的分子所引起的上调或下调(Swartzman,"A homogeneous and multiplexed immunoassay forhigh-throughput screening using fluorometric microvolume assay technology",(1999)Anal.Biochem.271:143-51)。
经过标记的本发明抗体可通过生物医学和分子成像的各种方法和技术用作成像生物标志物和探针，诸如：(i)MRI（磁共振成像）；(ii)microCT（计算机化断层成像）；(iii)SPECT（单光子发射计算机化断层成像）；(iv)正电子发射断层成像(PET)或免疫正电子发射断层成像（免疫PET）(参见vanDongen GA等,“Immuno-PET:a navigator in monoclonal antibody developmentand applications”Oncologist2007;12:1379-89)；(v)生物发光；(vi)荧光；和(vii)超声。免疫闪烁成像是一种成像规程，其中给动物或人患者施用用放射性物质标记的抗体，并拍摄身体中该抗体定位的部位的照片(US6528624)。可以将成像生物标志物作为正常生物学过程、致病过程、或对治疗性干涉的药理学应答的指示客观地测量并评估。生物标志物可以是数种类型：类型0是疾病的天然历史标志物，并与已知临床指标纵向相关，例如类风湿性关节炎中滑膜炎症的MRI评估；类型I标志物捕获干预的依照作用机制的效应，即使该机制可能与临床结果无关；类型II标志物发挥代用终点(surrogate endpoint)的功能，其中该生物标志物的改变或来自该生物标志物的信号预示临床益处以“证实”靶向应答，诸如通过CT在类风湿性关节炎中测量到的骨侵蚀。如此，成像生物标志物可以提供关于下列各项的药效学(PD)治疗信息：(i)靶蛋白的表达，(ii)治疗剂对靶蛋白的结合，即选择性，和(iii)清除和半衰期药动学数据。体内成像生物标志物相对于基于实验室的生物标志物的优点包括：非侵入性处理，可定量，全身评估，重复定量给药和评估（即多个时间点），及从临床前结果（小动物）至临床结果（人）的潜在可转换效应。对于一些应用，生物成像代替或最少化临床前研究中动物实验的数目。
肽标记方法是公知的。参见Haugland,2003,Molecular Probes Handbookof Fluorescent Probes and Research Chemicals,Molecular Probes,Inc.;Brinkley,1992,Bioconjugate Chem.3:2;Garman,(1997)Non-Radioactive Labelling:APractical Approach,Academic Press,London;Means(1990)Bioconjugate Chem.1:2;Glazer等(1975)Chemical Modification of Proteins.Laboratory Techniquesin Biochemistry and Molecular Biology(T.S.Work和E.Work编)AmericanElsevier Publishing Co.,New York;Lundblad,R.L.和Noyes,C.M.(1984)Chemical Reagents for Protein Modification,卷I和II,CRC Press,New York;Pfleiderer,G.(1985)“Chemical Modification of Proteins”,Modern Methods inProtein Chemistry,H.Tschesche编,Walter DeGryter,Berlin和New York;及Wong(1991)Chemistry of Protein Conjugation and Cross-linking,CRC Press,Boca Raton,Fla.);De Leon-Rodriguez等(2004)Chem.Eur.J.10:1149-1155;Lewis等(2001)Bioconjugate Chem.12:320-324;Li等(2002)BioconjugateChem.13:110-115;Mier等(2005)Bioconjugate Chem.16:240-237。
用两种模块即荧光报道物和淬灭剂标记的肽和蛋白质在足够接近时经历荧光共振能量转移(FRET)。报道物基团典型地是荧光染料，其由某个波长的光激发并转移能量给受体或淬灭剂基团，这具有合适的斯托克司频移(Stokes shift)以在最高亮度发光。荧光染料包括具有扩展芳香性(extendedaromaticity)的分子，诸如荧光素和罗丹明及其衍生物。荧光报道物可以由完整肽中的淬灭剂模块部分地或显著地淬灭。在肽酶或蛋白酶切割肽后，可以测量可检测的荧光增加(Knight,C.(1995)“Fluorimetric Assays of ProteolyticEnzymes”,Methods in Enzymology,Academic Press,248:18-34)。
经过标记的本发明抗体还可以用作亲和纯化剂。在该方法中，使用本领域公知的方法将经过标记的抗体固定化在固相（诸如Sephadex树脂或滤纸）上。使固定化的抗体与含有待纯化抗原的样品接触，其后用合适的溶剂清洗支持物，这会清除该样品中除待纯化抗原（其结合至固定化的多肽变体）以外的基本上所有材料。最后，用另一种合适的溶剂（诸如甘氨酸缓冲液，pH5.0）清洗支持物，这会从多肽变体中释放抗原。
标记试剂典型地具有反应性官能度，其可以(i)与半胱氨酸改造抗体的半胱氨酸硫醇直接反应以形成经过标记的抗体，(ii)与接头试剂反应以形成接头-标记物中间体，或(iii)与接头抗体反应以形成经过标记的抗体。标记试剂的反应性官能度包括：马来酰亚胺、卤乙酰基、碘乙酰胺琥珀酰亚氨基酯（例如NHS，N-羟基琥珀酰亚胺）、异硫氰酸盐/酯、磺酰氯、2,6-二氯三嗪基、五氟苯基酯、和亚磷酰胺，尽管还可以使用其它官能团。
例示性的反应性官能团是可检测标记物（例如生物素或荧光染料）的羧基取代基的N-羟基琥珀酰亚氨基酯(NHS)。可以预制、分离、纯化、和/或表征该标记物的NHS酯，或者可以使其原位形成并与抗体的亲核基团起反应。典型地，将羧基形式的标记物通过与碳二亚胺试剂（例如二环己基碳二亚胺、二异丙基碳二亚胺）、或脲阳离子试剂（例如TSTU（O-(N-琥珀酰亚氨基)-N,N,N’,N’-四甲基脲四氟硼酸盐/酯）、HBTU（(O-苯并***-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸盐/酯）、或HATU（(O-(7-氮杂苯并***-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸盐/酯）、活化剂（诸如1-羟基苯并***(HOBt)）、和N-羟基琥珀酰亚胺的一些组合起反应而活化以给出该标记物的NHS酯。在一些情况中，可以通过标记物的原位活化和与抗体反应来偶联标记物和抗体以在一个步骤中形成标记物-抗体偶联物。其它活化和偶联试剂包括TBTU(2-(1H-苯并***-1-基)-1-1,3,3-四甲基脲六氟磷酸盐/酯)、TFFH(N,N’,N”,N’”-四甲基脲2-氟-六氟磷酸盐/酯)、PyBOP(苯并***-1-基-氧-三吡咯烷膦六氟磷酸盐/酯)、EEDQ(2-乙氧基-1-乙氧羰基-1,2-二氢-喹啉)、DCC(二环己基碳二亚胺)、DIPCDI(二异丙基碳二亚胺)、MSNT(1-(均三甲基苯-2-磺酰)-3-硝基-1H-1,2,4-***、和芳基磺酰卤化物（例如三异丙基苯磺酰氯）。
本发明的清蛋白结合肽-Fab化合物
在一个方面，本发明的抗体融合至清蛋白结合蛋白。血浆蛋白结合可以是改善短命分子的药动学性质的有效手段。清蛋白是血浆中最丰富的蛋白质。血清清蛋白结合肽(ABP)可以改变所融合的活性结构域蛋白质的药效学，包括改变组织摄取、渗透、和扩散。可以通过合适的血清清蛋白结合肽序列的具体选择来调控这些药效学参数(US20040001827)。通过噬菌体展示筛选鉴定了一系列清蛋白结合肽(Dennis等(2002)“Albumin Binding As A GeneralStrategy For Improving The Pharmacokinetics Of Proteins”J Biol Chem.277:35035-35043;WO01/45746)。本发明的化合物包括由下列文献所教导的ABP序列：(i)Dennis等(2002)J Biol Chem.277:35035-35043表III和IV，第35038页；(ii)US20040001827段[0076]SEQ ID NO:9-22；和(iii)WO01/45746，第12-13页，都收入本文作为参考。通过以1:1化学计量比（1ABP/1Fab）将清蛋白结合肽融合至例如Fab重链的C末端来改造清蛋白结合(ABP)-Fab。显示了这些ABP-Fab与清蛋白的结合使抗体在家兔和小鼠中的半衰期增加了25倍多。因此，可以将上述反应性Cys残基导入这些ABP-Fab，并用于与细胞毒性药物的位点特异性偶联，接着是体内动物研究。
例示性的清蛋白结合肽序列包括但不限于SEQ ID NO:80-84中列出的氨基酸序列：
CDKTHTGGGSQRLMEDICLPRWGCLWEDDF      SEQ ID NO:80
QRLMEDICLPRWGCLWEDDF                SEQ ID NO:81
QRLIEDICLPRWGCLWEDDF                SEQ ID NO:82
RLIEDICLPRWGCLWEDD                  SEQ ID NO:83
DICLPRWGCLW                         SEQ ID NO:84
抗体-药物偶联物
在另一个方面，本发明提供了包含偶联有细胞毒剂的抗体的免疫偶联物或抗体-药物偶联物(ADC)，所述细胞毒剂诸如化疗剂、药物、生长抑制剂、毒素（例如细菌、真菌、植物、或动物起源的酶活性毒素或其片段）、或放射性同位素（即放射偶联物）。在另一个方面，本发明进一步提供了使用免疫偶联物的方法。在一个方面，免疫偶联物包含共价附着至细胞毒剂或可检测试剂的任何上述抗STEAP-1抗体。
抗体-药物偶联物在癌症治疗中用于局部投递细胞毒剂或细胞抑制剂（即杀死或抑制肿瘤细胞的药物）的用途(Syrigos和Epenetos(1999)Anticancer Research19:605-614;Niculescu-Duvaz和Springer(1997)Adv.DrgDel.Rev.26:151-172;US4,975,278)容许将药物模块靶向投递至肿瘤，并在那儿进行细胞内积累，而***施用这些未经偶联的药物试剂在试图消除的肿瘤细胞以外可导致不可接受的对正常细胞的毒性水平(Baldwin等(1986)Lancet(Mar.15,1986):603-05;Thorpe(1985)"Antibody Carriers Of CytotoxicAgents In Cancer Therapy:A Review",于Monoclonal Antibodies'84:BiologicalAnd Clinical Applications(A.Pinchera等编)pp.475-506)。由此寻求最大功效及最小毒性。多克隆抗体和单克隆抗体皆有报道可用于这些策略(Rowland等(1986)Cancer Immunol.Immunother.21:183-87)。这些方法中所使用的药物包括道诺霉素(daunomycin)、多柔比星(doxorubicin)、甲氨蝶呤(methotrexate)、和长春地辛(vindesine)(Rowland等(1986)见上文)。抗体-毒素偶联物中所使用的毒素包括细菌毒素诸如白喉毒素、植物毒素诸如蓖麻毒蛋白、小分子毒素诸如格尔德霉素(geldanamycin)(Mandler等(2000)Jour.of the Nat.CancerInst.92(19):1573-1581；Mandler等(2000)Bioorganic&Med.Chem.Letters10:1025-1028；Mandler等(2002)Bioconjugate Chem.13:786-791)、美登木素生物碱(EP1391213；Liu等(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA93:8618-8623)、和加利车霉素(Lode等(1998)Cancer Res.58:2928；Hinman等(1993)CancerRes.53:3336-3342)。毒素可通过包括微管蛋白结合、DNA结合、或拓扑异构酶抑制在内的机制发挥其细胞毒性和细胞抑制性效应。有些细胞毒性药物在与大的抗体或蛋白质受体配体偶联后趋于失活或活性降低。
Figure BDA00002807843500181
(ibritumomab tiuxetan,Biogen/Idec)是由针对在正常和恶性B淋巴细胞表面上发现的CD20抗原的鼠IgG1κ单克隆抗体与通过硫脲接头-螯合剂所结合的111In或90Y放射性同位素构成的抗体-放射性同位素偶联物(Wiseman等(2000)Eur.Jour.Nucl.Med.27(7):766-77;Wiseman等(2002)Blood99(12):4336-42;Witzig等(2002)J.Clin.Oncol.20(10):2453-63;Witzig等(2002)J.Clin.Oncol.20(15):3262-69)。尽管ZEVALIN具有针对B细胞非何杰金氏淋巴瘤(NHL)的活性，然而施药在大多数患者中导致严重且持久的血细胞减少。MYLOTARGTM(gemtuzumab ozogamicin,Wyeth Pharmaceuticals)，即由hu CD33抗体与加利车霉素连接而构成的抗体-药物偶联物，在2000年批准用于经注射治疗急性骨髓性白血病(Drugs of the Future(2000)25(7):686;美国专利No.4,970,198;5,079,233;5,585,089;5,606,040;5,693,762;5,739,116;5,767,285;5,773,001)。Cantuzumab mertansine(Immunogen,Inc.)，即由huC242抗体经二硫化物接头SPP与美登木素生物碱药物模块DM1连接而构成的抗体-药物偶联物，正在进入用于治疗表达CanAg的癌症（诸如结肠癌、胰腺癌、胃癌和其它癌）的II期试验。MLN-2704(Millennium Pharm.,BZL Biologics,Immunogen Inc.)，即由抗***特异膜抗原(PSMA)单克隆抗体与美登木素生物碱药物模块DM1连接而构成的抗体-药物偶联物，在开发用于***肿瘤的潜在治疗。已经将多拉司他汀(dolastatin)的合成类似物auristatin肽，auristatin E(AE)和单甲基auristatin(MMAE)与嵌合单克隆抗体cBR96（对癌瘤上的Lewis Y特异）和cAC10（对血液学恶性肿瘤上的CD30特异）偶联(Doronina等(2003)Nature Biotechnology21(7):778-784)，且正在进行治疗性开发。
本文中描述了可用于生成免疫偶联物的化疗剂。可使用的酶活性毒素及其片段包括白喉毒素A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链（来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)）、蓖麻毒蛋白(ricin)A链、相思豆毒蛋白(abrin)A链、蒴莲根毒蛋白(modeccin)A链、α-帚曲霉素(sarcin)、油桐(Aleutites fordii)毒蛋白、香石竹(dianthin)毒蛋白、美洲商陆(Phytolacaamericana)毒蛋白（PAPI、PAPII、和PAP-S）、苦瓜(Momordica charantia)抑制物、麻疯树毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制物、白树毒蛋白(gelonin)、丝林霉素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、依诺霉素(enomycin)、和单端孢菌素(trichothecenes)。参见例如1993年10月28日公布的WO93/21232。多种放射性核素可用于生成放射偶联抗体。例子包括212Bi、131I、131In、90Y、和186Re。抗体和细胞毒剂的偶联物使用多种双功能蛋白质偶联剂来制备，诸如N-琥珀酰亚氨基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)，亚氨基硫烷(IT)，亚氨酸酯（诸如盐酸己二酰亚氨酸二甲酯）、活性酯类（诸如辛二酸二琥珀酰亚氨基酯）、醛类（诸如戊二醛）、双叠氮化合物（诸如双(对-叠氮苯甲酰基)己二胺）、双重氮衍生物（诸如双(对-重氮苯甲酰基)-乙二胺）、二异硫氰酸酯（诸如甲苯2,6-二异氰酸酯）、和双活性氟化合物（诸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯）的双功能衍生物。例如，可如Vitetta等(1987)Science,238:1098中所述制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14标记的1-异硫氰酸苄基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸与抗体偶联的例示性螯合剂(WO94/11026)。
本文还涵盖抗体和一种或多种小分子毒素（诸如加利车霉素(calicheamicin)、美登木素生物碱(maytansinoid)、多拉司他汀(dolastatin)、auristatin、单端孢霉素(trichothecene)、和CC1065及这些毒素的具有毒素活性的衍生物）的偶联物。
美登素和美登木素生物碱
在有些实施方案中，免疫偶联物包含偶联有一个或多个美登木素生物碱分子的本发明抗体（全长或片段）。
美登木素生物碱是通过抑制微管蛋白聚合来发挥作用的有丝***抑制剂。美登素最初分离自东非灌木齿叶美登木（Maytenus serrata）（美国专利No.3,896,111）。随后发现某些微生物也生成美登木素生物碱，诸如美登醇和C-3美登醇酯（美国专利No.4,151,042）。例如下列美国专利公开了合成美登醇及其衍生物和类似物：4,137,230;4,248,870;4,256,746;4,260,608;4,265,814;4,294,757;4,307,016;4,308,268;4,308,269;4,309,428;4,313,946;4,315,929;4,317,821;4,322,348;4,331,598;4,361,650;4,364,866;4,424,219;4,450,254;4,362,663;及4,371,533。
美登木素生物碱药物模块是有吸引力的抗体-药物偶联物中药物模块，因为它们：(i)相对易于通过发酵或发酵产物的化学修饰、衍生化来制备；(ii)易于用适于通过非二硫化物接头偶联抗体的官能团衍生化；(iii)在血浆中稳定；且(iv)有效针对多种肿瘤细胞系。
适于用作美登木素生物碱药物模块的美登素化合物是本领域公知的，而且可以依照已知方法从天然来源分离，使用遗传工程技术生产(参见Yu等(2002)PNAS99:7968-7973)，或者美登醇和美登醇类似物也可以依照已知方法合成制备。
例示性的美登木素生物碱药物模块包括那些具有修饰的芳香环的，诸如：C-19-脱氯(US4256746)（通过安丝菌素(ansamytocin)P2的氢化铝锂还原来制备）；C-20-羟基（或C-20-脱甲基）+/-C-19-脱氯(美国专利No.4361650和4307016)（通过使用链霉菌或放线菌的脱甲基化或使用LAH的脱氯化来制备）；及C-20-脱甲氧基,C-20-酰氧基(-OCOR),+/-脱氯(美国专利No.4,294,757)（通过使用酰氯的酰化来制备），以及那些在其它位置具有修饰的。
例示性的美登木素生物碱药物模块还包括那些具有修饰的，诸如：C-9-SH(US4424219)（通过美登醇与H2S或P2S5的反应来制备）；C-14-烷氧甲基（脱甲氧基/CH2OR）(US4331598)；C-14-羟甲基或酰氧甲基（CH2OH或CH2OAc）(US4450254)（自诺卡氏菌制备）；C-15-羟基/酰氧基(US4364866)（通过链霉菌对美登醇的转化来制备）；C-15-甲氧基(美国专利No.4313946和4315929)（自Trewia nudlflora分离)；C-18-N-脱甲基(美国专利No.4362663和4322348)（通过链霉菌对美登醇的脱甲基化来制备）；及4,5-脱氧(US4371533)（通过美登醇的三氯化钛/LAH还原来制备）。
美登木素生物碱药物模块的例示性实施方案包括具有如下结构的DM1、DM3、和DM4：
Figure BDA00002807843500211
其中波形线指示药物的硫原子对抗体-药物偶联物的接头(L)的共价附着。
Figure BDA00002807843500212
(trastuzumab)经SMCC连接DM1已有报道(WO2005/037992，明确地完整收入本文作为参考)。本发明的抗体-药物偶联物可以依照其中披露的规程来制备。
其它例示性的美登木素生物碱抗体-药物偶联物具有如下结构和缩写（其中Ab是抗体，而p是1到大约8）：
Figure BDA00002807843500221
其中DM1经BMPEO接头连接抗体硫醇基的例示性抗体-药物偶联物具有如下结构和缩写：
Figure BDA00002807843500222
其中Ab是抗体；n是0、1、或2；而p是1、2、3、或4。
例如下列专利公开了包含美登木素生物碱的免疫偶联物及其制备方法和治疗用途：美国专利No.5,208,020;5,416,064;6,441,163;及欧洲专利EP0425235B1，明确将其公开内容收入本文作为参考。Liu等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA93:8618-8623(1996)记载了包含与针对人结肠直肠癌的单克隆抗体C242连接的称为DM1的美登木素生物碱的免疫偶联物。发现该偶联物具有针对培养的结肠癌细胞的高度细胞毒性，而且在体内肿瘤生长测定法中显示出抗肿瘤活性。Chari等,Cancer Research52:127-131(1992)记载了其中美登木素生物碱经二硫化物接头与结合人结肠癌细胞系上抗原的鼠抗体A7或结合HER-2/neu癌基因的另一种鼠单克隆抗体TA.1偶联的免疫偶联物。在体外在人乳腺癌细胞系SK-BR-3上测试了TA.1-美登木素生物碱偶联物的细胞毒性，该细胞系每个细胞表达3x105个HER-2表面抗原。药物偶联物达到了程度与游离美登木素生物碱药物相似的细胞毒性，这可通过增加每个抗体分子所偶联的美登木素生物碱分子数目来提高。A7-美登木素生物碱偶联物在小鼠中显示低***性细胞毒性。
抗STEAP-1抗体-美登木素生物碱偶联物通过将抗体与美登木素生物碱分子化学连接来制备，这没有显著削弱抗体或美登木素生物碱分子的生物学活性。参见例如美国专利No.5,208,020，明确将其公开内容收入本文作为参考。每个抗体分子偶联平均3-4个美登木素生物碱分子在增强针对靶细胞的细胞毒性方面显示功效，且对抗体的功能或溶解度没有负面影响，尽管甚至每个抗体偶联一分子毒素也会较之裸抗体的使用增强细胞毒性。美登木素生物碱在本领域是众所周知的，而且可通过已知技术合成或从天然来源分离。例如美国专利No.5,208,020和上文提及的其它专利及非专利发表物中公开了合适的美登木素生物碱。优选的美登木素生物碱是美登醇和美登醇分子的芳香环或其它位置经过修饰的美登醇类似物，诸如各种美登醇酯。
本领域知道许多连接基团可用于制备抗体-美登木素生物碱偶联物，包括例如美国专利No.5,208,020;6,441,163;或欧洲专利0425235B1;Chari等,Cancer Research52:127-131(1992);及US2005/0169933A1中所公开的，明确将其公开内容收入本文作为参考。包含接头构件SMCC的抗体-美登木素生物碱偶联物可以如2005年5月31日提交的美国专利申请No.11/141344,“Antibody Drug Conjugates and Methods”中所披露的来制备。连接基团包括二硫化物基团、硫醚基团、酸不稳定基团、光不稳定基团、肽酶不稳定基团、或酯酶不稳定基团，正如上文所述专利中所公开的。本文中描述和例示了别的连接基团。
可使用多种双功能蛋白质偶联剂来制备抗体和美登木素生物碱的偶联物，诸如N-琥珀酰亚氨基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)，琥珀酰亚氨基-4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)，亚氨基硫烷(IT)，亚氨酸酯（诸如盐酸己二酰亚氨酸二甲酯）、活性酯类（诸如辛二酸二琥珀酰亚氨基酯）、醛类（诸如戊二醛）、双叠氮化合物（诸如双(对-叠氮苯甲酰基)己二胺）、双重氮衍生物（诸如双(对-重氮苯甲酰基)-乙二胺）、二异氰酸酯（诸如甲苯2,6-二异氰酸酯）、和双活性氟化合物（诸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯）的双功能衍生物。特别优选的偶联剂包括N-琥珀酰亚氨基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)(Carlsson等,Biochem.J.173:723-737(1978))和N-琥珀酰亚氨基4-(2-吡啶基硫代)戊酸酯(SPP)，由此提供二硫化物连接。
根据连接的类型，可将接头附着于美登木素生物碱分子的多个位置。例如，可使用常规偶联技术通过与羟基的反应来形成酯键。反应可发生在具有羟基的C-3位置、经羟甲基修饰的C-14位置、经羟基修饰的C-15位置、和具有羟基的C-20位置。在一个优选的实施方案中，在美登醇或美登醇类似物的C-3位置形成连接。
在一个实施方案中，任何本发明抗体（全长或片段）偶联有一个或多个美登木素生物碱分子。在免疫偶联物的一个实施方案中，所述细胞毒剂D是美登木素生物碱DM1。在免疫偶联物的一个实施方案中，所述接头选自下组：SPDP、SMCC、IT、SPDP、和SPP。
Auristatin和多拉司他汀
在有些实施方案中，免疫偶联物包含与多拉司他汀(dolastatin)或多拉司他汀肽类似物和衍生物auristatin(美国专利No.5,635,483;5,780,588)偶联的本发明抗体。多拉司他汀和auristatin已经显示出干扰微管动力学、GTP水解、及核和细胞***(Woyke等(2001)Antimicrob.Agents and Chemother.45(12):3580-3584)且具有抗癌(US5,663,149)和抗真菌活性(Pettit等(1998)Antimicrob.Agents Chemother.42:2961-2965)。多拉司他汀或auristatin药物模块可经由肽药物模块的N（氨基）末端或C（羧基）末端附着于抗体(WO02/088172)。
例示性的auristatin实施方案包括N-末端连接的单甲基auristatin药物模块DE和DF，披露于Senter等,Proceedings of the American Association for CancerResearch,卷45,摘要号623,2004年3月28日，明确将其公开内容完整收入本文作为参考。
一个例示性的auristatin实施方案是MMAE，其中波形线指示共价附着至抗体-药物偶联物的接头(L)：
Figure BDA00002807843500251
另一个例示性的auristatin实施方案是MMAF，其中波形线指示共价附着至抗体-药物偶联物的接头(L)(US2005/0238649)：
Figure BDA00002807843500252
包含MMAE或MMAF及各种接头构件（本文有进一步描述）的别的例示性实施方案具有如下结构和缩写（其中Ab是抗体；而p是1到大约8）：
Figure BDA00002807843500253
Figure BDA00002807843500261
典型的是，基于肽的药物模块可通过在两个或更多氨基酸和/或肽片段之间形成肽键来制备。此类肽键可依照例如肽化学领域众所周知的液相合成法来制备(参见E.
Figure BDA00002807843500262
和K.Lübke,“The Peptides”,卷1,pp76-136,1965,Academic Press)。auristatin/多拉司他汀药物模块可依照以下文献中的方法来制备：US5,635,483;US5,780,588;Pettit等(1989)J.Am.Chem.Soc.111:5463-5465;Pettit等(1998)Anti-Cancer Drug Design13:243-277;Pettit,G.R.等Synthesis,1996,719-725;Pettit等(1996)J.Chem.Soc.Perkin Trans.15:859-863;及Doronina(2003)Nat.Biotechnol.21(7):778-784。
加利车霉素
在其它实施方案中，免疫偶联物包含偶联有一个或多个加利车霉素分子的本发明抗体。加利车霉素抗生素家族能够在亚皮摩尔浓度生成双链DNA断裂。关于加利车霉素家族偶联物的制备参见美国专利5,712,374;5,714,586;5,739,116;5,767,285;5,770,701;5,770,710;5,773,001;5,877,296（都是美国Cyanamid公司的）。可用的加利车霉素结构类似物包括但不限于γ1 I、α2 I、α3 I、N-乙酰基-γ1 I、PSAG和θI 1（Hinman等,Cancer Research53:3336-3342(1993);Lode等,Cancer Research58:2925-2928(1998);及上述美国Cyanamid公司的美国专利）。可以与抗体偶联的另一种抗肿瘤药物是QFA，它是一种抗叶酸药。加利车霉素和QFA都具有胞内作用位点，且不易穿过质膜。因此，这些试剂的经由抗体介导的内在化的细胞摄取大大增强了它们的细胞毒效应。
其它细胞毒剂
可以与本发明抗体偶联的其它抗肿瘤剂包括BCNU、链佐星(streptozoicin)、长春新碱(vincristine)、5-氟尿嘧啶、统称为LL-E33288复合物的试剂家族(美国专利5,053,394、5,770,710)、及埃斯波霉素(esperamicin)(美国专利No.5,877,296)。
可用的酶活性毒素及其片段包括白喉毒素A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链（来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)）、蓖麻毒蛋白(ricin)A链、相思豆毒蛋白(abrin)A链、蒴莲根毒蛋白(modeccin)A链、α-帚曲霉素(sarcin)、油桐(Aleutites fordii)毒蛋白、香石竹(dianthin)毒蛋白、美洲商陆(Phytolaca americana)毒蛋白（PAPI、PAPII、和PAP-S）、苦瓜(Momordicacharantia)抑制物、麻疯树毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制物、白树毒蛋白(gelonin)、丝林霉素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、依诺霉素(enomycin)和单端孢菌素(trichothecenes)。参见例如1993年10月28日公布的WO93/21232。
本发明进一步涵盖抗体和具有核酸降解活性的化合物（例如核糖核酸酶或DNA内切核酸酶，诸如脱氧核糖核酸酶；DNA酶）之间形成的免疫偶联物。
为了选择性破坏肿瘤，抗体可包含高度放射性原子。多种放射性同位素可用于生成放射偶联抗体。例子包括At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素。在将偶联物用于检测时，它可包含放射性原子用于闪烁照相研究，例如tc99m或I123，或是包含自旋标记物用于核磁共振(NMR)成像（也称为磁共振成像，MRI），诸如同样是碘-123、碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰或铁。
可以以已知方式将放射性标记物或其它标记物掺入偶联物。例如，可生物合成肽，或是通过化学氨基酸合成法合成肽，其中使用涉及例如氟-19代替氢的合适氨基酸前体。可以经肽中的半胱氨酸残基来附着标记物，诸如tc99m或I123、Re186、Re188和In111。可以经赖氨酸残基来附着钇-90。IODOGEN法（Fraker等(1978)Biochem.Biophys.Res.Commun.80:49-57）可用于掺入碘-123。《Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy》（Chatal,CRC Press,1989）详细记载了其它方法。
可使用多种双功能蛋白质偶联剂来制备抗体和细胞毒剂的偶联物，诸如N-琥珀酰亚氨基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)，琥珀酰亚氨基-4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)，亚氨基硫烷(IT)，亚氨酸酯（诸如盐酸己二酰亚氨酸二甲酯）、活性酯类（诸如辛二酸二琥珀酰亚氨基酯）、醛类（诸如戊二醛）、双叠氮化合物（诸如双(对-叠氮苯甲酰基)己二胺）、双重氮衍生物（诸如双(对-重氮苯甲酰基)-乙二胺）、二异硫氰酸酯（诸如甲苯2,6-二异氰酸酯）、和双活性氟化合物（诸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯）的双功能衍生物。例如，可以如Vitetta等,Science238:1098(1987)中所述制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14标记的1-异硫氰酸苄基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸与抗体偶联的例示性螯合剂。参见WO94/11026。接头可以是便于在细胞中释放细胞毒性药物的“可切割接头”。例如，可使用酸不稳定接头、肽酶敏感接头、光不稳定接头、二甲基接头或含二硫化物接头(Chari等,Cancer Research52:127-131(1992);美国专利No.5,208,020)。
本发明的化合物明确涵盖但不限于用下列交联接头试剂制备的ADC：BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、sulfo-EMCS、sulfo-GMBS、sulfo-KMUS、sulfo-MBS、sulfo-SIAB、sulfo-SMCC、sulfo-SMPB、和SVSB（琥珀酰亚氨基-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯），它们可通过商业途径获得（例如PierceBiotechnology,Inc.,Rockford,IL.,U.S.A）。参见2003-2004年度应用手册和产品目录(2003-2004Applications Handbook and Catalog)第467-498页。
抗体-药物偶联物的制备
在本发明的抗体-药物偶联物(ADC)中，抗体(Ab)经接头(L)偶联有一个或多个药物模块(D)，例如大约1个到大约20个药物模块每个抗体。在一个实施方案中，每个抗体的药物模块(D)的数目是大约1个到大约5个，或者大约2个到大约6个，或者大约2个到大约5个，或者大约3个到大约4个药物模块每个抗体。因为每个抗体的药物模块的数目通常是一群抗体药物偶联物中所有偶联物的平均数目，所以每个抗体的药物模块的数目可以不是整数。可以采用本领域技术人员知道的有机化学反应、条件、和试剂通过数种路径来制备通式I的ADC，包括：(1)抗体的亲核基团经共价键与二价接头试剂反应形成Ab-L，接着与药物模块D反应；和(2)药物模块的亲核基团经共价键与二价接头试剂反应形成D-L，接着与抗体的亲核基团反应。本文中描述了用于制备ADC的别的方法。
Ab-(L-D)p          式I
接头可以由一种或多种接头构件构成。例示性的接头构件包括6-马来酰亚氨基己酰基(“MC”)、马来酰亚氨基丙酰基(“MP”)、缬氨酸-瓜氨酸(“val-cit”)、丙氨酸-苯丙氨酸(“ala-phe”)、对氨基苄氧羰基(“PAB”)、N-琥珀酰亚氨基4-(2-吡啶基硫代)戊酸酯(“SPP”)、N-琥珀酰亚氨基4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己烷-1羧酸酯(“SMCC”)、和N-琥珀酰亚氨基(4-碘-乙酰基)氨基苯甲酸酯(“SIAB”)。在一个实施方案中，所述接头是缬氨酸-瓜氨酸-对氨基苄氧羰基(“vc-PAB”)。本领域知道别的接头构件，本文也描述了一些。
在有些实施方案中，接头可包含氨基酸残基。例示性的氨基酸接头构件包括二肽、三肽、四肽或五肽。例示性的二肽包括：缬氨酸-瓜氨酸(vc或val-cit)、丙氨酸-苯丙氨酸(af或ala-phe)。例示性的三肽包括：甘氨酸-缬氨酸-瓜氨酸(gly-val-cit)和甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸(gly-gly-gly)。构成氨基酸接头构件的氨基酸残基可以包括天然存在的氨基酸残基，以及次要氨基酸和非天然存在氨基酸类似物，诸如瓜氨酸。氨基酸接头构件可以在它们对特定酶（例如肿瘤相关蛋白酶，组织蛋白酶B、C和D，或纤溶酶蛋白酶）的酶促切割的选择性方面进行设计和优化。
例示性接头构件结构如下所示（其中波形线指示ADC其它构件共价附着的位点）：
别的例示性接头构件和缩写包括（其中描绘了抗体(Ab)和接头，而p是1到大约8）：
Figure BDA00002807843500301
抗体的亲核基团包括但不限于：(i)N末端胺基；(ii)侧链胺基，例如赖氨酸；(iii)侧链硫醇基，例如半胱氨酸；和(iv)糖基化抗体中糖的羟基或氨基。胺、硫醇、和羟基基团是亲核的，能够与接头模块上的亲电子基团反应而形成共价键，而接头试剂包括：(i)活性酯类，诸如NHS酯、HOBt酯、卤代甲酸酯、和酸性卤化物；(ii)烃基和苄基卤化物，诸如卤代乙酰胺；(iii)醛类、酮类、羧基、和马来酰亚胺基团。某些抗体具有可还原的链间二硫键，即半胱氨酸桥。可通过还原剂诸如DTT（二硫苏糖醇）处理，从而具有与接头试剂偶联的反应性。每个半胱氨酸桥理论上会形成两个反应性硫醇亲核体。可将额外亲核基团引入抗体中，经由赖氨酸与2-亚氨基硫烷（Traut氏试剂）的反应，导致胺转变为硫醇。可以通过导入一个、两个、三个、四个、或更多半胱氨酸残基（例如通过制备包含一个或多个非天然半胱氨酸氨基酸残基的突变型抗体）而将反应性硫醇基导入抗体（或其片段）中。
还可通过修饰抗体以导入能与接头试剂或药物上的亲核取代基起反应的亲电子模块来生成本发明的抗体-药物偶联物。可以用例如高碘酸盐氧化剂氧化糖基化抗体的糖，从而形成可与接头试剂或药物模块的胺基团反应的醛或酮基团。所得亚胺Schiff碱基可形成稳定的连接，或者可以用例如硼氢化物试剂还原而形成稳定的胺连接。在一个实施方案中，糖基化抗体的碳水化合物部分与半乳糖氧化酶或偏高碘酸钠的反应可以在蛋白质中生成羰基（醛和酮），其能与药物上的适宜基团反应(Hermanson,BioconjugateTechniques)。在另一个实施方案中，包含N-末端丝氨酸或苏氨酸残基的蛋白质能与偏高碘酸钠反应，导致在第一个氨基酸处生成醛(Geoghegan和Stroh,(1992)Bioconjugate Chem.3:138-146；US5362852)。此类醛能与药物模块或接头亲核体反应。
类似的，药物模块上的亲核基团包括但不限于：胺、硫醇、羟基、酰肼、肟、肼、缩氨基硫脲、肼羧酸酯、和芳基酰肼基团，它们能够与接头模块上的亲电子基团反应而形成共价键，而接头试剂包括：(i)活性酯类，诸如NHS酯、HOBt酯、卤代甲酸酯、和酸性卤化物；(ii)烃基和苄基卤化物，诸如卤代乙酰胺；(iii)醛类、酮类、羧基、和马来酰亚胺基团。
用于将接头-药物模块偶联至细胞靶向蛋白质（诸如抗体、免疫球蛋白或其片段）的方法可见于例如US5,208,020;US6,441,163;WO2005037992;WO2005081711;和WO2006/034488，都明确地完整收入本文作为参考。
或者，可通过例如重组技术或肽合成来制备包含抗体和细胞毒剂的融合蛋白。DNA的长度可以包含各自编码偶联物的两部分的区域，彼此或是毗邻或是由编码接头肽的区域分开，该接头肽不破坏偶联物的期望特性。
在又一个实施方案中，可以将抗体与“受体”（诸如链霉亲合素）偶联从而用于肿瘤预先靶向，其中对患者施用抗体-受体偶联物，接着使用清除剂由循环中清除未结合的偶联物，然后施用与细胞毒剂（例如放射性核苷酸）偶联的“配体”（例如亲合素）。
在免疫偶联物的一个实施方案中，所述细胞毒剂D是式DE或DF的auristatin
Figure BDA00002807843500321
且其中R2和R6各是甲基；R3和R4各是异丙基；R7是仲丁基；各个R8独立地选自CH3、O-CH3、OH、和H；R9是H；R10是芳基；Z是–O–或–NH–；R11是H、C1-C8烃基、或–(CH2)2–O–(CH2)2–O–(CH2)2–O–CH3；且R18是–C(R8)2–C(R8)2–芳基；且
(d)p的范围为大约1至8。
关于任何上述免疫偶联物，进一步提供了以下实施方案。在一个实施方案中，免疫偶联物具有体外或体内细胞杀伤活性。在一个实施方案中，所述接头经抗体上的硫醇基团附着于抗体。在一个实施方案中，所述接头是蛋白酶可切割的。在一个实施方案中，所述接头包含val-cit二肽。在一个实施方案中，所述接头包含对氨基苄基单元。在一个实施方案中，所述对氨基苄基单元部署在药物与接头中的蛋白酶切割位点之间。在一个实施方案中，所述对氨基苄基单元是对氨基苄氧羰基(PAB)。在一个实施方案中，所述接头包含6-马来酰亚氨基己酰基。在一个实施方案中，所述6-马来酰亚氨基己酰基部署在抗体与接头中的蛋白酶切割位点之间。上述实施方案可以单独的或彼此任意组合的发生。
在一个实施方案中，所述药物选自MMAE和MMAF。在一个实施方案中，所述免疫偶联物具有通式
Figure BDA00002807843500322
其中Ab是任何上述抗STEAP-1抗体，S是硫原子，而p的范围是自大约2至大约5。在一个实施方案中，所述免疫偶联物具有通式
Figure BDA00002807843500331
其中Ab是任何上述抗STEAP-1抗体，S是硫原子，而p的范围是自大约1至大约6、自大约2至大约5、自大约2至大约6、自大约2至大约4、自大约2至大约3、自大约3至大约4、自大约3至大约5、自大约3至大约6、或自大约4至大约6。
经标记抗体成像方法
在本发明的另一个实施方案中，可以用放射性核素、荧光染料、生物发光触发性底物模块、化学发光触发性底物模块、酶、和其它检测标记物通过半胱氨酸硫醇来标记半胱氨酸改造抗体以用于具有诊断、药效学和治疗应用的成像实验。一般而言，通过注射、输注或口服摄入给活的生物体（例如人、啮齿类、或其它小动物）、灌注器官、或组织样品施用经过标记的半胱氨酸改造抗体，即“生物标志物”或“探针”。在一段时间里检测探针的分布并由影像显示。
锆标记试剂
在本发明的另一个实施方案中，基于89Zr的免疫PET的开发使得能够测量小鼠和人中的靶物表达和抗体分布(Dijkers等,Nature Vol.87Number5(May2010))。作为靶物表达和抗体分布的测量，免疫PET可能在测定ADC靶物在原发性与转移性病灶上，特别是在***和其它癌症中的分布中具有价值。
可以以已知方式在偶联物中掺入放射性同位素或其它标记物(Fraker等(1978)Biochem.Biophys.Res.Commun.80:49-57;"Monoclonal Antibodies inImmunoscintigraphy"Chatal,CRC Press1989)。碳-14标记的1-异硫氰酸苄基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核酸与抗体偶联的例示性螯合剂(WO94/11026)。
制品
在本发明的另一个实施方案中，提供了包含可用于治疗上文所述病症的物质的制品或“试剂盒”。所述制品包括容器和容器上的或与容器相关的标签或包装插页。合适的容器包括例如瓶、管形瓶、注射器、泡罩包装、等。所述容器可以用多种材料制成，诸如玻璃或塑料。所述容器装有有效治疗所述疾患的抗体-药物偶联物(ADC)组合物，可以具有无菌存取口（例如所述容器可以是具有皮下注射针可刺穿的塞子的静脉内溶液袋或管形瓶）。所述组合物中的至少一种活性药剂是ADC。标签或包装插页指明该组合物用于治疗所选疾患，诸如癌症。或者/另外，所述制品可进一步包括第二（或第三）容器，其中装有药学可接受的缓冲液，诸如注射用抑菌水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏(Ringer)溶液和右旋糖溶液。它可进一步包括从商业和用户立场出发需要的其它物质，包括其它缓冲液、稀释剂、滤器、针头、和注射器。
药物组合物
一方面，提供了包含任何上述免疫偶联物和药学可接受载体的药物组合物。一方面，提供了治疗***、肺、结肠、膀胱、或卵巢细胞增殖性病症、或尤因氏肉瘤的方法，其中所述方法包括给个体施用所述药物组合物。在一个实施方案中，所述***、肺、结肠、膀胱、和卵巢癌和尤因氏肉瘤细胞增殖性病症是原发性***、肺、结肠、膀胱、或卵巢癌或尤因氏肉瘤的转移。在一个实施方案中，所述细胞增殖性病症与细胞表面上STEAP-1表达升高有关。
一方面，提供了抑制细胞增殖的方法，其中所述方法包括在容许免疫偶联物结合至STEAP-1的条件下使细胞暴露于任何上述免疫偶联物。在一个实施方案中，所述***、肺、结肠、膀胱、或卵巢细胞或尤因氏肉瘤是肿瘤细胞。在一个实施方案中，所述肿瘤细胞是正经历或怀疑正经历***、肺、结肠、膀胱细胞或尤因氏肉瘤增殖性病症（包括但不限于原发性***、肺、结肠、膀胱细胞癌肿瘤或尤因氏肉瘤肿瘤的转移）的哺乳动物的***、肺、结肠、膀胱、或卵巢肿瘤细胞或尤因氏肉瘤细胞。在一个实施方案中，所述***、肺、结肠、膀胱细胞或尤因氏肉瘤是异种移植物。在一个实施方案中，所述暴露发生于体外。在一个实施方案中，所述暴露发生于体内。
一方面，提供了使用本发明的抗STEAP-1抗体的方法，其用以测定发生***、肺或结肠细胞增殖性病症（或此类病症的原发性发病的转移）的哺乳动物中的血清可溶性STEAP-1、测量疾病的临床进展或消退、或评估肿瘤负荷或复发。
附图简述
本专利或申请文件包含至少一幅彩色绘制的附图。在提出请求并支付必要费用后专利局会提供附有彩色附图的本专利或专利申请公开文本的拷贝。
图1描绘了与来自小鼠和猕猴(cyno)的STEAP-1（分别为SEQ ID NO:2和3）比对的人STEAP-1(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列。以带阴影的方框标示和标记了胞外结构域1、2、和3。
图2A-2B：图2A描绘了与嵌合抗体（120嵌合体）和人源化抗体（120嫁接体）比对且与人亚组III序列比对的鼠120.545抗STEAP-1抗体的轻链可变区氨基酸序列。给CDR划上方框(CDR-L1、CDR-L2、和CDR-L3)。包夹CDR的序列是框架序列(FR-L1至FR-L4)。依照Kabat编号方式给序列编号。关于划了方框的CDR指明了Kabat、Chothia和接触CDR。图2B描绘了与嵌合抗体（120嵌合体）和人源化抗体（120嫁接体）比对且与人κI序列比对的鼠抗STEAP-1抗体(120.545)的重链可变区氨基酸序列。人源化变体24、37、48、67、和37/48、67、71、和78是通过在120嫁接抗体重链中进行以下氨基酸变化而制备的：A24V、V37I、V48M、F67I、和L78F。给CDR划上方框。FR-H1、FR-H2、FR-H3和FR-H4序列包夹CDR(CDR-H1、CDR-H2、和CDR-H3)。依照Kabat编号方式给序列编号。关于划了方框的CDR指明了Kabat、Chothia和接触CDR。
图3A和3B显示了用于实施本发明的例示性的受体人重链可变域(VH)共有框架序列，其具有如下序列标识符，其中按FR-H1、FR-H2、FR-H3、FR-H4的顺序列出了FR SEQ ID NO：
-人VH亚组I共有框架“A”减去Kabat CDR(SEQ ID NO:26,27,28,29)。
-人VH亚组I共有框架“B”、“C”和“D”减去延伸的高变区(SEQ ID NO:30,31,28,29；SEQ ID NO:30,31,32,29；和SEQ ID NO:30,31,33,29)。
-人VH亚组II共有框架“A”减去Kabat CDR(SEQ ID NO:34,35,36,29)。
-人VH亚组II共有框架“B”、“C”和“D”减去延伸的高变区(SEQ ID NO:37,38,36,29；SEQ ID NO:37,38,39,29；和SEQ ID NO:37,38,40,29)。
-人VH亚组III共有框架“A”减去Kabat CDR(SEQ ID NO:41,42,43,29)。
-人VH亚组III共有框架“B”、“C”和“D”减去延伸的高变区(SEQ ID NO:44,45,43,29；SEQ ID NO:44,45,46,29；和SEQ ID NO:44,45,46,29)。
-人VH受体1框架“A”减去Kabat CDR(SEQ ID NO:48,42,49,29)。
-人VH受体框架“B”和“C”减去延伸的高变区(SEQ ID NO:44,45,49,29；和SEQ ID NO:44,45,50,29)。
-人VH受体2框架“A”减去Kabat CDR(SEQ ID NO:48,42,51,29)。
-人VH受体2框架“B”、“C”和“D”减去延伸的高变区(SEQ ID NO:44,45,51,29；SEQ ID NO:44,45,52,29；和SEQ ID NO:44,45,53,29)。
图4A和4B显示了用于实施本发明的例示性的受体人轻链可变域(VL)共有框架序列，其具有如下序列标识符：
-人VLκ亚组I-1共有框架(κv1-1):SEQ ID NO:54,55,56,57
-人VLκ亚组I共有框架(κv1):SEQ ID NO:54,58,56,57
-人VLκ亚组II共有框架(κv2):SEQ ID NO:58,59,60,57
-人VLκ亚组III共有框架(κv3):SEQ ID NO:61,62,63,57
-人VLκ亚组IV共有框架(κv4):SEQ ID NO:64,65,66,57
图5描绘了天然序列人IgG Fc区序列，人IgG1(humIgG1)（非A同种异型，SEQ ID NO:85；和A同种异型，其中SEQ ID NO:85内的氨基酸序列SREEM变成SRDEL）、人IgG2(humIgG2)(SEQ ID NO:86)、人IgG3(humIgG3)(SEQ IDNO:87)和人IgG4(humIgG4)(SEQ ID NO:88)的比对，其中用星号标示序列间差异。序列上方的数字代表EU编号***。还显示了例示性的κ恒定区。
图6A-6D描绘了对每种抗体或变体在噬菌体上的展示水平进行标准化的FACS分析。图6A显示了在表达STEAP-1的细胞（LB50）上对四种例示性抗体而言的FACS位移(shift)。图6B显示了在不表达STEAP-1的细胞（S408）上如附图和实施例1所指示的数种抗体的FACS位移。图6C和6D是对噬菌体展示水平进行标准化后的FACS位移比对。
图7A-7F以图表方式描绘了显示抗STEAP-1鼠、嵌合和人源化型式24抗体对细胞表面上表达的人STEAP-1结合的FACS分析。图7A-7C表明抗STEAP-1鼠120、嵌合120和人源化120v.24结合人和猕猴的STEAP-1，但不结合小鼠的STEAP-1。图7D-7F是显示鼠120、120嵌合体和人源化120v.24（克隆67）对细胞表面上表达的人STEAP-1结合的FACS曲线图。外源STEAP-1在293细胞（命名为LB50细胞）和PC3细胞（命名为PS5.4细胞）中稳定表达（图7D和7E），并且在LNCaP BR细胞中内源性表达（图7F）。
图8A和8B：图8A是显示在***肿瘤（LNCaP-Ner细胞）异种移植物模型中施用3mg/kg的鼠抗STEAP-1120-MC-vc-PAB-MMAE是有效的曲线图。参见实施例4。图8B是显示在LNCaP细胞异种移植物***肿瘤模型中单剂施用人源化抗STEAP-1抗体120v.24-MC-vc-PAB-MMAE(3mg/kg)、120v.24-MC-MMAF(6mg/kg)、120v.24-MC-MMAF(12mg/kg)和抗STEAP-1120嵌合体-MC-vc-PAB-MMAE(3mg/kg)表现出有效的曲线图。参阅实施例4。
图9是显示在移植有LNCaP细胞的去势SCID米色小鼠的***癌异种移植物模型中施用3mg/kg抗STEAP-1抗体120嵌合体-MC-vc-PAB-MMAE（缩写为抗STEAP vcMMAE）或6mg/kg抗STEAP-1120嵌合体-MC-MMAF（缩写为抗STEAP mcMMAF）表现出有效的曲线图。参阅实施例4。
图10是显示在移植有LuCap77细胞的SCID米色雄性小鼠（受雄激素控制的(androgen dependent)）的***癌异种移植物模型中施用抗STEAP-1抗体120嵌合体-MC-vc-PAB-MMAE（缩写为抗STEAP vcMMAE）（3mg/kg）表现出有效的曲线图。参阅实施例4。
图11是显示对移植有LuCap35V***肿瘤的去势SCID米色小鼠施用3mg/kg人源化抗STEAP-1抗体120v.24-MC-vc-PAB-MMAE、6mg/kg和12mg/kg人源化抗STEAP-1抗体120v.24-MC-MMAF表现出相对于对照而言有效的曲线图。参阅实施例4。
图12是描绘包埋细胞膜中的STEAP-1的图解。抗STEAP-1抗体120的结合是依赖构象的并且不识别STEAP-1的线性表位。
图13A-13D显示了通过免疫组化所检测到的在细胞表面上表达的STEAP-1。图13A显示了在细胞表面上表达外源STEAP-1的293细胞的免疫组化染色。图13B显示了在细胞表面上表达外源STEAP-1的PC3细胞的免疫组化染色。图13C显示了在细胞表面上表达内源STEAP-1的LNCaP细胞的免疫组化染色。图13D显示了在细胞表面上表达内源STEAP-1的LuCAP77细胞的免疫组化染色。
图14A-14E是显示抗STEAP-1抗体120v.24-MCMMAF和抗STEAP-1抗体120v.24-MC-vc-PAB-MMAE在体外杀死表达STEAP-1的细胞的相对效力的图。PS5.4细胞（图14A）是经编码STEAP-1的载体转化以在细胞表面上表达STEAP-1的PC3细胞。LB50细胞（图14B）是经编码STEAP-1的载体转化以在细胞表面上表达STEAP-1的293细胞。LNCaP细胞（图14C）内源性地表达STEAP-1。“PC3vec”（图14D）和“293vec”（图14E）分别指经载体对照转化的293细胞和PC3细胞。
图15显示了半胱氨酸改造抗STEAP-1抗体-药物偶联物(ADC)的描绘，其中将药物模块附着至轻链(LC-ADC)、重链(HC-ADC)和Fc区(Fc-ADC)中改造的半胱氨酸基团。
图16显示了下列步骤：(i)用还原剂TCEP（盐酸三(2-羧基乙基)膦）(tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride)还原半胱氨酸改造抗STEAP-1抗体(ThioMab)中的半胱氨酸二硫化物加合物及链间和链内二硫化物；(ii)用dhAA（脱氢抗坏血酸）部分地氧化，即再氧化以再形成链间和链内二硫化物；和(iii)将再氧化后的抗体与药物-接头中间体偶联以形成半胱氨酸改造抗STEAP-1抗体-药物偶联物(ADC)。
图17A-17C显示了为产生半胱氨酸改造抗STEAP-1抗体（thio-mAb）而进行的氨基酸替代的位点。17A显示了具有相应顺序编号和依照Kabat***的标准化编号的thio-LC变体V205C。图17B显示了具有相应顺序编号和依照EU***的标准化编号的thio-HC变体A118C。图17C显示了具有相应顺序编号和依照EU***的标准化编号的thio-Fc变体S400C。
图18A-18F描绘了FACS分析，其显示抗STEAP-1thio抗体药物偶联物(TDC)保留与细胞表面上表达的STEAP-1结合的能力。图18A-18C是显示抗STEAP-1TDC thio-人120-vc-PAB-MMAE(LCV205C)（缩写为huSteap1TDC(L205C)vcE）和thio-人120-vc-PAB-MMAE(HCA118C)（缩写为huSteap1TDC(HCA118C)vcE）与细胞表面上表达的人STEAP-1结合的FACS图。外源STEAP-1在293细胞（命名为LB50细胞）和PC3细胞（命名为PS5.4细胞）中稳定表达（图18A和18B），并且在LNCaP BR细胞中内源性表达（图18C）。图18D、18E和18F分别是图7A、7B和7C中所显示的FACS位移的比对。
图19A-19C显示了抗STEAP-1thio抗体-药物偶联物(TDC)thio-人120-vc-PAB-MMAE(LCV205C)（缩写为huSteap1TDC(L205C)vcE）和thio-人120-vc-PAB-MMAE(HCA118C)（缩写为huSteap1TDC(HCA118C)vcE）在体外杀死表达STEAP-1的细胞的相对效力。LB50细胞（图19A）是经编码STEAP-1的载体转化以使STEAP-1在细胞表面上表达的293细胞。PS5.4细胞（图19B）是经编码STEAP-1的载体转化以使STEAP-1在细胞表面上表达的PC3细胞。LNCaP细胞（图19C）内源性表达STEAP-1。
图20是显示在移植有LNCaP细胞的雄性SCID米色小鼠（受雄激素控制的）的***癌异种移植物模型中施用3mg/kg抗STEAP-1TDC thio-人120-vc-PAB-MMAE(HCA118C)（缩写为hu Steap1HC TDC vcE）表现出相对于对照而言是有效的曲线图。参阅实施例8。
图21是显示在移植有LNCaP细胞的雄性SCID米色小鼠（受雄激素控制的）的***癌异种移植物模型中施用3mg/kg抗STEAP-1TDC thio-人120-vc-PAB-MMAE(HCA118C)（缩写为hu Steap1HC TDC vcE）或1、3或6mg/kg thio-人120-MC-MMAF(HCA118C)（缩写为hu Steap1HC TDC mcF）表现出相对于对照而言是有效的曲线图。参阅实施例8。
图22是显示在移植有LuCaP35V***肿瘤的去势SCID米色小鼠的***癌异种移植物模型中施用3mg/kg抗STEAP-1TDC thio-人120-vc-PAB-MMAE(HCA118C)（缩写为hu Steap1HC TDC vcE）或3或6mg/kgthio-人120-MC-MMAF(HCA125C)（缩写为hu Steap1HC TDC mcF）表现出相对于对照而言是有效的曲线图。参阅实施例8。
图23显示了为产生命名为“Simmons IV”或简称“SGIV”的半胱氨酸改造抗STEAP-1抗体(thio-mAb)而进行的氨基酸替代的位点。SGIV的轻链氨基酸序列(SEQ ID NO:90)以与mu120抗体(SEQ ID NO:89)和120.v24抗体(SEQID NO:91)的轻链比对的形式显示。具有相应顺序编号和依照Kabat***的标准化编号的thio-LC变体SGIV以与具有相应顺序编号和依照Kabat***标准化编号的亲本抗体mu120以及thio-LC变体120.v24比对的形式显示。给CDR划上方框(CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3)。包夹CDR的序列是框架序列(FR-L1至FR-L4)。依照Kabat编号方式给序列编号。关于划了方框的CDR指明了Kabat、Chothia和接触CDR。参阅实施例9。
图24显示了为产生SGIV和120v.24抗体的各种半胱氨酸改造抗STEAP-1抗体(thio-mAb)变体而进行的框架氨基酸替代的位点。SGIV轻链氨基酸序列以依照Kabat***的标准化编号，与变体LS.VLVH1(SEQ ID NO:92)；LS.VLVH2(SEQ ID NO:93)；LS.Q(SEQ ID NO:94)；和LS.CH1(SEQ IDNO:95)的比对的形式显示。依照Kabat***标准化编号的120.v24轻链氨基酸序列以与变体ED.FW1(SEQ ID NO:96)；ED.FW2(SEQ ID NO:97)；ED.FW3(SEQ ID NO:98)；ED.all(SEQ ID NO:99)；ED.Pro(SEQ ID NO:100)；和ED.pl(SEQ ID NO:101)比对的形式显示。给CDR划上方框。依照Kabat编号方式给序列编号。参见实施例9。
图25显示了与LNCaP.BR细胞表面上表达的STEAP-1结合的抗体的Scatchard图。使用120.v24抗体（图25A-25D）和SGIV变体（图25E-25H）测量了一式两份样品。参见实施例9。
图26显示了与293.LB50细胞表面表达的STEAP-1结合的抗体的Scatchard图。使用120.v24抗体（图26A-26D）和SGIV变体（图26E-26H）测量了一式两份样品。参见实施例9。
图27是比较Scatchard分析所测量的mu1789、mu120、Fc嵌合体、人源化120.v24、thio-120.v24和thio-SGIV抗体在PC-3-PS5.4、293-LB50和LNCaP-BR细胞中以及在瞬时表达STEAP-1的293细胞中平均结合亲和力的表。参见实施例9。
图28描绘了显示SGIV和120.v24抗体样本在经STEAP-1稳定转染的细胞（293STEAP-1LB48、293STEAP-1LB50和293STEAP-1LB53）上的FACS位移的FACS分析。参见实施例9。
图29显示了在生成SGIV或120.v24抗体的细胞的不同收获物中所观察到的抗体滴度。
图30显示服用100uCi ZR89-抗STEAP-1并在4天后成像的动物中的锆-89PET成像，其中Zr89-STEAP-1的摄取在Lucap35V中最高且在Lucap96.1中最低，与体外结果相似。
本发明实施方案的详述
提供了能结合STEAP-1的分离的抗体。还提供了包含抗STEAP-1抗体的免疫偶联物。本发明的抗体和免疫偶联物可用于例如与STEAP-1表达改变（例如表达升高）有关的病症的诊断或治疗。在某些实施方案中，本发明的抗体或免疫偶联物可用于细胞增殖性病症（诸如肿瘤或癌症）的诊断或治疗。在某些实施方案中，STEAP-1在***、肺、或结肠组织的肿瘤或癌症中表达。在某些实施方案中，本发明的抗体或免疫偶联物可用于STEAP-1（例如细胞表面上所表达的STEAP-1）的检测。在某些实施方案中，本发明的抗体或免疫偶联物可用于***、肺或结肠组织的正常和/或肿瘤或癌细胞表面上STEAP-1表达的检测。
提供了编码抗STEAP-1抗体的多核苷酸。提供了包含编码抗STEAP-1抗体的多核苷酸的载体，并提供了包含此类载体的宿主细胞。还提供了包含本发明的多核苷酸、抗STEAP-1抗体、或免疫偶联物中任何一种或多种的组合物（包括药物配制剂）。
提供了用抗STEAP-1抗体、抗体药物偶联物或免疫偶联物治疗细胞增殖性病症（包括但不限于肿瘤或癌症）的方法。此类方法包括但不限于哺乳动物的***、肺或结肠中的肿瘤或癌症的治疗。提供了使用抗STEAP-1抗体、抗体药物偶联物或免疫偶联物检测组织细胞上的STEAP-1表达的方法。此类方法包括但不限于作为非限制性例子的***、肺、或结肠细胞的正常细胞、肿瘤细胞、或癌细胞上STEAP-1表达的检测。
通用技术
本文中所描述或提到的技术和规程一般得到了本领域技术人员的充分理解，而且通常使用常规方法得以采用，诸如例如下列文献中所记载的广泛利用的方法：Sambrook等,Molecular Cloning:A Laboratory Manual第3版(2001)Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.;Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel等编,2003);丛书Methods in Enzymology(Academic Press,Inc.):PCR2:A Practical Approach(M.J.MacPherson,B.D.Hames和G.R.Taylor编,1995),Harlow和Lane编(1988)Antibodies,A Laboratory Manual,and Animal Cell Culture(R.I.Freshney编,1987);Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait编,1984);Methods in Molecular Biology,Humana Press;Cell Biology:A Laboratory Notebook(J.E.Cellis编,1998)Academic Press;Animal Cell Culture(R.I.Freshney编,1987);Introduction to Cell and Tissue Culture(J.P.Mather和P.E.Roberts,1998)Plenum Press;Cell and Tissue Culture:Laboratory Procedures(A.Doyle,J.B.Griffiths和D.G.Newell编,1993-8)J.Wiley and Sons;Handbook of Experimental Immunology(D.M.Weir和C.C.Blackwell编);Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(J.M.Miller和M.P.Calos编,1987);PCR:The Polymerase Chain Reaction,(Mullis等编,1994);Current Protocols in Immunology(J.E.Coligan等编,1991);Short Protocols in Molecular Biology(Wiley and Sons,1999);Immunobiology(C.A.Janeway和P.Travers,1997);Antibodies(P.Finch,1997);Antibodies:A Practical Approach(D.Catty编,IRLPress,1988-1989);Monoclonal Antibodies:A Practical Approach(P.Shepherd和C.Dean编,Oxford University Press,2000);Using Antibodies:A Laboratory Manual(E.Harlow和D.Lane(Cold Spring Harbor Laboratory Press,1999);The Antibodies(M.Zanetti和J.D.Capra编,Harwood Academic Publishers,1995);及Cancer:Principles and Practice of Oncology(V.T.DeVita等编,J.B.LippincottCompany,1993)。 89 Zr Immuno-PET:Comphrehensive Procedures for the Production of  89 Zr-Labeled Monoclonal Antibodies(Verel I.等,J Nucl Med;44:1271-1281,2003)。
定义和缩写
定义
“分离的”抗体指已经鉴定且自其天然环境的一种成分分开和/或回收的抗体。其天然环境的污染物成分指会干扰该抗体的研究、诊断或治疗用途的物质，可包括酶、激素、和其它蛋白质性质或非蛋白质性质的溶质。在有些实施方案中，抗体被纯化至(1)根据例如Lowry法的测定，抗体重量超过95%，而在有些实施方案中，重量超过99%，(2)足以通过使用例如转杯式测序仪获得至少15个残基的N-末端或内部氨基酸序列的程度，或(3)根据还原性或非还原性条件下的SDS-PAGE及使用例如考马斯蓝或银染色，达到同质。既然抗体天然环境的至少一种成分不会存在，那么分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体。然而，分离的抗体通常会通过至少一个纯化步骤来制备。
“分离的”核酸分子指与例如该核酸分子的天然环境中通常与之关联的至少一种其它核酸分子分开的核酸分子。分离的核酸分子进一步包括包含在正常情况下表达该核酸分子的细胞中的核酸分子，但是所述核酸分子是以染色体外形式存在的或在染色体上的定位不同于其天然染色体定位。
“纯化的”意味着分子以至少95%（以重量计）、或至少98%（以包含它的样品的重量计）的浓度存在于样品中。
短语“基本上相似”或“基本上相同”在用于本文时表示两个数值（例如，一个与本发明的抗体有关而另一个与参照/比较抗体有关）之间足够高的相似程度，以致本领域技术人员会认为在用所述数值（例如Kd值）所测量的生物学特性背景内两个数值之间的差异具有很小的或没有生物学和/或统计学显著性。作为参照/比较值的函数，所述两个数值之间的差异例如小于约50%，小于约40%，小于约30%，小于约20%，和/或小于约10%。
短语“实质性降低”或“实质性不同”在用于本文时表示两个数值（通常一个与某分子有关而另一个与参照/比较分子有关）之间足够高的差异程度，以致本领域技术人员会认为在用所述数值（例如Kd值）所测量的生物学特性背景内两个数值之间的差异具有统计学显著性。作为参照/比较分子该数值的函数，所述两个数值之间的差异例如大于约10%，大于约20%，大于约30%，大于约40%，和/或大于约50%。
术语“载体”在用于本文时意指能够运输与其连接的另一核酸的核酸分子。一类载体是“质粒”，指其中可连接别的DNA区段的环状双链DNA。另一类载体是噬菌体载体。另一类载体是病毒载体，其中可将别的DNA区段连接入病毒基因组中。某些载体能够在其所导入的宿主细胞中自主复制（例如具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体）。其它载体（例如非附加型哺乳动物载体）能在导入宿主细胞中后整合入宿主细胞的基因组中，由此随着宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导与其可操作连接的基因表达。此类载体在本文中称为“重组表达载体”，或简称为“表达载体”。通常，在重组DNA技术中有用的表达载体常常是质粒形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可互换使用，因为质粒是载体的最常用形式。
“多核苷酸”或“核酸”在本文中可互换使用，指任何长度的核苷酸聚合物，包括DNA和RNA。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、经过修饰的核苷酸或碱基、和/或其类似物，或者是可通过DNA或RNA聚合酶或者通过合成反应掺入聚合物中的任何底物。多核苷酸可包含经过修饰的核苷酸，诸如甲基化核苷酸及其类似物。如果有的话，对核苷酸结构的修饰可以在装配聚合物之前或之后进行。核苷酸序列可以由非核苷酸组分中断。多核苷酸可以包含合成后进行的修饰，诸如偶联至标记物。其它类型的修饰包括例如“帽”、将一个或多个天然存在的核苷酸用类似物替代、核苷酸间修饰诸如例如具有不带电荷连接（例如膦酸甲酯、磷酸三酯、磷酰胺酯(phosphoamidate)、氨基甲酸酯等）和具有带电荷连接（例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等）的修饰、含有悬垂模块(pendant moiety)诸如例如蛋白质（例如核酸酶、毒素、抗体、信号肽、聚L-赖氨酸等）的修饰、具有嵌入剂（例如吖啶、补骨脂素等）的修饰、含有螯合剂（例如金属、放射性金属、硼、氧化性金属等）的修饰、含有烷化剂的修饰、具有经修饰连接（例如α端基异构核酸(anomeric nucleic acid)等）的修饰、以及未修饰形式的多核苷酸。另外，通常存在于糖类中的任何羟基可以用例如膦酸(phosphonate)基团、磷酸(phosphate)基团替换，用标准保护基团保护，或活化以制备与别的核苷酸的别的连接，或者可偶联至固体或半固体支持物。5'和3'末端OH可磷酸化或者用胺或1-20个碳原子的有机加帽基团模块取代。其它羟基也可衍生成标准保护基团。多核苷酸还可含有本领域普遍知道的核糖或脱氧核糖糖类的类似物形式，包括例如2'-氧-甲基-、2'-氧-烯丙基-、2'-氟-或2'-叠氮-核糖，碳环糖类似物，α-端基异构糖，差向异构糖诸如***糖、木糖或来苏糖、吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖，无环类似物、及碱性(basic)核苷类似物诸如甲基核糖核苷。可用备选连接基团替换一个或多个磷酸二酯连接。这些备选连接基团包括但不限于以下实施方案，其中磷酸酯用P(O)S（“硫代酸酯”(thioate)）、P(S)S（“二硫代酸酯”(dithioate)）、(O)NR2（“酰胺酯”(amidate)）、P(O)R、P(O)OR'、CO、或CH2（“甲缩醛”(formacetal)）替换，其中各个R或R'独立地为H或者取代或未取代的烃基（1-20个C），任选含有醚(-O-)连接、芳基、烯基、环烃基、环烯基或芳烃基(araldyl)。并非多核苷酸中的所有连接都必需是相同的。前述描述适用于本文中提及的所有多核苷酸，包括RNA和DNA。
“寡核苷酸”在用于本文时一般指短的，一般是单链的，一般是合成的，长度一般但不是必需小于约200个核苷酸的多核苷酸。术语“寡核苷酸”与“多核苷酸”并不互相排斥。上文关于多核苷酸的描述平等且完全适用于寡核苷酸。
关于参考多肽序列的“百分比(%)氨基酸序列同一性”定义为比对序列并在必要时引入缺口以获取最大百分比序列同一性后，且不将任何保守替代视为序列同一性的一部分时，候选序列中与参考多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分率。为测定百分比氨基酸序列同一性目的的比对可以以本领域技术范围内的多种方式进行，例如使用公众可得到的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可决定用于比对序列的适宜参数，包括对所比较序列全长获得最大比对所需的任何算法。然而，为了本发明的目的，%氨基酸序列同一性值是使用序列比较计算机程序ALIGN-2获得的。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech公司编写，源代码已经连同用户文档一起提交给美国版权局(USCopyright Office,Washington D.C.,20559)，并以美国版权注册号TXU510087注册。公众可自Genentech公司(South San Francisco,California)得到ALIGN-2程序，或者可以自源代码编译。ALIGN-2程序应当编译成在UNIX操作***（优选数码UNIX V4.0D上）使用。所有序列比较参数由ALIGN-2程序设定且不变。
在采用ALIGN-2来比较氨基酸序列的情况中，给定氨基酸序列A相对于(to)、与(with)、或针对(against)给定氨基酸序列B的%氨基酸序列同一性（或者可表述为具有或包含相对于、与、或针对给定氨基酸序列B的某一%氨基酸序列同一性的给定氨基酸序列A）如下计算：
分数X/Y  乘  100
其中X是由序列比对程序ALIGN-2在该程序的A和B比对中评分为相同匹配的氨基酸残基数，且其中Y是B中的氨基酸残基总数。可以领会，若氨基酸序列A的长度与氨基酸序列B的长度不相等，则A相对于B的%氨基酸序列同一性会不等于B相对于A的%氨基酸序列同一性。除非另有具体说明，本文中所使用的所有%氨基酸序列同一性值都是依照上一段所述，使用ALIGN-2计算机程序获得的。
术语“STEAP-1”在用于本文时指来自任何脊椎动物来源的任何天然STEAP-1，包括哺乳动物，诸如灵长类动物（例如人、猕猴(cyno)）和啮齿类动物（例如小鼠和大鼠），除非另有说明。该术语涵盖“全长”未加工的STEAP-1以及自细胞中加工得到的任何形式的STEAP-1。该术语还涵盖天然存在的STEAP-1变体，例如剪接变体、等位变体、和同等型(isoform)。人STEAP-1的氨基酸序列描绘于图1（SEQ ID NO:1）。在一个实施方案中，STEAP-1在细胞表面上表达，诸如在正常***、肺或结肠细胞的表面上，而且在***、肺或结肠癌细胞或此类癌细胞的转移中具有升高的表达。图1还描绘了来自小鼠和猕猴的STEAP-1的氨基酸序列（分别是SEQ ID NO:2和3）。
“抗体”(Ab)和“免疫球蛋白”(Ig)是具有相似结构特征的糖蛋白。虽然抗体展现出对特定抗原的结合特异性，但是免疫球蛋白包括抗体和一般缺乏抗原特异性的其它抗体样分子二者。后一类多肽例如由淋巴***以低水平生成而由骨髓瘤以升高的水平生成。
术语“抗体”和“免疫球蛋白”以最广义互换使用，包括单克隆抗体（例如全长或完整单克隆抗体）、多克隆抗体、单价抗体、多价抗体、多特异性抗体（例如双特异性抗体，只要它们展现出期望的生物学活性），而且还可以包括某些抗体片段（如本文中更为详细描述的）。抗体可以是嵌合的、人的、人源化的和/或亲和力成熟的。
术语“抗STEAP-1抗体”或“结合STEAP-1的抗体”指能够以足够亲和力结合STEAP-1，使得该抗体可用作靶向STEAP-1的治疗剂和/或诊断剂的抗体。优选的是，抗STEAP-1抗体结合无关、非STEAP-1蛋白的程度小于该抗体对STEAP-1的结合的约10%，根据例如放射免疫测定法(RIA)的测量。在某些实施方案中，结合STEAP-1的抗体具有≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、或≤0.1nM的解离常数(Kd)。在某些实施方案中，抗STEAP-1抗体结合在来自不同物种的STEAP-1间保守的STEAP-1表位。
抗体的“可变区”或“可变域”指抗体重链或轻链的氨基末端结构域。重链的可变域可以称为“VH”。轻链的可变域可以称为“VL”。这些结构域一般是抗体的最易变部分且包含抗原结合位点。
术语“可变的”指可变域中的某些部分在抗体间序列差异广泛且用于每种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性的实情。然而，变异性并非均匀分布于抗体的整个可变域。它集中于轻链和重链可变域中称作互补决定区(CDR)或高变区(HVR)的三个区段。可变域中更加高度保守的部分称作框架区(FR)。天然重链和轻链的可变域各包含四个FR，它们大多采取β-折叠片构象，通过三个形成环状连接且在有些情况中形成β-折叠片结构一部分的CDR连接。每条链中的CDR通过FR非常接近的保持在一起，并与另一条链的CDR一起促成抗体的抗原结合位点的形成(参见Kabat等,Sequences of Proteins ofImmunological Interest,第5版,National Institute of Health,Bethesda,MD.(1991))。恒定域不直接参与抗体对抗原的结合，但展现出多种效应器功能，诸如抗体依赖性细胞的细胞毒性中抗体的参与。
根据其恒定域的氨基酸序列，来自任何脊椎动物物种的抗体（免疫球蛋白）的“轻链”可归入两种截然不同的型中的一种，称作卡帕(κ)和拉姆达(λ)。
根据其重链恒定域的氨基酸序列，抗体（免疫球蛋白）可归入不同的类。免疫球蛋白有五大类：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中有些可进一步分为亚类（同种型），例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。与不同类的免疫球蛋白对应的重链恒定域分别称作α、δ、ε、γ、和μ。不同类的免疫球蛋白的亚基结构和三维构造是众所周知的，一般性描述于例如Abbas等,Cellularand Mol.Immunology,第4版(2000)。抗体可以是抗体与一种或多种其它蛋白质或肽共价或非共价关联而形成的更大融合分子的一部分。
术语“全长抗体”、“完整抗体”和“全抗体”在本文中可互换使用，指基本上完整形式的抗体而非如下文所定义的抗体片段。该术语具体指重链包含Fc区的抗体。
“抗体片段”只包含完整抗体的一部分，其中所述部分保留该部分存在于完整抗体中时通常与之有关的至少一项、多至大多数或所有功能。在一个实施方案中，抗体片段包含完整抗体的抗原结合位点，如此保留结合抗原的能力。在另一个实施方案中，抗体片段，例如包含Fc区的抗体片段，保留通常与Fc区存在于完整抗体中时通常与之有关的至少一项生物学功能，诸如FcRn结合、抗体半衰期调控、ADCC功能和补体结合。在一个实施方案中，抗体片段是体内半衰期与完整抗体基本上相似的单价抗体。例如，此类抗体片段可包含一个抗原结合臂且该抗原结合臂与能够赋予该片段以体内稳定性的Fc序列连接。
抗体的木瓜蛋白酶消化产生：两个相同的抗原结合片段，称为“Fab”片段，各具有一个抗原结合位点；及一个剩余的“Fc”片段，其名称反映了它易于结晶的能力。胃蛋白酶处理产生一个F(ab')2片段，它具有两个抗原结合位点且仍能够交联抗原。
“Fv”是包含完整抗原结合位点的最小抗体片段。在一个实施方案中，双链Fv种类由紧密、非共价结合的一个重链可变域和一个轻链可变域的二聚体组成。在单链Fv(scFv)种类中，一个重链可变域和一个轻链可变域可以通过柔性肽接头共价相连接，使得轻链和重链在与双链Fv种类类似的“二聚体”结构中相结合。正是在这种构造中，每个可变域的三个CDR相互作用而在VH-VL二聚体表面上限定了一个抗原结合位点。六个CDR一起赋予抗体以抗原结合特异性。然而，即使是单个可变域（或是只包含对抗原特异性的三个CDR的半个Fv）也具有识别和结合抗原的能力，只是亲和力低于完整结合位点。
Fab片段包含重链可变域和轻链可变域，而且还包含轻链的恒定域和重链的第一恒定域(CH1)。Fab'片段与Fab片段的不同之处在于重链CH1结构域的羧基末端增加了少数残基，包括一个或多个来自抗体铰链区的半胱氨酸。Fab'-SH是本文中对其中恒定域半胱氨酸残基携带游离硫醇基的Fab'的称谓。F(ab')2抗体片段最初是作为在成对Fab'片段之间有铰链半胱氨酸的成对Fab'片段生成的。还知道抗体片段的其它化学偶联形式。
“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域存在于一条多肽链中。一般而言，scFv多肽在VH与VL结构域之间进一步包含多肽接头，其使得scFv能够形成结合抗原的期望结构。关于scFv的综述参见Pluckthun，于The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,卷113,Rosenburg和Moore编,Springer-Verlag,New York,第269-315页,1994。
术语“双抗体”指具有两个抗原结合位点的小型抗体片段，该片段在同一条多肽链（VH-VL）中包含相连的重链可变域(VH)和轻链可变域(VL)。通过使用过短的接头使得同一条链上的两个结构域之间不能配对，迫使这些结构域与另一条链的互补结构域配对，从而产生两个抗原结合位点。双抗体可以是二价的或双特异性的。双抗体更完整的记载于例如EP404,097;WO93/1161;Hudson等(2003)Nat.Med.9:129-134;及Hollinger等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444-6448(1993)。三抗体(triabody)和四抗体(tetrabody)也记载于Hudson等(2003)Nat.Med.9:129-134。
术语“单克隆抗体”在用于本文时指从一群基本上同质的抗体获得的抗体，即构成群体的各个抗体相同，除了可能以极小量存在的可能的突变形式外，例如天然存在的突变形式。如此，修饰语“单克隆”表明抗体不是不同的抗体的混合物的特征。在某些实施方案中，此类单克隆抗体典型的包括包含结合靶物的多肽序列的抗体，其中靶物结合多肽序列是通过包括从众多多肽序列中选择单一靶物结合多肽序列在内的过程得到的。例如，选择过程可以是从众多克隆（诸如杂交瘤克隆、噬菌体克隆、或重组DNA克隆的集合）中选择独特克隆。应当理解，所选择的靶物结合序列可进一步改变，例如为了改善对靶物的亲和力、将靶物结合序列人源化、改善其在细胞培养物中的产量、降低其在体内的免疫原性、创建多特异性抗体等，而且包含改变后的靶物结合序列的抗体也是本发明的单克隆抗体。与典型的包含针对不同决定簇（表位）的不同抗体的多克隆抗体制备物不同，单克隆抗体制备物的每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。在它们的特异性外，单克隆抗体制备物的优势在于它们通常未受到其它免疫球蛋白的污染。
修饰语“单克隆”表明抗体从基本上同质的抗体群获得的特征，不应解释为要求通过任何特定方法来生产抗体。例如，要依照本发明使用的单克隆抗体可通过多种技术来生成，包括例如杂交瘤法(例如Kohler等,Nature256:495(1975);Harlow等,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor Laboratory Press,第2版,1988;Hammerling等,于:MonoclonalAntibodies and T-Cell Hybridomas,563-681,Elsevier,N.Y.,1981)、重组DNA法(参见例如美国专利No.4,816,567)、噬菌体展示技术(参见例如Clackson等,Nature352:624-628(1991);Marks等,J.Mol.Biol.222:581-597(1992);Sidhu等,J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004);Lee等,J.Mol.Biol.340(5):1073-1093(2004);Fellouse,Proc.Nat.Acad.Sci.USA101(34):12467-12472(2004);及Lee等,J.Immunol.Methods284(1-2):119-132(2004))、及用于在具有部分或整个人免疫球蛋白基因座或编码人免疫球蛋白序列的基因的动物中生成人或人样抗体的技术(参见例如WO98/24893;WO96/34096;WO96/33735;WO91/10741;Jakobovits等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:2551(1993);Jakobovits等,Nature362:255-258(1993);Bruggemann等,Year in Immuno.7:33(1993);美国专利No.5,545,807;5,545,806;5,569,825;5,625,126;5,633,425;5,661,016;Marks等,Bio.Technology10:779-783(1992);Lonberg等,Nature368:856-859(1994);Morrison,Nature368:812-813(1994);Fishwild等,Nature Biotechnol.14:845-851(1996);Neuberger,Nature Biotechnol.14:826(1996);及Lonberg和Huszar,Intern.Rev.Immunol.13:65-93(1995))。
单克隆抗体在本文中明确包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的剩余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，以及此类抗体的片段，只要它们展现出期望的生物学活性(美国专利No.4,816,567及Morrison等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:6851-6855(1984))。
非人（例如鼠）抗体的“人源化”形式指最低限度包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗体。在一个实施方案中，人源化抗体指人免疫球蛋白（受体抗体）中的高变区残基用具有期望特异性、亲和力、和/或能力的非人物种（供体抗体）诸如小鼠、大鼠、家兔、或非人灵长类动物的高变区残基替换的免疫球蛋白。在有些情况中，将人免疫球蛋白的框架区(FR)残基用相应的非人残基替换。此外，人源化抗体可包含在受体抗体或供体抗体中没有找到的残基。可以进行这些修饰以进一步改进抗体的性能。一般而言，人源化抗体会包含至少一个、通常两个基本上整个如下的可变域，其中所有或基本上所有高变环对应于非人免疫球蛋白的高变环，且所有或基本上所有FR是人免疫球蛋白序列的FR。人源化抗体任选还会包含至少部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定区。更多细节参见Jones等,Nature321:522-525(1986);Riechmann等,Nature332:323-329(1988);及Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)。还可参见以下综述及其引用的参考文献：Vaswani和Hamilton,Ann.Allergy,Asthma&Immunol.1:105-115(1998);Harris,Biochem.Soc.Transactions23:1035-1038(1995);及Hurle和Gross,Curr.Op.Biotech.5:428-433(1994)。
“人抗体”指拥有与由人生成的抗体的氨基酸序列对应的氨基酸序列和/或使用本文所公开的用于生成人抗体的任何技术生成的抗体。人抗体的这种定义明确排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。
术语“高变区”、“HVR”、或“HV”在用于本文时指抗体可变域中序列上高度可变和/或形成结构上定义的环的区域。通常，抗体包含六个高变区：三个在VH中（H1、H2、H3），三个在VL中（L1、L2、L3）。在天然抗体中，H3和L3展示这六个高变区的最大多样性，而且认为（特别是H3）在赋予抗体以精密特异性方面发挥独特作用。Xu等(2000)Immunity13:37-45;Johnson和Wu(2003)于:Methods in Molecular Biology248:1-25(Lo编,Human Press,Totowa,NJ)。事实上，仅由重链组成的天然存在camelid抗体在缺乏轻链时是有功能的且稳定的。Hamers-Casterman等(1993)Nature363:446-448;Sheriff等(1996)Nature Struct.Biol.3:733-736。
本文中使用且涵盖许多高变区的叙述。Kabat互补决定区(CDR)是以序列变异性为基础的，而且是最常用的(Kabat等,Sequences of Proteins ofImmunological Interest,第5版,Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,MD.(1991))。Chothia改为指结构环的位置(Chothia和Lesk J.Mol.Biol.196:901-917(1987))。AbM高变区代表Kabat CDR与Chothia结构环之间的折衷，而且得到Oxford Molecular的AbM抗体建模软件的使用。“接触”高变区是以对可获得的复合物晶体结构的分析为基础的。下文记录了这些高变区中每一个的残基。
Figure BDA00002807843500501
高变区可包括如下“延伸的高变区”：VL中的24-36或24-34(L1)、46-56或50-56(L2)和89-97或89-96(L3)及VH中的26-35或26-35A(H1)、50-65或49-65(H2)和93-102、94-102或95-102(H3)。对于这些定义中的每一个，可变域残基是依照Kabat等,见上文编号的。本发明的人源化抗STEAP-1120v.24抗体的HVR-H1、HVR-H2、和HVR-H3高变区是使用Kabat编号方式的H26-H35A、H49-H65、和H95-H102。本发明的人源化抗STEAP-1120v.24抗体的HVR-L1、HVR-L2、和HVR-L3高变区是使用Kabat编号方式的L24-34、L50-56、和L89-97。在用于本文时，术语“HVR”和“CDR”可互换使用。
“框架”或“FR”残基指可变域中除本文中所定义的高变区残基外的那些残基。
术语“如Kabat中的可变域残基编号方式”或“如Kabat中的氨基酸位置编号方式”及其变化形式指Kabat等，《Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest》，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991)中用于抗体重链可变域或轻链可变域编辑的编号***。使用此编号***，实际的线性氨基酸序列可以包含或多或少的氨基酸，对应于可变域FR或HVR的缩短或***。例如，重链可变域可以包含H2残基52后的单一氨基酸***（依照Kabat的残基52a）和重链FR残基82后的***残基（例如依照Kabat的残基82a、82b、和82c等）。给定抗体的Kabat残基编号方式可以通过将抗体序列与“标准”Kabat编号序列比对同源区来确定。
“亲和力成熟的”抗体指在抗体的一个或多个HVR中具有一处或多处改变、导致该抗体对抗原的亲和力与没有这些改变的亲本抗体相比有所改进的抗体。在一个实施方案，亲和力成熟的抗体具有纳摩尔或甚至皮摩尔量级的对靶抗原的亲和力。亲和力成熟的抗体可通过本领域已知规程来生成。Marks等,Bio/Technology10:779-783(1992)记载了通过VH和VL结构域改组进行的亲和力成熟。以下文献记载了HVR和/或框架残基的随机诱变：Barbas等,Proc.Nat.Acad.Sci.USA91:3809-3813(1994);Schier等,Gene169:147-155(1995);Yelton等,J.Immunol.155:1994-2004(1995);Jackson等,J.Immunol.154(7):3310-9(1995);及Hawkins等,J.Mol.Biol.226:889-896(1992)。
“阻断性”抗体或“拮抗性”抗体指抑制或降低其所结合的抗原的生物学活性的抗体。某些阻断性抗体或拮抗性抗体实质或完全抑制抗原的生物学活性。
“激动性抗体”在用于本文时指模拟感兴趣多肽的至少一项功能性活性的抗体。
抗体“效应器功能”指那些可归于抗体Fc区（天然序列Fc区或氨基酸序列变体Fc区）且随抗体同种型而变化的生物学活性。抗体效应器功能的例子包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体（例如B细胞受体）下调；和B细胞活化。
“Fc受体”或“FcR”描述结合抗体Fc区的受体。在有些实施方案中，FcR是天然人FcR。在有些实施方案中，FcR是结合IgG抗体的FcR（γ受体），包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亚类的受体，包括这些受体的等位变体和可变剪接形式。FcγRII受体包括FcγRIIA（“活化受体”）和FcγRIIB（“抑制受体”），它们具有相似的氨基酸序列，区别主要在于其胞质结构域。活化受体FcγRIIA在其胞质结构域中包含免疫受体基于酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制受体FcγRIIB在其胞质结构域中包含免疫受体基于酪氨酸的抑制基序(ITIM)（参见
Figure BDA00002807843500521
Annu.Rev.Immunol.15:203-234(1997)）。FcR的综述参见Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-92(1991);Capel等,Immunomethods4:25-34(1994);及de Haas等,J.Lab.Clin.Med.126:330-41(1995)。术语“FcR”在本文中涵盖其它FcR，包括那些未来会鉴定的。
术语“Fc受体”或“FcR”还包括新生儿受体，FcRn，其负责将母体IgG转移给胎儿（Guyer等,J.Immunol.117:587(1976)及Kim等,J.Immunol.24:249(1994)）和调节免疫球蛋白的体内稳态。测量对FcRn的结合的方法是已知的（参见例如Ghetie1997,Hinton2004）。可以测定人FcRn高亲和力结合多肽对人FcRn的体内结合和血清半衰期，例如在表达人FcRn的转基因小鼠或经转染人细胞系中，或者在施用了Fc变体多肽的灵长类动物中。
WO00/42072(Presta)记载了对FcR的结合得到改进或消除的抗体变体。将该专利出版物的内容明确收入本文作为参考。还可参见Shields等,J.Biol.Chem.9(2):6591-6604(2001)。
“人效应细胞”指表达一种或多种FcR并行使效应器功能的白细胞。在某些实施方案中，该细胞至少表达FcγRIII并行使ADCC效应器功能。介导ADCC的人白细胞的例子包括外周血单个核细胞(PBMC)、天然杀伤(NK)细胞、单核细胞、细胞毒性T细胞和嗜中性细胞。效应细胞可以自其天然来源分离，例如血液。
“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”指其中结合到某些细胞毒性细胞（例如天然杀伤(NK)细胞、嗜中性细胞和巨噬细胞）上存在的Fc受体(FcR)上的分泌型Ig使得这些细胞毒性效应细胞能够特异性结合携带抗原的靶细胞，随后用细胞毒素杀死靶细胞的细胞毒性形式。介导ADCC的主要细胞，NK细胞，只表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-92(1991)第464页表3总结了造血细胞上的FcR表达。为了评估感兴趣分子的ADCC活性，可进行体外ADCC测定法，诸如美国专利No.5,500,362或5,821,337或Presta美国专利No.6,737,056中所记载的。可用于此类测定法的效应细胞包括外周血单个核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。或者/另外，可在体内评估感兴趣分子的ADCC活性，例如在动物模型中，诸如Clynes等,PNAS(USA)95:652-656(1998)中所披露的。
“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”指存在补体时对靶细胞的溶解。经典补体途径的激活是由补体***第一组分(C1q)与结合至关联抗原的抗体（适宜亚类的）结合起始的。为了评估补体激活，可进行CDC测定法，例如如Gazzano-Santoro等,J.Immunol.Methods202:163(1996)中所记载的。
具有改变的Fc区氨基酸序列及提高的或降低的C1q结合能力的多肽变体记载于美国专利No.6,194,551B1和WO99/51642。将那些专利出版物的内容明确收入本文作为参考。还可参见Idusogie等,J.Immunol.164:4178-4184(2000)。
术语“含Fc区多肽”指包含Fc区的多肽，诸如抗体或免疫粘附素。Fc区的C-末端赖氨酸（依照EU编号***的残基447）可以消除，例如在纯化多肽的过程中或者通过重组改造编码多肽的核酸。因而，依照本发明包含具有Fc区的多肽的组合物可包含都具有K447的多肽、都消除了K447的多肽、或具有与没有K447残基的多肽的混合物。
就本文目的而言，“受体人框架”是包含衍生自人免疫球蛋白框架或人共有框架的VL或VH框架之氨基酸序列的框架。“衍生自”人免疫球蛋白框架或人共有框架的受体人框架可包含与之相同的氨基酸序列，或者可包含预先存在的氨基酸序列变化。在有些实施方案中，预先存在的氨基酸变化的数目是10个或更少、9个或更少、8个或更少、7个或更少、6个或更少、5个或更少、4个或更少、3个或更少、或者2个或更少。当VH中存在预先存在的氨基酸变化时，优选那些变化只存在于71H、73H和78H中的三个、两个或一个位置；例如，位于那些位置的氨基酸残基可以是71A、73T和/或78A。在一个实施方案中，VL受体人框架在序列上与VL人免疫球蛋白框架序列或人共有框架序列相同。
“人共有框架”指代表人免疫球蛋白VL或VH框架序列选集中最常见的氨基酸残基的框架。通常，人免疫球蛋白VL或VH序列选集来自可变域序列亚组。通常，序列亚组是如Kabat等,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,第5版,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)中的亚组。在一个实施方案中，对于VL，亚组是如Kabat等,见上文中的亚组κI。在一个实施方案中，对于VH，亚组是如Kabat等,见上文中的亚组III。
“VH亚组III共有框架”包含从Kabat等,见上文的可变重链亚组III中的氨基酸序列获得的共有序列。在一个实施方案中，VH亚组III共有框架氨基酸序列包含下列各序列的至少一部分或整个：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS(FR-H1,SEQ ID NO:21)-HVR-H1-WVRQAPGKGLEWV(FR-H2,SEQ ID NO:22)-HVR-H2-RFTISRDTSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR(FR-H3,SEQ ID NO:23)-HVR-H3-WGQGTLVTVSS(FR-H4,SEQ ID NO:24)。
“VL亚组I共有框架”包含从Kabat等,见上文的可变轻链κ亚组I中的氨基酸序列获得的共有序列。在一个实施方案中，VL亚组I共有框架氨基酸序列包含下列各序列的至少一部分或整个：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(FR-L1,SEQ ID NO:17)-HVR-L1-WYQQKPGKAPKLLIY(FR-L2,SEQ ID NO:18)-HVR-L2-GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC(FR-L3,SEQ ID NO:19)-HVR-L3-FGQGTKVEIKR(FR-L4,SEQ ID NO:20)。
“分泌信号序列”或“信号序列”指编码可用于指导新合成的感兴趣蛋白质穿过细胞膜的短信号肽的核酸序列，所述细胞膜通常指原核生物的内膜或者内膜和外膜二者。如此，感兴趣蛋白质诸如免疫球蛋白轻链或重链多肽分泌进入原核宿主细胞的周质或者进入培养基。由分泌信号序列编码的信号肽对宿主细胞可以是内源的，或者它们可以是外源的，包括对待表达多肽是天然的信号肽。分泌信号序列通常存在于待表达多肽的氨基末端，而且通常在多肽的生物合成和从细胞质分泌出去之间酶促切除。如此，信号肽通常不存在于成熟蛋白质产物中。
“游离半胱氨酸氨基酸”指已经工程改造入亲本抗体的、具有硫醇官能团(-SH)的、且没有配对或以其它方式成为分子内或分子间二硫桥一部分的半胱氨酸氨基酸残基。
术语“硫醇反应性值”是游离半胱氨酸氨基酸的反应性的定量表征。硫醇反应性值指半胱氨酸改造抗体中与硫醇反应性试剂反应的游离半胱氨酸氨基酸的百分比，且换算成最大值1。例如，半胱氨酸改造抗体上与硫醇反应性试剂（诸如生物素-马来酰亚胺试剂）以100%产率反应（以形成生物素标记的抗体）的游离半胱氨酸氨基酸具有1.0的硫醇反应性值。已工程改造入相同或不同亲本抗体、与硫醇反应性试剂以80%产率反应的另一个半胱氨酸氨基酸具有0.8的硫醇反应性值。已工程改造入相同或不同亲本抗体、完全不能与硫醇反应性试剂反应的另一个半胱氨酸氨基酸具有0的硫醇反应性值。特定半胱氨酸的硫醇反应性值的测定可以通过ELISA测定法、质谱、液相层析、放射自显影、或其它定量分析测试来进行。容许捕捉半胱氨酸改造抗体及比较和定量半胱氨酸反应性的硫醇反应性试剂包括生物素-PEO-马来酰亚胺((+)-生物素基-3-马来酰亚氨基丙酰氨基-3,6-二
Figure BDA00002807843500551
辛烷二胺((+)-biotinyl-3-maleimidopropionamidyl-3,6-dioxaoctaine diamine),Oda等(2001)Nature Biotechnology19:379-382,Pierce Biotechnology,Inc.)、生物素-BMCC、PEO-吲哚乙酰基生物素、吲哚乙酰基-LC-生物素、和生物素-HPDP(Pierce Biotechnology,Inc.)、及Nα-(3-马来酰亚氨基丙酰基)生物胞素(MPB,Molecular Probes,Eugene,OR)。生物素化、双功能和多功能接头试剂的其它商业来源包括Molecular Probes(Eugene,OR)和Sigma(St.Louis,MO)。
“亲本抗体”指包含其中一个或多个氨基酸残基有待用一个或多个半胱氨酸残基替换的氨基酸序列的抗体。亲本抗体可以包含天然的或野生型的序列。亲本抗体可具有相对于其它天然的、野生型的、或修饰形式的抗体而言的现有氨基酸序列修饰（诸如添加、删除和/或替代）。亲本抗体可以针对感兴趣的靶抗原，例如生物学重要的多肽。本发明还涵盖针对非多肽抗原（诸如肿瘤相关糖脂抗原；参见US5091178）的抗体。
“结合亲和力”通常指分子（例如抗体）的单一结合位点与其结合配偶（例如抗原）之间全部非共价相互作用总和的强度。除非另有说明，在用于本文时，“结合亲和力”指反映结合对的成员（例如抗体与抗原）之间1:1相互作用的内在结合亲和力。分子X对其配偶Y的亲和力通常可用解离常数(Kd)来表述。亲和力可通过本领域知道的常用方法来测量，包括本文中所描述的。低亲和力抗体通常缓慢的结合抗原且趋于容易解离，而高亲和力抗体通常更快速的结合抗原且趋于保持更长时间的结合。本领域知道测量结合亲和力的多种方法，其中任一种都可用于本发明的目的。下文描述了具体的示例性实施方案。
在一个实施方案中，依照本发明的“Kd”或“Kd值”是通过如下测定法所述使用Fab型式的感兴趣抗体及其抗原进行的放射性标记抗原结合测定法(RIA)来测量的。通过在存在未标记抗原的滴定系列的条件下，用最小浓度的（125I）标记抗原平衡Fab，然后用抗Fab抗体包被的平板捕捉所结合的抗原来测量Fab对抗原的溶液结合亲和力(Chen等,(1999)J.Mol.Biol.293:865-881)。为了建立测定条件，用50mM碳酸钠(pH9.6)中的5μg/ml捕捉用抗Fab抗体(Cappel Labs)包被微量滴定板(Dynex)过夜，随后用PBS中的2%(w/v)牛血清清蛋白在室温（约23°C）封闭2-5小时。在非吸附平板(Nunc#269620)中，将100pM或26pM[125I]-抗原与连续稀释的感兴趣Fab混合（例如与Presta等,(1997)Cancer Res.57:4593-4599中抗VEGF抗体，Fab-12的评估一致）。然后将感兴趣Fab温育过夜；然而，温育可持续更长时间（例如约65个小时）以保证达到平衡。此后，将混合物转移至捕捉板以进行室温保温（例如1小时）。然后除去溶液，并用PBS中的0.1%Tween-20洗板8次。平板干燥后，加入150μl/孔闪烁液(MicroScint-20;Packard)，然后在Topcount伽马计数器(Packard)上对平板计数10分钟。选择各Fab给出小于或等于最大结合之20%的浓度用于竞争性结合测定法。
依照另一实施方案，Kd或Kd值是通过表面等离振子共振测定法使用BIAcoreTM-2000或BIAcoreTM-3000(BIAcore,Inc.,Piscataway,NJ)在25°C使用固定化抗原CM5芯片在约10个响应单位(RU)测量的。简而言之，依照供应商的说明书用盐酸N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧甲基化右旋糖苷生物传感器芯片(CM5,Inc.)。用10mM乙酸钠pH4.8将抗原稀释至5μg/ml（约0.2μM），然后以5μl/分钟的流速注入至获得约10个响应单位(RU)的偶联蛋白质。注入抗原后，注入1M乙醇胺以封闭未反应基团。为了进行动力学测量，在25°C以约25μl/分钟的流速注入在含0.05%Tween-20的PBS(PBST)中两倍连续稀释的Fab（0.78nM至500nM）。使用简单一对一朗格缪尔(Langmuir)结合模型
Figure BDA00002807843500572
Evaluation Software version3.2)通过同时拟合结合和解离传感图来计算结合速率(kon)和解离速率(koff)。平衡解离常数(Kd)以比率koff/kon计算。参见例如Chen,Y.等,(1999)J.Mol.Biol.293:865-881。如果根据上文表面等离振子共振测定法，结合速率超过106M-1s-1，那么结合速率可使用荧光淬灭技术来测定，即根据分光计诸如配备了断流装置的分光光度计(astop-flow equipped spectrophometer)(Aviv Instruments)或8000系列SLM-Aminco分光光度计(ThermoSpectronic)中用搅拌比色杯的测量，在存在浓度渐增的抗原的条件下，测量PBS,pH7.2中的20nM抗抗原抗体（Fab形式）在25°C的荧光发射强度（激发=295nm；发射=340nm，16nm带通）的升高或降低。
依照本发明的“结合速率”（on-rate,rate of association,association rate）或“kon”也可如上所述使用BIAcoreTM-2000或BIAcoreTM-3000***(Inc.,Piscataway,NJ)来测定。
“病症”指任何会受益于使用本发明物质/分子或方法的治疗的疾患或疾病。这包括慢性和急性病症，包括那些使哺乳动物倾向于所讨论病症的病理状况。本文中待治疗的病症的非限制性例子包括癌性疾患，诸如***、肺、和结肠的癌症或转移。
术语“细胞增殖性病症”和“增殖性病症”指与一定程度的异常细胞增殖有关的病症。在一个实施方案中，细胞增殖性病症指癌症。
“肿瘤”在用于本文时指所有赘生性(neoplastic)细胞生长和增殖，无论是恶性的还是良性的，及所有癌前(pre-cancerous)和癌性细胞和组织。术语“癌症”、“癌性”、“细胞增殖性病症”、“增殖性病症”和“肿瘤”在本文中提到时并不互相排斥。
术语“癌症”和“癌性”指向或描述哺乳动物中特征通常为细胞生长不受调节的生理疾患。癌症的例子包括但不限于癌瘤，淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤和白血病或淋巴样恶性肿瘤。此类癌症的更具体例子包括鳞状细胞癌（例如上皮鳞状细胞癌）、肺癌（包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺的腺癌和肺的鳞癌）、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌（包括胃肠癌）、胰腺癌、成胶质细胞瘤、***、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、尿道癌、肝瘤、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、***癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌、***癌、***癌、黑素瘤、多发性骨髓瘤和B细胞淋巴瘤、脑瘤和脑癌、以及头颈癌、及相关转移。
“表达STEAP-1的细胞”指在细胞表面上表达内源或转染的STEAP-1的细胞。“表达STEAP-1的癌”指包含如下细胞的癌症，所述细胞具有在细胞表面上存在的STEAP-1蛋白。“表达STEAP-1的癌”在其细胞表面上生成足够水平的STEAP-1，使得抗STEAP-1抗体可与其结合并在癌症方面产生治疗效果。“过表达”STEAP-1的癌指与同一组织类型的非癌性细胞相比，在其细胞表面上具有显著更高水平的STEAP-1的癌。此类过表达可以是由基因扩增或者是由转录或翻译提高引起的。可在诊断或预后测定法中通过评估细胞表面上存在的STEAP-1蛋白质水平的升高（例如通过免疫组织化学测定法；FACS分析）来确定STEAP-1过表达。或者/另外，可测量细胞中编码STEAP-1的核酸或mRNA的水平，例如通过荧光原位杂交（FISH；参见WO98/45479，公布于1998年10月）；Southern印迹；Northern印迹；或聚合酶链式反应(PCR)技术，诸如实时定量PCR(RT-PCR)。还可使用例如基于抗体的测定法，通过测量生物学流体诸如血清中的脱落抗原来研究STEAP-1过表达（还可参见例如美国专利No.4,933,294，公告于1990年6月12日;WO91/05264，公布于1991年4月18日;美国专利No.5,401,638，公告于1995年3月28日;及Sias等,J.Immunol.Methods132:73-80(1990)）。除了上述测定法，熟练从业人员还可利用多种体内测定法。例如，可将患者体内细胞暴露于任选用可检测标记物例如放射性同位素标记的抗体，并且可评估抗体与患者体内细胞的结合，例如通过外部扫描放射性或通过分析取自事先已暴露于所述抗体的患者的活组织检查切片。表达STEAP-1的癌包括***、肺、和结肠癌。
在用于本文时，“治疗”（及变化形式，诸如“处理”或“处置”）指试图改变所治疗个体或细胞的自然进程的临床干预，可以是为了预防或在临床病理学的进程中进行。治疗的期望效果包括预防疾病的发生或复发、缓解症状、削弱疾病的任何直接或间接病理学后果、预防转移、减缓疾病进展的速率、改善或减轻疾病状态、及免除或改善预后。在有些实施方案中，本发明的抗体用于延迟疾病或病症的发生，或用于减缓疾病或病症的进展。
用于评估疾病的成功治疗和改善的上述参数可以容易的通过内科医师所熟悉的常规规程来测量。对于癌症治疗，可通过例如评估疾病进展前时间(TTP)和/或测定响应率(RR)来测量功效。对于***癌，可以通过常规方法来评估治疗的进展，通常通过测量血清PSA（***特异性抗原）水平来进行；血液中PSA的水平越高，癌症越广泛。可获得用于检测PSA的商品化测定法，例如Hybitech Tandem-E和Tandem-R PSA测定试剂盒、Yang ProsCheck多克隆测定法(Yang Labs,Bellevue,WA)、Abbott Imx(Abbott Labs,AbbottPark,IL)等。转移可通过分期测试(staging test)来测定，及通过骨扫描及钙水平和其它酶的测试以测定是否传播到骨。还可进行CT扫描以查明是否传播到骨盆及该区域中的***。分别使用胸腔X射线和通过已知方法进行的肝酶水平测量来查明是否转移到肺和肝。用于监测疾病的其它常规方法包括经直肠超声检查(TRUS)和经直肠针吸活组织检查(TRNB)。
“个体”指脊椎动物。在某些实施方案中，脊椎动物指哺乳动物。哺乳动物包括，但不限于，牲畜（诸如牛）、运动用动物、宠物（诸如猫、犬、和马）、灵长类动物、小鼠和大鼠。在某些实施方案中，哺乳动物指人。
“有效量”指在必需的剂量和时间上有效实现期望的治疗或预防效果的量。本发明的物质/分子的“治疗有效量”可根据诸如个体的疾病状态、年龄、性别和体重及该物质/分子在个体中引发期望应答的能力等因素而变化。治疗有效量还涵盖该物质/分子的治疗有益效果胜过任何有毒或有害后果的量。“预防有效量”指在必需的剂量和时间上有效实现期望的预防效果的量。通常而非必然，由于预防剂量是在疾病发作之前或在疾病的早期用于受试者的，因此预防有效量会低于治疗有效量。在癌症的情况中，药物的治疗有效量可减少癌细胞数；缩小肿瘤体积；抑制（即一定程度的减缓，优选停止）癌细胞浸润到周围器官中；抑制（即一定程度的减缓，优选停止）肿瘤转移；一定程度的抑制肿瘤生长；和/或一定程度的减轻与癌症有关的一种或多种症状。参见前面“处理”和“治疗”的定义。就药物可预防癌细胞生长和/或杀死现有癌细胞的程度而言，它可以是细胞抑制的和/或细胞毒性的。
“长期”施用指与短期模式相反，以连续模式施用药剂，从而将初始治疗效果（活性）维持较长一段时间。“间歇”施用指不是无间断连续进行的治疗，而是本质上周期性的。
“联合”一种或多种其它治疗剂的施用包括同时（共同）施用和任意次序的序贯施用。
“载体”在用于本文时包括药学可接受的载体、赋形剂或稳定剂，它们在所采用的剂量和浓度对暴露于其的细胞或哺乳动物是无毒的。通常，生理学可接受的载体是pH缓冲水溶液。生理学可接受载体的例子包括缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸；低分子量（少于约10个残基）多肽；蛋白质，诸如血清清蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖醇，诸如甘露醇或山梨醇；成盐反荷离子，诸如钠；和/或非离子表面活性剂，诸如TWEENTM、聚乙二醇(PEG)和PLURONICSTM。
“标记物”在用于本文时指与抗体直接或间接偶联从而生成“带标记物的”或“经过标记的”抗体的可检测化合物或组合物。标记物可以是通过自身就可检测的（例如放射性同位素标记物或荧光标记物），或者在酶标记物的情况中，可催化底物化合物或组合物的可检测的化学改变。
术语“免疫PET”用于放射性标记的抗体包括抗体-药物偶联物诸如抗STEAP-1-vc-MMAE ADC或thioMAb-药物偶联物(TDC)的正电子发射断层成像(PET)。术语“89Zr-STEAP-1免疫PET”指STEAP-1的锆放射性标记PET成像。
术语“表位标记的”或“带表位标签的”在用于本文时指包含与“标签多肽”融合的抗PSCA抗体多肽的嵌合多肽。标签多肽具有足够残基以提供表位而可制备针对其的抗体，但又足够短使得其不干扰与其融合的Ig多肽的活性。标签多肽还优选是相当独特的，使得其抗体基本上不与其它表位发生交叉反应。合适的标签多肽通常具有至少6个氨基酸残基，通常在约8个和约50个氨基酸残基之间（优选在约10个和20个氨基酸残基之间）。
“小分子”在本文中定义为分子量小于约500道尔顿。
术语“包装插页”用于指通常包括在治疗用产品的商业包装中的说明书，它们包含有关涉及此类治疗用产品应用的适应征、用法、剂量、施用、禁忌症和/或警告的信息。
“分离的核酸”指基本上与天然伴随天然序列的其它基因组DNA序列以及蛋白质或复合物诸如核糖体和聚合酶分开的核酸，例如RNA、DNA、或混合聚合物。该术语涵盖已经自其天然存在环境中取出的核酸序列，包括重组体的或克隆的DNA分离物和化学修饰的类似物或通过异源***生物学合成的类似物。基本上纯的分子包括分子的分离形式。
“载体”包括穿梭载体和表达载体。典型的是，质粒构建物还会包含复制起点（例如ColE1复制起点）和选择标志（例如氨苄青霉素或四环素抗性），分别用于质粒在细菌中的复制和选择。“表达载体”指包含在细菌或真核细胞中表达抗体（包括本发明的抗体片段）所必需的控制序列或调控元件的载体。下文公开了合适的载体。
生成本发明抗STEAP-1抗体的细胞包括亲本杂交瘤细胞，例如保藏于ATCC的杂交瘤，以及其中已经导入了编码该抗体的核酸的细菌和真核宿主细胞。下文公开了合适的宿主细胞。
“生长抑制剂”在用于本文时指在体外或在体内抑制细胞（尤其是表达PSCA的癌细胞）生长的化合物或组合物。如此，生长抑制剂可以是显著降低处于S期的表达PSCA的细胞百分比的药剂。生长抑制剂的例子包括阻断细胞周期行进（处于S期以外的位置）的药剂，诸如诱导G1停滞和M期停滞的药剂。经典的M期阻断剂包括长***类(vincas)（长春新碱(vincristine)和长春碱(vinblastine)）、紫杉烷类(taxanes)、和拓扑异构酶II抑制剂诸如多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、柔红霉素(daunorubicin)、依托泊苷(etoposide)和博来霉素(bleomycin)。那些阻滞G1的药剂也溢出进入S期停滞，例如DNA烷化剂类诸如他莫昔芬(tamoxifen)、***(prednisone)、达卡巴嗪(dacarbazine)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、顺铂(cisplatin)、甲氨蝶呤(methotrexate)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)和ara-C。更多信息可参见《TheMolecular Basis of Cancer》，Mendelsohn和Israel编，第1章，题为“Cell cycleregulation,oncogenes,and antieioplastic drugs”，Murakaini等，WB Saunders，Philadelphia，1995，尤其是第13页。紫杉烷类（帕利他塞(paclitaxel)和多西他赛(docetaxel)）是衍生自紫杉树的抗癌药。衍生自欧洲紫杉的多西他赛
Figure BDA00002807843500621
Rhone-Poulenc Rorer)是帕利他塞(
Figure BDA00002807843500622
Bristol-MyersSquibb)的半合成类似物。帕利他塞和多西他赛促进由微管蛋白二聚体装配成微管并通过防止解聚使微管稳定，导致对细胞中有丝***的抑制。
术语“细胞毒剂”在用于本文时指抑制或防止细胞的功能和/或引起细胞死亡或破坏的物质。该术语意图包括：放射性同位素，例如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素；化疗剂，例如甲氨蝶呤(methotrexate)、阿霉素(adriamycin)、长春花生物碱类(vincaalkaloids)（长春新碱(vincristine)、长春碱(vinblastine)、依托泊苷(etoposide)）、多柔比星(doxorubicin)、美法仑(melphalan)、丝裂霉素(mitomycin)C、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、柔红霉素(daunorubicin)或其它嵌入剂；酶及其片段，诸如核溶酶；抗生素；和毒素，诸如小分子毒素或者细菌、真菌、植物或动物起源的酶活性毒素，包括其片段和/或变体；毒素；生长抑制剂；药物模块；及下文披露的各种抗肿瘤药或抗癌药。下文记载了其它细胞毒剂。杀肿瘤药引起肿瘤细胞的破坏。
“毒素”指能够对细胞的生长或增殖产生有害效果的任何物质。
“化疗剂”指可用于治疗癌症的化学化合物。化疗剂的例子包括烷化剂类(alkylating agents)，诸如塞替派(thiotepa)和
Figure BDA00002807843500623
环磷酰胺(cyclophosphamide)；磺酸烃基酯类(alkyl sulfonates)，诸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶类(aziridines)，诸如苯佐替派(benzodepa)、卡波醌(carboquone)、美妥替派(meturedepa)和乌瑞替派(uredepa)；乙撑亚胺类(ethylenimines)和甲基蜜胺类(methylamelamines)，包括六甲蜜胺(altretamine)、三乙撑蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撑磷酰胺(triethylenephosphoramide)、三乙撑硫代磷酰胺(triethylenethiophosphoramide)和三羟甲蜜胺(trimethylolomelamine)；番荔枝内酯类(acetogenin)（尤其是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone)）；δ-9-四氢***酚(tetrahydrocannabinol)（屈***酚(dronabinol)，
Figure BDA00002807843500624
）；β-拉帕醌(lapachone)；拉帕醇(lapachol)；秋水仙素类(colchicines)；白桦脂酸(betulinicacid)；喜树碱(camptothecin)（包括合成类似物托泊替康(topotecan)
Figure BDA00002807843500631
CPT-11（伊立替康(irinotecan)，
Figure BDA00002807843500632
）、乙酰喜树碱、东莨菪亭(scopoletin)和9-氨基喜树碱）；苔藓抑素(bryostatin)；callystatin；CC-1065（包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物）；鬼臼毒素(podophyllotoxin)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；替尼泊苷(teniposide)；隐藻素类(cryptophycins)（特别是隐藻素1和隐藻素8）；多拉司他汀(dolastatin)；duocarmycin（包括合成类似物，KW-2189和CB1-TM1）；艾榴塞洛素(eleutherobin)；pancratistatin；sarcodictyin；海绵抑素(spongistatin)；氮芥类(nitrogen mustards)，诸如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、胆磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、盐酸氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法仑(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；亚硝脲类(nitrosoureas)，诸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimustine)；抗生素类，诸如烯二炔类抗生素(enediyne)（例如加利车霉素(calicheamicin)，尤其是加利车霉素γ1I和加利车霉素ωI1（参见例如Agnew,Chem.Intl.Ed.Engl.33:183-186(1994)）；蒽环类抗生素(dynemicin)，包括dynemicin A；埃斯波霉素(esperamicin)；以及新制癌素(neocarzinostatin)发色团和相关色蛋白烯二炔类抗生素发色团）、阿克拉霉素(aclacinomycin)、放线菌素(actinomycin)、氨茴霉素(anthramycin)、偶氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycin)、放线菌素C(cactinomycin)、carabicin、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycin)、放线菌素D(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-二氮-5-氧-L-正亮氨酸、
Figure BDA00002807843500633
多柔比星(doxorubicin)（包括吗啉代多柔比星、氰基吗啉代多柔比星、2-吡咯代多柔比星和脱氧多柔比星）、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素类(mitomycins)诸如丝裂霉素C、霉酚酸(mycophenolic acid)、诺拉霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、泊非霉素(porfiromycin)、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(streptonigrin)、链佐星(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物类，诸如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，诸如二甲叶酸(denopterin)、甲氨蝶呤、蝶酰三谷氨酸(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，诸如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤(mercaptopurine)、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤(thioguanine)；嘧啶类似物，诸如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、双脱氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)；雄激素类，诸如卡鲁睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、表硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酯(testolactone)；抗肾上腺类，诸如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，诸如亚叶酸(folinic acid)；醋葡醛内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid)；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defosfamide)；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；elfornithine；依利醋铵(elliptinium acetate)；埃坡霉素(epothilone)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟脲(hydroxyurea)；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidamine)；美登木素生物碱(maytansinoids)，诸如美登素(maytansine)和安丝菌素(ansamitocin)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidamol)；二胺硝吖啶(nitracrine)；喷司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；2-乙基酰肼(ethylhydrazide)；丙卡巴肼(procarbazine)；
Figure BDA00002807843500644
多糖复合物（JHS NaturalProducts,Eugene,OR）；雷佐生(razoxane)；根霉素(rhizoxin)；西索菲兰(sizofiran)；螺旋锗(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌(triaziquone)；2,2',2''-三氯三乙胺；单端孢菌素类(trichothecenes)（尤其是T-2毒素、疣孢菌素(verrucarin)A、杆孢菌素(roridin)A和蛇行菌素(anguidin)）；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine)（
Figure BDA00002807843500641
达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；gacytosine；阿糖胞苷(arabinoside)（“Ara-C”）；塞替派(thiotepa)；类紫杉醇(taxoids)，例如
Figure BDA00002807843500643
帕利他塞(paclitaxel)（Bristol-Myers Squibb Oncology,Princeton,N.J.）、ABRAXANETM不含克列莫佛(Cremophor)，清蛋白改造的纳米颗粒剂型帕利他塞（American Pharmaceutical Partners,Schaumberg,Illinois）和
Figure BDA00002807843500651
多西他塞(docetaxel)（
Figure BDA00002807843500652
Antony,France）；苯丁酸氮芥(chlorambucil)；吉西他滨(gemcitabine)（
Figure BDA00002807843500653
6-硫鸟嘌呤(thioguanine)；巯基嘌呤(mercaptopurine)；甲氨蝶呤(methotrexate)；铂类似物，诸如顺铂(cisplatin)和卡铂(carboplatin)；长春碱(vinblastine)（
Figure BDA00002807843500654
）；铂；依托泊苷(etoposide)（VP-16）；异环磷酰胺(ifosfamide)；米托蒽醌(mitoxantrone)；长春新碱(vincristine)（
Figure BDA00002807843500655
）；奥沙利铂(oxaliplatin)；亚叶酸(leucovorin)；长春瑞滨(vinorelbine)（）；能灭瘤(novantrone)；依达曲沙(edatrexate)；道诺霉素(daunomycin)；氨基蝶呤(aminopterin)；伊本膦酸盐(ibandronate)；拓扑异构酶抑制剂RFS2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类视黄酸(retinoids)，诸如视黄酸(retinoic acid)；卡培他滨(capecitabine)（
Figure BDA00002807843500657
）；任何上述物质的药学可接受盐、酸或衍生物；以及两种或更多上述物质的组合，诸如CHOP（环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和***龙联合疗法的缩写）和FOLFOX（奥沙利铂（ELOXATINTM）联合5-FU和亚叶酸的治疗方案的缩写）。
该定义还包括起调节、降低、阻断或抑制可促进癌生长的激素效果作用的抗激素剂，且常常是***或全身治疗的形式。它们自身可以是激素。例子包括抗***类和选择性***受体调节剂类(SERM)，包括例如他莫昔芬(tamoxifen)（包括
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他莫昔芬）、
Figure BDA00002807843500659
雷洛昔芬(raloxifene)、屈洛昔芬(droloxifene)、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、那洛昔芬(keoxifene)、LY117018、奥那司酮(onapristone)和托瑞米芬(toremifene)；抗孕酮类；***受体下调剂类(ERD)；发挥抑制或关闭卵巢功能的药剂，例如促黄体生成激素释放激素(LHRH)激动剂，诸如
Figure BDA000028078435006511
和醋酸亮丙瑞林(leuprolide acetate)、醋酸戈舍瑞林(goserelinacetate)、醋酸布舍瑞林(buserelin acetate)和曲普瑞林(triptorelin)；其它抗雄激素类，诸如氟他米特(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)和比卡米特(bicalutamide)；及抑制在肾上腺中调节***生成的芳香酶的芳香酶抑制剂，诸如例如4(5)-咪唑、氨鲁米特(aminoglutethimide)、醋酸甲地孕酮(megestrol acetate)、
Figure BDA000028078435006514
依西美坦(exemestane)、福美坦(formestane)、法倔唑(fadrozole)、
Figure BDA000028078435006515
伏氯唑(vorozole)、
Figure BDA000028078435006516
来曲唑(letrozole)和阿那曲唑(anastrozole)。另外，化疗剂的这种定义包括二膦酸盐类(bisphosphonates)，诸如氯膦酸盐(clodronate)(例如依替膦酸盐(etidronate)、NE-58095、
Figure BDA00002807843500663
唑来膦酸/唑来膦酸盐(zoledronic acid/zoledronate)、
Figure BDA00002807843500664
阿伦膦酸盐(alendronate)、帕米膦酸盐(pamidronate)、
Figure BDA00002807843500666
替鲁膦酸盐(tiludronate)或利塞膦酸盐(risedronate)；以及曲沙他滨(troxacitabine)（1,3-二氧戊环核苷胞嘧啶类似物）；反义寡核苷酸，特别是那些抑制涉及异常(abherant)细胞增殖的信号传导途经中的基因表达的反义寡核苷酸，诸如例如PKC-α、Raf、H-Ras和表皮生长因子受体(EGF-R)；疫苗，诸如
Figure BDA00002807843500668
疫苗和基因疗法疫苗，例如疫苗、
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疫苗和
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疫苗；
Figure BDA000028078435006612
拓扑异构酶1抑制剂；lapatinib ditosylate（ErbB-2和EGFR双重酪氨酸激酶小分子抑制剂，也称为GW572016）；及任何上述物质的药学可接受的盐、酸或衍生物。
“生长抑制剂”在用于本文时指在体外或在体内抑制细胞（诸如表达STEAP-1的细胞）生长的化合物或组合物。如此，生长抑制剂可以是显著降低处于S期的细胞（诸如表达STEAP-1的细胞）百分比的药剂。生长抑制剂的例子包括阻断细胞周期行进（处于S期以外的位置）的药剂，诸如诱导G1停滞和M期停滞的药剂。经典的M期阻断剂包括长***类(vincas)（长春新碱(vincristine)和长春碱(vinblastine)）、紫杉烷类(taxanes)、和拓扑异构酶II抑制剂诸如多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、柔红霉素(daunorubicin)、依托泊苷(etoposide)和博来霉素(bleomycin)。那些阻滞G1的药剂也溢出进入S期停滞，例如DNA烷化剂类诸如他莫昔芬(tamoxifen)、***(prednisone)、达卡巴嗪(dacarbazine)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、顺铂(cisplatin)、甲氨蝶呤(methotrexate)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)和ara-C。更多信息可参见TheMolecular Basis of Cancer,Mendelsohn和Israel编,第1章,题为“Cell cycleregulation,oncogenes,and antieioplastic drugs”,Murakaini等,WB Saunders，Philadelphia,1995,尤其是第13页。紫杉烷类（帕利他塞(paclitaxel)和多西他赛(docetaxel)）是衍生自紫杉树的抗癌药。衍生自欧洲紫杉的多西他赛
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Rhone-Poulenc Rorer)是帕利他塞(Bristol-MyersSquibb)的半合成类似物。帕利他塞和多西他赛促进由微管蛋白二聚体装配成微管并通过防止解聚使微管稳定，导致对细胞中有丝***的抑制。
术语“胞内代谢物”指由细胞内对抗体-药物偶联物(ADC)的代谢过程或反应产生的化合物。所述代谢过程或反应可以是酶促过程，诸如ADC的肽接头的蛋白水解切割，或者是官能团诸如腙、酯或酰胺的水解。胞内代谢物包括但不限于在进入、扩散、摄取或转运进入细胞后经历胞内切割的抗体和游离药物。
术语“胞内切割的”和“胞内切割”指细胞内对抗体-药物偶联物(ADC)的代谢过程或反应，由此药物模块(D)与抗体(Ab)之间的共价附着，即接头被打断，导致细胞内游离药物与抗体解离。如此，ADC被切割的模块是胞内代谢物。
术语“生物利用度”指施用于患者的给定量的药物的***利用度（即血液/血浆水平）。生物利用度是表明药物从所施用的剂量形式到达大循环的时间（速率）和总量（程度）二者度量的绝对项。
术语“细胞毒活性”指抗体-药物偶联物或抗体-药物偶联物的胞内代谢物的细胞杀伤、细胞抑制、或生长抑制效果。细胞毒活性可以表述为IC50值，即半数细胞存活时每单位体积的浓度（摩尔或质量）。
“烃基”指含正、仲、叔或环碳原子的C1-C18烃（碳氢化合物）。例子有甲基(Me,-CH3)、乙基(Et,-CH2CH3)、1-丙基(n-Pr,正丙基,-CH2CH2CH3)、2-丙基(i-Pr,异丙基,-CH(CH3)2)、1-丁基(n-Bu,正丁基,-CH2CH2CH2CH3)、2-甲基-1-丙基(i-Bu,异丁基,-CH2CH(CH3)2)、2-丁基(s-Bu,仲丁基,-CH(CH3)CH2CH3)、2-甲基-2-丙基(t-Bu,叔丁基,-C(CH3)3)、1-戊基(n-戊基,-CH2CH2CH2CH2CH3)、2-戊基(-CH(CH3)CH2CH2CH3)、3-戊基(-CH(CH2CH3)2)、2-甲基-2-丁基(-C(CH3)2CH2CH3)、3-甲基-2-丁基(-CH(CH3)CH(CH3)2)、3-甲基-1-丁基(-CH2CH2CH(CH3)2)、2-甲基-1-丁基(-CH2CH(CH3)CH2CH3)、1-己基(-CH2CH2CH2CH2CH2CH3)、2-己基(-CH(CH3)CH2CH2CH2CH3)、3-己基(-CH(CH2CH3)(CH2CH2CH3))、2-甲基-2-戊基(-C(CH3)2CH2CH2CH3)、3-甲基-2-戊基(-CH(CH3)CH(CH3)CH2CH3)、4-甲基-2-戊基(-CH(CH3)CH2CH(CH3)2)、3-甲基-3-戊基(-C(CH3)(CH2CH3)2)、2-甲基-3-戊基(-CH(CH2CH3)CH(CH3)2)、2,3-二甲基-2-丁基(-C(CH3)2CH(CH3)2)、3,3-二甲基-2-丁基(-CH(CH3)C(CH3)3。
术语“C1-C8烃基”在用于本文时指具有1-8个碳原子的直链的或分支的、饱和的或不饱和的烃。代表性的“C1-C8烃基”包括但不限于-甲基、-乙基、-正丙基、-正丁基、-正戊基、-正己基、-正庚基、-正辛基、-正壬基和-正癸基；而分支的C1-C8烃基包括但不限于-异丙基、-仲丁基、-异丁基、-叔丁基、-异戊基、2-甲基丁基，不饱和的C1-C8烃基包括但不限于-乙烯基、-丙烯基、-1-丁烯基、-2-丁烯基、-异丁烯基、-1-戊烯基、-2-戊烯基、-3-甲基-1-丁烯基、-2-甲基-2-丁烯基、-2,3-二甲基-2-丁烯基、1-己烯基、2-己烯基、3-己烯基、-乙炔基、-丙炔基、-1-丁炔基、-2-丁炔基、-1-戊炔基、-2-戊炔基、-3-甲基-1-丁炔基。甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、新戊基、正己基、异己基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、2,2-二甲基丁基、2,3-二甲基丁基、2,2-二甲基戊基、2,3-二甲基戊基、3,3-二甲基戊基、2,3,4-三甲基戊基、3-甲基己基、2,2-二甲基己基、2,4-二甲基己基、2,5-二甲基己基、3,5-二甲基己基、2,4-二甲基戊基、2-甲基庚基、3-甲基庚基、正庚基、异庚基、正辛基、和异辛基。C1-C8烃基基团可以是未取代的，或者是被一个或多个下述基团取代的，包括但不限于-C1-C8烃基、-O-(C1-C8烃基)、-芳基、-C(O)R’、-OC(O)R’、-C(O)OR’、-C(O)NH2、-C(O)NHR’、-C(O)N(R’)2、-NHC(O)R’、-SO3R’、-S(O)2R’、-S(O)R’、-OH、-卤素、-N3、-NH2、-NH(R’)、-N(R’)2和-CN；其中每个R’独立选自H、-C1-C8烃基和芳基。
“烯基”指有至少一个不饱和位点即碳-碳，sp2双键的含正、仲、叔或环碳原子的C2-C18烃。例子包括但不限于：次乙基或乙烯基(-CH=CH2)、丙烯基(-CH2CH=CH2)、环戊烯基(-C5H7)、和5-己烯基(-CH2CH2CH2CH2CH=CH2)。
“炔基”指有至少一个不饱和位点即碳-碳，sp三键的含正、仲、叔或环碳原子的C2-C18烃。例子包括但不限于：乙炔基(-C≡CH)和丙炔基(-CH2C≡CH)。
“亚烷基(Alkylene)”指1-18个碳原子且具有两个单价基心(radical center)（通过从亲本烷烃的同一碳原子或两个不同碳原子除去两个氢原子而衍生的）的饱和的、分支的或直链的或环状的烃基。典型的亚烃基包括但不限于：亚甲基(-CH2-)、1,2-乙基(-CH2CH2-)、1,3-丙基(-CH2CH2CH2-)、1,4-丁基(-CH2CH2CH2CH2-)等等。
“C1-C10亚烷基”指通式-(CH2)1-10-的直链、饱和烃基。C1-C10亚烷基的例子包括亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚丁基、亚戊基、亚己基、亚庚基、亚辛基、亚壬基和亚癸基。
“亚烯基”指2-18个碳原子且具有两个单价基心(radical center)（通过从亲本烯烃的同一碳原子或两个不同碳原子除去两个氢原子而衍生的）的不饱和的、分支的或直链的或环状的烃基。典型的亚烯基包括但不限于：1,2-亚乙烯基(-CH=CH-)。
“亚炔基”指2-18个碳原子且具有两个单价基心(radical center)（通过从亲本炔烃的同一碳原子或两个不同碳原子除去两个氢原子而衍生的）的不饱和的、分支的或直链的或环状的烃基。典型的亚炔基包括但不限于：亚乙炔基(-C≡C-)、亚丙炔基(-CH2C≡C-)、和亚4-戊炔基(-CH2CH2CH2C≡C-)。
“芳基”指碳环芳香族基团。芳基的例子包括但不限于苯基、萘基、和蒽基。碳环芳香族基团或杂环芳香族基团可以是未取代的，或者是被一个或多个下述基团取代的，包括但不限于-C1-C8烃基、-O-(C1-C8烃基)、-芳基、-C(O)R’、-OC(O)R’、-C(O)OR’、-C(O)NH2、-C(O)NHR’、-C(O)N(R’)2、-NHC(O)R’、-S(O)2R’、-S(O)R’、-OH、-卤素、-N3、-NH2、-NH(R’)、-N(R’)2和-CN；其中每个R’独立选自H、-C1-C8烃基和芳基。
“亚芳基”指具有两个共价键且可以是邻位、间位或对位构型（如下述结构所示）的芳基：
Figure BDA00002807843500691
其中苯基可以是未取代的，或者是被至多四个下述基团取代的，包括但不限于-C1-C8烃基、-O-(C1-C8烃基)、-芳基、-C(O)R’、-OC(O)R’、-C(O)OR’、-C(O)NH2、-C(O)NHR’、-C(O)N(R’)2、-NHC(O)R’、-S(O)2R’、-S(O)R’、-OH、-卤素、-N3、-NH2、-NH(R’)、-N(R’)2和-CN；其中每个R’独立选自H、-C1-C8烃基和芳基。
“芳基烃基”指键合至碳原子（通常是末端或sp3碳原子）的氢原子之一被芳基取代的无环烃基。典型的芳基烃基包括但不限于苄基、2-苯基乙烷-1-基、2-苯基乙烯-1-基、萘基甲基、2-萘基乙烷-1-基、2-萘基乙烯-1-基、萘并苄基、2-萘并苯基乙烷-1-基等等。芳基烃基包含6-20个碳原子，例如芳基烃基的烃基模块（包括烷基、烯基或炔基）是1-6个碳原子，芳基模块是5-14个碳原子。
“杂芳基烃基”指键合至碳原子（通常是末端或sp3碳原子）的氢原子之一被杂芳基取代的无环烃基。典型的杂芳基烃基包括但不限于2-苯并咪唑基甲基、2-呋喃基乙基等等。杂芳基烃基包含6-20个碳原子，例如杂芳基烃基的烃基模块（包括烷基、烯基或炔基）是1-6个碳原子，杂芳基模块是5-14个碳原子和1-3个选自N、O、P和S的杂原子。杂芳基烃基的杂芳基模块可以是具有3-7个环成员（2-6个碳原子和1-3个选自N、O、P和S的杂原子）的单环或具有7-10个环成员（4-9个碳原子和1-3个选自N、O、P和S的杂原子）的双环，例如双环[4,5]、[5,5]、[5,6]或[6,6]体系。
“取代的烃基”、“取代的芳基”、和“取代的芳基烃基”分别指其中一个或多个氢原子各自独立被取代基取代的烃基、芳基、和芳基烃基。典型的取代基包括但不限于-X、-R、-O-、-OR、-SR、-S-、-NR2、-NR3、=NR、-CX3、-CN、-OCN、-SCN、-N=C=O、-NCS、-NO、-NO2、=N2、-N3、NC(=O)R、-C(=O)R、-C(=O)NR2、-SO3 -、-SO3H、-S(=O)2R、-OS(=O)2OR、-S(=O)2NR、-S(=O)R、-OP(=O)(OR)2、-P(=O)(OR)2、-PO- 3、-PO3H2、-C(=O)R、-C(=O)X、-C(=S)R、-CO2R、-CO2 -、-C(=S)OR、-C(=O)SR、-C(=S)SR、-C(=O)NR2、-C(=S)NR2、-C(=NR)NR2，其中每个X独立为卤素：F、Cl、Br、或I；且每个R独立为-H、C2-C18烃基、C6-C20芳基、C3-C14杂环、保护基团或前体药物模块。上文所述亚烃基/亚烷基、亚烯基、和亚炔基也可以被类似的取代。
“杂芳基”和“杂环”指其中一个或多个环原子是杂原子（例如氮、氧和硫）的环体系。杂环基包含1-20个碳原子和1-3个选自N、O、P和S的杂原子。杂环可以是具有3-7个环成员（2-6个碳原子和1-3个选自N、O、P和S的杂原子）的单环或具有7-10个环成员（4-9个碳原子和1-3个选自N、O、P和S的杂原子）的双环，例如双环[4,5]、[5,5]、[5,6]或[6,6]体系。
杂环记载于Paquette,Leo A.;"Principles of Modern HeterocyclicChemistry"(W.A.Benjamin,New York,1968),特别是第1,3,4,6,7,和9章;"The Chemistry of Heterocyclic Compounds,A series of Monographs"(JohnWiley&Sons,New York,1950至今),特别是第13,14,16,19和28卷;及J.Am.Chem.Soc.(1960)82:5566。
举例而言，杂环的例子包括但不限于吡啶基、二氢吡啶基、四氢吡啶基（哌啶基）、噻唑基、四氢噻吩基(tetrahydrothiophenyl)、硫氧化的四氢噻吩基、嘧啶基、呋喃基、噻吩基、吡咯基、吡唑基、咪唑基、四唑基、苯并呋喃基、硫萘基（thianaphthalenyl）、吲哚基、indolenyl、喹啉基、异喹啉基、苯并咪唑基、哌啶基、4-哌啶酮基、吡咯烷基、2-吡咯烷酮基、吡咯啉基、四氢呋喃基、双-四氢呋喃基、四氢吡喃基、双-四氢吡喃基、四氢喹啉基、四氢异喹啉基、十氢喹啉基、八氢异喹啉基、吖辛因基(azocinyl)、三嗪基、6H-1,2,5-噻二嗪基、2H,6H-1,5,2-二噻嗪基、噻吩基、噻蒽基、吡喃基、异苯并呋喃基、色烯基、呫吨基、酚
Figure BDA00002807843500714
噻基(phenoxathinyl)、2H-吡咯基、异噻唑基、异唑基、吡嗪基、哒嗪基、吲嗪基、异吲哚基、3H-吲哚基、1H-吲唑基、嘌呤基(purinyl)、4H-喹嗪基、酞嗪基、萘啶基、喹喔啉基、喹唑啉基、噌啉基、喋啶基、4aH-咔唑基、咔唑基、β-咔啉基、菲啶基、吖啶基、嘧啶基、菲咯啉基、酚嗪基、酚噻嗪基、呋咱基、酚
Figure BDA00002807843500716
嗪基、异色满基、色满基、咪唑烷基、咪唑啉基、吡唑烷基、吡唑啉基、哌嗪基、二氢吲哚基、异二氢吲哚基、奎宁环基、吗啉基、
Figure BDA00002807843500711
唑烷基、苯并***基、苯并异
Figure BDA00002807843500712
唑基、羟吲哚基、苯并唑啉基、和靛红酰基(isatinoyl)。
举例而言而非限制，碳键合的杂环键合于吡啶的2、3、4、5、或6位，哒嗪的3、4、5、或6位，嘧啶的2、4、5、或6位，吡嗪的2、3、5、或6位，呋喃、四氢呋喃、噻吩(thiofuran)、噻吩(thiophene)、吡咯或四氢吡咯的2、3、4、或5位，唑、咪唑或噻唑的2、4、或5位，异
Figure BDA00002807843500718
唑、吡唑或异噻唑的3、4、或5位，吖丙啶的2或3位，吖丁啶的2、3、或4位，喹啉的2、3、4、5、6、7、或8位，或异喹啉的1、3、4、5、6、7、或8位。还要更典型的是，碳键合的杂环包括2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、5-吡啶基、6-吡啶基、3-哒嗪基、4-哒嗪基、5-哒嗪基、6-哒嗪基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-嘧啶基、6-嘧啶基、2-吡嗪基、3-吡嗪基、5-吡嗪基、6-吡嗪基、2-噻唑基、4-噻唑基、或5-噻唑基。
举例而言而非限制，氮键合的杂环键合于吖丙啶、吖丁啶、吡咯、吡咯烷、2-吡咯啉、3-吡咯啉、咪唑、咪唑啉、2-咪唑啉、3-咪唑啉、吡唑、吡唑啉、2-吡唑啉、3-吡唑啉、哌啶、哌嗪、吲哚、二氢吲哚、1H-吲唑的1位，异吲哚或异二氢吲哚的2位，吗啉的4位，及咔唑或β-咔啉的9位。还要更典型的是，氮键合的杂环包括1-aziridyl、1-azetedyl、1-吡咯基、1-咪唑基、1-吡唑基、和1-哌啶基。
“C3-C8杂环”指其中1-4个环碳原子独立地被选自O、S和N的杂原子取代的芳香族或非芳香族C3-C8碳环。C3-C8杂环的代表性例子包括但不限于苯并呋喃基、苯并噻吩(benzothiophene)、吲哚基、苯并吡唑基、香豆素基、异喹啉基、吡咯基、硫苯基、呋喃基、噻唑基、咪唑基、吡唑基、***基、喹啉基、嘧啶基、吡啶基、吡啶酮基、吡嗪基、哒嗪基、异噻唑基、异
Figure BDA00002807843500721
唑基、和四唑基。C3-C8杂环可以是未取代的，或者是被至多7个下述基团取代的，包括但不限于-C1-C8烃基、-O-(C1-C8烃基)、-芳基、-C(O)R’、-OC(O)R’、-C(O)OR’、-C(O)NH2、-C(O)NHR’、-C(O)N(R’)2、-NHC(O)R’、-S(O)2R’、-S(O)R’、-OH、-卤素、-N3、-NH2、-NH(R’)、-N(R’)2和-CN；其中每个R’独立选自H、-C1-C8烃基和芳基。
“C3-C8杂环基/C3-C8杂环并”指其中杂环基团的氢原子之一被键取代的上文定义的C3-C8杂环基团。C3-C8杂环基可以是未取代的，或者是被至多6个下述基团取代的，包括但不限于-C1-C8烃基、-O-(C1-C8烃基)、-芳基、-C(O)R’、-OC(O)R’、-C(O)OR’、-C(O)NH2、-C(O)NHR’、-C(O)N(R’)2、-NHC(O)R’、-S(O)2R’、-S(O)R’、-OH、-卤素、-N3、-NH2、-NH(R’)、-N(R’)2和-CN；其中每个R’独立选自H、-C1-C8烃基和芳基。
“碳环”指饱和的或不饱和的环，作为单环具有3-7个碳原子，作为双环具有7-12个碳原子。单环碳环具有3-6个环原子，还要更典型的是5或6个环原子。双环碳环具有7-12个环原子，例如排列成双环[4,5]、[5,5]、[5,6]或[6,6]体系，或者具有9或10个环原子，排列成双环[5,6]或[6,6]体系。单环碳环的例子包括环丙基、环丁基、环戊基、1-环戊-1-烯基、1-环戊-2-烯基、1-环戊-3-烯基、环己基、1-环己-1-烯基、1-环己-2-烯基、1-环己-3-烯基、环庚基、和环辛基。
“C3-C8碳环”指3、4、5、6、7或8个成员的饱和的或不饱和的非芳香族碳环。代表性的C3-C8碳环包括但不限于-环丙基、-环丁基、-环戊基、-环戊二烯基、-环己基、-环己烯基、-1,3-环己二烯基、-1,4-环己二烯基、-环庚基、-1,3-环庚二烯基、-1,3,5-环庚三烯基、-环辛基、和-环辛二烯基。C3-C8碳环基团可以是未取代的，或者是被一个或多个下述基团取代的，包括但不限于-C1-C8烃基、-O-(C1-C8烃基)、-芳基、-C(O)R’、-OC(O)R’、-C(O)OR’、-C(O)NH2、-C(O)NHR’、-C(O)N(R’)2、-NHC(O)R’、-S(O)2R’、-S(O)R’、-OH、-卤素、-N3、-NH2、-NH(R’)、-N(R’)2和-CN；其中每个R’独立选自H、-C1-C8烃基和芳基。
“C3-C8碳环基/C3-C8碳环并”指其中碳环基团的氢原子之一被键取代的上文定义的C3-C8碳环基团。
“接头”指包含使抗体共价附着于药物模块的共价键或原子链的化学模块。在各个实施方案中，接头包括：二价基，诸如亚烃基(alkyldiyl)、亚芳基、亚杂芳基，诸如-(CR2)nO(CR2)n-、烃氧基重复单元（例如聚亚乙基氧基(polyethyleneoxy)、PEG、聚亚甲基氧基(polymethyleneoxy)）和烃氨基（例如聚乙烯氨基，JeffamineTM）等模块；及二酸酯和酰胺类，包括琥珀酸酯、琥珀酰胺、二乙醇酸酯、丙二酸酯和己酰胺。
术语“手性”指分子具有镜像对映体不可重叠的特性，而术语“非手性”指分子可重叠于其镜像对映体上。
术语“立体异构体”指具有相同的化学结构，但是在原子或基团的空间排列方面有所不同的化合物。
“非对映异构体”指具有两个或更多手性中心且其分子彼此不为镜像对映体的空间异构体。非对映体具有不同的物理特性，例如熔点、沸点、光谱特征、和反应性。非对映异构体的混合物可以在高分辨力的分析规程下分开，诸如电泳和层析。
“对映异构体”指化合物的彼此为不可重叠镜像的两种空间异构体。
本文中使用的立体化学的定义和规则一般遵循S.P.Parker编,McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms(1984)McGraw-Hill BookCompany,New York;及Eliel,E.和Wilen,S.,Stereochemistry of OrganicCompunds(1994)John Wiley&Sons,Inc.,New York。许多有机化合物以旋光形式存在，即它们有能力旋转平面偏振光的平面。在描述旋光化合物时，前缀D和L或R和S用于表示分子关于其手性中心的绝对构型。前缀d和l或(+)和(-)用于表示化合物对平面偏振光的旋转的标记，其中(-)或1指化合物是左旋的。以(+)或d为前缀的化合物是右旋的。对于指定的化学结构，这些立体异构体是相同的，只是它们互为镜像。特定的立体异构体还可称作对映体，此类异构体的混合物通常称作对映混合物。对映体的50:50混合物称作外消旋混合物或外消旋物，它们可以在没有立体选择性或立体特异性的化学反应或方法中存在。术语“外消旋混合物”和“外消旋物”指两种对映体等摩尔混合从而没有旋光性的混合物。
“离去基团”指可以被另一官能团取代的官能团。某些离去基团是本领域公知的，例子包括但不限于卤化物（例如氯化物、溴化物、碘化物）、甲基磺酰基（甲磺酰基）、对甲苯磺酰基（甲苯磺酰基）、三氟甲基磺酰基(triflate)、和三氟甲基磺酸根。
缩写
接头组件：
MC=6-马来酰亚氨基己酰基
Val-Cit或“vc”=缬氨酸-瓜氨酸（蛋白酶可切割接头中的例示二肽）
瓜氨酸=2-氨基-5-脲基戊酸
PAB=对氨基苄氧羰基（“自我牺牲”接头组件的例示）
Me-Val-Cit=N-甲基-缬氨酸-瓜氨酸（其中接头肽键已经修饰以防止其受到组织蛋白酶B的切割）
MC(PEG)6-OH=马来酰亚氨基己酰基-聚乙二醇（可附着于抗体半胱氨酸）
SPP=N-琥珀酰亚氨基4-(2-吡啶基硫代)戊酸酯
SPDP=N-琥珀酰亚氨基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯
SMCC=琥珀酰亚氨基4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己烷-1-羧酸酯
IT=亚氨基硫烷
细胞毒性药物：
MMAE=单甲基auristatin E(MW718)
MMAF=auristatin E(MMAE)的变体，其在药物的C-末端处有苯丙氨酸(MW731.5)
MMAF-DMAEA=有DMAEA（二甲基氨基乙胺）以酰胺连接至C-末端苯丙氨酸的MMAF(MW801.5)
MMAF-TEG=有四乙二醇酯化至苯丙氨酸的MMAF
MMAF-NtBu=N-叔丁基作为酰胺附着于MMAF的C-末端
DM1=N(2')-脱乙酰基-N(2')-(3-巯基-1-氧丙基)-美登素
DM3=N(2')-脱乙酰基-N2-(4-巯基-1-氧戊基)-美登素
DM4=N(2')-脱乙酰基-N2-(4-巯基-4-甲基-1-氧戊基)-美登素
别的缩写如下：AE指auristatin E；Boc指N-(叔丁氧羰基)；cit指瓜氨酸；dap指dolaproine；DCC指1,3-二环己基碳二亚胺；DCM指二氯甲烷；DEA指二乙胺；DEAD指偶氮二羧酸二乙酯；DEPC指氰基磷酸二乙酯；DIAD指偶氮二羧酸二异丙酯；DIEA指N,N-二异丙基乙胺；dil指dolaisoleucine；DMA指二甲基乙酰胺；DMAP指4-二甲基氨基吡啶；DME指乙二醇二甲基醚（或1,2-二甲氧基乙烷）；DMF指N,N-二甲基甲酰胺；DMSO指二甲基亚砜；doe指dolaphenine；dov指N,N-二甲基缬氨酸；DTNB指5,5’-二硫双(2-硝基苯甲酸)；DTPA指二乙烯三胺五乙酸；DTT指二硫苏糖醇；EDCI指盐酸1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺；EEDQ指2-乙氧基-1-乙氧羰基-1,2-二氢喹啉；ES-MS指电喷雾质谱；EtOAc指乙酸乙酯；Fmoc指N-(9-芴基甲氧羰基)；gly指甘氨酸；HATU指O-(7-氮杂苯并***-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸酯；HOBt指1-羟基苯并***；HPLC指高压液相层析；ile指异亮氨酸；lys指赖氨酸；MeCN(CH3CN)指乙腈；MeOH指甲醇；Mtr指4-茴香基联苯基甲基（或4-甲氧基三苯甲基）；nor指(1S,2R)-(+)-去甲麻黄碱；PBS指磷酸盐缓冲盐水(pH7.4)；PEG指聚乙二醇；Ph指苯基；Pnp指对硝基苯基；MC指6-马来酰亚氨基己酰基；phe指L-苯丙氨酸；PyBrop指溴三吡咯烷膦六氟磷酸酯；SEC指大小排阻层析；Su指琥珀酰亚胺；TFA指三氟乙酸；TLC指薄层层析；UV指紫外线；而val指缬氨酸。
组合物及其制备方法
提供了结合STEAP-1的抗体。提供了包含抗STEAP-1抗体的免疫偶联物。本发明的抗体和免疫偶联物对于例如与STEAP-1表达改变（例如表达升高）有关的病症的诊断或治疗是有用的。在某些实施方案中，本发明的抗体或免疫偶联物对于细胞增殖性病症（诸如癌症）的诊断或治疗是有用的。
抗STEAP-1抗体
一方面，本发明提供了结合STEAP-1的抗体。在有些实施方案中，提供了结合成熟形式的人和猕猴(cyno)STEAP-1的抗体。在一个此类实施方案中，成熟形式的人STEAP-1具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列（图1）。猕猴STEAP-1具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列（图1）。在有些实施方案中，针对STEAP-1的抗体结合在细胞表面上表达的成熟形式的STEAP-1。在有些实施方案中，结合在细胞表面上表达的成熟形式的STEAP-1的抗体抑制细胞的生长。在有些实施方案中，抗STEAP-1抗体结合在细胞表面上表达的成熟形式的STEAP-1且抑制细胞增殖。在某些实施方案中，抗STEAP-1抗体结合在细胞表面上表达的成熟形式的STEAP-1且诱导细胞死亡。在有些实施方案中，抗STEAP-1抗体结合在癌细胞表面上表达的成熟形式的STEAP-1。在有些实施方案中，抗STEAP-1抗体结合在癌细胞表面上相对于同一组织起源的正常细胞过表达的成熟形式的STEAP-1。在有些实施方案中，抗STEAP-1抗体偶联至细胞毒素或可检测标记物且结合细胞表面上的STEAP-1。在有些实施方案中，抗体-毒素偶联物抑制细胞的生长。在有些实施方案中，抗体-可检测标记物偶联物使得在其表面上表达STEAP-1的细胞在体外或在体内可检测。
一方面，抗STEAP-1抗体是单克隆抗体。一方面，抗STEAP-1抗体是抗体片段，例如Fab、Fab’-SH、Fv、scFv、或(Fab’)2片段。一方面，抗STEAP-1抗体是嵌合抗体、人源化抗体、或人抗体。一方面，任何本文所述抗STEAP-1抗体是纯化的。
本文中提供了例示性的衍生自噬菌体文库的单克隆抗体。用于筛选文库的抗原是具有SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:30的氨基酸序列之序列的多肽，所述氨基酸序列对应于STEAP-1β和α的胞外结构域(ECD)。源自文库筛选的抗体是亲和力成熟的。
一方面，提供了与鼠120.545、120嫁接体(graft)、和人源化120v.24竞争结合STEAP-1的单克隆抗体。还提供了与鼠120.545、120嫁接体(graft)、和人源化120v.24结合相同表位的单克隆抗体。
在本发明的一个方面，提供了编码抗STEAP-1抗体的多核苷酸。在某些实施方案中，提供了包含编码抗STEAP-1抗体的多核苷酸的载体。在某些实施方案中，提供了包含此类载体的宿主细胞。在本发明的另一个方面，提供了包含抗STEAP-1抗体或编码抗STEAP-1抗体的多核苷酸的组合物。在某些实施方案中，本发明的组合物是用于治疗细胞增殖性病症（诸如本文所列举的那些）的药物配制剂。
例示性抗STEAP-1抗体的详细描述如下：
1.抗STEAP-1抗体的具体实施方案
在一个方面，本发明提供了抗STEAP-1抗体，其包含重链可变域，该重链可变域包含图2B的SEQ ID NO:9或10。在一个方面，本发明提供了抗STEAP-1抗体，其包含轻链可变域，该轻链可变域包含图2A的SEQ ID NO:6。
在一个方面，本发明提供了抗STEAP-1抗体，其包含重链，该重链包含SEQ ID NO:9，在指定的Kabat位置具有一处或多处以下氨基酸变化：A24V,V37I,V48M,F67I,和L78F。在一个实施方案中，重链包含选自SEQ ID NO:25,75,76,77,78,和79的重链框架区。在用于本文时，重链框架区称为“FR-H1-H4”或“HC-FR1-FR4”，而轻链框架区称为“FR-L1-L4”或“LC-FR1-FR4”。在一个方面，本发明提供了抗STEAP-1抗体，其包含轻链，该轻链包含SEQ ID NO:6。
在一个方面，本发明提供了抗STEAP-1抗体，其包含图2A和2B所示抗体120.v24的1,2,3,4,5,或6个HVR序列。
抗STEAP-1抗体可包含任何合适的框架可变域序列，前提是该抗体保留结合STEAP-1的能力。例如，在有些实施方案中，本发明的抗STEAP-1抗体包含人亚组III重链框架共有序列。在这些抗体的一个实施方案中，所述重链框架共有序列在第24,37,48,67,和/或78位包含替代。在这些抗体的一个实施方案中，第24位是A或V，第37位是I或V，第48位是M或V，第67位是I或F，和/或第78位是F或L。在一个实施方案中，这些抗体包含huMAb4D5-8的重链可变域框架序列，例如SEQ ID NO:21,22,23,和24(分别为FR-H1,FR-H2,FR-H3,FR-H4)。huMAb4D5-8在商业上称为
Figure BDA00002807843500771
抗HER2抗体,Genentech,Inc.,South San Francisco,CA,USA；在美国专利No.6,407,213&5,821,337,及Lee等,J.Mol.Biol.(2004),340(5):1073-93中也有提及。在这样一个实施方案中，这些抗体进一步包含人κI轻链框架共有序列。在这样一个实施方案中，这些抗体包含huMAb4D5-8的轻链可变域框架序列，例如SEQID NO:17,18,19,和20(分别为FR-L1,FR-L2,FR-L3,FR-L4)。
在一个实施方案中，抗STEAP-1抗体包含重链可变域，该重链可变域包含框架序列和高变区，其中所述框架序列包含分别为SEQ ID NO:21或25(FR-H1),22(FR-H2),23(FR-H3),和24(FR-H4)的FR-H1-FR-H4序列；HVRH1包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列；HVR-H2包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列；而HVR-H3包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列。在一个实施方案中，抗STEAP-1抗体包含轻链可变域，该轻链可变域包含框架序列和高变区，其中所述框架序列包含分别为SEQ ID NO:17,18,19和20的FR-L1-FR-L4序列；HVR-L1包含选自SEQ ID NO:11,12,和13的氨基酸序列。在这些抗体的一个实施方案中，重链可变域包含SEQ ID NO:9或10，而轻链可变域包含SEQ IDNO:6。
在有些实施方案中，本发明提供了抗STEAP-1抗体，其包含重链可变域，该重链可变域包含与氨基酸序列SEQ ID NO:9或10具有至少90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,或99%序列同一性的氨基酸序列。在有些实施方案中，具有至少90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,或99%序列同一性的氨基酸序列相对于参比序列包含替代、***、或删除，但是包含该氨基酸序列的抗体保留结合STEAP-1的能力。在有些实施方案中，在序列SEQ ID NO:9,10,14,15,16,21,22,23,24,25,75,76,77,78,和/或79中替代、***、或删除了总共1-10个氨基酸。在有些实施方案中，所述替代、***、或删除发生在HVR以外的区域中（即在FR中）。在有些实施方案中，抗STEAP-1抗体包含重链可变域，该重链可变域包含选自SEQ ID NO:9或10的氨基酸序列。
在有些实施方案中，本发明提供了包含图2B所示重链可变域(SEQ IDNO:9或10)的抗STEAP-1抗体。
在有些实施方案中，重链HVR和FR序列包含如下各项：
HVR-H1(GYSITSDYAWN,SEQ ID NO:14)；
HVR-H2(GYISNSGSTSYNPSLKS,SEQ ID NO:15)；
HVR-H3(ERNYDYDDYYYAMDY,SEQ ID NO:16)；
FR-H1(EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS,SEQ ID NO:21)；
FR-H1(EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVS,SEQ ID NO:25)；
FR-H2(WVRQAPGKGLEWV,SEQ ID NO:22)；
FR-H2(WIRQAPGKGLEWV,SEQ ID NO:75)；
FR-H2(WVRQAPGKGLEWM,SEQ ID NO:76)；
FR-H2(WIRQAPGKGLEWM,SEQ ID NO:77)；
FR-H3(RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR,SEQ ID NO:23)；
FR-H3(RITISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR,SEQ ID NO:78)；
FR-H3(RFTISRDNSKNTFYLQMNSLRAEDTAVYYCAR,SEQ ID NO:79)；
FR-H4(WGQGTLVTVSS,SEQ ID NO:24)。
在有些实施方案中，本发明提供了包含图2A所示轻链可变域(SEQ IDNO:6)的抗STEAP-1抗体。
在有些实施方案中，轻链HVR序列包含如下各项：
HVR-L1(KSSQSLLYRSNQKNYLA,SEQ ID NO:11)；
HVR-L2(WASTRES,SEQ ID NO:12)；
HVR-L3(QQYYNYPRT,SEQ ID NO:13)。
在有些实施方案中，轻链FR序列包含如下各项：
FR-L1(DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC,SEQ ID NO:17)；
FR-L2(WYQQKPGKAPKLLIY,SEQ ID NO:18)；
FR-L3(GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC,SEQ ID NO:19)；
FR-L4(FGQGTKVEIKR,SEQ ID NO:20)。
一方面，本发明提供了抗STEAP-1抗体，其包含轻链可变域，该轻链可变域包含与氨基酸序列SEQ ID NO:6具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%序列同一性的氨基酸序列。在有些实施方案中，具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%序列同一性的氨基酸序列相对于参比序列包含替代、添加、或删除，但是包含该氨基酸序列的抗体保留结合STEAP-1的能力。在有些实施方案中，在选自SEQ ID NO:6,11,12,13,17,18,19,和20的序列中替代、***、或删除了总共1-10个氨基酸。在有些实施方案中，所述替代、***、或删除存在于HVR以外的区域（即在FR中）。在有些实施方案中，抗STEAP-1抗体包含轻链可变域，该轻链可变域包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。
一方面，本发明提供了抗STEAP-1抗体，其包含重链可变域和轻链可变域，(a)该重链可变域包含与选自SEQ ID NO:9或10的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%序列同一性的氨基酸序列；且(b)该轻链可变域包含与SEQ ID NO:6的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%序列同一性的氨基酸序列。在有些实施方案中，具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%序列同一性的氨基酸序列相对于参比序列包含替代、添加、或删除，但是包含该氨基酸序列的抗体保留结合STEAP-1的能力。在有些实施方案中，在参比序列（包括但不限于选自SEQ IDNO:9,10,14,15,16,21,22,23,24,25,75,76,77,78,79的序列）中替代、***、或删除了总共1-10个氨基酸。在有些实施方案中，所述替代、***、或删除存在于HVR以外的区域（即在FR中）。在有些实施方案中，抗STEAP-1抗体包含重链可变域和轻链可变域，该重链可变域包含SEQ ID NO:9或10的氨基酸序列，且该轻链可变域包含选自SEQ ID NO:6的氨基酸序列。
一方面，本发明提供了抗STEAP-1抗体，其包含(a)一种、两种、或三种选自图2B所示VH HVR的VH HVR和/或(b)一种、两种、或三种选自图2A所示VL HVR的VL HVR。一方面，本发明提供了抗STEAP-1抗体，其包含选自图2B所示重链可变域的重链可变域和选自图2A所示轻链可变域的轻链可变域。
2.抗体片段
本发明涵盖抗体片段。抗体片段可以通过传统手段来生成，诸如酶促消化，或者通过重组技术来生成。在某些情况中，使用抗体片段有优势，而不是完整抗体。片段的较小尺寸容许快速清除，而且可导致更易于到达实体瘤。某些抗体片段的综述参见Hudson等(2003)Nat.Med.9:129-134。
已经开发了用于生成抗体片段的多种技术。传统上，通过蛋白水解消化完整抗体来衍生这些片段(参见例如Morimoto等,Journal of Biochemical andBiophysical Methods24:107-117(1992);及Brennan等,Science229:81(1985))。然而，现在可直接由重组宿主细胞生成这些片段。Fab、Fv和scFv抗体片段都可在大肠杆菌中表达和由大肠杆菌分泌，如此容许容易地生成大量的这些片段。可从上文讨论的噬菌体抗体库中分离抗体片段。或者，可直接从大肠杆菌回收Fab'-SH片段并化学偶联以形成F(ab')2片段(Carter等,Bio/Technology10:163-167(1992))。依照另一种方法，可直接从重组宿主细胞培养物分离F(ab')2片段。包含补救受体结合表位残基、具有延长的体内半衰期的Fab和F(ab')2片段记载于美国专利No.5,869,046。用于生成抗体片段的其它技术对于熟练从业人员会是显而易见的。在某些实施方案中，抗体是单链Fv片段(scFv)。参见WO93/16185;美国专利No.5,571,894;及5,587,458。Fv和scFv是具有完整结合位点、缺少恒定区的唯一类型；如此，它们可能适于在体内使用时降低非特异性结合。可构建scFv融合蛋白以生成效应器蛋白质在scFv的氨基或羧基末端的融合。参见Antibody Engineering,Borrebaeck编,见上文。抗体片段还可以是“线性抗体”，例如如美国专利No.5,641,870中所记载的。此类线性抗体可以是单特异性的或双特异性的。
3.人源化抗体
本发明涵盖人源化抗体。本领域知道用于人源化非人抗体的多种方法。例如，人源化抗体可具有一个或多个从非人来源引入的氨基酸残基。这些非人氨基酸残基常常称为“输入”残基，它们通常取自“输入”可变域。基本上可遵循Winter及其同事的方法进行人源化（Jones等(1986)Nature321:522-525;Riechmann等(1988)Nature332:323-327;Verhoeyen等(1988)Science239:1534-1536），即用高变区序列替代人抗体的对应序列。因此，此类“人源化”抗体是嵌合抗体（美国专利No.4,816,567），其中显著少于完整的人可变域用非人物种的相应序列替代。在实践中，人源化抗体通常是如下人抗体，其中有些高变区残基和可能的有些FR残基用啮齿类抗体类似位点的残基替代。
用于制备人源化抗体的人轻链和重链二者可变域的选择对于降低抗原性可能是重要的。依照所谓的“最适(best-fit)”方法，用啮齿类抗体的可变域序列对已知人可变域序列的整个文库进行筛选。然后选择与啮齿类最接近的人序列作为人源化抗体的人框架（Sims等(1993)J.Immunol.151:2296;Chothia等(1987)J.Mol.Biol.196:901）。另一种方法使用由特定轻链或重链亚组的所有人抗体的共有序列衍生的特定框架。相同框架可用于数种不同的人源化抗体（Carter等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:4285;Presta等(1993)J.Immunol.151:2623）。
一般还希望的是，抗体在人源化后保留对抗原的高亲和力和其它有利的生物学特性。为了达到此目的，依照一种方法，通过使用亲本序列和人源化序列的三维模型分析亲本序列和各种概念性人源化产物的过程来制备人源化抗体。通常可获得免疫球蛋白三维模型，这是本领域技术人员所熟悉的。还可获得图解和显示所选候选免疫球蛋白序列的可能三维构象结构的计算机程序。通过检查这些显示图像容许分析残基在候选免疫球蛋白序列发挥功能中的可能作用，即分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。这样，可以从受体序列和输入序列中选出FR残基并组合，从而得到期望的抗体特征，诸如对靶抗原的亲和力升高。一般而言，高变区残基直接且最实质地涉及对抗原结合的影响。
4.人抗体
本发明的人抗STEAP-1抗体可以通过如上所述联合选自人衍生噬菌体展示库的Fv克隆可变域序列与已知的人恒定域序列来构建。或者，可以通过杂交瘤方法来生成本发明的人单克隆抗STEAP-1抗体。用于生成人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系已有记载，例如Kozbor,J.Immunol.,133:3001(1984);Brodeur等,Monoclonal Antibody ProductionTechniques and Applications,pp.51-63(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987);及Boerner等,J.Immunol.,147:86(1991).
例如，现在有可能生成在缺乏内源免疫球蛋白生成的情况下能够在免疫后生成人抗体完整全集的转基因动物（例如小鼠）。例如，已经记载了嵌合和种系突变小鼠中抗体重链连接区(JH)基因的纯合删除导致内源抗体生成的完全抑制。在此类种系突变小鼠中转移大量人种系免疫球蛋白基因会导致在抗原攻击后生成人抗体。参见例如Jakobovits等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:2551(1993);Jakobovits等,Nature362:255(1993);Bruggermann等,Year inImmunol.7:33(1993)。
基因改组也可用于自非人（例如啮齿类）抗体衍生人抗体，其中人抗体具有与起始非人抗体相似的亲和力和特异性。依照此方法，它也称为“表位印记”(epitope imprinting)，如本文所述通过噬菌体展示技术得到的非人抗体片段的重链或轻链可变域用人V结构域基因全集替换，产生非人链/人链scFv或Fab嵌合物群。用抗原进行的选择导致如下非人链/人链嵌合scFv或Fab的分离，其中人链在一级噬菌体展示克隆中消除相应的非人链后恢复了抗原结合位点，即表位决定（印记，imprint）人链配偶的选择。在重复该过程以替换剩余非人链时，得到人抗体（参见PCT WO93/06213，公布于1993年4月1日）。与传统的通过CDR嫁接进行的非人抗体的人源化不同，此技术提供完全人的抗体，它们不含非人起源的FR或CDR残基。
5.双特异性抗体
双特异性抗体指对至少两种不同抗原具有结合特异性的单克隆抗体。在某些实施方案中，双特异性抗体是人抗体或人源化抗体。在某些实施方案中，结合特异性之一针对STEAP-1，结合特异性之另一针对任何其它抗原。在某些实施方案中，双特异性抗体可结合STEAP-1的两种不同表位。双特异性抗体还可用于将细胞毒剂定位于表达STEAP-1的细胞。这些抗体拥有STEAP-1结合臂和结合细胞毒剂（诸如例如肥皂草毒蛋白、抗干扰素-α、长春花生物碱类、蓖麻毒蛋白A链、甲氨蝶呤或放射性同位素半抗原）的臂。可将双特异性抗体制备成全长抗体或抗体片段（例如F(ab')2双特异性抗体）。
用于构建双特异性抗体的方法是本领域已知的。在传统上，双特异性抗体的重组生产基于两对免疫球蛋白重链-轻链的共表达，其中两种重链具有不同的特异性(Millstein和Cuello,Nature305:537(1983))。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机分配，这些杂交瘤（四源杂交瘤(quadroma)）生成10种不同抗体分子的潜在混合物，其中只有一种具有正确的双特异性结构。通常通过亲和层析步骤进行的正确分子的纯化相当麻烦且产物产量低。类似的规程披露于WO93/08829,公布于1993年5月13日及Traunecker等,EMBO J.10:3655(1991)。
依照一种不同的方法，将具有期望结合特异性（抗体-抗原结合位点）的抗体可变域与免疫球蛋白恒定域序列融合。例如，与包含至少部分铰链、CH2和CH3区的免疫球蛋白重链恒定域进行融合。在某些实施方案中，在至少一种融合物中存在包含轻链结合所必需的位点的第一重链恒定区(CH1)。将编码免疫球蛋白重链融合物和，在需要时，免疫球蛋白轻链的DNA***分开的表达载体，并共转染入合适的宿主生物体。在用于构建的三种多肽链比例不等时提供最佳产量的实施方案中，这为调整三种多肽片段的相互比例提供了极大的灵活性。然而，在至少两种多肽链以相同比例表达导致高产量时或在该比例没有特别意义时，有可能将两种或所有三种多肽链的编码序列***一个表达载体。
在该方法的一个实施方案中，双特异性抗体由一个臂上具有第一结合特异性的杂合免疫球蛋白重链，和另一个臂上的杂合免疫球蛋白重链-轻链对（提供第二结合特异性）构成。由于免疫球蛋白轻链仅在半个双特异性分子中的存在提供了便利的分离途径，因此发现这种不对称结构便于将期望的双特异性化合物与不想要的免疫球蛋白链组合分开。该方法披露于WO94/04690。关于生成双特异性抗体的进一步详情参见例如Suresh等,Methodsin Enzymology121:210(1986)。
依照另一种方法，可改造一对抗体分子间的界面，以将从重组细胞培养物回收的异二聚体的百分比最大化。界面包含至少部分抗体恒定域CH3结构域。在该方法中，将第一抗体分子界面的一个或多个小氨基酸侧链用较大侧链（例如酪氨酸或色氨酸）替换。通过将大氨基酸侧链用较小氨基酸侧链（例如丙氨酸或苏氨酸）替换，在第二抗体分子的界面上产生与大侧链相同或相似大小的补偿性“空腔”。这提供了较之其它不想要的终产物诸如同二聚体提高异二聚体产量的机制。
双特异性抗体包括交联或“异源偶联”抗体。例如，异源偶联物中的一种抗体可以与亲合素偶联，另一种抗体与生物素偶联。例如，此类抗体已经建议用于将免疫***细胞靶向不想要的细胞(美国专利No.4,676,980)，及用于治疗HIV感染(WO91/00360,WO92/00373和EP03089)。可使用任何便利的交联方法来制备异源偶联抗体。合适的交联剂是本领域众所周知的，连同许多交联技术一起披露于美国专利No.4,676,980。
文献中还记载了由抗体片段生成双特异性抗体的技术。例如，可使用化学连接来制备双特异性抗体。Brennan等,Science229:81(1985)记载了通过蛋白水解切割完整抗体以生成F(ab')2片段的规程。将这些片段在存在二硫醇络合剂***的情况下（用以稳定邻近的二硫醇和防止分子间二硫键的形成）还原。然后将产生的Fab’片段转变为硫代硝基苯甲酸酯(TNB)衍生物。然后将Fab'-TNB衍生物之一通过巯基乙胺的还原重新恢复成Fab'-硫醇，并与等摩尔量的另一种Fab'-TNB衍生物混合，以形成双特异性抗体。产生的双特异性抗体可用作酶的选择性固定化试剂。
最新的进展便于从大肠杆菌直接回收Fab'-SH片段，这些片段可化学偶联以形成双特异性抗体。Shalaby等,J.Exp.Med.175:217-225(1992)记载了完全人源化的双特异性抗体F(ab')2分子的生成。由大肠杆菌分开分泌每种Fab'片段，并在体外进行定向化学偶联以形成双特异性抗体。如此形成的双特异性抗体能够结合过表达HER2受体的细胞和正常人T细胞，以及触发人细胞毒性淋巴细胞针对人***肿瘤靶物的溶解活性。
还记载了直接从重组细胞培养物生成和分离双特异性抗体片段的多种技术。例如，已使用亮氨酸拉链生成双特异性抗体。Kostelny等,J.Immunol.148(5):1547-1553(1992)。将来自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉链肽通过基因融合与两种不同抗体的Fab'部分连接。抗体同二聚体在铰链区还原以形成单体，然后重新氧化以形成抗体异二聚体。这种方法也可用于生成抗体同二聚体。Hollinger等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444-6448(1993)记载的“双抗体”技术提供了构建双特异性抗体片段的替代机制。该片段包含通过接头相连的重链可变域(VH)和轻链可变域(VL)，所述接头太短使得同一条链上的两个结构域之间不能配对。因此，迫使一个片段上的VH和VL结构域与另一个片段上的互补VL和VH结构域配对，由此形成两个抗原结合位点。还报道了通过使用单链Fv(sFv)二聚体构建双特异性抗体片段的另一种策略。参见Gruber等,J.Immunol.152:5368(1994)。
涵盖具有超过两个效价的抗体。例如，可制备三特异性抗体。Tutt等,J.Immunol.147:60(1991)。
6.多价抗体
多价抗体可以比二价抗体更快的受到表达该抗体所结合抗原的细胞的内在化（和/或异化）。本发明的抗体可以是可容易地通过编码抗体多肽链的核酸的重组表达而生成的、具有三个或更多抗原结合位点（例如四价抗体）的多价抗体（IgM类别以外的）。多价抗体可包含二聚化结构域和三个或更多抗原结合位点。在某些实施方案中，二聚化结构域包含（或由其组成）Fc区或铰链区。在这种情况中，抗体会包含Fc区及Fc区氨基末端的三个或更多抗原结合位点。在某些实施方案中，多价抗体包含（或由其组成）三个至大约八个抗原结合位点。在一个这样的实施方案中，多价抗体包含（或由其组成）四个抗原结合位点。多价抗体包含至少一条多肽链（例如两条多肽链），其中所述多肽链包含两个或更多可变域。例如，多肽链可包含VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fc，其中VD1是第一可变域，VD2是第二可变域，Fc是Fc区的一条多肽链，X1和X2代表氨基酸或多肽，而n是0或1。例如，多肽链可包含：VH-CH1-柔性接头-VH-CH1-Fc区链；或VH-CH1-VH-CH1-Fc区链。本文中的多价抗体可进一步包含至少两条（例如四条）轻链可变域多肽。本文中的多价抗体可包含例如约两条至约八条轻链可变域多肽。本文所涵盖的轻链可变域多肽包含轻链可变域，且任选进一步包含CL结构域。
7.单域抗体
在有些实施方案中，本发明的抗体是单域抗体(single-domain antibody)。单域抗体是包含抗体的整个或部分重链可变域或者整个或部分轻链可变域的单一多肽链。在某些实施方案中，单域抗体是人单域抗体(Domantis,Inc.,Waltham,MA;参见例如美国专利No.6,248,516B1)。在一个实施方案中，单域抗体由抗体的整个或部分重链可变域组成。
8.抗体变体
在有些实施方案中，涵盖本文所述抗体的氨基酸序列修饰。例如，可能希望改进抗体的结合亲和力和/或其它生物学特性。抗体的氨基酸序列变体可以是通过将适宜的变化引入编码抗体的核苷酸序列或通过肽合成制备的。此类修饰包括例如抗体氨基酸序列内的残基删除和/或***和/或替代。可进行任何删除、***和替代组合以获得最终的构建物，倘若最终的构建物具有期望的特征。可在制备序列时将氨基酸改变引入受试抗体的氨基酸序列。
可用于鉴定抗体中作为优选诱变位置的某些残基或区域的方法有“丙氨酸扫描诱变”，如Cunningham和Wells(1989)Science244:1081-1085中所述。这里，鉴定一个残基或一组靶残基（例如带电荷的残基，诸如arg、asp、his、lys、和glu）并用中性或带负电荷的氨基酸（例如丙氨酸或多丙氨酸）替换，以影响氨基酸与抗原的相互作用。然后通过在或对替代位点引入更多或其它变体，推敲对替代展示功能敏感性的氨基酸位置。由此，尽管用于引入氨基酸序列变异的位点是预先决定的，然而突变本身的本质不必预先决定。例如，为了分析指定位点处突变的后果，在靶密码子或区域进行丙氨酸扫描或随机诱变，并对所表达的免疫球蛋白筛选期望的活性。
氨基酸序列***包括氨基和/或羧基末端的融合，长度范围由一个残基至包含一百或更多残基的多肽，以及单个或多个氨基酸残基的序列内***。末端***的例子包括具有N端甲硫氨酰残基的抗体。抗体分子的其它***变体包括将抗体的N或C端与酶（例如用于ADEPT）或延长抗体血清半衰期的多肽融合。
在某些实施方案中，本发明的抗体发生了改变以提高或降低抗体糖基化的程度。多肽的糖基化典型的或是N-连接的或是O-连接的。N-连接指碳水化合物模块附着于天冬酰胺残基的侧链。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸（其中X是除脯氨酸外的任何氨基酸）是将碳水化合物模块酶促附着于天冬酰胺侧链的识别序列。如此，多肽中这两种三肽序列任一的存在产生了潜在的糖基化位点。O-连接的糖基化指将糖类N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖之一附着于羟基氨基酸，最常见的是丝氨酸或苏氨酸，但也可使用5-羟脯氨酸或5-羟赖氨酸。
向抗体中添加或删除糖基化位点可通过改变氨基酸序列从而创建或消除一个或多个上述三肽序列而便利地完成（用于N-连接的糖基化位点）。所述改变还可通过向原始抗体的序列中添加、删除、或替代一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基来进行（用于O-连接的糖基化位点）。
若抗体包含Fc区，则可改变附着其上的碳水化合物。例如，美国专利申请号US2003/0157108(Presta,L.)中记载了有缺乏岩藻糖的成熟碳水化合物结构附着于抗体Fc区的抗体。还可参见US2004/0093621(Kyowa Hakko KogyoCo.,Ltd.)。WO2003/011878(Jean-Mairet等)和美国专利No.6,602,684(Umana等)中提到了在附着于抗体Fc区的碳水化合物中有等分N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)的抗体。WO1997/30087(Patel等)中报告了在附着于抗体Fc区的寡糖中有至少一个半乳糖残基的抗体。关于有更改碳水化合物附着于其Fc区的抗体还可参见WO1998/58964(Raju,S.)和WO1999/22764(Raju,S.)。关于具有改良糖基化的抗原结合分子还可参见US2005/0123546(Umana等)。
在某些实施方案中，糖基化变体包含Fc区，其中附着于Fc区的碳水化合物结构缺乏岩藻糖。此类变体具有改进的ADCC功能。任选的是，Fc区还包含进一步改进ADCC的一处或多处氨基酸替代，例如Fc区位置298、333和/或334处的替代（Eu残基编号方式）。涉及“脱岩藻糖型”或“岩藻糖缺乏型”抗体的出版物的例子包括：US2003/0157108;WO2000/61739;WO2001/29246;US2003/0115614;US2002/0164328;US2004/0093621;US2004/0132140;US2004/0110704;US2004/0110282;US2004/0109865;WO2003/085119;WO2003/084570;WO2005/035586;WO2005/035778;WO2005/053742;Okazaki等J.Mol.Biol.336:1239-1249(2004);Yamane-Ohnuki等Biotech.Bioeng.87:614(2004)。生成脱岩藻糖化抗体的细胞系的例子包括蛋白质岩藻糖化缺陷的Lec13CHO细胞(Ripka等Arch.Biochem.Biophys.249:533-545(1986);美国专利申请号US2003/0157108A1,Presta,L;及WO2004/056312A1,Adams等,尤其是实施例11)和敲除细胞系，诸如α-1,6-岩藻糖基转移酶基因FUT8敲除的CHO细胞(Yamane-Ohnuki等Biotech.Bioeng.87:614(2004))。
在一个实施方案中，抗体进行了改变以改进其血清半衰期。为了延长抗体的血清半衰期，可以将补救受体结合表位掺入抗体（尤其是抗体片段），如例如US5739277中所记载的。在用于本文时，术语“补救受体结合表位”指IgG分子（例如IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4）Fc区中负责延长IgG分子体内血清半衰期的表位（US2003/0190311;US6821505;US6165745;US5624821;US5648260;US6165745;US5834597）。
另一类变体是氨基酸替代变体。这些变体在抗体分子中有至少一个氨基酸残基用不同残基替换。进行替代诱变的感兴趣位点包括高变区，但是也涵盖FR改变。表1中“优选替代”栏显示了保守替代。如果此类替代导致期望的生物学活性变化，那么可导入表1中称为“例示替代”的更实质变化，或如下文参照氨基酸分类进一步所述，并筛选产物。
表1
Figure BDA00002807843500871
Figure BDA00002807843500881
对抗体生物学特性的实质性修饰可通过选择对维持以下方面的效果差异显著的替代来实现：(a)替代区域中多肽主链的结构，例如（折叠）片或螺旋构象，(b)靶位点处分子的电荷或疏水性，或(c)侧链的体积。根据其侧链特性的相似性，可将氨基酸如下分组(A.L.Lehninger,于Biochemistry,第2版,pp.73-75,Worth Publishers,New York(1975))：
(1)非极性的：Ala(A)、Val(V)、Leu(L)、Ile(I)、Pro(P)、Phe(F)、Trp(W)、Met(M)
(2)不带电荷的、极性的：Gly(G)、Ser(S)、Thr(T)、Cys(C)、Tyr(Y)、Asn(N)、Gln(Q)
(3)酸性的：Asp(D)、Glu(E)
(4)碱性的：Lys(K)、Arg(R)、His(H)或者，根据共同的侧链特性，天然存在残基可如下分组：
(1)疏水性的：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
(2)中性、亲水性的：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
(3)酸性的：Asp、Glu；
(4)碱性的：His、Lys、Arg；
(5)影响链取向的残基：Gly、Pro；
(6)芳香族的：Trp、Tyr、Phe。
非保守替代需要用这些类别之一的成员替换另一个类别的。此类替代残基还可以导入保守替代位点，或导入剩余（非保守）位点。
一类替代变体涉及替代亲本抗体（例如人源化或人抗体）的一个或多个高变区残基。通常，选择用于进一步开发的所得变体相对于产生它们的亲本抗体会具有改变的（例如改进的）生物学特性。用于生成此类替代变体的一种便利方法涉及使用噬菌体展示的亲和力成熟。简而言之，将数个高变区位点（例如6-7个位点）突变，在各个位点产生所有可能的氨基酸替代。如此生成的抗体展示在丝状噬菌体颗粒上，作为与各个颗粒内包装的噬菌体外壳蛋白（例如M13基因III产物）至少一部分的融合物。然后对噬菌体展示的变体筛选其生物学活性（例如结合亲和力）。为了鉴定用于修饰的候选高变区位点，可进行扫描诱变（例如丙氨酸扫描）以鉴定对抗原结合具有重要贡献的高变区残基。或者/另外，分析抗原-抗体复合物的晶体结构以鉴定抗体和抗原之间的接触点可能是有益的。此类接触残基及邻近残基是依照本领域已知的技术（包括本文详述的技术）进行替代的候选位点。一旦产生这样的变体，使用本领域已知的技术（包括本文所述的技术）对该组变体进行筛选，可选择在一种或多种相关测定法中具有优良特性的抗体用于进一步的开发。
编码抗体氨基酸序列变体的核酸分子可通过本领域知道的多种方法来制备。这些方法包括但不限于从天然来源分离（在天然存在氨基酸序列变体的情况中），或者通过对较早制备的变体或非变体型式的抗体进行寡核苷酸介导的（或定点）诱变、PCR诱变和盒式诱变来制备。
可能希望在本发明抗体的Fc区中引入一处或多处氨基酸修饰，由此生成Fc区变体。Fc区变体可包括在一个或多个氨基酸位置（包括铰链半胱氨酸的位置）包含氨基酸修饰（例如替代）的人Fc区序列（例如人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc区）。
依照此描述和本领域的教导，涵盖在有些实施方案中，本发明的抗体与野生型对应抗体相比可包含一处或多处改变（在例如Fc区中）。与它们的野生型对应物相比，这些抗体仍会基本上保留治疗功效所需要的相同特性。例如，认为可以在Fc区中进行会导致C1q结合和/或补体依赖性细胞毒性（CDC）改变（即或是增强或是削弱）的某些改变，例如WO99/51642中所述。还可参见关注Fc区变体其它例子的Duncan和Winter,Nature322:738-40(1988);美国专利No.5,648,260;美国专利No.5,624,821;及WO94/29351。WO00/42072(Presta)和WO2004/056312(Lowman)记载了对FcR的结合提高或降低的抗体变体。在此明确收入这些专利出版物的内容作为参考。还可参见Shields等J.Biol.Chem.9(2):6591-6604(2001)。半衰期延长且对新生儿Fc受体(FcRn)（它负责将母体IgG转移给胎儿）(Guyer等,J.Immunol.117:587(1976)及Kim等,J.Immunol.24:249(1994))的结合改良的抗体记载于US2005/0014934A1(Hinton等)。这些抗体包含具有一处或多处改进Fc区与FcRn结合的替代的Fc区。具有改变的Fc区氨基酸序列且C1q结合能力升高或降低的多肽变体记载于美国专利No.6,194,551B1,WO99/51642。在此明确收入这些专利出版物的内容作为参考。还可参见Idusogie等J.Immunol.164:4178-4184(2000)。
一方面，本发明提供了在构成Fc区的Fc多肽的界面中包含修饰的抗体，其中所述修饰便于和/或促进异二聚化。这些修饰包括在第一Fc多肽中导入***(protuberance)和在第二Fc多肽中导入空腔(cavity)，其中所述***可位于所述空腔中，从而促进第一与第二Fc多肽的复合。生成具有这些修饰的抗体的方法是本领域已知的，例如记载于美国专利No.5,731,168。
9.抗体衍生物
可进一步修饰本发明的抗体以包含本领域知道的且易于获得的额外非蛋白质性质模块。优选的是，适于抗体衍生化的模块是水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性例子包括但不限于聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纤维素、右旋糖苷、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二氧戊环、聚-1,3,6-三
Figure BDA00002807843500901
烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸（均聚物或随机共聚物）、右旋糖苷或聚(n-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇（例如甘油）、聚乙烯醇、及其混合物。由于其在水中的稳定性，聚乙二醇丙醛在生产中可能具有优势。聚合物可以是任何分子量，而且可以是分支的或不分支的。附着于抗体的聚合物数目可以变化，而且如果附着了超过一个聚合物，那么它们可以是相同或不同的分子。一般而言，可根据下列考虑来确定用于衍生化的聚合物的数目和/或类型，包括但不限于待改进抗体的具体特性或功能、抗体衍生物是否将用于指定条件下的治疗等。
在另一个实施方案中，提供了抗体与可通过暴露于辐射而选择性加热的非蛋白质性质模块的偶联物。在一个实施方案中，该非蛋白质性质模块是碳纳米管(Kam等,Proc.Natl.Acad.Sci.102:11600-11605(2005))。辐射可以是任何波长的，包括但不限于对普通细胞无害但将非蛋白质性质模块加热至接近抗体-非蛋白质性质模块的细胞被杀死的温度的波长。
制备抗体的某些方法
1.某些基于杂交瘤的方法
本发明的抗STEAP-1单克隆抗体可使用最初由Kohler等,Nature256:495(1975)记载的杂交瘤方法来制备，或者可以通过重组DNA方法(美国专利No.4,816,567)来制备。
在杂交瘤方法中，免疫小鼠或其它适宜的宿主动物，诸如仓鼠，以引发生成或能够生成如下抗体的淋巴细胞，所述抗体会特异性结合用于免疫的蛋白质。针对STEAP-1的抗体一般通过在动物中多次皮下(sc)或腹膜内(ip)注射STEAP-1和佐剂来生成。STEAP-1可以使用本领域众所周知的方法来制备，其中有些方法在本文中有进一步描述。例如，STEAP-1可以重组生产。在一个实施方案中，将动物用包含STEAP-1胞外部分且其融合至免疫球蛋白重链Fc部分的STEAP-1衍生物免疫。在一个实施方案中，将动物用STEAP-1-IgG1融合蛋白免疫。在一个实施方案中，将动物用在单磷酰脂质A(MPL)/海藻糖dicrynomycolate(TDM)(Ribi Immunochem.Research,Inc.,Hamilton,MT)的溶液中的STEAP-1免疫原性衍生物进行免疫，溶液皮内注射于多个部位。2周后，对动物进行加强免疫。7-14天后，对动物采血，并对血清测定抗STEAP-1滴度。对动物进行加强免疫，直到滴度达到平台(plateaus)。
或者，可以在体外免疫淋巴细胞。然后，使用合适的融合剂诸如聚乙二醇将淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，以形成杂交瘤细胞(Goding,MonoclonalAntibodies:Principles and Practice,pp.59-103,Academic Press,1986)。
将如此制备的杂交瘤细胞在合适的培养基中接种和培养，例如含有抑制未融合的亲本骨髓瘤细胞生长或存活的一种或多种物质的培养基。例如，若亲本骨髓瘤细胞缺乏酶次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HGPRT或HPRT)，则用于杂交瘤的培养基典型的会含有次黄嘌呤、氨基喋呤和胸苷（HAT培养基），这些物质阻止HGPRT缺陷细胞生长。
在某些实施方案中，骨髓瘤细胞是那些高效融合、支持所选抗体生成细胞稳定的高水平生成抗体、并对诸如HAT培养基的培养基敏感的。例示性的骨髓瘤细胞包括但不限于鼠骨髓瘤系，诸如那些可从索尔克研究所细胞分配中心(Salk Institute Cell Distribution Center,San Diego,California,USA)获得的MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤及可从美国典型培养物保藏中心(AmericanType Culture Collection,Rockville,Maryland,USA)获得的SP-2或X63-Ag8-653细胞所衍生的。人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系也已记载用于生成人单克隆抗体(Kozbor,J.Immunol.133:3001(1984);Brodeur等,Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,pp.51-63,Marcel Dekker,Inc.,New York,1987)。
可对杂交瘤细胞正在其中生长的培养液测定结合STEAP-1的单克隆抗体的生成。优选的是，通过免疫沉淀或通过体外结合测定法，诸如放射免疫测定法(RIA)或酶联免疫吸附测定法(ELISA)，测定由杂交瘤细胞生成的单克隆抗体的结合特异性。单克隆抗体的结合亲和力可通过例如Munson等,Anal.Biochem.107:220(1980)的Scatchard分析来测定。
在鉴定得到生成具有期望特异性、亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞后，该克隆可通过有限稀释规程进行亚克隆并通过标准方法进行培养(Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,pp.59-103,AcademicPress,1986)。适于这一目的的培养基包括例如D-MEM或RPMI-1640培养基。另外，杂交瘤细胞可以在动物中作为腹水瘤进行体内培养。可通过常规免疫球蛋白纯化规程，诸如例如蛋白A-Sepharose、羟磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析，将亚克隆分泌的单克隆抗体与培养液、腹水或血清适当分开。
2.某些文库筛选方法
本发明的抗STEAP-1抗体可以通过使用组合库筛选具有期望活性的抗体来生成。例如，本领域知道用于构建噬菌体展示库及对此类文库筛选具有期望的结合特性的抗体的多种方法。此类方法一般记载于Hoogenboom等(2001)于:Methods in Molecular Biology178:1-37(O’Brien等编,Human Press,Totowa,NJ)，在某些实施方案中是Lee等(2004)J.Mol.Biol.340:1073-1093。
在原理上，通过筛选噬菌体文库来选择合成抗体克隆，所述噬菌体文库含有展示融合至噬菌体外壳蛋白的各种抗体可变区(Fv)片段的噬菌体。通过针对所需抗原的亲和层析来淘选此类噬菌体文库。表达能够结合所需抗原的Fv片段的克隆被吸附至抗原，从而与文库中不结合的克隆分开。然后将结合的克隆从抗原上洗脱，而且可以通过额外的抗原吸附/洗脱循环进一步富集。本发明的任何抗STEAP-1抗体可以如下获得，即设计合适的抗原筛选规程来选择感兴趣的噬菌体克隆，接着使用来自感兴趣的噬菌体克隆的Fv序列和Kabat等,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,NIHPublication91-3242,Bethesda MD(1991),卷1-3中记载的合适的恒定区(Fc)序列来构建全长抗STEAP-1抗体克隆。
在某些实施方案中，抗体的抗原结合域由两个约110个氨基酸的可变(V)区形成，分别来自轻链(VL)和重链(VH)，都呈现三个高变环(HVR)或互补决定区(CDR)。可变域可以功能性的展示在噬菌体上，或是作为单链Fv(scFv)片段（其中VH和VL通过短的、柔性的接头共价相连），或者作为Fab片段（其中它们各自与恒定域融合且非共价相互作用），如Winter等,Ann.Rev.Immunol.,12:433-455(1994)所述。在用于本文时，编码scFv的噬菌体克隆和编码Fab的噬菌体克隆统称为“Fv噬菌体克隆”或“Fv克隆”。
VH和VL基因的全集可以通过聚合酶链式反应(PCR)分开克隆，并在噬菌体文库中随机重组，然后可以搜索抗原结合克隆，如Winter等,Ann.Rev.Immunol.,12:433-455(1994)所述。来自经免疫来源的文库提供对免疫原有高亲和力的抗体，无需构建杂交瘤。或者，可以克隆未免疫的全集，用于为广泛的非自身的及自身的抗原提供单一人抗体来源，无需任何免疫，如Griffiths等,EMBO J,12:725-734(1993)所述。最后，未免疫的文库还可以以合成方式来构建，即从干细胞克隆未重排的V基因区段，并使用包含随机序列的PCR引物来编码高度可变的CDR3区及用来在体外实现重排，如Hoogenboom和Winter,J.Mol.Biol.,227:381-388(1992)所述。
在某些实施方案中，通过与次要外壳蛋白pIII融合，使用丝状噬菌体来展示抗体片段。抗体片段可以展示为单链Fv片段，其中VH与VL结构域通过柔性多肽间隔物在同一多肽链上相连，例如如Marks等,J.Mol.Biol.,222:581-597(1991)所述，或者展示为Fab片段，其中一条链与pIII融合，另一条链分泌入细菌宿主细胞周质，在此装配Fab-外壳蛋白结构，其通过替换一些野生型外壳蛋白而展示在噬菌体表面上，例如如Hoogenboom等,Nucl.AcidsRes.,19:4133-4137(1991)所述。
一般而言，从收获自人或动物的免疫细胞获得编码抗体基因片段的核酸。如果希望文库偏向抗STEAP-1克隆，那么可以给受试者免疫STEAP-1以产生抗体应答，并回收脾细胞和/或循环B细胞或其它外周血淋巴细胞(PBL)用于文库构建。在一个优选的实施方案中，如下得到了偏向抗STEAP-1克隆的人抗体基因片段文库，即在携带功能性人免疫球蛋白基因阵列（且缺乏功能性内源抗体生成***）的转基因小鼠中产生抗STEAP-1抗体应答，使得STEAP-1免疫产生生成针对STEAP-1的人抗体的B细胞。生成人抗体的转基因小鼠的生成在下文中有描述。
可以如下获得抗STEAP-1反应性细胞群的进一步富集，即使用合适的筛选规程来分离表达STEAP-1特异性膜结合抗体的B细胞，例如通过使用STEAP-1亲和层析进行的细胞分离或者细胞对荧光染料标记的STEAP-1的吸附及后续的荧光激活细胞分选(flow-activated cell sorting,FACS)。
或者，来自未免疫供体的脾细胞和/或B细胞或其它PBL的使用提供了可能的抗体全集的更佳展现，而且还容许使用STEAP-1在其中没有抗原性的任何动物（人或非人的）物种构建抗体文库。对于构建体外掺入抗体基因的文库，从受试者收获干细胞以提供编码未重排抗体基因区段的核酸。可以从多种动物物种（诸如人、小鼠、大鼠、兔类、luprine、犬、猫、猪、牛、马、和禽类物种等）获得感兴趣的免疫细胞。
从感兴趣的细胞回收编码抗体可变基因区段（包括VH和VL区段）的核酸并扩增。就重排的VH和VL基因文库而言，可以如下获得所需DNA，即从淋巴细胞分离基因组DNA或mRNA，接着用与重排的VH和VL基因的5'和3'末端匹配的引物进行聚合酶链式反应(PCR)，如Orlandi等,Proc.Natl.Acad.Sci.(USA),86:3833-3837(1989)所述，由此构建多样性V基因全集供表达。可以从cDNA和基因组DNA扩增V基因，反向引物位于编码成熟V结构域的外显子的5'末端，正向引物基于J区段内部，如Orlandi等(1989)和Ward等,Nature,341:544-546(1989)所述。然而，为了从cDNA进行扩增，反向引物还可基于前导外显子内，如Jones等,Biotechnol.,9:88-89(1991)所述，正向引物基于恒定区内，如Sastry等,Proc.Natl.Acad.Sci.(USA),86:5728-5732(1989)所述。为了使互补性最大化，引物中可以掺入简并性，如Orlandi等(1989)或Sastry等(1989)所述。在某些实施方案中，如下将文库多样性最大化，即使用靶向每个V基因家族的PCR引物来扩增免疫细胞核酸样品中存在的所有可获得的VH和VL重排，例如如Marks等,J.Mol.Biol.,222:581-597(1991)的方法中所述或Orum等,Nucleic Acids Res.,21:4491-4498(1993)的方法中所述。为了将所扩增的DNA克隆入表达载体，可以在PCR引物的一端引入罕见的限制性位点作为标签，如Orlandi等(1989)所述，或者用带标签的引物进行进一步的PCR扩增，如Clackson等,Nature,352:624-628(1991)所述。
合成重排的V基因全集可以在体外从V基因区段衍生。大多数人VH基因区段已经克隆和测序(Tomlinson等,J.Mol.Biol.,227:776-798(1992))，并定位(Matsuda等,Nature Genet.,3:88-94(1993))；这些克隆的区段（包括H1和H2环的所有主要构造）可用于生成多样性VH基因全集，用到编码序列和长度多样性的H3环的PCR引物，如Hoogenboom和Winter,J.Mol.Biol.,227:381-388(1992)所述。VH全集还可如下生成，所有序列多样性集中于单一长度的长H3环，如Barbas等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4457-4461(1992)所述。人Vκ和Vλ区段已经克隆和测序(Williams和Winter,Eur.J.Immunol.,23:1456-1461(1993))，而且可用于生成合成轻链全集。基于一系列VH和VL折叠结构及L3和H3长度的合成V基因全集将编码具有可观结构多样性的抗体。扩增编码V基因的DNA后，依照Hoogenboom和Winter,J.Mol.Biol.,227:381-388(1992)的方法，可以在体外重排种系V基因区段。
抗体片段全集可以如下构建，即以数种方式将VH与VL基因全集联合在一起。可以在不同载体中创建各个全集，并在体外重组载体，例如如Hogrefe等,Gene,128:119-126(1993)所述，或者在体内通过组合感染来重组载体，例如Waterhouse等,Nucl.Acids Res.,21:2265-2266(1993)中记载的loxP***。体内重组方法利用Fab片段的双链性质来克服因大肠杆菌转化效率施加的库容量限制。分开克隆未免疫的VH和VL全集，一个克隆入噬菌粒，另一个克隆入噬菌体载体。然后通过用噬菌体感染含噬菌粒的细菌使得每个细胞包含一种不同组合来联合两个文库，库容量只受细胞存在数的限制（约1012个克隆）。两种载体都包含体内重组信号，使得VH与VL基因重组到单一复制子上，并共包装成噬菌体病毒粒。这些巨型文库提供了大量的具有优良亲和力(Kd -1为约10-8M)的多样性抗体。
或者，可以将全集序贯克隆入同一载体，例如如Barbas等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:7978-7982(1991)所述，或者通过PCR装配到一起，然后克隆，例如如Clackson等,Nature,352:624-628(1991)所述。PCR装配还可用于将VH和VL DNA与编码柔性肽间隔物的DNA连接以形成单链Fv(scFv)全集。在另一种技术中，“细胞内PCR装配”用于通过PCR在淋巴细胞内联合VH与VL基因，然后克隆所连接基因的全集，如Embleton等,Nucl.Acids Res.,20:3831-3837(1992)所述。
未免疫文库（天然的或合成的）生成的抗体可具有中等亲和力（Kd -1为约106-107M-1），但还可以如下在体外模拟亲和力成熟，即构建次生文库并再次选择，如Winter等(1994),见上文所述。例如，在Hawkins等,J.Mol.Biol.,226:889-896(1992)的方法或Gram等,Proc.Natl.Acad.Sci USA,89:3576-3580(1992)的方法中，使用易错聚合酶在体外随机引入突变(Leung等,Technique,1:11-15(1989))。另外，可以通过随机突变一个或多个CDR来进行亲和力成熟，例如在选定的个别Fv克隆中使用携带跨越感兴趣CDR的随机序列的引物进行PCR并筛选更高亲和力的克隆。WO9607754(公布于1996年3月14日)记载了用于在免疫球蛋白轻链的互补决定区中诱导诱变以创建轻链基因文库的方法。另一种高效方法是将通过噬菌体展示选出的VH或VL结构域与得自未免疫供体的天然存在V结构域变体全集重组，并在数轮链改组中筛选更高亲和力，如Marks等,Biotechnol.,10:779-783(1992)所述。此技术容许生成亲和力约10-9M或更低的抗体和抗体片段。
文库的筛选可通过本领域已知的多种技术来实现。例如，STEAP-1可用于包被吸附板的孔，在附着至吸附板的宿主细胞上表达，或用于细胞分选，或者偶联至生物素以用链霉亲合素包被的珠捕捉，或者用于淘选噬菌体展示库的任何其它方法。
在适于至少部分噬菌体颗粒结合吸附剂的条件下，使噬菌体文库样品接触固定化的STEAP-1。正常情况下，选择包括pH、离子强度、温度等等的条件来模拟生理学条件。结合至固相的噬菌体进行清洗，然后用酸洗脱，例如如Barbas等,Proc.Natl.Acad.Sci USA,88:7978-7982(1991)所述，或者用碱洗脱，例如如Marks等,J.Mol.Biol.,222:581-597(1991)所述，或者通过STEAP-1抗原竞争洗脱，例如在与Clackson等,Nature,352:624-628(1991)的抗原竞争法类似的规程中。噬菌体在单轮选择中可以富集20-1,000倍。此外，富集的噬菌体可以在细菌培养物中进行培养，并进行更多轮选择。
选择的效率取决于许多因素，包括清洗过程中解离的动力学，及单个噬菌体上的多个抗体片段是否能同时结合抗原。具有较快解离动力学（和弱结合亲和力）的抗体可以通过使用短时间的清洗、多价噬菌体展示、及固相中的高抗原包被密度来保留。高密度不仅通过多价相互作用而稳定了噬菌体，而且有利于已解离的噬菌体的再结合。具有较慢解离动力学（和强结合亲和力）的抗体的选择可以通过使用长时间的清洗和单价噬菌体展示（如Bass等,Proteins,8:309-314(1990)和WO92/09690所述）及低抗原包被密度（如Marks等,Biotechnol.,10:779-783(1992)所述）来促进。
有可能在对STEAP-1具有不同亲和力的噬菌体抗体之间进行选择，甚至是亲和力略有差异的。然而，选定抗体的随机突变（例如如有些亲和力成熟技术中所进行的）有可能产生许多突变体，多数结合抗原，少数具有更高的亲和力。通过限制STEAP-1，罕见的高亲和力噬菌体能竞争胜出。为了保留所有较高亲和力的突变体，可以将噬菌体与过量的生物素化STEAP-1一起温育，但是生物素化STEAP-1的浓度以摩尔计低于STEAP-1的目标摩尔亲和常数。然后可以用链霉亲合素包被的顺磁珠捕捉高亲和力的结合噬菌体。此类“平衡捕捉”容许依照结合亲和力来选择抗体，其灵敏性容许从大大过量的低亲和力噬菌体中分离出亲和力只有原值2倍的突变体克隆。还可以操作用于清洗结合至固相的噬菌体的条件来进行基于解离动力学的区分。
抗STEAP-1克隆可以基于活性进行选择。在某些实施方案中，本发明提供了结合天然表达STEAP-1的活细胞的抗STEAP-1抗体。在一个实施方案中，本发明提供了阻断STEAP-1配体与STEAP-1之间的结合但不阻断STEAP-1配体与第二蛋白质之间的结合的抗STEAP-1抗体。对应于此类抗STEAP-1抗体的Fv克隆可以如下选出：(1)如上所述从噬菌体文库分离抗STEAP-1克隆，并任选通过在合适的细菌宿主中培养所分离的噬菌体克隆群来扩增该群体；(2)选出分别想要阻断和不阻断其活性的第二蛋白质和STEAP-1；(3)使抗STEAP-1噬菌体克隆吸附至固定化的STEAP-1；(4)使用过量的第二蛋白质来洗脱任何不想要的、识别STEAP-1结合决定簇（其与第二蛋白质的结合决定簇交叠或共享）的克隆；并(5)洗脱在步骤(4)后仍然吸附的克隆。任选的是，具有期望的阻断/不阻断特性的克隆可以通过一次或多次重复本文所述选择规程来进一步富集。
编码本发明杂交瘤衍生单克隆抗体或噬菌体展示Fv克隆的DNA易于使用常规规程分离和测序（例如通过使用设计成自杂交瘤或噬菌体DNA模板特异性扩增感兴趣的重链和轻链编码区的寡核苷酸引物）。一旦分离，可将DNA置于表达载体中，然后将该表达载体转染入原本不生成免疫球蛋白蛋白质的宿主细胞，诸如大肠杆菌细胞、猿COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞，以在重组宿主细胞中获得所需单克隆抗体的合成。关于编码抗体的DNA在细菌中的重组表达的综述性论文包括Skerra等,Curr.Opinion inImmunol.,5:256(1993)及Pluckthun,Immunol.Revs,130:151(1992)。
编码本发明Fv克隆的DNA可以联合编码重链和/或轻链恒定区的已知DNA序列（例如适宜的DNA序列可得自Kabat等,见上文）以形成编码全长或部分长度重链和/或轻链的克隆。应当领会，任何同种型的恒定区都可用于此目的，包括IgG、IgM、IgA、IgD和IgE恒定区，而且此类恒定区可以得自任何人或动物物种。衍生自一种动物（诸如人）物种的可变域DNA，然后与另一动物物种的恒定区DNA融合以形成“杂合的”全长重链和/或轻链的编码序列的Fv克隆包括在本文所用“嵌合”和“杂合”抗体的定义中。在某些实施方案中，衍生自人可变DNA的Fv克隆与人恒定区DNA融合以形成全长或部分长度人重链和/或轻链的编码序列。
还可以修饰编码衍生自本发明杂交瘤的抗STEAP-1抗体的DNA，例如通过替代，即用人重链和轻链恒定域的编码序列替换衍生自杂交瘤克隆的同源鼠序列(例如如Morrison等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984)中的方法)。可以进一步修饰编码杂交瘤或Fv克隆衍生抗体或片段的DNA，通过共价连接免疫球蛋白编码序列和非免疫球蛋白多肽的整个或部分编码序列。可以以该方式制备具有本发明的Fv克隆或杂交瘤克隆衍生抗体的结合特异性的“嵌合”或“杂合”抗体。
3.载体、宿主细胞和重组方法
为了重组生产本发明的抗体，分离编码它的核酸，并将其***可复制载体，用于进一步克隆（DNA扩增）或表达。可使用常规规程容易的分离编码抗体的DNA并测序（例如使用能够与编码抗体重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针）。可利用许多载体。载体的选择部分取决于将要使用的宿主细胞。一般而言，宿主细胞或是原核或是真核（通常是哺乳动物）起源的。应当领会，任何同种型的恒定区可用于此目的，包括IgG、IgM、IgA、IgD和IgE恒定区，而且此类恒定区可以从任何人或动物物种获得。
使用原核宿主细胞生成抗体：
载体构建
可使用标准重组技术来获得编码本发明抗体多肽构件的多核苷酸序列。可以从抗体生成细胞诸如杂交瘤细胞分离期望的多核苷酸序列并测序。或者，可使用核苷酸合成仪或PCR技术合成多核苷酸。一旦得到，将编码多肽的序列***能够在原核宿主中复制并表达异源多核苷酸的重组载体。为了本发明目的，可使用本领域可获得的且知道的许多载体。适宜载体的选择会主要取决于将要***载体的核酸的大小和将要用载体转化的具体宿主细胞。根据其功能（扩增或表达异源多核苷酸，或二者兼之）及其与它在其中驻留的具体宿主细胞的相容性，每种载体含有多种构件。载体构件通常包括但不限于：复制起点、选择标志基因、启动子、核糖体结合位点(RBS)、信号序列、异源核酸***物、和转录终止序列。
一般而言，与宿主细胞一起使用包含衍生自与这些宿主相容物种的复制子和控制序列的质粒载体。载体通常携带复制位点，以及能够在转化细胞中提供表型选择的标志序列。例如，通常用衍生自大肠杆菌物种的质粒pBR322转化大肠杆菌。pBR322包含编码氨苄青霉素(Amp)和四环素(Tet)抗性的基因，由此提供轻松鉴定转化细胞的手段。pBR322、其衍生物、或其它微生物质粒或噬菌体还可包含或经修饰而包含可被微生物生物体用于表达内源蛋白质的启动子。Carter等,美国专利No.5,648,237中详细记载了用于表达特定抗体的pBR322衍生物的例子。
另外，可以将包含与宿主微生物相容的复制子和控制序列的噬菌体载体用作这些宿主的转化载体。例如，可使用噬菌体诸如λGEM.TM.-11来构建可用于转化易感宿主细胞诸如大肠杆菌LE392的重组载体。
本发明的表达载体可包含两种或更多启动子-顺反子对，它们编码每一种多肽构件。启动子是位于顺反子上游（5'）的非翻译调控序列，它调控顺反子的表达。原核启动子通常分成两类，诱导型的和组成性的。诱导型启动子指响应培养条件的变化（例如营养物的存在与否或温度变化）而启动受其控制的顺反子的升高水平转录的启动子。
众所周知受到多种潜在宿主细胞识别的大量启动子。通过限制酶消化切下源DNA中的启动子并将分离的启动子序列***本发明的载体，由此可以将选择的启动子与编码轻链或重链的顺反子DNA可操作连接。天然启动子序列和许多异源启动子都可用于指导靶基因的扩增和/或表达。在有些实施方案中，使用异源启动子，因为与天然靶多肽启动子相比，它们通常容许所表达靶基因的更高转录和更高产量。
适用于原核宿主的启动子包括PhoA启动子、β-半乳糖苷酶和乳糖启动子***、色氨酸(trp)启动子***、和杂合启动子诸如tac或trc启动子。然而，在细菌中有功能的其它启动子（诸如其它已知的细菌或噬菌体启动子）也是合适的。它们的核苷酸序列已经发表，由此熟练工作人员能够使用提供任何所需限制性位点的接头或衔接头将它们与编码靶轻链和重链的顺反子可操作连接（Siebenlist等(1980)Cell20:269）。
在本发明的一个方面，重组载体内的每个顺反子都包含指导所表达多肽穿膜转运的分泌信号序列构件。一般而言，信号序列可以是载体的构件，或者它可以是***载体的靶多肽DNA的一部分。为了本发明目的而选择的信号序列应当是受到宿主细胞识别并加工（即被信号肽酶切除）的信号序列。对于不识别并加工异源多肽的天然信号序列的原核宿主细胞，将信号序列用选自例如下组的原核信号序列替代：碱性磷酸酶、青霉素酶、Ipp、或热稳定的肠毒素II(STII)前导序列、LamB、PhoE、PelB、OmpA和MBP。在本发明的一个实施方案中，表达***的两个顺反子中都使用的信号序列是STII信号序列或其变体。
在另一方面，依照本发明的免疫球蛋白的生成可以在宿主细胞的细胞质中发生，因此不需要在每个顺反子内存在分泌信号序列。在那点上，免疫球蛋白轻链和重链在细胞质内表达、折叠和装配而形成功能性免疫球蛋白。某些宿主菌株（例如大肠杆菌trxB-菌株）提供有利于二硫键形成的细胞质条件，从而容许所表达蛋白质亚基的正确折叠和装配。Proba和Pluckthun,Gene159:203(1995)。
本发明的抗体还可使用如下表达***来生成，其中所表达多肽构件的数量比率可以受到调控，从而将分泌且正确装配的本发明抗体的产量最大化。此类调控是至少部分通过同时调控多肽构件的翻译强度而实现的。
Simmons等,美国专利No.5,840,523中公开了用于调控翻译强度的一种技术。它在顺反子内利用翻译起始区(TIR)的变体。对于指定的TIR，可创建具有一定范围翻译强度的一系列氨基酸或核酸序列变体，由此提供针对特定链的期望表达水平调节此因素的方便手段。可通过常规诱变技术导致能改变氨基酸序列的密码子变化来生成TIR变体。在某些实施方案中，核苷酸序列中的变化是沉默的。TIR中的改变可包括例如Shine-Dalgarno序列的数目或间距的改变，及信号序列中的改变。用于生成突变型信号序列的一种方法是在编码序列的开始端生成不改变信号序列氨基酸序列的“密码子库”（即变化是沉默的）。这可通过改变每个密码子的第三个核苷酸位置来实现；另外，有些氨基酸，诸如亮氨酸、丝氨酸、和精氨酸，具有多种第一个和第二个位置，这可在建库中增加复杂性。Yansura等(1992)METHODS:A Companion toMethods in Enzymol.4:151-158中详细记载了这种诱变方法。
在一个实施方案中，对于载体中的每个顺反子，生成具有一定范围TIR强度的一组载体。这个有限集合提供了每条链的表达水平以及期望抗体产物的产量在各种TIR强度组合下的比较。可通过量化报道基因的表达水平来测定TIR强度，Simmons等,美国专利No.5,840,523中有详细描述。根据翻译强度的比较，选择期望的个别TIR在本发明的表达载体构建物中进行组合。
适于表达本发明抗体的原核宿主细胞包括古细菌（Archaebacteria）和真细菌（Eubacteria），诸如革兰氏阴性或阳性生物体。有用细菌的例子包括埃希氏菌属（Escherichia）（例如大肠埃希氏菌或大肠杆菌E.coli）、芽孢杆菌属（Bacillus）（例如枯草芽孢杆菌B.subtilis）、肠杆菌属（Enterobacteria）、假单胞菌属（Pseudomonas）（例如铜绿假单胞菌P.aeruginosa）物种、鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）、粘质沙雷氏菌（Serratia marcescans）、克雷伯氏菌属（Klebsiella）、变形菌属（Proteus）、志贺氏菌属（Shigella）、根瘤菌属（Rhizobium）、透明颤菌属（Vitreoscilla）、或副球菌属（Paracoccus）。在一个实施方案中，使用革兰氏阴性细胞。在一个实施方案中，使用大肠杆菌细胞作为本发明的宿主。大肠杆菌菌株的例子包括菌株W3110（Bachmann,Cellular and Molecular Biology,卷2,Washington,D.C.,美国微生物学学会,1987,第1190-1219页；ATCC保藏号27,325）及其衍生物，包括具有基因型W3110 ΔfhuA(ΔtonA)ptr3 lac Iq lacL8 ΔompTΔ(nmpc-fepE)degP41kanR的菌株33D3（美国专利No.5,639,635）。其它菌株及其衍生物，诸如大肠杆菌294（ATCC31,446）、大肠杆菌B、大肠杆菌λ1776（ATCC31,537）和大肠杆菌RV308（ATCC31,608）也是合适的。这些例子只是例示而非限制。本领域知道用于构建具有指定基因型的任何上述细菌衍生物的方法，参见例如Bass等,Proteins8:309-314(1990)。通常必需考虑复制子在细菌细胞中的可复制性来选择适宜的细菌。例如，在使用众所周知的质粒诸如pBR322、pBR325、pACYC177或pKN410来提供复制子时，大肠杆菌、沙雷氏菌属、或沙门氏菌属物种可能适于用作宿主。通常，宿主细胞应当分泌最小量的蛋白水解酶，而且可能希望在细胞培养中掺入额外的蛋白酶抑制剂。
抗体生成
用上述表达载体转化宿主细胞，并在为了诱导启动子、选择转化子或扩增编码期望序列的基因而适当改动的常规营养培养基中进行培养。
转化即将DNA导入原核宿主，使得DNA能够进行复制，或是作为染色体外元件或是通过染色体整合(integrant)。根据所用宿主细胞，使用适于此类细胞的标准技术进行转化。采用氯化钙的钙处理通常用于具有坚固细胞壁屏障的细菌细胞。另一种转化方法采用聚乙二醇/DMSO。使用的还有一种技术是电穿孔。
在本领域知道的且适于培养选定宿主细胞的培养基中培养用于生成本发明多肽的原核细胞。合适培养基的例子包括添加了必需营养补充物的LB培养基(Luria broth)。在有些实施方案中，培养基还含有根据表达载体的构建而选择的选择剂，以选择性容许包含表达载体的原核细胞生长。例如，向用于培养表达氨苄青霉素抗性基因的细胞的培养基中添加氨苄青霉素。
在碳源、氮源、和无机磷酸盐源以外，还可含有适当浓度的任何必需补充物，或是单独加入或是作为与另一种补充物或培养基的混合物，诸如复合氮源。任选的是，培养基可含有一种或多种选自下组的还原剂：谷胱甘肽、半胱氨酸、胱胺、巯基乙酸盐/酯、二硫赤藓糖醇和二硫苏糖醇。
在合适的温度培养原核宿主细胞。在某些实施方案中，对于培养大肠杆菌，培养温度的范围为约20℃至约39℃、约25℃至约37℃、或约30℃。主要取决于宿主生物体，培养基的pH可以是范围为约5至约9的任何pH。在某些实施方案中，对于大肠杆菌，pH是约6.8至约7.4、或约7.0。
如果本发明的表达载体中使用诱导型启动子，那么在适于激活启动子的条件下诱导蛋白质表达。在本发明的一个方面，使用PhoA启动子来控制多肽的转录。因此，为了诱导，在磷酸盐限制培养基中培养经过转化的宿主细胞。在某些实施方案中，磷酸盐限制培养基是C.R.A.P培养基（参见例如Simmons等,J.Immunol.Methods263:133-147(2002)）。根据所采用的载体构建物，可采用多种其它诱导物，正如本领域所知道的。
在一个实施方案中，所表达的本发明多肽分泌入宿主细胞的周质并从中回收。蛋白质回收通常涉及破坏微生物，通常通过诸如渗压震扰(osmoticshock)、超声处理或裂解等手段。一旦细胞遭到破坏，可通过离心或过滤清除细胞碎片或整个细胞。可以通过例如亲和树脂层析进一步纯化蛋白质。或者，蛋白质可以转运入培养液并从中分离。可以从培养液清除细胞，并将培养物上清液过滤和浓缩，用于进一步纯化所生成蛋白质。可使用普遍知道的方法诸如聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和Western印迹分析进一步分离和鉴定所表达多肽。
在本发明的一个方面，通过发酵过程大量进行抗体生产。多种大规模补料-分批发酵规程可用于生产重组蛋白。大规模发酵具有至少1000升的容量，在某些实施方案中是约1,000至100,000升的容量。这些发酵罐使用搅拌器叶轮来分配氧和养分，尤其是葡萄糖（优选的碳源/能源）。小规模发酵通常指在体积容量不超过约100升的发酵罐中进行的发酵，范围可以是约1升至约100升。
在发酵过程中，通常在将细胞在合适条件下培养至期望密度（例如OD550约180-220，在此阶段细胞处于早期稳定期）后启动蛋白质表达的诱导。根据所采用的载体构建物，可使用多种诱导物，正如本领域知道的和上文描述的。可以在诱导前将细胞培养更短的时间。通常将细胞诱导约12-50小时，但是可使用更长或更短的诱导时间。
为了提高本发明多肽的产量和质量，可修改多项发酵条件。例如，为了改善所分泌抗体多肽的正确装配和折叠，可使用过表达伴侣蛋白诸如Dsb蛋白（DsbA、DsbB、DsbC、DsbD和/或DsbG）或FkpA（具有伴侣活性的一种肽基脯氨酰-顺式,反式-异构酶）的额外载体来共转化宿主原核细胞。已经证明伴侣蛋白促进在细菌宿主细胞中生成的异源蛋白质的正确折叠和溶解度。Chen等(1999)J.Biol.Chem.274:19601-19605;Georgiou等,美国专利No.6,083,715;Georgiou等,美国专利No.6,027,888;Bothmann和Pluckthun(2000)J.Biol.Chem.275:17100-17105;Ramm和Pluckthun(2000)J.Biol.Chem.275:17106-17113;Arie等(2001)Mol.Microbiol.39:199-210）。
为了将所表达异源蛋白质（尤其是对蛋白水解敏感的异源蛋白质）的蛋白水解降至最低，可以将蛋白水解酶缺陷的某些宿主菌株用于本发明。例如，可修饰宿主细胞菌株，在编码已知细菌蛋白酶的基因中进行遗传突变，诸如蛋白酶III、OmpT、DegP、Tsp、蛋白酶I、蛋白酶Mi、蛋白酶V、蛋白酶VI及其组合。可以获得有些大肠杆菌蛋白酶缺陷菌株，参见例如Joly等(1998)见上文;Georgiou等,美国专利No.5,264,365;Georgiou等,美国专利No.5,508,192;Hara等,Microbial Drug Resistance2:63-72(1996)。
在一个实施方案中，在本发明的表达***中使用蛋白水解酶缺陷且经过过表达一种或多种伴侣蛋白的质粒转化的大肠杆菌菌株作为宿主细胞。
抗体纯化
在一个实施方案中，进一步纯化本文中生成的抗体蛋白质以获得基本上同质的制备物，用于进一步的测定和使用。可采用本领域知道的标准蛋白质纯化方法。下面的规程是合适纯化规程的例示：免疫亲和或离子交换柱上的分级、乙醇沉淀、反相HPLC、硅土或阳离子交换树脂诸如DEAE上的层析、层析聚焦、SDS-PAGE、硫酸铵沉淀、和使用例如Sephadex G-75的凝胶过滤。
在一个方面，将固定化在固相上的蛋白A用于本发明抗体产物的免疫亲和纯化。蛋白A是来自金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureas）的41kD细胞壁蛋白质，它以高亲和力结合抗体Fc区。Lindmark等,J.Immunol.Meth.62:1-13(1983)）。蛋白A固定化其上的固相可以是具有玻璃或石英表面的柱子，或者可控孔径玻璃柱或硅酸柱。在有些应用中，柱子以诸如甘油等试剂包被，用以有可能防止污染物的非特异粘附。
作为纯化的第一步，可以将衍生自如上所述细胞培养物的制备物施加到蛋白A固定化固相上，使得感兴趣抗体特异性结合蛋白A。然后清洗固相以清除与固相非特异性结合的污染物。最后通过洗脱从固相回收感兴趣抗体。
使用真核宿主细胞生成抗体：
在真核宿主细胞中使用的载体通常包含一种或多种以下非限制性构件：信号序列、复制起点、一种或多种标志基因、增强子元件、启动子、和转录终止序列。
信号序列构件
在真核宿主细胞中使用的载体还可在感兴趣成熟蛋白质或多肽的N端包含信号序列或具有特异性切割位点的其它多肽。可以选择受到宿主细胞识别并加工（即被信号肽酶切除）的异源信号序列。在哺乳动物细胞表达中，可利用哺乳动物信号序列以及病毒分泌前导，例如单纯疱疹gD信号。将此类前体区的DNA连接到编码抗体的DNA的读码框中。
复制起点
通常，哺乳动物表达载体不需要复制起点构件。例如，通常可使用SV40起点，只因其包含早期启动子。
选择基因构件
表达和克隆载体可包含选择基因，也称为选择标志。典型的选择基因编码如下蛋白质：(a)赋予对抗生素或其它毒素的抗性，例如氨苄青霉素、新霉素、甲氨蝶呤或四环素；(b)补足相应的营养缺陷；或(c)提供不能从复合培养基获得的关键营养物。
选择方案的一个例子利用药物来阻滞宿主细胞的生长。经异源基因成功转化的那些细胞生成赋予药物抗性的蛋白质，因而幸免于选择方案。此类显性选择的例子使用药物新霉素、霉酚酸和潮霉素。
适于哺乳动物细胞的选择标志的另一个例子是能够鉴定有能力摄取抗体核酸的细胞的选择标志，诸如DHFR、胸苷激酶、金属硫蛋白I和II（优选灵长类金属硫蛋白基因）、腺苷脱氨酶、鸟氨酸脱羧酶等。
例如，在有些实施方案中，首先通过将所有转化子在含有甲氨蝶呤（Mtx，DHFR的一种竞争性拮抗剂）的培养基中进行培养来鉴定经DHFR选择基因转化的细胞。在有些实施方案中，在采用野生型DHFR时，适宜的宿主细胞是DHFR活性缺陷的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系（例如ATCC CRL-9096）。
或者，可通过在含有针对选择标志的选择剂诸如氨基糖苷抗生素例如卡那霉素、新霉素或G418的培养基中培养细胞来选择经编码抗体、野生型DHFR蛋白、和另一种选择标志诸如氨基糖苷3'-磷酸转移酶(APH)的DNA序列转化或共转化的宿主细胞（特别是包含内源DHFR的野生型宿主）。参见美国专利No.4,965,199。
启动子构件
表达和克隆载体通常包含受到宿主生物体识别且与编码感兴趣多肽（例如抗体）的核酸可操作连接的启动子。已知真核细胞的启动子序列。例如，事实上所有真核基因都具有富含AT区，它位于起始转录的位点上游约25至30个碱基处。在许多基因的转录起点上游70至80个碱基处发现的另一种序列是CNCAAT区，其中N可以是任何核苷酸。在大多数真核基因的3'端是AATAAA序列，它可能是向编码序列的3'端添加聚腺苷酸(polyA)尾的信号。在某些实施方案中，任何或所有这些序列可以合适的***真核表达载体。
在哺乳动物宿主细胞中由载体转录受到例如从病毒（诸如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒（诸如2型腺病毒）、牛***瘤病毒、禽类肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙肝病毒、和猿病毒40(SV40)）基因组获得的、来自异源哺乳动物启动子（例如肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子）的、来自热休克启动子的启动子的控制，倘若此类启动子与宿主细胞***相容的话。
方便的以SV40限制性片段的形式获得SV40病毒的早期和晚期启动子，该片段还包含SV40病毒复制起点。方便的以HindIII E限制性片段的形式获得人巨细胞病毒的立即早期启动子。美国专利No.4,419,446中公开了使用牛***瘤病毒作为载体在哺乳动物宿主中表达DNA的***。美国专利No.4,601,978中记载了该***的一种修改。还可参见Reyes等,Nature297:598-601(1982)，其记载了在小鼠细胞中在来自单纯疱疹病毒的胸苷激酶启动子的控制下表达人β-干扰素cDNA。或者，可使用劳氏肉瘤病毒长末端重复序列作为启动子。
增强子元件构件
常常通过在载体中***增强子序列来提高高等真核细胞对编码本发明抗体的DNA的转录。现在知道来自哺乳动物基因（珠蛋白、弹性蛋白酶、清蛋白、甲胎蛋白和胰岛素）的许多增强子序列。然而，通常使用来自真核细胞病毒的增强子。例子包括SV40复制起点晚期侧的增强子（bp100-270）、巨细胞病毒早期启动子增强子、多瘤病毒复制起点晚期侧的增强子、和腺病毒增强子。还可参见Yaniv,Nature297:17-18(1982)，其记载了激活真核启动子的增强子元件。增强子可剪接入载体，位于抗体多肽编码序列的5'或3'位置，但是一般位于启动子的5'位点。
转录终止构件
在真核宿主细胞中使用的表达载体可以还包含终止转录和稳定mRNA所必需的序列。此类序列通常可从真核或病毒DNA或cDNA非翻译区的5'端和偶尔的3'端获得。这些区域包含编码抗体的mRNA的非翻译部分中转录成聚腺苷酸化片段的核苷酸区段。一种有用的转录终止构件是牛生长激素聚腺苷酸化区。参见WO94/11026及其中公开的表达载体。
宿主细胞的选择和转化
适于克隆或表达本文载体中的DNA的宿主细胞包括本文描述的高等真核细胞，包括脊椎动物宿主细胞。脊椎动物细胞在培养（组织培养）中的繁殖已经成为常规规程。有用哺乳动物宿主细胞系的例子有经SV40转化的猴肾CV1系（COS-7，ATCC CRL1651）、人胚肾系（293细胞或为悬浮培养而亚克隆的293细胞，Graham等,J.Gen.Virol.36:59(1977)）、幼仓鼠肾细胞（BHK，ATCC CCL10）、中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR（CHO，Urlaub等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:4216(1980)）、小鼠塞托利(Sertoli)细胞（TM4，Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980)）、猴肾细胞（CV1，ATCC CCL70）、非洲绿猴肾细胞（VERO-76，ATCC CRL1587）、人***细胞（HELA，ATCC CCL2）、犬肾细胞（MDCK，ATCC CCL34）、牛鼠(buffalo rat)肝细胞（BRL3A，ATCC CRL1442）、人肺细胞（W138，ATCC CCL75）、人肝细胞（Hep G2，HB8065）、小鼠乳瘤（MMT060562，ATCC CCL51）、TRI细胞（Mather等,Annals N.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982)）、MRC5细胞、FS4细胞和人肝瘤(hepatoma)系（Hep G2）。
为了生成抗体，用上文所述表达或克隆载体转化宿主细胞，并在为了诱导启动子、选择转化子或扩增编码期望序列的基因而适当改动的常规营养培养基中进行培养。
宿主细胞的培养
可在多种培养基中培养用于生成本发明抗体的宿主细胞。商品化培养基诸如Ham氏F10（Sigma）、极限必需培养基（MEM，Sigma）、RPMI-1640（Sigma）、和Dulbecco氏改良Eagle氏培养基（DMEM，Sigma）适于培养宿主细胞。另外，可使用下列文献中记载的任何培养基作为宿主细胞的培养基：Ham等,Meth.Enz.58:44(1979);Barnes等,Anal.Biochem.102:255(1980);美国专利No.4,767,704;4,657,866;4,927,762;4,560,655;5,122,469;WO90/03430;WO87/00195;或美国专利Re.30,985。任何这些培养基可根据需要补充激素和/或其它生长因子（诸如胰岛素、运铁蛋白或表皮生长因子）、盐（诸如氯化钠、钙、镁和磷酸盐）、缓冲剂（诸如HEPES）、核苷酸（诸如腺苷和胸苷）、抗生素（诸如GENTAMYCINTM药物）、痕量元素（定义为通常以微摩尔范围的终浓度存在的无机化合物）、和葡萄糖或等效能源。还可以以适宜浓度含有本领域技术人员知道的任何其它补充物。培养条件诸如温度、pH等即为表达而选择的宿主细胞先前所用的，这对于普通技术人员是显然的。
抗体的纯化
在使用重组技术时，可以在细胞内生成抗体，或者直接分泌入培养基。如果在细胞内生成抗体，那么首先可以通过例如离心或超滤清除微粒碎片，或是宿主细胞或是裂解片段。如果抗体分泌入培养基，那么可以首先使用商品化蛋白质浓缩滤器（例如Amicon或Millipore Pellicon超滤单元）浓缩来自此类表达***的上清液。可以在任何上述步骤中包括蛋白酶抑制剂诸如PMSF以抑制蛋白水解，而且可包括抗生素以防止外来污染物的生长。
可使用例如羟磷灰石层析、凝胶电泳、透析和亲和层析（亲和层析是一种便利的技术）来纯化从细胞制备的抗体组合物。蛋白A作为亲和配体的适宜性取决于抗体中存在的任何免疫球蛋白Fc结构域的种类和同种型。蛋白A可用于纯化基于人γ1、γ2、或γ4重链的抗体（Lindmark等,J.Immunol.Methods62:1-13(1983)）。蛋白G推荐用于所有小鼠同种型和人γ3（Guss等,EMBO J.5:1567-1575(1986)）。亲和配体所附着的基质可以是琼脂糖，但是可使用其它基质。物理稳定的基质诸如可控孔径玻璃或聚(苯乙烯二乙烯)苯能获得比琼脂糖更快的流速和更短的加工时间。若抗体包含CH3结构域，则可使用Bakerbond ABXTM树脂（J.T.Baker，Phillipsburg，NJ）进行纯化。根据待回收的抗体，也可使用其它蛋白质纯化技术诸如离子交换柱上的分级、乙醇沉淀、反相HPLC、硅土上的层析、肝素SEPHAROSETM上的层析、阴离子或阳离子交换树脂（诸如聚天冬氨酸柱）上的层析、层析聚焦、SDS-PAGE和硫酸铵沉淀。
在任何初步纯化步骤之后，可以将含有感兴趣抗体和污染物的混合物进行进一步的纯化，例如低pH疏水相互作用层析，使用pH约2.5-4.5的洗脱缓冲液，优选在低盐浓度（例如约0-0.25M盐）进行。
一般而言，用于制备供研究、测试和临床使用的抗体的各种方法是本领域已完善建立的，与上文所述方法是一致的和/或本领域技术人员认为对于特定的感兴趣抗体是适宜的。
免疫偶联物
本发明还提供了包含偶联有一种或多种细胞毒剂（诸如化疗剂、药物、生长抑制剂、毒素（例如细菌、真菌、植物或动物起源的酶活性毒素或其片段））或放射性同位素（即放射偶联物）的本发明任何抗STEAP-1抗体的免疫偶联物（可互换的称为“抗体-药物偶联物”或“ADC”）。
在某些实施方案中，免疫偶联物包含抗STEAP-1抗体和化疗剂或其它毒素。本文中（上文）描述了可用于生成免疫偶联物的化疗剂。也可使用酶活性毒素及其片段，这些酶活性毒素及其片段已在说明书中描述。
在某些实施方案中，免疫偶联物包含抗STEAP-1抗体和一种或多种小分子毒素，包括但不限于小分子药物，诸如加利车霉素(calicheamicin)、美登木素生物碱(maytansinoids)、多拉司他汀(dolastatin)、auristatin、单端孢霉素(trichothecene)和CC1065及这些药物具有细胞毒活性的片段。此类免疫偶联物的例子在下文中有更为详细的讨论。
1.例示性的免疫偶联物
本发明的免疫偶联物（或“抗体-药物偶联物”(“ADC”)）可以是下文通式I，其中抗STEAP-1抗体经任选的接头(L)与一个或多个药物模块(D)偶联（即共价附着）。
Ab-(L-D)p           通式I
因而，抗STEAP-1抗体可直接地或经接头地偶联至药物。在通式I中，p是每个抗体的平均药物模块数，其范围可以是例如每个抗体约1个到约20个药物模块，在某些实施方案中是每个抗体1个到约8个药物模块。
例示性的接头
本文中披露了例示性的接头和药物模块。接头可以包含一种或多种接头构件。例示性的接头构件包括6-马来酰亚氨基己酰基(“MC”)、马来酰亚氨基丙酰基(“MP”)、缬氨酸-瓜氨酸(“val-cit”或“vc”)、丙氨酸-苯丙氨酸(“ala-phe”)、对氨基苄氧羰基(“PAB”)、N-琥珀酰亚氨基4-(2-吡啶基硫代)戊酸酯(“SPP”)、N-琥珀酰亚氨基4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己烷-1羧酸酯(“SMCC”)、N-琥珀酰亚氨基(4-碘-乙酰基)氨基苯甲酸酯(“SIAB”)、和乙烯氧基-CH2CH2O-作为一个或多个重复单元(“EO”或“PEO”)。本领域知道多种接头构件，下文也描述了一些。
接头可以是便于在细胞中释放药物的“可切割接头”。例如，可使用酸不稳定接头（例如腙）、蛋白酶敏感（例如肽酶敏感）接头、光不稳定接头、二甲基接头、或含二硫化物接头(Chari等,Cancer Research52:127-131(1992)；美国专利No.5,208,020)。
在一个实施方案中，ADC的接头L具有通式：
—Aa—Ww—Yy—
其中：
-A-为共价附着于抗体(Ab)半胱氨酸硫醇的延伸物(stretcher)单元；
a为0或1；
每个-W-独立为氨基酸单元；
w独立为0-12的整数；
-Y-为共价附着于药物模块的间隔物(spacer)单元；且
y为0、1或2。
延伸物单元
当存在时，延伸物单元(-A-)能够连接抗体单元与氨基酸单元(-W-)。在这方面，抗体(Ab)具有能与延伸物单元的亲电子官能团形成键的游离半胱氨酸硫醇基团。式II和III描绘了式I中的例示性延伸物单元，其中Ab-、-W-、-Y-、-D、w和y如上文所定义且R17为选自下列的二价基：(CH2)r、C3-C8碳环基、O-(CH2)r、亚芳基、(CH2)r-亚芳基、-亚芳基-(CH2)r-、(CH2)r-(C3-C8碳环基)、(C3-C8碳环基)-(CH2)r、C3-C8杂环基、(CH2)r-(C3-C8杂环基)、-(C3-C8杂环基)-(CH2)r-、-(CH2)rC(O)NRb(CH2)r-、-(CH2CH2O)r-、-(CH2CH2O)r-CH2-、-(CH2)rC(O)NRb(CH2CH2O)r-、-(CH2)rC(O)NRb(CH2CH2O)r-CH2-、-(CH2CH2O)rC(O)NRb(CH2CH2O)r-、-(CH2CH2O)rC(O)NRb(CH2CH2O)r-CH2-和-(CH2CH2O)rC(O)NRb(CH2)r-；其中Rb为H、C1-C6烃基、苯基或苄基；且r独立为范围1-10的整数。
亚芳基包括通过从芳族环体系中除去两个氢原子而衍生的6-20个碳原子的二价芳族烃基。典型的亚芳基包括但不限于衍生自苯、取代的苯、萘、蒽、联苯等的基团。
杂环基包括一个或多个环原子为杂原子（例如氮、氧和硫）的环体系。杂环基包含1-20个碳原子和1-3个选自N、O、P和S的杂原子。杂环可以为具有3-7个环成员的单环（2-6个碳原子和1-3个选自N、O、P和S的杂原子）或具有7-10个环成员的双环（4-9个碳原子和1-3个选自N、O、P和S的杂原子），例如：双环[4,5]，[5,5]，[5,6]或[6,6]体系。杂环记载于Paquette,Leo A.;“Principles of Modern Heterocyclic Chemistry”,W.A.Benjamin,New York,1968,特别是1,3,4,6,7,和9章;“The Chemistry of Heterocyclic Compound,Aseries of Monographs”,John Wiley&Sons,New York,1950至今,特别是卷13,14,16,19,和28；及J.Am.Chem.Soc.(1960)82:5566。
举例而言而非限制，杂环的例子包括：吡啶基、二氢吡啶基、四氢吡啶基(哌啶基)、噻唑基、四氢噻吩基(tetrahydrothiophenyl)、硫氧化的四氢噻吩基、嘧啶基、呋喃基、噻吩基(thienyl)、吡咯基、吡唑基、咪唑基、四唑基、苯并呋喃基、硫杂萘基（thianaphthalenyl）、吲哚基、indolenyl、喹啉基、异喹啉基、苯并咪唑基、哌啶基、4-哌啶酮基、吡咯烷基、2-吡咯烷酮基、吡咯啉基、四氢呋喃基、双-四氢呋喃基(bis-tetrahydrofuranyl)、四氢吡喃基、双-四氢吡喃基(bis-tetrahydropyranyl)、四氢喹啉基、四氢异喹啉基、十氢喹啉基、八氢喹啉基、吖辛因基(azocinyl)、三嗪基、6H-1,2,5-噻二嗪基、2H,6H-1,5,2-二噻嗪基、噻吩基、噻蒽基、吡喃基、异苯并呋喃基、色烯基、呫吨基、酚
Figure BDA00002807843501112
噻基(phenoxathinyl)、2H-吡咯基、异噻唑基、异
Figure BDA00002807843501113
唑基、吡嗪基、哒嗪基、吲嗪基、异吲哚基、3H-吲哚基、1H-吲唑基、嘌呤基、4H-喹嗪基、酞嗪基、萘啶基、喹喔啉基、喹唑啉基、噌啉基、蝶啶基、4Ah-咔唑基、咔唑基、β-咔啉基、菲啶基、吖啶基、嘧啶基、菲咯啉基、吩嗪基、吩噻嗪基、呋咱基、吩
Figure BDA00002807843501114
嗪基、异色满基、色满基、咪唑烷基、咪唑啉基、吡唑烷基、吡唑啉基、哌嗪基、二氢吲哚基、异二氢吲哚基、奎宁环基、吗啉基、
Figure BDA00002807843501115
唑烷基、苯并***基、苯并异
Figure BDA00002807843501116
唑基、羟吲哚基、苯并
Figure BDA00002807843501117
唑啉基和靛红酰基(isatinoyl)。
碳环基包括具有3-7个碳原子（作为单环）或7-12个碳原子（作为双环）的饱和或不饱和环。单环碳环具有3-6个环原子，更通常地为5或6个环原子。双环碳环具有7-12个环原子，例如排列成双环[4,5]，[5,5]，[5,6]或[6,6]体系，或者9或10个环原子，排列成双环[5,6]或[6,6]体系。单环碳环的例子包括环丙基、环丁基、环戊基、1-环戊-1-烯基、1-环戊-2-烯基、1-环戊-3-烯基、环己基、1-环己-1-烯基、1-环己-2-烯基、1-环己-3-烯基、环庚基和环辛基。
根据式I ADC的所有例示性实施方案诸如II-VI应当理解，即使在未明确表述的情况中，有1-4个药物模块与抗体连接（p=1-4），这取决于改造的半胱氨酸残基的数目。
Figure BDA00002807843501111
Figure BDA00002807843501121
一种例示性式II延伸物单元衍生自马来酰亚氨基-己酰基(MC)，其中R17为-(CH2)5-：
一种例示性式II延伸物单元衍生自马来酰亚氨基-丙酰基(MP)，其中R17为-(CH2)2-：
另一种例示性式II延伸物单元，其中R17为-(CH2CH2O)r-CH2–且r为2：
Figure BDA00002807843501124
另一种例示性式II延伸物单元，其中R17为-(CH2)rC(O)NRb(CH2CH2O)r-CH2-，其中Rb为H且每个r为2：
另一种例示性式III延伸物单元，其中R17为-(CH2)5-：
在另一个实施方案中，延伸物单元通过抗体的改造半胱氨酸的硫原子与延伸物单元的硫原子之间的二硫键与半胱氨酸改造抗_______抗体连接。该实施方案的代表性延伸物单元以式IV描绘，其中R17、Ab-、-W-、-Y-、-D、w和y如上文所定义。
Figure BDA00002807843501131
在又一个实施方案中，延伸物的反应性基团含有能与抗体的游离半胱氨酸硫醇形成键的硫醇反应性官能团。硫醇反应性官能团的例子包括但不限于：马来酰亚胺；α-卤代乙酰基；活化的酯类，诸如琥珀酰亚胺酯、4-硝基苯基酯、五氟苯基酯、四氟苯基酯；酸酐类；酸性氯化物或酰基氯类(acidchloride)；磺酰氯类；异氰酸酯类和异硫氰酸酯类。该实施方案的代表性延伸物单元以式Va和Vb描绘，其中-R17-、Ab-、-W-、-Y-、-D、w和y如上文所定义。
Figure BDA00002807843501132
在另一个实施方案中，接头可以为树状类型接头(dendritic type linker)，其用于通过分支的多功能接头模块将超过一个药物模块共价附着于抗体(Sun等(2002)Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters12:2213-2215；Sun等(2003)Bioorganic&Medicinal Chemistry11:1761-1768；King(2002)Tetrahedron Letters43:1987-1990)。树状接头能增加药物与抗体的摩尔比，即载荷，它与ADC的效能相关。如此，如果半胱氨酸改造抗体仅携带一个反应性半胱氨酸硫醇基团，那么可以通过树状接头附着众多药物模块。
氨基酸单元
接头可以包含氨基酸残基。如果存在，那么氨基酸单元(-Ww-)使本发明的半胱氨酸改造抗体-药物偶联物(ADC)的抗体(Ab)与药物模块(D)连接。
-Ww-为二肽、三肽、四肽、五肽、六肽、七肽、八肽、九肽、十肽、十一肽或十二肽单元。构成氨基酸单元的氨基酸残基包括那些天然存在的以及次要的氨基酸和非天然存在的氨基酸类似物，诸如瓜氨酸。各个-W-单元独立地具有如下所示的方括号内的通式，且w为范围0-12的整数：
Figure BDA00002807843501141
其中R19为氢、甲基、异丙基、异丁基、仲丁基、苄基、对羟基苄基、-CH2OH、-CH(OH)CH3、-CH2CH2SCH3、-CH2CONH2、-CH2COOH、-CH2CH2CONH2、-CH2CH2COOH、-(CH2)3NHC(=NH)NH2、-(CH2)3NH2、-(CH2)3NHCOCH3、-(CH2)3NHCHO、-(CH2)4NHC(=NH)NH2、-(CH2)4NH2、-(CH2)4NHCOCH3、-(CH2)4NHCHO、-(CH2)3NHCONH2、-(CH2)4NHCONH2、-CH2CH2CH(OH)CH2NH2、2-吡啶基甲基-、3-吡啶基甲基-、4-吡啶基甲基-、苯基、环己基、
Figure BDA00002807843501142
当R19不为氢时，R19所附着的碳原子为手性的。R19所附着的各个碳原子独立地以(S)或(R)构型或外消旋混合物附着。氨基酸单元如此可以为对映体方面纯的、外消旋的或非对映异构体的。
例示性的-Ww-氨基酸单元包括二肽、三肽、四肽或五肽。例示性的二肽包括：缬氨酸-瓜氨酸(vc或val-cit)、丙氨酸-苯丙氨酸(af或ala-phe)。例示性的三肽包括：甘氨酸-缬氨酸-瓜氨酸(gly-val-cit)和甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸(gly-gly-gly)。构成氨基酸接头构件的氨基酸残基包括天然存在的氨基酸，以及次要氨基酸和非天然存在的氨基酸类似物，诸如瓜氨酸。
可以用一种或多种酶（包括肿瘤相关蛋白酶）酶促切割氨基酸单元，以释放药物模块(-D)，其在一个实施方案中在体内释放时被质子化以提供药物(D)。可以在特定酶（例如肿瘤相关蛋白酶，组织蛋白酶B、C和D，或纤溶酶蛋白酶）的酶促切割的选择性方面设计和优化氨基酸接头构件。
间隔物单元
在氨基酸单元存在时（w=1-12），间隔物单元(-Yy-)（在存在时，y=1或2）使氨基酸单元(-Ww-)与药物模块(D)连接。或者，在氨基酸单元不存在时，间隔物单元使延伸物单元与药物模块连接。在氨基酸单元和延伸物单元都不存在时(w,y=0)，间隔物单元还使药物模块与抗体单元连接。间隔物单元有两大类：自我牺牲的(self-immolative)和非自我牺牲的。非自我牺牲的间隔物单元为部分或所有间隔物单元在从抗体-药物偶联物或药物模块-接头切割（特别是酶促切割）氨基酸单元后保持与药物模块结合的间隔物单元。当含有甘氨酸-甘氨酸间隔物单元或甘氨酸间隔物单元的ADC通过肿瘤细胞相关蛋白酶、癌细胞相关蛋白酶或淋巴细胞相关蛋白酶进行酶促切割时，甘氨酸-甘氨酸-药物模块或甘氨酸-药物模块从Ab-Aa-Ww-上切割下来。在一个实施方案中，在靶细胞内发生独立的水解反应，其切割甘氨酸-药物模块的键并释放药物。
在另一个实施方案中，-Yy-为对氨基苄基氨基甲酰基(PAB)单元，其亚苯基部分被Qm取代，其中Q为-C1-C8烃基、-O-(C1-C8烃基)、-卤素、-硝基或-氰基；且m为范围0-4的整数。
非自我牺牲的间隔物单元(-Y-)的例示性实施方案为：-Gly-Gly-；-Gly-；-Ala-Phe-；-Val-Cit-。
在一个实施方案中，提供了药物模块-接头或ADC或其药学可接受的盐或溶剂化物，其中间隔物单元不存在(y=0)。
或者，含有自我牺牲的间隔物单元的ADC能释放-D。在一个实施方案中，-Y-为通过PAB基团的氨基氮原子连接至-Ww-且通过碳酸酯、氨基甲酸酯或醚基团直接连接至-D的PAB基团，其中ADC具有如下例示性结构：
Figure BDA00002807843501151
其中Q为-C1-C8烃基、-O-(C1-C8烃基)、-卤素、-硝基或-氰基；m为范围0-4的整数；且p范围为1-4。
自我牺牲的间隔物的其它例子包括但不限于在电子方面与PAB基团类似的芳族化合物，诸如2-氨基咪唑-5-甲醇衍生物(Hay等(1999)Bioorg.Med.Chem.Lett.9:2237)、杂环PAB类似物（US2005/0256030）、β-葡糖苷酸（WO2007/011968）、和邻位或对位氨基苄基乙缩醛。可以使用在酰胺键水解时进行环化的间隔物，诸如取代和未取代的4-氨基丁酸酰胺类(Rodrigues等(1995)Chemistry Biology2:223)、适当取代的双环[2.2.1]和双环[2.2.2]环体系(Storm等(1972)J.Amer.Chem.Soc.94:5815)和2-氨基苯基丙酸酰胺类(Amsberry等(1990)J.Org.Chem.55:5867)。消去在甘氨酸上取代的含胺药物(Kingsbury等(1984)J.Med.Chem.27:1447)也是可用于ADC的自我牺牲的间隔物的例子。
例示性的间隔物单元(-Yy-)以式X-XII表示：
Figure BDA00002807843501161
树状接头
在另一个实施方案中，接头L可以为树状类型接头(dendritic type linker)，其用于通过分支的多功能接头模块将超过一个药物模块共价附着于抗体(Sun等(2002)Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters12:2213-2215；Sun等(2003)Bioorganic&Medicinal Chemistry11:1761-1768)。树状接头能增加药物与抗体的摩尔比，即载荷，它与ADC的效能相关。如此，如果半胱氨酸改造抗体仅携带一个反应性半胱氨酸硫醇基团，那么可以通过树状接头附着众多药物模块。分支的树状接头的例示性实施方案包括2,6-双(羟甲基)-对甲酚和2,4,6-三(羟甲基)-酚树状聚物单元(WO2004/01993;Szalai等(2003)J.Amer.Chem.Soc.125:15688-15689;Shamis等(2004)J.Amer.Chem.Soc.126:1726-1731;Amir等(2003)Angew.Chem.Int.Ed.42:4494-4499)。
在一个实施方案中，间隔物单元为分支的双(羟甲基)苯乙烯(BHMS)，它可以用于掺入和释放众多药物，其具有如下结构：
Figure BDA00002807843501171
其包含2-(4-氨基亚苄基)丙烷-1,3-二醇树状聚物单元(WO2004/043493；deGroot等(2003)Angew.Chem.Int.Ed.42:4490-4494)，其中Q为-C1-C8烃基,-O-(C1-C8烃基)、-卤素、-硝基或-氰基；m为范围0-4的整数；n为0或1；且p范围为1-4。
式I抗体-药物偶联物化合物的例示性实施方案包括XIIIa(MC)、XIIIb(val-cit)、XIIIc(MC-val-cit)、和XIIId(MC-val-cit-PAB)：
式Ia抗体-药物偶联物化合物的其它例示性实施方案包括XIVa-e:
Figure BDA00002807843501173
Figure BDA00002807843501181
其中X为：
Figure BDA00002807843501182
Y为：
Figure BDA00002807843501183
且R独立为H或C1-C6烃基；且n为1-12。
在另一个实施方案中，接头具有反应性官能团，该反应性官能团具有与存在于抗体上的亲电子基团具有反应性的亲核基团。抗体上有用的亲电子基团包括但不限于醛和酮羰基。接头的亲核基团的杂原子能与抗体上的亲电子基团反应并且与抗体单元形成共价键。接头上有用的亲核基团包括但不限于酰肼、肟、氨基、肼、缩氨基硫脲(thiosemicarbazone)、肼羧酸酯和芳基酰肼。抗体上的亲电子基团提供了用于附着接头的便利位点。
典型地，可以通过在两个或更多氨基酸和/或肽片段之间形成肽键来制备肽类型的接头。例如，可以按照肽化学领域众所周知的液相合成法(E.
Figure BDA00002807843501191
和K.Lübke(1965)“The Peptides”,卷1,pp76-136,Academic Press)来制备此类肽键。可以通过包括间隔物、延伸物和氨基酸单元的反应的任意组合或顺序来装配接头中间体。间隔物、延伸物和氨基酸单元可以采用本质上为亲电子、亲核或游离基的反应性官能团。反应性官能团包括但不限于羧基、羟基、对硝基苯基碳酸根、异硫氰酸根和离去基团，诸如O-甲磺酰基、O-甲苯磺酰基、-Cl、-Br、-I；或马来酰亚胺。
在另一个实施方案中，接头可以用调节溶解性或反应性的基团取代。例如，带电荷的取代基，诸如磺酸根(-SO3 -)或铵可以增加试剂的水溶性并且有利于接头试剂与抗体或药物模块的偶联反应，或有利于Ab-L（抗体-接头中间体）与D的偶联反应或D-L（药物-接头中间体）与Ab的偶联反应，这取决于用于制备ADC的合成途径。
例示性的药物模块
美登素和美登木素生物碱
在有些实施方案中，免疫偶联物包含偶联有一个或多个美登木素生物碱分子的本发明抗体。美登木素生物碱是通过抑制微管蛋白聚合来发挥作用的有丝***抑制剂。美登素最初从东非灌木齿叶美登木（Maytenus serrata）分离得到（美国专利No.3,896,111）。随后发现某些微生物也生成美登木素生物碱，诸如美登醇和C-3美登醇酯（美国专利No.4,151,042）。例如下列美国专利公开了合成美登醇及其衍生物和类似物：4,137,230;4,248,870;4,256,746;4,260,608;4,265,814;4,294,757;4,307,016;4,308,268;4,308,269;4,309,428;4,313,946;4,315,929;4,317,821;4,322,348;4,331,598;4,361,650;4,364,866;4,424,219;4,450,254;4,362,663;及4,371,533。
美登木素生物碱药物模块在抗体-药物偶联物中是有吸引力的药物模块，因为它们：(i)相对易于通过发酵或发酵产物的化学修饰或衍生化来制备；(ii)易于用适于通过非二硫化物接头偶联至抗体的官能团衍生化；(iii)在血浆中稳定；且(iv)有效针对多种肿瘤细胞系。
适于用作美登木素生物碱药物模块的美登素化合物是本领域公知的，而且可以依照已知方法从天然来源分离，或是使用遗传工程技术生产(参见Yu等(2002)PNAS99:7968-7973)。美登醇和美登醇类似物也可以依照已知方法合成制备。
美登木素生物碱药物模块的例示性实施方案包括：DM1；DM3；和DM4，正如本文中所公开的。
Auristatin和多拉司他汀
在有些实施方案中，免疫偶联物包含与多拉司他汀(dolastatin)或多拉司他汀肽类似物或衍生物（例如auristatin）(美国专利No.5,635,483;5,780,588)偶联的本发明抗体。多拉司他汀和auristatin已经显示出干扰微管动力学、GTP水解、及核和细胞***(Woyke等(2001)Antimicrob.Agents and Chemother.45(12):3580-3584)且具有抗癌(美国专利No.5663149)和抗真菌活性(Pettit等(1998)Antimicrob.Agents Chemother.42:2961-2965)。多拉司他汀或auristatin药物模块可经由肽药物模块的N（氨基）末端或C（羧基）末端附着于抗体(WO02/088172)。
例示性的auristatin实施方案包括N-末端连接的单甲基auristatin药物模块DE和DF，披露于Senter等,Proceedings of the American Association for CancerResearch,卷45,摘要号623,2004年3月28日，明确将其公开内容完整收入本文作为参考。
肽药物模块可以选自下文通式DE和DF：
Figure BDA00002807843501201
其中DE和DF的波形线指示抗体或抗体-接头构件的共价附着位点，且每个位置独立地是
R2选自H和C1-C8烃基；
R3选自H、C1-C8烃基、C3-C8碳环、芳基、C1-C8烃基-芳基、C1-C8烃基-(C3-C8碳环)、C3-C8杂环和C1-C8烃基-(C3-C8杂环)；
R4选自H、C1-C8烃基、C3-C8碳环、芳基、C1-C8烃基-芳基、C1-C8烃基-(C3-C8碳环)、C3-C8杂环和C1-C8烃基-(C3-C8杂环)；
R5选自H和甲基；
或者R4与R5一起形成碳环且具有通式-(CRaRb)n-，其中Ra和Rb独立地选自H、C1-C8烃基和C3-C8碳环，而n选自2、3、4、5和6；
R6选自H和C1-C8烃基；
R7选自H、C1-C8烃基、C3-C8碳环、芳基、C1-C8烃基-芳基、C1-C8烃基-(C3-C8碳环)、C3-C8杂环和C1-C8烃基-(C3-C8杂环)；
每个R8独立地选自H、OH、C1-C8烃基、C3-C8碳环和O-(C1-C8烃基)；
R9选自H和C1-C8烃基；
R10选自芳基或C3-C8杂环；
Z为O、S、NH或NR12，其中R12为C1-C8烃基；
R11选自H、C1-C20烃基、芳基、C3-C8杂环、-(R13O)m-R14或-(R13O)m-CH(R15)2；
m是范围为1-1000的整数；
R13为C2-C8烃基；
R14为H或C1-C8烃基；
R15每次出现独立为H、COOH、-(CH2)n-N(R16)2、-(CH2)n-SO3H或-(CH2)n-SO3-C1-C8烃基；
R16每次出现独立为H、C1-C8烃基或-(CH2)n-COOH；
R18选自-C(R8)2-C(R8)2-芳基、-C(R8)2-C(R8)2-(C3-C8杂环)和-C(R8)2-C(R8)2-(C3-C8碳环)；且
n是范围为0到6的整数。
在一个实施方案中，R3、R4和R7独立为异丙基或仲丁基，而R5为-H或甲基。在一个例示性的实施方案中，R3和R4各自为异丙基，R5为-H，而R7为仲丁基。
在又一个实施方案中，R2和R6各自为甲基，而R9为-H。
在又一个实施方案中，R8每次出现为-OCH3。
在一个例示性的实施方案中，R3和R4各自为异丙基，R2和R6各自为甲基，R5为-H，R7为仲丁基，R8每次出现为-OCH3，而R9为-H。
在一个实施方案中，Z为-O-或-NH-。
在一个实施方案中，R10为芳基。
在一个例示性的实施方案中，R10为-苯基。
在一个例示性的实施方案中，若Z为-O-，则R11为-H、甲基或叔丁基。
在一个实施方案中，若Z为-NH，则R11为-CH(R15)2，其中R15为-(CH2)n-N(R16)2，而R16为-C1-C8烃基或-(CH2)n-COOH。
在另一个实施方案中，若Z为-NH，则R11为-CH(R15)2，其中R15为-(CH2)n-SO3H。
通式DE的一种例示性auristatin实施方案是MMAE，其中波形线指示共价附着至抗体-药物偶联物的接头(L)：
Figure BDA00002807843501221
通式DF的一种例示性auristatin实施方案是MMAF，其中波形线指示共价附着至抗体-药物偶联物的接头(L)(参见US2005/0238649及Doronina等(2006)Bioconjugate Chem.17:114-124)：
Figure BDA00002807843501222
其它药物模块包括以下MMAF衍生物，其中波形线指示共价附着至抗体-药物偶联物的接头(L)：
Figure BDA00002807843501223
Figure BDA00002807843501241
一方面，可以将亲水性基团在R11处附着于药物模块，所述亲水性基团包括但不限于三乙二醇酯(triethylene glycol ester,TEG)，如上所示。不限于任何特定理论，所述亲水性基团有助于药物模块的内在化和不聚集(non-agglomeration)。
包含auristatin/多拉司他汀或其衍生物的通式I ADC的例示性实施方案记载于US2005-0238649A1及Doronina等(2006)Bioconjugate Chem.17:114-124，明确收入本文作为参考。包含MMAE或MMAF及各种接头构件的通式I ADC的例示性实施方案具有如下结构和缩写（其中“Ab”是抗体；p是1到约8；“Val-Cit”是缬氨酸-瓜氨酸二肽；而“S”是硫原子）：
Figure BDA00002807843501251
包含MMAF及各种接头构件的通式I ADC的例示性实施方案进一步包括Ab-MC-PAB-MMAF和Ab-PAB-MMAF。有趣的是，包含经不可蛋白水解切割的接头附着于抗体的MMAF的免疫偶联物显示出具有与包含经可蛋白水解切割的接头附着于抗体的MMAF的免疫偶联物相当的活性。参见Doronina等(2006)Bioconjugate Chem.17:114-124。在这种情况中，认为药物释放是由细胞中的抗体降解来实现的。同上。
典型的是，基于肽的药物模块可通过在两个或更多氨基酸和/或肽片段之间形成肽键来制备。此类肽键可依照例如肽化学领域众所周知的液相合成法来制备(参见E.
Figure BDA00002807843501252
和K.Lübke,“The Peptides”,卷1,pp76-136,1965,Academic Press)。auristatin/多拉司他汀药物模块可依照以下文献中的方法来制备：US2005-0238649A1;美国专利No.5635483;美国专利No.5780588;Pettit等(1989)J.Am.Chem.Soc.111:5463-5465;Pettit等(1998)Anti-CancerDrug Design13:243-277;Pettit,G.R.等,Synthesis,1996,719-725;Pettit等(1996)J.Chem.Soc.Perkin Trans.15:859-863;及Doronina(2003)Nat.Biotechnol.21(7):778-784。
具体而言，通式DF的auristatin/多拉司他汀药物模块诸如MMAF及其衍生物可以使用US2005-0238649A1及Doronina等(2006)Bioconjugate Chem.17:114-124中记载的方法来制备。通式DE的auristatin/多拉司他汀药物模块诸如MMAE及其衍生物可以使用Doronina等(2003)Nat.Biotech.21:778-784中记载的方法来制备。可以通过常规方法方便地合成药物-接头模块MC-MMAF、MC-MMAE、MC-vc-PAB-MMAF、和MC-vc-PAB-MMAE，例如Doronina等(2003)Nat.Biotech.21:778-784及美国专利申请公开号US2005/0238649A1中所记载的，然后将它们偶联至感兴趣的抗体。
药物载荷
药物载荷(loading)由p表示，即通式I的分子中每个抗体的平均药物模块数。药物载荷的范围可以为每个抗体1-20个药物模块(D)。通式I的ADC包括偶联有一定范围（1-20个）药物模块的抗体的集合。来自偶联反应的ADC制备物中每个抗体的平均药物模块数可以通过常规手段来表征，诸如质谱、ELISA测定法、和HPLC。还可以测定ADC在p方面的定量分布。在有些情况中，将p为某数值的同质ADC从具有其它药物载荷的ADC中分离、纯化、和表征可以通过诸如反相HPLC或电泳的手段来实现。
对于有些抗体-药物偶联物，p可能受到抗体上附着位点数目的限制。例如，若附着是半胱氨酸硫醇，正如上文例示性实施方案中的那样，则抗体可能只有一个或数个半胱氨酸硫醇基，或者可能只有一个或数个有足够反应性的硫醇基，可附着接头。在某些实施方案中，较高的药物载荷，例如p>5，可引起某些抗体-药物偶联物的聚集、不溶性、毒性、或丧失细胞通透性。在某些实施方案中，本发明ADC的药物载荷的范围为1到约8；约2到约6；约3到约5；约3到约4；约3.1到约3.9；约3.2到约3.8；约3.2到约3.7；约3.2到约3.6；约3.3到约3.8；或约3.3到约3.7。事实上，对于某些ADC已经显示了每个抗体的药物模块的最佳比率可以为小于8，可以为约2到约5。参见US2005-0238649A1（完整收入本文作为参考）。
在某些实施方案中，在偶联反应中少于理论最大值的药物模块偶联至抗体。抗体可包含例如赖氨酸残基，其不与药物-接头中间物或接头试剂起反应，如下文所讨论的。一般而言，抗体不包含许多游离的和反应性的半胱氨酸硫醇基，其可连接药物模块；事实上，抗体中的大多数半胱氨酸硫醇基以二硫桥形式存在。在某些实施方案中，可以在部分或完全还原性条件下用还原剂诸如二硫苏糖醇(DTT)或三羰基乙基膦(TCEP)还原抗体以产生反应性半胱氨酸硫醇基。在某些实施方案中，将抗体置于变性条件以暴露反应性亲核基团，诸如赖氨酸或半胱氨酸。
ADC的载荷（药物/抗体比率）可以以不同方式来控制，例如通过：(i)限制药物-接头中间物或接头试剂相对于抗体的摩尔过量，(ii)限制偶联反应的时间或温度，(iii)半胱氨酸硫醇修饰的部分或限制还原性条件，(iv)通过重组技术对抗体的氨基酸序列进行工程改造，使得半胱氨酸残基的数目和位置为了控制接头-药物附着的数目和/或位置而进行改变（诸如如本文中和WO2006/034488（完整收入本文作为参考）中所述而制备的thioMab或thioFab）。
应当理解，若超过一个亲核基团与药物-接头中间物或者与接头试剂和接下来的药物模块试剂起反应，则所得产物是具有一个或多个药物模块附着于抗体之分布的ADC化合物混合物。可以通过对抗体特异性的和对药物特异性的双重ELISA抗体测定法自混合物计算每个抗体的平均药物数。混合物中的各种ADC分子可以通过质谱来鉴定，并通过HPLC来分离，例如疏水相互作用层析(参见例如Hamblett,K.J.等,“Effect of drug loading on thepharmacology,pharmacokinetics,and toxicity of an anti-CD30antibody-drugconjugate,”摘要号624,American Association for Cancer Research,2004Annual Meeting,2004年3月27-31日,Proceedings of the AACR,卷45,March2004;Alley,S.C.等,“Controlling the location of drug attachment inantibody-drug conjugates,”摘要号627,American Association for CancerResearch,2004Annual Meeting,2004年3月27-31日,Proceedings of the AACR,卷45,March2004)。在某些实施方案中，可以通过电泳或层析从偶联混合物中分离具有单一载荷值的同质ADC。
制备免疫偶联物的某些方法
可以采用本领域技术人员知道的有机化学反应、条件和试剂通过数种路径来制备通式I的ADC，包括：(1)抗体的亲核基团经共价键与二价接头试剂反应形成Ab-L，接着与药物模块D反应；和(2)药物模块的亲核基团经共价键与二价接头试剂反应形成D-L，接着与抗体的亲核基团反应。经后一种路径制备通式I的ADC的例示性方法记载于US20050238649A1，明确收入本文作为参考。
抗体的亲核基团包括但不限于：(i)N末端胺基；(ii)侧链胺基，例如赖氨酸；(iii)侧链硫醇基，例如半胱氨酸；和(iv)糖基化抗体中糖的羟基或氨基。胺、硫醇、和羟基是亲核的，能够与接头模块上的亲电子基团反应而形成共价键，而接头试剂包括：(i)活性酯类，诸如NHS酯、HOBt酯、卤代甲酸酯、和酸性卤化物；(ii)烃基和苄基卤化物，诸如卤代乙酰胺；(iii)醛、酮、羧基和马来酰亚胺基团。某些抗体具有可还原的链间二硫化物，即半胱氨酸桥。可通过还原剂诸如DTT（二硫苏糖醇）或三羰基乙基膦(TCEP)处理使抗体完全或部分还原，从而具有与接头试剂偶联的反应性。每个半胱氨酸桥理论上会形成两个反应性硫醇亲核体。或者，可经由赖氨酸残基的修饰将别的亲核基团引入抗体，例如通过使赖氨酸残基与2-亚氨基硫烷（Traut氏试剂）起反应，导致胺转变为硫醇。可以通过导入一个、两个、三个、四个、或更多个半胱氨酸残基（例如通过制备包含一个或多个非天然半胱氨酸氨基酸残基的变体抗体）而将反应性硫醇基导入抗体。
还可通过抗体上的亲电子基团（诸如醛或酮羰基）与接头试剂或药物上的亲核基团之间的反应来生成本发明的抗体-药物偶联物。接头试剂上的有用亲核基团包括但不限于酰肼(hydrazide)、肟(oxime)、氨基(amino)、肼(hydrazine)、缩氨基硫脲(thiosemicarbazone)、肼羧酸酯(hydrazine carboxylate)、和芳基酰肼(arylhydrazide)。在一个实施方案中，修饰抗体以导入能够与接头试剂或药物上的亲核取代基起反应的亲电子模块。在另一个实施方案中，可以用例如高碘酸盐氧化剂氧化糖基化抗体的糖，从而形成可与接头试剂或药物模块的胺基团反应的醛或酮基团。所得亚胺Schiff碱基可形成稳定的连接，或者可以用例如硼氢化物试剂还原而形成稳定的胺连接。在一个实施方案中，糖基化抗体的碳水化合物部分与半乳糖氧化酶或偏高碘酸钠的反应可以在抗体中生成羰基（醛基和酮基），它可与药物上的适宜基团反应(Hermanson,Bioconjugate Techniques)。在另一个实施方案中，包含N-末端丝氨酸或苏氨酸残基的抗体可以与偏高碘酸钠反应，导致在第一个氨基酸处生成醛(Geoghegan和Stroh,(1992)Bioconjugate Chem.3:138-146；US5362852)。这样的醛可与药物模块或接头亲核体反应。
药物模块上的亲核基团包括但不限于：胺、硫醇、羟基、酰肼、肟、肼、缩氨基硫脲、肼羧酸酯、和芳基酰肼基团，它们能够与接头模块上的亲电子基团反应而形成共价键，而接头试剂包括：(i)活性酯类，诸如NHS酯、HOBt酯、卤代甲酸酯、和酸性卤化物；(ii)烃基和苄基卤化物，诸如卤代乙酰胺；(iii)醛、酮、羧基、和马来酰亚胺基团。
本发明的化合物明确涵盖但不限于用如下交联试剂制备的ADC：BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、sulfo-EMCS、sulfo-GMBS、sulfo-KMUS、sulfo-MBS、sulfo-SIAB、sulfo-SMCC和sulfo-SMPB、及SVSB（琥珀酰亚氨基-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯），它们可通过商业途径获得（例如Pierce Biotechnology,Inc.,Rockford,IL.,U.S.A；参见2003-2004年度应用手册和产品目录(2003-2004Applications Handbook and Catalog)第467-498页）。
还可使用多种双功能蛋白质偶联剂来制备包含抗体和细胞毒剂的免疫偶联物，诸如N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)，琥珀酰亚氨基-4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)，亚氨基硫烷(IT)，亚氨酸酯（诸如盐酸己二酰亚氨酸二甲酯）、活性酯类（诸如辛二酸二琥珀酰亚氨基酯）、醛类（诸如戊二醛）、双叠氮化合物（诸如双(对-叠氮苯甲酰基)己二胺）、双重氮衍生物（诸如双(对-重氮苯甲酰基)-乙二胺）、二异硫氰酸酯（诸如甲苯2,6-二异氰酸酯）、和双活性氟化合物（诸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯）的双功能衍生物。例如，可以如Vitetta等,Science238:1098(1987)中所述制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14标记的1-异硫氰酸苄基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸与抗体偶联的例示性螯合剂。参见WO94/11026。
或者，可通过例如重组技术或肽合成来制备包含抗体和细胞毒剂的融合蛋白。重组DNA分子可以包含各自编码偶联物的抗体和细胞毒部分的区域，彼此或是毗邻或是由编码接头肽的区域分开，该接头肽不破坏偶联物的期望特性。
在又一个实施方案中，可以将抗体与“受体”（诸如链霉亲合素）偶联从而用于肿瘤预先靶向，其中对患者施用抗体-受体偶联物，接着使用清除剂由循环中清除未结合的偶联物，然后施用与细胞毒剂（例如放射性核苷酸）偶联的“配体”（例如亲合素）。
半胱氨酸改造抗STEAP-1抗体的制备
本发明的设计、选择和制备方法进一步能够得到具有亲电子官能度反应性的半胱氨酸改造抗STEAP-1抗体。这些方法进一步能够获得抗体偶联物化合物，诸如在指定的、设计的、选择性的位点上具有药物分子的抗体-药物偶联物(ADC)化合物。抗体表面上的反应性半胱氨酸残基容许通过硫醇反应性基团，诸如马来酰亚胺或卤代乙酰基特异性地偶联药物模块。Cys残基的硫醇官能度与马来酰亚胺基团的亲核反应性高于蛋白质中任何其它氨基酸官能度，诸如赖氨酸残基的氨基或N-末端氨基约1000倍。碘乙酰基和马来酰亚胺试剂中的硫醇特异性官能度可以与胺基团反应，但需要更高的pH(>9.0)和更长的反应时间(Garman,1997,Non-Radioactive Labelling:A PracticalApproach,Academic Press,London)。可以通过标准Ellman测定法来估计蛋白质中游离硫醇的量。免疫球蛋白M为二硫化物连接的五聚体的例子，而免疫球蛋白G为内部二硫桥将各亚基键合在一起的蛋白质的例子。在诸如这种蛋白质中，用诸如二硫苏糖醇(DTT)或硒醇还原二硫键(Singh等(2002)Anal.Biochem.304:147-156)是产生反应性游离硫醇所需的。这种方法可以导致抗体的三级结构和抗原结合特异性丧失。
Pheselector(用于选择反应性硫醇的噬菌体ELISA)测定法容许以ELISA噬菌体形式检测抗体中反应性半胱氨酸基团，由此辅助半胱氨酸改造抗体的设计(WO2006/034488)。在孔表面上包被半胱氨酸改造抗体，随后与噬菌体颗粒一起温育，添加HRP标记的二抗，并检测吸光度。可以以快速、有力和高流通量方式筛选噬菌体上展示的突变蛋白。可以使用与从抗体或其它蛋白质的随机蛋白质-噬菌体文库鉴定游离Cys掺入的适当反应性位点相同的方法生成半胱氨酸改造抗体的文库并且进行结合选择。这项技术包括使噬菌体上展示的半胱氨酸突变蛋白与也为硫醇反应性的亲和试剂或报告基团反应。
PHESELECTOR测定法容许筛选抗体中的反应性硫醇基团。通过该方法鉴定A121C变体是例示性的。可以高效地搜索整个Fab分子以鉴定更多的带有反应性硫醇基团的ThioFab变体。采用参数，表面可及分数(fractional surfaceaccessibility)来鉴定和量化溶剂对多肽中氨基酸残基的可及性。将表面可及性表述为可以由溶剂分子，例如水接触的表面积
Figure BDA00002807843501301
水占据的空间近似为
Figure BDA00002807843501302
半径球体。软件为自由可获得的或可许可的(Secretary to CCP4,DaresburyLaboratory,Warrington,WA44AD,United Kingdom,Fax:(+44)1925603825，或通过因特网：www.ccp4.ac.uk/dist/html/INDEX.html)，如使用计算具有已知X射线晶体学衍生坐标的蛋白质的每个氨基酸的表面可及性的算法的晶体学程序CCP4Suite(“The CCP4Suite:Programs for Protein Crystallography”(1994)Acta.Cryst.D50:760-763)。执行表面可及性计算的两种例示性软件模块为“AREAIMOL”和“SURFACE”，其基于B.Lee和F.M.Richards(1971)J.Mol.Biol.55:379-400的算法。AREAIMOL将蛋白质的溶剂可及表面定义为探针球(probe sphere)(代表溶剂分子)在蛋白质的Van der Waals表面上翻转时其中心的位置。AREAIMOL如下计算溶剂可及表面积，即在关于每个原子的扩充球体上产生表面点（距原子中心的距离等于原子和探针半径的总和)，并且消除那些位于与相邻原子相关的等同球体内的点。AREAIMOL找到了PDB坐标文件中原子的溶剂可及面积并概括了残基、链和整个分子的可及面积。可以将各原子的可及面积（或面积差）存储成假拟-PDB输出文件。AREAIMOL假设了每个成分的单一半径并仅识别有限数量的不同成分。
AREAIMOL和SURFACE报导了绝对可及性，即平方埃
Figure BDA00002807843501311
数。通过参比多肽内氨基酸相关标准状态来计算表面可及分数。参比状态为三肽Gly-X-Gly，其中X为感兴趣的氨基酸，且参比状态应为“扩展的”构象，即像那些在β链中的构象。扩展的构象使X的可及性达到最大值。用计算的可及面积除以Gly-X-Gly三肽参比状态中的可及面积并报告商数，其为可及性分数。可及性百分比为可及性分数乘以100。计算表面可及性的另一种例示性算法基于程序xsae的SOLV模块(Broger,C.,F.Hoffman-LaRoche,Basel)，它基于多肽的X射线坐标计算氨基酸残基对水球体的可及性分数。可以使用可得到的晶体结构信息来计算抗体中每个氨基酸的表面可及性分数(Eigenbrot等(1993)J Mol Biol.229:969-995)。
编码半胱氨酸改造抗体的DNA易于使用常规规程来分离和测序（例如通过使用能够与编码鼠抗体重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针）。杂交瘤细胞充当此类DNA的来源。一旦分离，可以将DNA置入表达载体，然后转染入原本不生成抗体蛋白质的宿主细胞，诸如大肠杆菌细胞、猿COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、或其它哺乳动物宿主细胞，诸如骨髓瘤细胞(US5807715;US2005/0048572;US2004/0229310)，以获得单克隆抗体在重组宿主细胞中的合成。
在设计和选择后，可如下生成具有改造的、高度反应性的未配对的Cys残基的半胱氨酸改造抗体，例如ThioFab：(i)在细菌例如大肠杆菌***(Skerra等(1993)Curr.Opinion in Immunol.5:256-262;Plückthun(1992)Immunol.Revs.130:151-188)或哺乳动物细胞培养物***(WO01/00245)例如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中表达；和(ii)使用常用的蛋白质纯化技术纯化(Lowman等(1991)J.Biol.Chem.266(17):10982-10988)。
改造的Cys硫醇基团与亲电子的接头试剂和药物-接头中间体起反应而形成半胱氨酸改造抗体-药物偶联物和其它经标记的半胱氨酸改造抗体。半胱氨酸改造抗体的和存在于亲本抗体中的、配对并形成链间和链内二硫键的Cys残基不具有任何反应性硫醇基团（除非用还原剂处理）且不与亲电子的接头试剂或药物-接头中间体起反应。新近改造的Cys残基可以保持不配对，而且能够与亲电子的接头试剂或药物-接头中间体（诸如药物-马来酰亚胺）起反应（即偶联）。例示性的药物-接头中间体包括：MC-MMAE、MC-MMAF、MC-vc-PAB-MMAE、和MC-vc-PAB-MMAF。重链和轻链中经改造的Cys残基的结构位置依照连续编号***来编号。此连续编号***与自N末端起始的Kabat编号***(Kabat等(1991)Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,第5版,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD)有关，与Kabat编号方案（底行）的区别在于标示为a、b、c的***。使用Kabat编号***，实际的线性氨基酸序列可包含更多或更少的氨基酸，对应于可变域FR或CDR中的缩短或***。经半胱氨酸改造的重链变***点通过连续编号方式和Kabat编号方案来标示。
在一个实施方案中，通过包括下列步骤的方法来制备半胱氨酸改造抗STEAP-1抗体：
(a)用半胱氨酸替换亲本抗STEAP-1抗体的一个或多个氨基酸残基；并
(b)通过使半胱氨酸改造抗体与硫醇反应性试剂起反应来测定半胱氨酸改造抗STEAP-1抗体的硫醇反应性。
半胱氨酸改造抗体可以比亲代抗体更具与硫醇反应性试剂的反应性。
游离半胱氨酸氨基酸残基可以位于重链或轻链中或者恒定域或可变域中。还可以通过用一个或多个半胱氨酸氨基酸替换抗体片段的氨基酸来改造抗体片段，例如Fab，以形成半胱氨酸改造抗体片段。
本发明的另一个实施方案提供了制备（生成）半胱氨酸改造抗STEAP-1抗体的方法，包括：
(a)将一个或多个半胱氨酸氨基酸引入亲本抗STEAP-1抗体以生成半胱氨酸改造抗STEAP-1抗体；并
(b)测定半胱氨酸改造抗体与硫醇反应性试剂的硫醇反应性；
其中半胱氨酸改造抗体比亲代抗体更具与硫醇反应性试剂的反应性。
制备半胱氨酸改造抗体的方法的步骤(a)可以包括：
(i)诱变编码半胱氨酸改造抗体的核酸序列；
(ii)表达半胱氨酸改造抗体；和
(iii)分离和纯化半胱氨酸改造抗体。
制备半胱氨酸改造抗体的方法的步骤(b)可以包括在选自噬菌体或噬菌粒颗粒的病毒颗粒上表达半胱氨酸改造抗体。
制备半胱氨酸改造抗体的方法的步骤(b)还可以包括：
(i)使半胱氨酸改造抗体与硫醇反应性亲和试剂反应以生成亲和标记的半胱氨酸改造抗体；和
(ii)测量亲和标记的半胱氨酸改造抗体与俘获介质的结合。
本发明的另一个实施方案是对带有高反应性的未配对的半胱氨酸氨基酸的半胱氨酸改造抗体筛选硫醇反应性的方法，包括：
(a)将一个或多个半胱氨酸氨基酸引入亲本抗体以生成半胱氨酸改造抗体；
(b)使半胱氨酸改造抗体与硫醇反应性亲和试剂反应以生成亲和标记的半胱氨酸改造抗体；和
(c)测量亲和标记的半胱氨酸改造抗体与俘获介质的结合；和
(d)测定半胱氨酸改造抗体与硫醇反应性试剂的硫醇反应性。
筛选半胱氨酸改造抗体的方法的步骤(a)可以包括：
(i)诱变编码半胱氨酸改造抗体的核酸序列；
(ii)表达半胱氨酸改造抗体；和
(iii)分离和纯化半胱氨酸改造抗体。
筛选半胱氨酸改造抗体的方法的步骤(b)可以包括在选自噬菌体或噬菌粒颗粒的病毒颗粒上表达半胱氨酸改造抗体。
筛选半胱氨酸改造抗体的方法的步骤(b)还可以包括：
(i)使半胱氨酸改造抗体与硫醇反应性亲和试剂反应以生成亲和标记的半胱氨酸改造抗体；和
(ii)测量亲和标记的半胱氨酸改造抗体与俘获介质的结合。
经过标记的半胱氨酸改造抗STEAP-1抗体
半胱氨酸改造抗STEAP-1抗体可以位点特异性地和高效地与硫醇反应性试剂偶联。硫醇反应性试剂可以为多功能接头试剂；俘获物，即亲和、标记物试剂（例如生物素-接头试剂）；检测标记物（例如荧光团试剂）；固相固定化试剂（例如SEPHAROSETM、聚苯乙烯或玻璃）；或药物-接头中间体。硫醇反应性试剂的一个例子为N-乙基马来酰亚胺(NEM)。在一个例示性的实施方案中，ThioFab与生物素-接头试剂的反应得到了生物素化的ThioFab，由此可以检测和测量改造的半胱氨酸残基的存在和反应性。ThioFab与多功能接头试剂反应得到了带有可以与药物模块试剂或其它标记物进一步反应的官能化接头的ThioFab。ThioFab与药物-接头中间体的反应得到了ThioFab-药物偶联物。
本文所述的例示性方法一般可以应用于鉴定和生产抗体，并且更一般地通过应用本文所述的设计和筛选步骤用于其它蛋白质。
此类方法可以应用于其它硫醇反应性试剂的偶联，其中反应性基团为例如马来酰亚胺、碘乙酰胺、吡啶基二硫化物或其它硫醇反应性偶联配偶(Haugland,2003,Molecular Probes Handbook of Fluorescent Probes andResearch Chemicals,Molecular Probes,Inc.；Brinkley,1992,Bioconjugate Chem.3:2；Garman,1997,Non-Radioactive Labelling:A Practical Approach,AcademicPress,London；Means(1990)Bioconjugate Chem.1:2；Hermanson,G.,于Bioconjugate Techniques(1996)Academic Press,San Diego,pp.40-55,643-671)。硫醇反应性试剂可以为药物模块；荧光团，诸如荧光染料，像荧光素或罗丹明；用于成像或放射性治疗金属的螯合剂；肽基或非肽基标记物或检测标签；或清除改性剂(clearance-modifying agent)，诸如聚乙二醇的各种异构体；结合第三组分的肽；或另一种碳水化合物或亲脂剂。
半胱氨酸改造抗STEAP-1抗体的用途
半胱氨酸改造抗STEAP-1抗体及其偶联物可用作治疗剂和/或诊断剂。本发明还提供了预防、管理、治疗或改善一种或多种与STEAP-1相关病症有关的症状的方法。具体而言，本发明提供了预防、管理、治疗或改善一种或多种与细胞增殖性病症有关的症状的方法，所述细胞增殖性病症诸如癌症，例如***癌、肺癌、结肠癌、膀胱癌、卵巢癌、和尤因氏肉瘤。本发明还提供了用于诊断STEAP-1相关病症或发生此类病症的素因的方法，以及用于鉴定优先结合细胞相关(associated)STEAP-1多肽的抗体及其抗原结合片段的方法。
本发明的另一个实施方案致力于半胱氨酸改造抗STEAP-1抗体用于制备药物的用途，所述药物可用于治疗对于STEAP-1相关病症是响应性的疾患。
半胱氨酸改造抗STEAP-1抗体-药物偶联物的制备
可以通过数种途径，采用本领域技术人员公知的有机化学反应、条件和试剂来制备式I的ADC，包括：(1)使半胱氨酸改造抗体的半胱氨酸基团与接头试剂反应，从而通过共价键形成抗体-接头中间体Ab-L，随后与活化的药物模块D反应；和(2)使药物模块的亲核基团与接头试剂反应，从而通过共价键形成药物-接头中间体D-L，随后与半胱氨酸改造抗体的半胱氨酸基团反应。偶联方法(1)和(2)可以与各种半胱氨酸改造抗体、药物模块和接头一起使用以制备式I的抗体-药物偶联物。
抗体半胱氨酸硫醇基团为亲核性的并且能够与接头试剂和药物-接头中间体上的亲电子基团反应而形成共价键，所述亲电子基团包括：(i)活性酯类，诸如NHS酯类、HOBt酯类、卤代甲酸酯类和酸性氯化物类；(ii)烃基和苄基卤化物，诸如卤代乙酰胺；(iii)醛类、酮类、羧基和马来酰亚胺基团；和(iv)通过硫化物交换的二硫化物，包括吡啶基二硫化物。药物模块上的亲核基团包括但不限于：胺、硫醇、羟基、酰肼、肟、肼、缩氨基硫脲、肼羧酸酯和芳基酰肼基团，它们能够与接头模块和接头试剂上的亲电子基团反应而形成共价键。
可以如下使半胱氨酸改造抗体变成反应性的以便偶联接头试剂，即用还原剂，诸如DTT（Cleland氏试剂，二硫苏糖醇）或TCEP（三(2-羧乙基)膦盐酸盐）处理(Getz等(1999)Anal.Biochem.273:73-80；Soltec Ventures,Beverly,MA)，接着再氧化以再形成链间和链内二硫键（实施例x）。例如，在37°C用约50倍过量的TCEP将在CHO细胞中表达的全长半胱氨酸改造的单克隆抗体(ThioMab)还原3小时以还原半胱氨酸加合物的二硫键，其可以在新引入的半胱氨酸残基与存在于培养基中的半胱氨酸之间形成。用10mM乙酸钠,pH5稀释还原后的ThioMab并且加载至10mM乙酸钠,pH5中的HiTrap S柱上并且用含有0.3M氯化钠的PBS洗脱。在室温用稀(200nM)硫酸铜(CuSO4)水溶液重新建立亲本Mab中存在的半胱氨酸残基之间的二硫键过夜。或者，脱氢抗坏血酸(DHAA)是有效的氧化剂，用于在半胱氨酸加合物的还原性切割之后重新建立半胱氨酸改造抗体的链内二硫化物基团。可以使用本领域公知的其它氧化剂，即氧化性试剂和氧化性条件。环境空气氧化也是有效的。这种温和的部分再氧化步骤有效地高保真度地形成链内二硫键并保护新引入的半胱氨酸残基的硫醇基团。加入约10倍过量的药物-接头中间体，例如MC-vc-PAB-MMAE，混合并且在室温放置约1小时，以进行偶联并形成抗体-药物偶联物。将偶联混合物进行凝胶过滤、加载和通过HiTrap S柱洗脱以除去过量的药物-接头中间体和其它杂质。
附图16显示了制备由细胞培养物表达的用于偶联的半胱氨酸改造抗体的一般方法。当细胞培养基含有半胱氨酸时，可以在新引入的半胱氨酸氨基酸和培养基中的半胱氨酸之间形成二硫化物加合物。必须将这些半胱氨酸加合物（描绘为图12中的例示性ThioMab（左）中的环）还原以生成具有偶联反应性的半胱氨酸改造抗体。将半胱氨酸加合物和可能的各个链间二硫键用还原剂诸如TCEP还原性切割以产生还原形式的抗体。在部分氧化条件下，用硫酸铜、DHAA、或暴露于环境氧而重新形成配对半胱氨酸残基之间的链间二硫键。新引入的、改造的和未配对的半胱氨酸残基仍然可用于与接头试剂或药物-接头中间体反应而形成本发明的抗体偶联物。哺乳动物细胞系中表达的ThioMab通过-S-S-键形成产生外部偶联至改造的Cys的Cys加合物。因此，纯化的ThioMab如实施例x所述通过还原和再氧化规程处理以产生反应性ThioMab。这些ThioMab用于偶联含有马来酰亚胺的细胞毒性药物、荧光团和其它标记物。
图15显示了半胱氨酸改造抗STEAP-1抗体药物偶联物(ADC)的实施方案，其中auristatin药物模块附着于轻链(LC-ADC)、重链(HC-ADC)、和Fc区(Fc-ADC)中的改造半胱氨酸基团。
药物配制剂
抗体-药物偶联物的施用
可以通过适合于待治疗疾患的任何路径来施用本发明的抗体-药物偶联物(ADC)。典型地，胃肠外施用ADC，即输注，皮下、肌肉内、静脉内、真皮内、鞘内和硬膜外。
为了治疗例如***、肺和/或结肠的癌症，在一个实施方案中，抗体-药物偶联物经静脉内输注来施用。经输注而施用的剂量范围为大约1μg/m2至大约10,000μg/m2每剂，一般是每周一剂，总共一剂、两剂、三剂或四剂。或者，剂量范围是大约1μg/m2至大约1000μg/m2、大约1μg/m2至大约800μg/m2、大约1μg/m2至大约600μg/m2、大约1μg/m2至大约400μg/m2、大约10μg/m2至大约500μg/m2、大约10μg/m2至大约300μg/m2、大约10μg/m2至大约200μg/m2、和大约1μg/m2至大约200μg/m2。剂量施用可以每天一次、每周一次、每周多次但少于每天一次、每月多次但少于每天一次、每月多次但少于每周一次、每月一次或间歇地施用以减轻或缓解疾病的症状。施用可以以任何已公开的间隔持续进行，直至所治疗的白血病、淋巴瘤的症状或肿瘤消退。施用可以在实现症状消退或减轻后继续进行，其中所述消退或减轻因所述继续施用而延长。
本发明还提供了治疗***癌、肺癌、和/或结肠癌、和/或此类癌症的转移的方法，包括给患有***癌、肺癌或结肠癌的患者施用治疗有效量的任一前述实施方案的人源化120v.24抗体，该抗体未偶联细胞毒性分子或可检测分子。该抗体通常在大约1μg/m2至大约1000mg/m2的剂量范围内施用。
本发明还提供了治疗***癌、肺癌、和/或结肠癌、和/或此类癌症的转移的方法，包括给患有***癌、肺癌或结肠癌的患者施用治疗有效量的任一前述实施方案的人源化120v.24抗体，该抗体偶联有细胞毒性分子或可检测分子。该抗体通常在大约1μg/m2至大约1000mg/m2的剂量范围内施用。
一方面，本发明还提供了包含至少一种本发明抗STEAP-1抗体和/或至少一种其免疫偶联物和/或至少一种本发明抗STEAP-1抗体-药物偶联物的药物配制剂。在有些实施方案中，药物配制剂包含：1)抗STEAP-1抗体和/或抗STEAP-1抗体-药物偶联物和/或其免疫偶联物，和2)药学可接受载体。在有些实施方案中，药物配制剂包含：1)抗STEAP-1抗体和/或其免疫偶联物，和任选的2)至少一种别的治疗剂。
包含本发明抗体或免疫偶联物或本发明抗体-药物偶联物的药物配制剂通过将具有期望纯度的抗体或抗体-药物偶联物与任选的生理学可接受载体、赋形剂或稳定剂（《Remington's Pharmaceutical Sciences》，第16版，Osol,A.编，1980）混合来制备成水溶液或冻干剂型或其它干燥剂型的形式供贮存。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所采用的剂量和浓度对接受者是无毒的，并且包括：缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐、组氨酸和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂（诸如氯化十八烷基二甲基苄基铵；氯己双铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烃基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚）；低分子量（少于约10个残基）多肽；蛋白质，诸如血清清蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖类，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐抗衡离子，诸如钠；金属复合物（例如Zn-蛋白质复合物）；和/或非离子表面活性剂，诸如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。用于体内施用的药物配制剂一般是无菌的。这易于通过无菌滤膜过滤来实现。
活性成分还可包载于例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中（例如分别是羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊）、在胶状药物投递***中（例如脂质体、清蛋白微球体、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊）、或在粗滴乳状液中。此类技术公开于Remington's PharmaceuticalSciences,第16版,Osol,A.编(1980)。
可以制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适例子包括含有本发明抗体或免疫偶联物的固体疏水聚合物的半透性基质，该基质是定型产品的形式，例如薄膜或微胶囊。持续释放基质的例子包括聚酯、水凝胶（例如聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇)）、聚交酯(美国专利No.3,773,919)、L-谷氨酸和γ-乙基L-谷氨酸酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物诸如LUPRON DEPOTTM（由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林构成的可注射微球体）及聚-D-(-)-3-羟基丁酸。虽然诸如乙烯-乙酸乙烯和乳酸-乙醇酸的聚合物能够释放分子达100天以上，但是某些水凝胶释放蛋白质的时间较短。当所封装的抗体或免疫偶联物在体内长时间维持时，它们可能由于暴露于37°C的潮湿环境而变性或聚集，导致生物学活性损失和免疫原性可能改变。可以根据相关机制来设计合理的稳定化策略。例如，如果发现聚集机制是经由硫-二硫化物互换的分子间S-S键形成，那么可通过修饰巯基、自酸性溶液冻干、控制含水量、使用适宜添加剂和开发特定聚合物基质组合物来实现稳定化。
抗体-药物偶联物治疗
涵盖本发明的抗体-药物偶联物(ADC)可以用于治疗各种疾病或病症，例如其特征在于肿瘤抗原过表达的疾病或病症。例示性的疾患或过度增殖性病症包括良性或恶性肿瘤；白血病和淋巴样恶性肿瘤。其它病症包括神经元、神经胶质、星形胶质细胞、下丘脑、腺体、巨噬细胞、上皮、基质(stromal)、囊胚腔、炎性、血管发生性和免疫学病症，包括自身免疫性病症。还包括***癌、肺癌和结肠癌。
可以在携带肿瘤的高级灵长类和人体临床试验中进一步测试在动物模型和基于细胞的测定法中鉴定的ADC化合物。可以设计人体临床试验以测试本发明的抗STEAP-1单克隆抗体或免疫偶联物在发生***、肺或结肠细胞增殖性病症的患者中的功效，所述***、肺或结肠细胞增殖性病症包括但不限于***癌、肺癌和结肠癌和此类癌症的转移。可以设计临床试验以评价ADC与已知治疗方案的组合的功效，所述的已知治疗方案诸如涉及已知化疗剂和/或细胞毒剂的化疗和/或放疗。
癌可以包含表达STEAP-1的细胞，使得本发明的ADC能够结合癌细胞。为了测定癌中的STEAP-1表达，可以利用各种诊断/预后测定法。在一个实施方案中，可以通过IHC来分析STEAP-1过表达。可以对来自肿瘤活检的石蜡包埋的组织切片进行IHC测定法并根据染色程度和所检查肿瘤细胞中的比例而给予(accord)STEAP-1蛋白质染色强度标准。
为了预防或治疗疾病，ADC的适当剂量会取决于上文所定义的待治疗疾病的类型、疾病的严重程度和进程、施用所述分子是为了预防还是为了治疗目的、先前的疗法、患者的临床史和对抗体的应答、及主治医师的判断。一次性地或在一系列治疗中将所述分子适当施用于患者。根据疾病的类型和严重程度，对患者施用的初始候选剂量为大约1μg/kg至15mg/kg（例如0.1-20mg/kg）的分子，例如，或是通过一次或多次分开的施用，或是通过连续输注。典型的每日剂量范围可以为大约1μg/kg至100mg/kg或更大，这取决于上文所述因素。对患者施用的例示性ADC剂量范围为大约0.1至大约10mg/kg患者体重。
对于持续数天或更长时间的反复施用，根据状况，持续治疗，直至发生对疾病症状的期望抑制。例示性的剂量给药方案包括施用大约4mg/kg的初始加载剂量，随后施用大约2mg/kg抗STEAP-1抗体的每周维持剂量。其它剂量方案也是有用的。该疗法的进展易于通过常规技术和测定法来监测。
联合疗法
可以将本发明的抗体-药物偶联物(ADC)与至少一种具有抗癌特性的别的化合物在药物组合配制剂中或给药方案联合，作为联合疗法。药物组合配制剂或给药方案中的至少一种别的化合物优选具有对组合中的ADC的补充活性，使得它们彼此不会产生不利影响。
所述至少一种别的化合物可以为化疗剂、细胞毒剂、细胞因子、生长抑制剂、抗激素剂和/或心脏保护剂。此类分子以对指定目的有效的量适当地联合存在。含有本发明ADC的药物组合物还可以具有治疗有效量的化疗剂，诸如微管蛋白形成抑制剂、拓扑异构酶抑制剂或DNA结合剂。
一方面，所述第一化合物是本发明的抗STEAP-1ADC，而所述至少一种别的化合物是不同于抗STEAP-1的治疗性抗体（或是裸抗体或是ADC）。在一个实施方案中，所述至少一种别的化合物是抗PSCA抗体。在一个实施方案中，所述至少一种别的化合物是抗HER2抗体，trastuzumab(例如
Figure BDA00002807843501401
Genentech,Inc.,South San Francisco,CA)。在一个实施方案中，所述至少一种别的化合物是抗HER2抗体，pertuzumab(OmnitargTM,Genentech,Inc.,SouthSan Francisco,CA,参见US6949245)。在一个实施方案中，所述至少一种别的化合物是抗VEGF抗体(例如
Figure BDA00002807843501402
Genentech,Inc.)。在每一种情况中，所述至少一种别的化合物或是裸抗体或是ADC。在一个实施方案中，所述至少一种别的化合物是抗体（或是裸抗体或是ADC），且所述别的抗体是第二种、第三种、第四种、第五种、第六种抗体或更多，使得此类第二种、第三种、第四种、第五种、第六种、或更多抗体（或是裸抗体或是ADC）的组合有效治疗表达STEAP-1的组织中的细胞增殖性病症。
可以将其它治疗方案与依照本发明所鉴定的抗癌药施用联合，包括但不限于放疗和/或骨髓和外周血移植物、和/或细胞毒剂、化疗剂、或生长抑制剂。在这样的一个实施方案中，化疗剂是诸如例如下列药剂或药剂组合：环磷酰胺、羟基柔红霉素、阿霉素、多柔比星(doxorubincin)、长春新碱(OncovinTM)、***龙、CHOP、CVP、或COP、或免疫治疗剂诸如抗PSCA、抗HER2(例如
Figure BDA00002807843501403
OmnitargTM)或抗VEGF(例如联合疗法可以作为同时或序贯方案施用。当序贯施用时，可以以两次或更多次施用来施用所述组合。联合施用包括使用分开的配制剂或单一药物配制剂的共施用，和任意次序的序贯施用，其中优选有一段时间所有活性剂同时发挥其生物学活性。
在一个实施方案中，使用ADC的治疗涉及联合施用本文中所鉴定的抗癌药和一种或多种化疗剂或生长抑制剂，包括共施用不同化疗剂鸡尾酒。化疗剂包括紫杉烷类（诸如帕利他塞(paclitaxel)和多西他赛(docetaxel)）和/或蒽环类抗生素。熟练从业人员可以按照制造商的说明书或凭经验确定地使用此类化疗剂的制备和剂量给药方案。此类化疗剂的制备和剂量给药方案还记载于“Chemotherapy Service”,(1992)M.C.Perry编,Williams&Wilkins,Baltimore,Md。
任何上述共施用的药剂的合适剂量就是那些当前使用的剂量，而且可以由于新鉴定的药剂和其它化疗剂或治疗的联合作用（协同作用）而降低。
联合疗法可以提供“协同作用”并且证实是“协同性”的，即当一起使用活性组分时所实现的效果大于分开使用所述化合物时所产生的效果之和。当活性组分为如下情况时可以获得协同效应：(1)共同配制和施用或在合并的单位剂量配制剂中同时投递；(2)作为分开的配制剂交替或平行投递；或(3)通过一些其它方案。当在交替疗法中投递时，在序贯施用或投递所述化合物时，例如通过不同注射器中的不同注射，可以获得协同效应。一般而言，在交替疗法中，序贯地，即依序地施用每种活性组分的有效剂量，而在联合疗法中，一起施用两种或更多活性组分的有效剂量。
抗体-药物偶联物的代谢物
本文所述ADC化合物的体内代谢产物也落在本发明的范围内，就此类产物相对于现有技术为新的且非显而易见的而言。此类产物可能源自例如所施用化合物的氧化、还原、水解、酰胺化、酯化、酶促切割、等等。因而，本发明包括通过如下方法产生的新的和非显而易见的化合物，所述方法包括使本发明的化合物与哺乳动物接触足以产生其代谢产物的一段时间。
一般如下鉴定代谢产物，即制备放射性标记的（例如14C或3H）ADC，将其以可检测剂量（例如大于约0.5mg/kg）胃肠外施用于动物（诸如大鼠、小鼠、豚鼠、猴）或人，允许足够时间让代谢发生（通常约30秒到30小时），及从尿液、血液或其它生物学样品分离其转化产物。这些产物易于分离，因为它们是经过标记的（其它的通过使用能够结合在代谢物中幸存的表位的抗体来分离）。按照常规方式，例如通过MS、LC/MS或NMR分析来测定代谢物结构。一般而言，按照与本领域技术人员众所周知的常规药物代谢研究相同的方式对代谢物进行分析。转化产物，只要没在其它情况中在体内发现它们，即可用于诊断测定法以用于本发明ADC化合物的治疗性剂量给药。
使用抗STEAP-1抗体和免疫偶联物的其它方法
诊断方法和检测方法
一方面，本发明的抗STEAP-1抗体和免疫偶联物可用于检测生物学样品中STEAP-1的存在。术语“检测”在用于本文时涵盖定量或定性检测。在某些实施方案中，生物学样品包含细胞或组织。在某些实施方案中，此类组织包括相对于其它组织以更高水平表达STEAP-1的正常的和/或癌性的组织，例如***、肺和结肠。
一方面，本发明提供了检测生物学样品中STEAP-1的存在的方法。在某些实施方案中，所述方法包括在容许抗STEAP-1抗体结合STEAP-1的条件下使生物学样品接触抗STEAP-1抗体，并检测在抗STEAP-1抗体与STEAP-1之间是否形成复合物。
一方面，本发明提供了诊断与STEAP-1表达升高有关的病症的方法。在某些实施方案中，所述方法包括使测试细胞接触抗STEAP-1抗体；通过检测抗STEAP-1抗体对STEAP-1的结合来测定测试细胞的STEAP-1表达水平（或是定量的或是定性的）；并比较测试细胞的STEAP-1表达水平与对照细胞（例如与测试细胞相同组织起源的正常细胞或以与这样的正常细胞相当的水平表达STEAP-1的细胞）的STEAP-1表达水平，其中测试细胞的STEAP-1表达水平比对照细胞高指示存在与STEAP-1表达升高有关的病症。在某些实施方案中，测试细胞得自怀疑患有与STEAP-1表达升高有关的病症的个体。在某些实施方案中，所述病症是细胞增殖性病症，诸如癌症或肿瘤。
可以使用本发明的抗体诊断的例示性细胞增殖性病症包括***癌、肺癌和结肠癌或此类癌症的转移。
在某些实施方案中，诊断或检测方法，诸如上文所述那些，包括检测抗STEAP-1抗体对在细胞表面上表达的STEAP-1或在得自在其表面上表达STEAP-1的细胞的膜制备物中的STEAP-1的结合。在某些实施方案中，所述方法包括在容许抗STEAP-1抗体结合STEAP-1的条件下使细胞接触抗STEAP-1抗体，并检测在抗STEAP-1抗体与细胞表面上的STEAP-1之间是否形成复合物。用于检测抗STEAP-1抗体对在细胞表面上表达的STEAP-1的结合的例示性测定法是“FACS”测定法。
可以使用某些其它方法来检测抗STEAP-1抗体对STEAP-1的结合。此类方法包括但不限于本领域公知的抗原结合测定法，诸如Western印迹、放射免疫测定法、ELISA（酶联免疫吸附测定法）、“三明治/夹心式”免疫测定法、免疫沉淀测定法、荧光免疫测定法、蛋白A免疫测定法、免疫PEG、和免疫组化(IHC)。
在某些实施方案中，89Zr-抗STEAP-1免疫PET体外或体内分析可用于量化原发性***肿瘤病灶中的抗体摄取和生物分布，而且可用于鉴定原发性肿瘤转移时肿瘤抗原谱的变化。免疫PET需要发射正电子的放射性同位素,诸如锆(89ZR)(Verel I.等,J Nucl Med2003:44:1271-1281;“89Zr Immuno-PET:Comprehensive Procedures for the Production of 89Zr-Labeled MonoclonalAntibodies”)。免疫PET（PET与单克隆抗体(mAb)的组合）的使用是改进肿瘤检测和mAb量化的一个有吸引力的选项。长命正电子发射体89Zr具有对于免疫PET而言理想的物理特征，诸如半衰期3.27天，其与完整mAb实现最佳肿瘤对非肿瘤比需要的时间相当。
采用基于去铁敏B(Df)的例示性双功能试剂来将89Zr络合至抗体，包括单克隆抗体(mAb)。去铁敏B（N'-{5-[乙酰基(羟基)氨基]戊基}-N-[5-({4-[(5-氨基戊基)(羟基)氨基]-4-氧丁酰基}氨基)戊基]-N-羟基琥珀酰胺(CAS Reg.No.70-51-9)；而且也称作去铁胺、去铁敏B、DFO-B、DFOA、DFB或除铁灵）是一种由放线菌毛链霉菌（Streptomyces pilosus）生成的细菌铁载体（图20顶部）。去铁敏B具有作为螯合剂用于自身体除去过量的铁的医学应用(Miller,Marvin J.“Syntheses and therapeutic potential of hydroxamic acid basedsiderophores and analogs”(1989)Chemical Reviews89(7):1563-1579)。DFO-B的甲磺酸盐是商品化的。最初的实验是用N-(S-乙酰基)硫代乙酰基-Df(SATA-Df)和用附着至赖氨酸侧链中-氨基的马来酰亚胺基团，4-[N-马来酰亚胺甲基]环己烷-1-羧酸酯装饰的mAb(mAb-SMCC)进行的(Meijs WE等,“Zirconium-labeled monoclonal antibodies and their distribution intumor-bearing nude mice”(1997)J.Nucl.Med.38:112-8;Meijs WE等,“A facilemethod for the labeling of proteins with zirconium isotopes”(1996)Nucl MedBiol.23:439-48)。
另一种例示性氨基反应性双功能螯合剂，基于经琥珀酸酐(Suc)修饰的Df，用于将Df的氨基转变成羧酸并随后活化为2,3,5,6-四氟苯基酯(TFP)。将TFP-N-Suc-Df（图20中部）偶联至mAb的赖氨酸-氨基，并用89Zr螯合纯化的mAb-N-Suc-Df。所得89Zr-mAb-N-Suc-Df在生理条件是稳定的，而且在小鼠中将它的生物分布与mAb-SMCC-SATA-Df比较(Verel I等,“89Zrimmuno-PET:comprehensive procedures for the production of89Zr-labeledmonoclonal antibodies”(2003)J Nucl Med.44:1271-81)。然而，TFP-N-Suc-Df的制备要求作为Fe(III)复合物保护羟基草酰胺(hydroxamide)基团。在用89Zr螯合之前通过EDTA处理除去铁，但是该多步骤方法是冗长的，而且具有自去铁敏不完全除去铁和/或自偶联缓冲液不完全除去EDTA的危险，这可能对89Zr螯合产量有负面影响。因此，最近开发出异双功能氨基反应性试剂，对-异硫氰酰苄基-去铁胺(Df-Bz-NCS)，用于经硫脲连接将Df掺入蛋白质(PerkLR等,“Facile radiolabeling of monoclonal antibodies and other proteins withzirconium-89or gallium-68for PET Imaging usingp-isothiocyanatobenzyl-desferrioxamine”(2008)Nature Protocols,publishedonline:DOI:10.1038/nprot.2008.22;Perk LR等,“p-Isothiocyanatobenzyl-desferrioxamine:a new bifunctional chelate for facileradiolabeling of monoclonal antibodies with zirconium-89for immuno-PETimaging”(2009)European Journal Of Nuclear Medicine And MolecularImaging)。
使用Df-Bz-NCS制备的抗体偶联物显示出与使用TFP-N-Suc-Df制备的参照偶联物相当的稳定性和成像特性。由于已经开发出用于经由赖氨酸-氨基将89Zr与抗体偶联的可靠方法，已经报告的用89Zr标记的抗体进行的临床前和临床免疫PET研究的数目在快速增长中(Verel I等,“Long-lived positronemitters zirconium-89and iodine-124for scouting of therapeuticradioimmunoconjugates with PET”(2003)Cancer Biother Radiopharm.18:655-61;Nagengast WB等,“In vivo VEGF imaging with radiolabeledbevacizumab in a human ovarian tumor xenograft”(2007)J Nucl Med.48:1313-9;Perk LR,et al.“(89)Zr as a PET surrogate radioisotope for scoutingbiodistribution of the therapeutic radiometals(90)Y and(177)Lu intumor-bearing nude mice after coupling to the internalizing antibody cetuximab”(2005)J Nucl Med.46:1898-906;Perk LR等,“Quantitative PET imaging ofMet-expressing human cancer xenografts with(89)Zr-labelled monoclonalantibody DN30”(2008)European Journal Of Nuclear Medicine And MolecularImaging35:1857-67;Perk LR等,“Preparation and evaluation of(89)Zr-Zevalinfor monitoring of(90)Y-Zevalin biodistribution with positron emissiontomography”(2006)European Journal Of Nuclear Medicine And MolecularImaging33:1337-45;Borjesson PK等,“Performance of immuno-positronemission tomography with zirconium-89-labeled chimeric monoclonal antibodyU36in the detection of lymph node metastases in head and neck cancer patients”(2006)Clin Cancer Res.12:2133-40;Aerts HJ等,“Disparity between in vivoEGFR expression and 89Zr-labeled cetuximab uptake assessed with PET”(2009)J Nucl Med.50:123-31;Dijkers EC等,“Development and Characterization ofClinical-Grade 89Zr-Trastuzumab for HER2/neu ImmunoPET Imaging”(2009)JNucl Med50(6):974-981)。
锆复合物的实施方案还包括锆结合（螯合）配体诸如DTPA(CAS Reg.No.67-43-6)、DOPA（1,4,7,10-四氮环十二烷-1,4,7,10-四乙酸）(Liu,Shuang(2008)Advanced Drug Delivery Reviews60(12):1347-1370)、环戊二烯基、和烯丙基（Erker,G.(1991)Pure and Applied Chemistry63(6):797-806;Erker,G.(1990)Jour.of Organometallic Chem.400(1-2):185-203)，通过述及将其每一篇收入本文）。
可以经由赖氨酸侧链中的-氨基或经由半胱氨酸的硫醇基将锆复合物(Z)和其它放射性核素偶联至抗体(Ab)，包括单克隆抗体(mAb)。由于抗体中有大约40个赖氨酸侧链(Wang L等,“Structural characterization of themaytansinoid-monoclonal antibody immunoconjugate,huN901-DM1,by massspectrometry”(2005)Protein Sci.14:2436-46)或8个半胱氨酸(Hamblett KJ等,“Effects of drug loading on the antitumor activity of a monoclonal antibody drugconjugate”(2004)Clin Cancer Res.10:7063-70)可供偶联用，这两种办法都在mAb偶联物比和偶联位点方面提供异质性。修饰结合位点内的赖氨酸残基可能降低偶联物的生物学活性(Cai W等,“PET imaging of colorectal cancer inxenograft-bearing mice by use of an18F-labeled T84.66anti-carcinoembryonicantigen diabody”(2007)J Nucl Med.48:304-10;Shively JE.“18F labeling forimmuno-PET:where speed and contrast meet”(2007)J Nucl Med.48:170-2;TaitJF等,“Improved detection of cell death in vivo with annexin V radiolabeled bysite-specific methods”(2006)J Nucl Med.47:1546-53;Schellenberger EA等,“Optical imaging of apoptosis as a biomarker of tumor response tochemotherapy”(2003)Neoplasia(New York,N.Y)5:187-92)，而修饰铰链区中的半胱氨酸提供缩短的血浆半衰期(Hamblett KJ等,“Effects of drug loadingon the antitumor activity of a monoclonal antibody drug conjugate”(2004)ClinCancer Res.10:7063-70)。凭借用于快速鉴定抗体中可突变成半胱氨酸的优选氨基酸的生化测定法PHESELECTOR(US7521541;Junutula JR等,“Rapididentification of reactive cysteine residues for site-specific labeling ofantibody-Fabs”J Immunol Methods2008;332:41-52)，通过使用改造成含有为了位点特异性偶联的目的而选择性定位的半胱氨酸的mAb，能避免这些限制。随后将所得抗体(THIOMAB)化学选择性和位点特异性偶联至细胞毒性药物，没有结合亲和力的任何损失或对抗体支架稳定性的有害影响(JunutulaJR等,“Site-specific conjugation of a cytotoxic drug to an antibody improves thetherapeutic index”(2008)Nat Biotechnol.26:925-32)。
从成像的观点看，最佳图像质量要求高靶物亲和力和最小非特异性摄取。因而，位点特异性放射性标记的半胱氨酸工程化改造抗体(THIOMAB)能提供具有未改变的结合亲和力和支架稳定性的示踪剂，其可以将代谢物在靶组织以外的非特异性摄取最小化。本发明的一个方面是一种使用新的基于Df的硫醇反应性双功能试剂马来酰亚胺环己基-去铁敏(Df-Chx-Mal)、溴乙酰基-去铁敏(Df-Bac)和碘乙酰基-去铁敏(Df-Iac)位点特异性放射性标记THIOMAB的方法。例示性实施方案包括将这些试剂位点特异性偶联至曲妥单抗THIOMAB（thio-曲妥单抗），用89Zr螯合，并在体外及在体内评估的情况。
在某些实施方案中，抗STEAP-1抗体是经过标记的。标记物包括但不限于直接检测的标记物或模块（诸如荧光、显色、电子密度、化学发光、和放射性标记物），以及间接检测（例如通过酶促反应或分子相互作用）的模块，诸如酶或配体。例示性的标记物包括但不限于放射性同位素32P、14C、125I、3H、和131I，荧光团诸如稀土螯合物或荧光素及其衍生物，罗丹明及其衍生物，丹酰，伞形酮，萤光素酶例如萤火虫萤光素酶和细菌萤光素酶(美国专利No.4,737,456)，萤光素，2,3-二氢萘嗪二酮，辣根过氧化物酶(HRP)，碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶，葡糖淀粉酶，溶菌酶，糖氧化酶例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶、和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，杂环氧化酶诸如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶，偶联利用过氧化氢氧化染料前体的酶诸如HRP、乳过氧化物酶、或微过氧化物酶，生物素/亲合素，自旋标记物，噬菌体标记物，稳定自由基等等。
在某些实施方案中，抗STEAP-1抗体是固定化在不溶性基质上的。固定化能够将抗STEAP-1抗体与仍然在溶液中游离的任何STEAP-1分开。这可以如下常规实现：或是通过在测定规程之前使抗STEAP-1抗体不溶解，即通过吸附至水不溶性基质或表面(Bennich等,U.S.3,720,760)或通过共价偶联（例如使用戊二醛交联）；或者通过在抗STEAP-1抗体与STEAP-1之间形成复合物之后使抗STEAP-1抗体不溶解，例如通过免疫沉淀。
可以使用本发明的免疫偶联物来实施诊断或检测的任何上述实施方案，或是用所述免疫偶联物替换抗STEAP-1抗体或是所述免疫偶联物与抗STEAP-1抗体一起使用。
治疗方法
本发明的抗体或免疫偶联物可用于例如体外、回体(ex vivo)、和体内治疗方法。一方面，本发明提供了在体内或在体外抑制细胞生长或增殖的方法，所述方法包括在容许免疫偶联物结合STEAP-1的条件下使细胞暴露于抗STEAP-1抗体或其免疫偶联物。“抑制细胞生长或增殖”意味着将细胞的生长或增殖降低至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、或100%，而且包括诱导细胞死亡。在某些实施方案中，所述细胞是肿瘤细胞。在某些实施方案中，所述细胞是***、肺、结肠、膀胱、或卵巢细胞或尤因氏肉瘤细胞。在某些实施方案中，所述细胞是异种移植物，例如本文中所例示的。
一方面，本发明的抗体或免疫偶联物用于治疗或预防***、肺、结肠、膀胱、或卵巢细胞或尤因氏肉瘤细胞增殖性病症。在某些实施方案中，所述细胞增殖性病症与STEAP-1的表达和/或活性升高有关。例如，在某些实施方案中，所述***、肺、结肠、膀胱、或卵巢细胞或尤因氏肉瘤细胞增殖性病症与***、肺、结肠、膀胱、或卵巢细胞或尤因氏肉瘤细胞表面上的STEAP-1表达升高有关。在某些实施方案中，所述***、肺、结肠、膀胱、或卵巢细胞或尤因氏肉瘤细胞增殖性病症是肿瘤或癌症或此类癌症的转移。
一方面，本发明提供了治疗***、肺或结肠细胞增殖性病症的方法，包括给个体施用有效量的抗STEAP-1抗体或其免疫偶联物。在某些实施方案中，用于治疗***、肺或结肠细胞增殖性病症的方法包括给个体施用有效量的药物配制剂，其包含抗STEAP-1抗体或抗STEAP-1免疫偶联物和任选的至少一种别的治疗剂，诸如本文所提供的那些。
一方面，本发明的至少有些抗体或免疫偶联物能结合来自人以外物种的STEAP-1。因而，本发明的抗体或免疫偶联物可用于结合例如包含STEAP-1的细胞培养物中的、人中的、或具有本发明抗体或免疫偶联物与其交叉反应的STEAP-1的其它哺乳动物（例如黑猩猩、狒狒、狨、猕猴和恒河猴、犬、猪、大鼠、或小鼠）中的STEAP-1。在一个实施方案中，抗STEAP-1抗体或免疫偶联物可用于靶向***、肺或结肠细胞上的STEAP-1，其通过使所述抗体或免疫偶联物接触STEAP-1以形成抗体或免疫偶联物-抗原复合物使得免疫偶联物中所偶联的细胞毒素到达细胞内部来实现。在一个实施方案中，所述抗STEAP-1抗体所结合的STEAP-1是人STEAP-1。在一个实施方案中，所述抗STEAP-1抗体所结合的STEAP-1是猕猴STEAP-1。在一个实施方案中，所述人源化抗STEAP-1抗体结合人和/或猕猴STEAP-1。
在一个实施方案中，抗STEAP-1抗体或免疫偶联物可用于结合患有与STEAP-1表达和/或活性升高有关的病症的个体中的STEAP-1的方法，所述方法包括给个体施用抗体或免疫偶联物使得个体中的STEAP-1得到结合。在一个实施方案中，所结合的抗体或免疫偶联物内在化入表达STEAP-1的***、肺、结肠、膀胱、或卵巢细胞或尤因氏肉瘤细胞中。在一个实施方案中，所述STEAP-1是人STEAP-1，所述个体是人个体。或者，所述个体可以是表达抗STEAP-1抗体所结合的STEAP-1的哺乳动物。还有，所述个体可以是其中导入了STEAP-1的哺乳动物（例如通过施用STEAP-1或通过表达编码STEAP-1的转基因）。
可以出于治疗目的将抗STEAP-1抗体或免疫偶联物施用于人。此外，可以出于兽医目的或作为人类疾病的动物模型将抗STEAP-1抗体或免疫偶联物施用于表达抗体与其交叉反应的STEAP-1的非人哺乳动物（例如灵长类、犬、猪、大鼠、或小鼠）。关于后者，此类动物模型可用于评估本发明抗体或免疫偶联物的治疗功效（例如测试施用的剂量和时间进程）。
本发明的抗体或免疫偶联物可以在治疗中单独地或联合其它组合物地使用。例如，本发明的抗体或免疫偶联物可以与至少一种别的治疗剂和/或佐剂共施用。在某些实施方案中，别的治疗剂是细胞毒剂、化疗剂、或生长抑制剂。在这样一个实施方案中，化疗剂是诸如例如下列药剂或药剂组合，环磷酰胺、羟基柔红霉素、阿霉素、多柔比星(doxorubincin)、长春新碱(OncovinTM)、***龙、CHOP、CVP、或COP、或免疫治疗剂诸如抗PSCA(参见例如US6824780)、抗VEGF(例如Genentech,Inc.)、抗HER2(例如OmnitargTMGenentech,Inc.)、或抗HER2联合
Figure BDA00002807843501493
(参见例如BioWorld Today,1999年11月17日,第1页)，其中所述联合疗法可用于治疗***、肺和/或结肠的细胞增殖性病症、癌症、和/或癌症转移。
上文所述此类联合疗法涵盖联合施用（其中两种或更多治疗剂包含在同一配制剂中或分开的配制剂中）和分开施用，其中本发明抗体或免疫偶联物的施用可以在别的治疗剂和/或佐剂的施用之前、同时、和/或之后进行。本发明的抗体或免疫偶联物还可以与放疗联合使用。
本发明的抗体或免疫偶联物（及任何别的治疗剂或佐剂）可以通过任何合适的手段来施用，包括胃肠外、皮下、腹膜内、肺内、和鼻内，及损伤内施用（如果希望局部治疗的话）。胃肠外输注包括肌肉内、静脉内、动脉内、腹膜内、或皮下施用。另外，通过脉冲输注来施用抗体或免疫偶联物是合适的，特别是使用递减剂量的抗体或免疫偶联物。剂量给药可以通过任何合适的路径，例如通过注射，诸如静脉内或皮下注射，这部分取决于施用是短暂的还是长时间的。
可以与优良医学实践一致的方式配制、剂量给药和施用本发明的抗体或免疫偶联物。在此内容中考虑的因素包括所治疗的具体病症、所治疗的具体哺乳动物、患者个体的临床状况、病症的起因、投递药剂的部位、施药的方法、施药的日程安排、和医学从业人员知道的其它因素。不是必需而是任选将抗体或免疫偶联物与一种或多种目前用于预防或治疗所讨论病症的药剂一起配制。此类其它药剂的有效量取决于配制剂中存在的抗体或免疫偶联物的量、病症或治疗的类型、和上文讨论的其它因素。这些通常是以与本文所用相同的剂量和施用路径使用，或是本文所述剂量的大约1-99%，或是凭经验/在临床上确定为适宜的任何剂量和任何路径。
对于疾病的预防或治疗，本发明抗体或免疫偶联物的适宜剂量（在单独地或联合一种或多种其它别的治疗剂诸如化疗剂地使用时）会取决于待治疗疾病的类型、抗体或免疫偶联物的类型、疾病的严重程度和进程、施用抗体或免疫偶联物是出于预防还是治疗目的、先前的疗法、患者的临床史和对抗体或免疫偶联物的响应、及主治医师的判断。合适的是，一次性或通过一系列治疗将抗体或免疫偶联物施用于患者。根据疾病的类型和严重程度，施用于患者的初始候选剂量可以是约1μg/kg至100mg/kg（例如0.1mg/kg-20mg/kg）抗体或免疫偶联物，例如或是通过一次或多次分开施药或是通过连续输注。根据上文所述因素，典型日剂量的范围可以是约1μg/kg至100mg/kg或更多。对于持续数天或更长时间的重复施药，根据状况，通常持续治疗直至疾病症状发生期望的抑制。抗体或免疫偶联物的例示剂量的范围可以是约0.05mg/kg至约10mg/kg。如此，可以对患者施用一剂或多剂约0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg或10mg/kg（或其任意组合）的抗体或免疫偶联物。此类剂量可间歇施用，例如每周或每三周（例如使得患者接受约2剂至约20剂，或例如约6剂抗体或免疫偶联物）。可施用一剂较高的初始加载剂量，后续一剂或多剂较低剂量。例示性剂量给药方案包括施用一剂约4mg/kg抗体的初始加载剂量，后续每周一剂约2mg/kg抗体的维持剂量。然而，其它剂量方案也可能是有用的。这种疗法的进程易于通过常规技术和测定法来监测。
测定法
本发明的抗STEAP-1抗体和免疫偶联物可以通过本领域知道的各种测定法来表征其物理/化学特性和/或生物学活性。
活性测定法
一方面，提供了用于鉴定具有生物学活性的抗STEAP-1抗体或其免疫偶联物的方法。生物学活性可以包括例如抑制细胞生长或增殖的能力（例如“细胞杀伤”活性）、或诱导细胞死亡（包括程序性细胞死亡（凋亡））的能力。还提供了在体内和/或在体外具有此类生物学活性的抗体或免疫偶联物。
在某些实施方案中，测试抗STEAP-1抗体或其免疫偶联物在体外抑制细胞生长或增殖的能力。抑制细胞生长或增殖的测定法是本领域公知的。细胞增殖的某些测定法，以本文所述“细胞杀伤”测定法为例，测量细胞存活力(viability)。这样的一种测定法是CellTiter-GloTM发光细胞存活力测定法，其可购自Promega(Madison,WI)。该测定法基于存在的ATP（有代谢活性的细胞的一项指标）的量化来测定培养物中的可存活细胞数。参见Crouch等(1993)J.Immunol.Meth.160:81-88;美国专利No.6602677。该测定法可以以96孔或384孔形式进行，使之适应自动化高通量筛选(HTS)。参见Cree等(1995)AntiCancer Drugs6:398-404。该测定法规程涉及直接向培养细胞添加单一试剂（
Figure BDA00002807843501501
试剂）。这导致细胞溶解和通过萤光素酶反应产生的发光信号的生成。发光信号与存在的ATP的量成正比，后者直接与培养物中存在的可存活细胞数成正比。可以通过光度计或CCD照相机成像装置来记录数据。发光输出表述成相对光单位(RLU)。
细胞增殖的另一种测定法是“MTT”测定法，一种测量3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑氮溴化物被线粒体还原酶氧化成甲
Figure BDA00002807843501511
(formazan)的比色测定法。像CellTiter-GloTM测定法一样，此测定法指示细胞培养物中存在的有代谢活性的细胞的数目。参见例如Mosmann(1983)J.Immunol.Meth.65:55-63;及Zhang等(2005)Cancer Res.65:3877-3882。
一方面，测试抗STEAP-1抗体在体外诱导细胞死亡的能力。诱导细胞死亡的测定法是本领域公知的。在有些实施方案中，此类测定法测量例如膜完整性的丧失，其通过碘化丙啶(PI)、台盼蓝(参见Moore等(1995)Cytotechnology,17:1-11)、或7AAD的摄取来指示。在一种例示性PI摄取测定法中，将细胞在补充有10%热灭活FBS(Hyclone)和2mM L-谷氨酰胺的Dulbecco氏改良Eagle培养基(D-MEM):Ham氏F-12(50:50)中培养。如此，该测定法在缺乏补体和免疫效应细胞时进行。将细胞以3x106个/盘的密度接种入100x20mm盘，并容许附着过夜。除去培养基，并用单独的新鲜培养基或含有各种浓度抗体或免疫偶联物的培养基更换。将细胞温育3天时间段。处理后，将细胞单层用PBS清洗，并通过胰蛋白酶处理而脱离。然后将细胞于4°C以1200rpm离心5分钟，将沉淀物重悬于3ml冷的Ca2+结合缓冲液(10mMHepes,pH7.4,140mM NaCl,2.5mM CaCl2)，并等分入35mm盖有滤网(strainer-capped)的12x75mm管（1ml/管，3管/处理组）以除去细胞团块。然后向管中加入PI(10μg/ml)。使用FACSCANTM流式细胞仪和FACSCONVERTTMCellQuest软件(Becton Dickinson)分析样品。根据PI摄取的测定诱导统计学显著水平的细胞死亡的抗体或免疫偶联物如此得到鉴定。
一方面，测试抗STEAP-1抗体或免疫偶联物在体外诱导凋亡（程序性细胞死亡）的能力。诱导凋亡的抗体或免疫偶联物的一种例示性测定法是膜联蛋白结合测定法。在一种例示性的膜联蛋白结合测定法中，将细胞如上一段所述培养并接种入盘。除去培养基，并用单独的新鲜培养基或含有0.001-10μg/ml抗体或免疫偶联物的培养基更换。3天温育期后，将细胞单层用PBS清洗，并通过胰蛋白酶处理脱离。然后将细胞如上一段所述离心，重悬于Ca2+结合缓冲液，并等分入管。然后向管中加入经过标记的膜联蛋白（例如膜联蛋白V-FITC）(1μg/ml)。使用FACSCANTM流式细胞仪和FACSCONVERTTMCellQuest软件(BD Biosciences)分析样品。相对于对照诱导统计学显著水平的膜联蛋白结合的抗体或免疫偶联物如此得到鉴定。诱导凋亡的抗体或免疫偶联物的另一种例示性测定法是组蛋白DNA ELISA比色测定法，其用于检测基因组DNA的核小体间降解。此类测定法可使用例如细胞死亡检测ELISA试剂盒(Roche,Palo Alto,CA)来实施。
用于任何上述体外测定法的细胞包括天然表达STEAP-1或经改造而表达STEAP-1的细胞或细胞系。此类细胞包括相对于同一组织起源的正常细胞过表达STEAP-1的肿瘤细胞。此类细胞还包括表达STEAP-1的细胞系（包括肿瘤细胞系）和在正常情况下不表达STEAP-1但经编码STEAP-1的核酸转染的细胞系。
一方面，测试抗STEAP-1抗体或其免疫偶联物在体内抑制细胞生长或增殖的能力。在某些实施方案中，测试抗STEAP-1抗体或其免疫偶联物在体内抑制肿瘤生长的能力。体内模型***，诸如异种移植物模型，可用于此类测试。在一种例示性异种移植物***中，将人肿瘤细胞导入适当免疫受损的非人动物，例如SCID小鼠。将本发明的抗体或免疫偶联物施用于所述动物。测量抗体或免疫偶联物抑制或降低肿瘤生长的能力。在上述异种移植物***的某些实施方案中，所述人肿瘤细胞是来自人类患者的肿瘤细胞。可用于制备异种移植物模型的此类细胞包括人***、肺、或结肠肿瘤细胞系，其包括但不限于表达外源STEAP-1的PC3细胞，和天然表达STEAP-1的细胞，其包括但不限于LnCAP细胞(Southern Research Institute,Birmingham,AL)、LuCAP77细胞、和LuCAP35V细胞(University of Washington,Seattle,WA)。在某些实施方案中，通过皮下注射或通过移植入合适的位点（诸如***脂肪垫），将人肿瘤细胞导入适当免疫受损的非人动物。
结合测定法和其它测定法
一方面，对抗STEAP-1抗体测试其抗原结合活性。例如，在某些实施方案中，对抗STEAP-1抗体测试其结合在细胞表面上表达的外源或内源STEAP-1的能力。可以将FACS测定法用于此类测试。
一方面，可以使用竞争测定法来鉴定与120嫁接或其人源化变体，包括但不限于120v.24抗体竞争STEAP-1结合的单克隆抗体。在某些实施方案中，此类竞争性抗体与120嫁接抗体，或人源化120嫁接抗体，包括变体120v.24人源化抗STEAP-1抗体结合相同的表位（例如通过细胞表面上的STEAP1表达所形成的构象表位或线性表位肽）。例示性的竞争测定法包括但不限于常规测定法，诸如Harlow和Lane(1988)Antibodies:A Laboratory Manual,14章(Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY)中所提供的那些。抗体所结合表位的作图的详细例示性方法见Morris(1996)“Epitope MappingProtocols,”于Methods in Molecular Biology卷66(Humana Press,Totowa,NJ)。若两种抗体各自阻断彼此50%或更多的结合，则说这两种抗体结合相同表位。
在一种例示性的竞争测定法中，将固定化的STEAP-1在包含结合STEAP-1的第一经标记抗体（例如鼠120.545抗体、120嫁接抗体、或人源化120v.24抗体）和要测试其与第一抗体竞争STEAP-1结合的第二未标记抗体的溶液中温育。所述第二抗体可以存在于杂交瘤上清液中。作为对照，将固定化的STEAP-1在包含第一经标记抗体但没有第二未标记抗体的溶液中温育。在容许第一抗体结合STEAP-1的条件下温育后，除去过量的未结合抗体，并测量与固定化的STEAP-1结合的标记物的量。如果测试样品中与固定化STEAP-1结合的标记物的量相对于对照样品有实质性降低，那么这指示所述第二抗体与所述第一抗体竞争STEAP-1结合。在某些实施方案中，固定化的STEAP-1存在于细胞表面上或得自在其表面上表达STEAP-1的细胞的膜制备物中。
一方面，纯化的抗STEAP-1抗体可以通过一系列测定法进一步表征，包括但不限于N-末端测序、氨基酸分析、非变性大小排阻高压液相层析(HPLC)、质谱、离子交换层析、和木瓜蛋白酶消化。
在一个实施方案中，本发明涵盖改良的抗体，其具有一些但非所有效应器功能，这使之成为如下许多应用的期望候选物，其中抗体的体内半衰期是重要的，但某些效应器功能（诸如补体和ADCC）不是必需的或有害的。在某些实施方案中，测量抗体的Fc活性以确保只保留了期望的特性。可进行体外和/或体内细胞毒性测定法来证实CDC和/或ADCC活性的降低/消除。例如，可以进行Fc受体(FcR)结合测定法来确认抗体缺乏FcγR结合（从此有可能缺乏ADCC活性），但保留FcRn结合能力。介导ADCC的主要细胞，NK细胞，只表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-92(1991)第464页表3总结了造血细胞上的FcR表达。美国专利No.5,500,362或5,821,337中记载了评估感兴趣分子的ADCC活性的体外测定法的例子。可用于此类测定法的效应细胞包括外周血单个核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。或者/另外，可以在体内评估感兴趣分子的ADCC活性，例如在动物模型中，诸如Clynes等PNAS(USA)95:652-656(1998)中所披露的。还可以进行C1q结合测定法来证实抗体不能结合C1q及从此缺乏CDC活性。为了评估补体激活，可进行CDC测定法，例如如Gazzano-Santoro等,J.Immunol.Methods202:163(1996)中所记载的。还可以使用本领域知道的方法进行FcRn结合和体内清除/半衰期测定。
实施例
下文是本发明方法和组合物的实施例。应当理解，根据上文提供的全面描述，可以实施各种其它的实施方案。
实施例1：人源化抗STEAP-1抗体的制备
通过本领域已知的多种方法制备编码抗体、抗体片段、VL结构域或VH结构域的氨基酸序列变体的核酸分子。这些方法包括但不限于从天然来源(在天然存在的氨基酸序列变体的情况中)分离或通过对早期制备的变体或非变体型式的抗体、抗体片段、VL结构域或VH结构域进行寡核苷酸介导的诱变（或定点诱变）、PCR诱变和盒式诱变来制备。例如，可以使用Kunkel的方法通过寻找(targeting)VH中和任选的一个或多个CDR中VL可及氨基酸位置并用变体氨基酸进行氨基酸替代来创建文库。参见例如Kunkel等,MethodsEnzymol.(1987),154:367-382和本文中的实施例。下文实施例中还描述了随机化序列的产生。
寡核苷酸的序列对于本发明多肽的CDR(HVR)或FR区中的特定位置包括一种或多种设计的密码子集合(codon set)。密码子集合是用于编码期望变体氨基酸的一套不同的核苷酸三联体序列。依照IUB代码，可使用符号来代表密码子集合以指明特定核苷酸或核苷酸等摩尔混合物，正如下文所示。
IUB代码
G   鸟嘌呤
A   腺嘌呤
T   胸腺嘧啶
C   胞嘧啶
R   (A或G)
Y   (C或T)
M   (A或C)
K   (G或T)
S   (C或G)
W   (A或T)
H   (A或C或T)
B   (C或G或T)
V   (A或C或G)
D   (A或G或T)
N   (A或C或G或T)
例如，在密码子集合DVK中，D可以是核苷酸A或G或T；V可以是A或G或C；而K可以是G或T。该密码子集合能表示18种不同的密码子，且能编码氨基酸Ala、Trp、Tyr、Lys、Thr、Asn、Lys、Ser、Arg、Asp、Glu、Gly和Cys。
可以使用标准方法来合成寡核苷酸或引物集合。可以合成（例如通过固相合成）含如下序列的一套寡核苷酸，所述序列代表由该密码子集合所提供的核苷酸三联体的所有可能组合，且其会编码期望的一组氨基酸。在某些位置处具有选定核苷酸“简并性”的寡核苷酸的合成是该领域中公知的。具有某些密码子集合的此类核苷酸集合可以使用商品化的核酸合成仪(可购自例如Applied Biosystems,Foster City,CA)合成，或者可以商购(例如购自LifeTechnologies,Rockville,MD)。因此，具有特定密码子集合的一套合成寡核苷酸会典型地包括具有不同序列的多种寡核苷酸，其差异由全序列内的密码子集合来确立。在依照本发明使用时，寡核苷酸具有容许杂交至可变域核酸模板的序列，且还可以包括用于克隆目的的限制酶位点。
在一种方法中，可通过寡核苷酸介导的诱变产生编码变体氨基酸的核酸序列。该技术是本领域公知的，如Zoller等,1987,Nucleic Acids Res.10:6487-6504所记载。简言之，通过将编码期望密码子集合的寡核苷酸集合杂交至DNA模板来产生编码变体氨基酸的核酸序列，其中该模板是含有可变区核酸模板序列的单链形式质粒。杂交后，使用DNA聚合酶合成该模板的整个第二条互补链，因而其会掺入寡核苷酸引物，并会含有寡核苷酸集合所提供的密码子集合。
一般地，使用长度至少为25个核苷酸的寡核苷酸。最佳的寡核苷酸会具有12至15个核苷酸，其与编码一个或多个突变的一个或多个核苷酸的任一侧上的模板完全互补。这确保该寡核苷酸会正确杂交至单链DNA模板分子。使用本领域已知的技术，诸如Crea等,Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA,75:5765(1978)所记载的，轻易地合成该寡核苷酸。
通过载体产生DNA模板，所述载体或是那些衍生自噬菌体M13载体的(商品化的M13mp18和M13mp19载体是适合的)，或是那些含有单链噬菌体复制起点的，如Viera等,Meth.Enzymol.,153:3(1987)所述。如此，可将待突变的DNA***这些载体之一以产生单链模板。单链模板的生成记载于Sambrook等(见上文)第4.21-4.41节。
为了改变天然DNA序列，将寡核苷酸在合适的杂交条件下杂交至单链模板。然后添加DNA聚合酶（通常是T7DNA聚合酶或DNA聚合酶I的Klenow片段）以合成该模板的互补链，其中使用该寡核苷酸作为用于合成的引物。如此，形成异源双链体分子，使得DNA的一条链编码基因1的突变形式，而另一条链（原始模板）编码基因1的天然的、未改变的序列。然后将该异源双链体分子转化入合适的宿主细胞，通常是原核细胞，诸如大肠杆菌JM101。在培养该细胞后，将它们涂布在琼脂糖平板上，并使用经32-磷酸盐放射性标记的寡核苷酸引物来筛选以鉴定含突变型DNA的细菌菌落。
可以修改上文刚刚描述的方法，使得产生同源双链体分子，其中质粒的两条链都含有一个或多个突变。所述修改如下：将单链寡核苷酸退火至上文所述单链模板。将三种脱氧核糖核苷酸即脱氧核糖腺苷酸(deoxyriboadenosine)(dATP)、脱氧核糖鸟苷酸(deoxyriboguanosine)(dGTP)和脱氧核糖胸苷酸(deoxyribothymidine)(dTT)的混合物与称为dCTP-(aS)的经修饰硫醇脱氧核糖胞苷酸(thiodeoxyribocytosine)（其可获自Amersham）混合。将该混合物添加至模板-寡核苷酸复合物。在将DNA聚合酶添加至该混合物后，产生除突变碱基之外与模板同样的DNA链。另外，该DNA新链会含有替代dCTP的dCTP-(aS)，其发挥保护该DNA新链免受限制性内切核酸酶消化的作用。在用合适的限制酶使双链异源双链体的模板链产生缺刻后，可以用ExoIII核酸酶或另一种合适的核酸酶消化该模板链，途经含有待诱变位点的区域。然后停止该反应以使分子仅是部分为单链。然后在存在所有四种脱氧核糖核苷酸三磷酸、ATP和DNA连接酶时，使用DNA聚合酶来形成完整的双链DNA同源双链体。然后可以将该同源双链体分子转化入合适的宿主细胞。
如之前所指出，寡核苷酸集合的序列长度对于杂交至模板核酸是足够的，而且可以但不是必需含有限制性位点。可以通过载体产生DNA模板，所述载体或是那些衍生自噬菌体M13载体的，或是含有单链噬菌体复制起点的，如Viera等(1987)Meth.Enzymol.,153:3所述。如此，必须将待突变的DNA***这些载体之一以产生单链模板。单链模板的产生记载于Sambrook等（见上文）第4.21-4.41节。
依照另一种方法，可以如下产生文库，即提供上游和下游寡核苷酸集合，每个集合具有众多寡核苷酸，其具有不同的序列，所述不同序列由寡核苷酸序列内提供的密码子集合所确立。可以在聚合酶链式反应中使用上游和下游寡核苷酸集合，以及可变域模板核酸序列以产生PCR产物“文库”。该PCR产物可以称为“核酸盒”，因为它们可以与其它有关的或无关的核酸序列（例如病毒外壳蛋白和二聚化结构域）融合，其使用已确立的分子生物学技术。
可以在使用可变域核酸模板序列作为模板的聚合酶链式反应中使用寡核苷酸集合以产生核酸盒。该可变域核酸模板序列可以是含有靶核酸序列（即编码有待替代的氨基酸的核酸序列）的免疫球蛋白重链任何部分。该可变区核酸模板序列是具有第一条核酸链和互补的第二条核酸链的双链DNA分子的一部分。该可变域核酸模板序列含有可变域的至少一部分，并具有至少一个CDR。在有些情况中，该可变域核酸模板序列含有超过一个CDR。上游寡核苷酸集合和下游寡核苷酸集合的成员的杂交可以以可变域核酸模板序列的上游部分和下游部分为靶物。
上游引物集合的第一个寡核苷酸可以杂交至第一条核酸链，而下游引物集合的第二个寡核苷酸可以杂交至第二条核酸链。寡核苷酸引物可包括一个或多个密码子集合，并设计成杂交至可变区核酸模板序列的一部分。在PCR之后，这些寡核苷酸的使用可以将两个或更多个密码子集合引入PCR产物（即核酸盒）。杂交至核酸序列中编码抗体可变域的区域的寡核苷酸引物包括编码CDR残基（其作为氨基酸替代的靶物）的部分。
还可以合成上游和下游寡核苷酸集合以包括寡核苷酸序列内的限制性位点。这些限制性位点可以便于核酸盒（即PCR反应产物）***具有别的抗体序列的表达载体。在一个实施方案中，将限制性位点设计成便于核酸盒的克隆而不导入额外核酸序列或消除最初的CDR或框架核酸序列。
可以将核酸盒克隆入任何适于表达部分或完整的轻链或重链序列的载体，所述序列含有经PCR反应产生的目标氨基酸替代。依照本发明中详述的方法，将该核酸盒克隆入容许生成与整个或部分病毒外壳蛋白融合的部分或完整轻链或重链序列（即产生融合蛋白）的载体并展示在颗粒或细胞的表面上。虽然数种类型的载体是可获得的，并可用于实施本发明，但噬菌粒载体是用于此处的优选载体，因为它们可以相对容易地构建，而且可以轻易地扩增。一般地，噬菌粒载体含有多种构件，包括启动子、信号序列、表型选择基因、复制起点、和本领域普通技术人员知道的其它必需构件。
在要表达特定变体氨基酸组合时，核酸盒含有能够编码整个或部分重链或轻链可变域且能够编码变体氨基酸组合的序列。为了生成含有这些变体氨基酸或变体氨基酸组合的抗体，像在文库中，可以将核酸盒***含有别的抗体序列（例如轻链和重链可变区的整个或部分可变域或恒定域）的表达载体。还可以将这些别的抗体序列与其它核酸序列（诸如编码病毒外壳蛋白的序列）融合，并因此容许生成融合蛋白。
小鼠抗人STEAP-1抗体的人源化描述于此。
材料和方法
残基编号依照Kabat(Kabat等,Sequences of proteins of immunologicalinterest,第5版,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991))。使用了单字母氨基酸缩写。DNA简并性使用IUB代码表示（N=A/C/G/T,D=A/G/T,V=A/C/G,B=C/G/T,H=A/C/T,K=G/T,M=A/C,R=A/G,S=G/C,W=A/T,Y=C/T）。
鼠120可变域的克隆和嵌合120抗体的产生－使用标准方法自生成M2-120.545（在此命名为“鼠120”或“mu120”）的杂交瘤细胞提取总RNA。用针对重链和轻链的简并引物使用RT-PCR扩增轻链(VL)和重链(VH)可变域。正向引物特异于VL和VH区的N末端氨基酸序列。LC和HC反向引物分别设计成与轻链恒定域(CL)和重链第一恒定域(CH1)退火，它们在物种间是高度保守的。将扩增的VL和VH克隆入哺乳动物表达载体。使用常规测序方法测定***物的多核苷酸序列。M2-120.545（“mu120”）VL和VH氨基酸序列分别显示于图2A和2B。
鼠120嵌合体的产生－通过将鼠120重链（VH）和轻链（VL）可变区与人IgG的恒定域融合来制备嵌合抗STEAP-1抗体。所得抗体在此命名为“120嵌合体”、“嵌合体120”、“嵌合120IgG”或“Fc嵌合体”。
直接高变区嫁接到受体人共有框架上－从作为IgG形式的蛋白质或者作为展示于噬菌体上的Fab两方面评估在鼠120人源化期间构建的变体。
用于此项工作的噬菌粒是单价Fab-g3展示载体并且包含在phoA启动子控制下的两个可读框。第一个可读框包含与受体轻链VL和CH1结构域融合的stII信号序列，第二个包含与受体重链VH和CH1结构域融合的stII信号序列，随后是噬菌体的次要外壳蛋白P3。
将来自鼠120的VL和VH结构域与人VLκI（huKI）和人VH亚组III（huIII）共有序列进行比对。为了制备CDR嫁接体，将来自鼠120抗体的高变区嫁接入huKI和huIII受体框架。
将来自鼠120抗体（mu120）的高变区改造入受体人共有框架以产生直接CDR嫁接体（在此命名为“120嫁接体”、“120移植体”或“嫁接120”、“移植120”）。在VL结构域中，以下区域被嫁接入人共有受体：第24-34位(L1)、第50-56位(L2)和第89-97位(L3)。在VH结构域中，嫁接了第26-35a位(H1)、第49-65位(H2)和第95-102位(H3)。所述120嫁接体的轻链和重链可变区序列如图2A-2B所示。CDR（在此又称为HVR）以方框显示（图2A-2B）。这些CDR的定义包括由它们的序列高变性(Kabat ref)、它们的结构位置(Chothia ref)以及它们在抗原-抗体接触中的参与(MacCallum等J.Mol.Biol.262:732-745(1996))所限定的位置。
通过Kunkel诱变使用针对每个高变区的不同寡核苷酸产生作为展示于噬菌体上的Fab或作为IgG表达的直接嫁接体变体。通过DNA测序评估正确的克隆。
人源化120噬菌体变体的产生－通过Kunkle诱变产生作为展示于噬菌体上的Fab的人源化120变体。将磷酸化寡核苷酸添加至在50mM Tris pH7.5,10mM MgCl2中的300ng Kunkel模板，终体积10μl。将混合物90℃2分钟、50℃5分钟退火，然后冰上冷却。然后将退火后的模板通过添加0.5μl10mM ATP,0.5μl10mM dNTP(dATP,dCTP,dGTP和dTTP各10mM),1μl100mM DTT,1μl10X TM缓冲液(0.5M Tris pH7.5,0.1M MgCl2),80U T4连接酶和4U T7聚合酶至总体积20μl在室温填平2小时。然后将填平并连接的产物转化入XL1-蓝色细胞(Stratagene)。通过DNA测序鉴定正确的克隆。
将正确的噬菌体克隆在25ml含50μg/ml羧苄青霉素(carbenacillin)和M13/KO7辅助噬菌体(MOI10)的2YT中37℃培养过夜。
人源化120变体的评估－通过FACS分析使用Steap1阳性(293Steap1NTLB50)和阴性(293载体S408)细胞系评估作为IgG表达的人源化变体。
还通过FACS分析评估表达成展示于噬菌体上的Fab的人源化变体。首先使用用于检测与Fab轻链融合的flag标签的噬菌体ELISA对表达Fab变体的噬菌体评估其Fab展示水平。用10μg/ml溶于PBS的抗gD1766将MaxiSorp微量滴定板包被过夜，然后用酪蛋白封闭剂封闭。在组织培养微量滴定板中将来自培养基上清液的噬菌体在含0.5%BSA的PBST中连续稀释，然后转移至包被孔中1小时以捕捉展示Fab的噬菌体。用PBST漂洗板，然后添加偶联有HRP的抗M13(Amersham Pharmacia Biotech)（在含0.5%BSA的PBST中1:5000稀释）40分钟。将板用PBST漂洗并通过添加四甲基联苯胺底物(Kirkegaard andPerry Laboratories,Gaithersburg,MD)显色。使用405nm吸光值来估算噬菌体表面上的Fab展示水平。通过稀释对噬菌体制备物关于展示进行标准化。低展示的噬菌体（例如嵌合体）使用原液进行FACS分析。
为了进行噬菌体结合的FACS分析，使用2mM EDTA自板中取出细胞，收集于15mL锥形底管中，并离心沉淀。将细胞（每份样品5x105个细胞）重悬于FACS缓冲液(1%FBS,含2mM EDTA的PBS)中的100mL噬菌体（根据展示水平进行标准化）中并在冰上温育1-2小时。用FACS缓冲液通过离心漂洗样品两次。添加2μg/mL抗M135G7对照抗体(Genentech,Inc.South SanFrancisco,CA)并在冰上温育至少45分钟。用FACS缓冲液离心漂洗样品两次。添加1:200稀释的抗小鼠PE（R-藻红蛋白山羊抗小鼠IgG Fcy片段，JacksonImmunoresearch）并在冰上温育30分钟。样品再次用FACS缓冲液离心漂洗两遍，并通过FACS进行分析。
为了通过FACS分析IgG，与噬菌体FACS中一样地制备细胞。添加5μg/mL每种IgG并在冰上温育1小时。用FACS缓冲液离心漂洗样品两次，并添加1:200稀释的抗人PE偶联物（R-藻红蛋白山羊抗人IgG Fcy片段，JacksonImmunoresearch）30分钟。样品再次用FACS缓冲液离心漂洗两遍，并通过FACS进行分析。
IgG生成和亲和力测定－用蛋白G亲和层析纯化IgG。通过Scatchard分析用293STEAP-1NT LB50细胞实施亲和力测定。
结果和讨论
鼠120可变域序列和CDR指派嫁接体设计－用于M2-120.545人源化的人受体框架是以共有人κI VL结构域和人亚组III共有VH结构域为基础的。将鼠M2-120.545的VL和VH结构域各自与人κI和亚组III结构域比对；鉴定每个互补区(CDR)并嫁接入人受体框架以产生能作为Fab展示于噬菌体上的和表达为IgG的CDR嫁接体。人源化抗STEAP-1抗体型式24可变区的序列如图2A和2B所示。通过FACS分析对展示于噬菌体上的120嫁接体和120嫁接体IgG测试与表达外源STEAP-1的细胞(293STEAP-1NT LB50)的结合。尽管120嫁接体IgG特异性结合表达STEAP-1的细胞，但是对120嫁接体IgG所观察到的FACS信号小于对嵌合120IgG所观察到的，指示结合亲和力的损失。展示120嫁接体Fab的噬菌体也产生了只在表达STEAP-1的细胞上观察到的FACS信号。此改变(shift)小于对嵌合120IgG所观察到的。120嫁接体IgG的Scatchard分析也指示了结合亲和力的显著（大约50倍）损失（120v.78的KD=36nM；120嫁接体的KD=260nM）。
M2-120.545的人源化－已经鉴定了影响CDR构象和VL:VH结构域包装的大约30个微调(vernier)位置，并且在人源化抗体时应考虑供体和人框架之间这些位置的变化(Foote,J.和Winter,G.,J.Mol.Biol.224(2):487-499(1992))。鼠M2-120.545与共有人κI VL结构域和人亚组III共有VH结构域的比对评估揭示了VH结构域中6个关键微调位置的序列差异：第24、37、48、67、73、78位（参见图2B）。为了评估这些位置的影响，将鼠残基个别引入噬菌体上Fab的人共有亚组III VH结构域中。这涉及对展示于噬菌体上的120嫁接体Fab分别制造以下突变：A24V(120.v24),V37I(120.v37),V48M(120.v48),F67I(120.v67),和L78F(120.v78)。N73T未测试。将每种噬菌体变体通过稀释至等同的Fab展示水平进行标准化，所述Fab展示水平是通过与展示于噬菌体上的轻链融合的表位标签的滴定来测定的，然后通过FACS分析使用表达STEAP-1的细胞(293STEAP-1NT LB50)和不表达细胞(293载体S408)评估与STEAP-1的结合。术语“2°”指FACS分析中的二抗。术语“α-120”指鼠120抗STEAP-1抗体。术语“α-10H1”指对照抗体。术语“24噬菌体”、“37噬菌体”等等指本文中公开的在噬菌体上展示的人源化抗STEAP-1变体。“Ch120噬菌体”指展示于噬菌体上的120嵌合体，而“120.嫁接体噬菌体”指展示在噬菌体上的120嫁接体（图6）。根据其Fab展示水平对噬菌体克隆进行标准化的重要性通过在不同噬菌体滴度进行的120嫁接体FACS分析加以说明：图6中的7x1012个噬菌体/ml和图6中的2x1011个噬菌体/ml。一旦稀释至较低的噬菌体浓度，120嫁接体噬菌体不再产生可观察到的FACS改变。因此不同噬菌体克隆针对其展示水平进行的标准化对于评估它们对Steap1的亲和力差异而言是一个重要步骤。
在针对Fab展示水平进行标准化后，包含额外突变A24V(120.v24)的120嫁接体变体产生了优于其它变体的FACS改变（图6）。当表达成IgG时，在所有测试浓度，120.v24均产生与嵌合120抗体相似的FACS改变。随后对120.v24进行的Scatchard分析指示对293STEAP-1NT LB50细胞结合的Kd是2.2nM，比120嵌合体和最初的鼠M2-120.545提高了两倍（表2）。
表2：抗STEAP-1抗体对细胞表面STEAP-1的结合亲和力(Kd(nM))
还使用FACS分析测试了抗STEAP-1裸抗体、鼠120和嵌合体120的结合活性。对293稳定STEAP-1NT LB50、PC3稳定STEAP-1PS5.4细胞中的外源STEAP-1和LNCaP细胞中的内源STEAP-1比较了结合。结果也如图7D-7F所示。通过用人STEAP-1DNA稳定转化293细胞(ATCC CRL-1573)制备在细胞表面上表达外源人STEAP-1的NT LB50细胞。通过用人STEAP-1DNA稳定转化PC3(ATCC CLL-1435)制备在细胞表面上表达外源人STEAP-1的PS5.4细胞。LNCaP细胞(ATCC CRL-1740)内源表达STEAP-1。
实施例2：抗STEAP-1抗体的表征
依照标准方法，表征抗STEAP-1抗体（本文中公开的裸抗体和抗体药物偶联物）。
基于ELISA的测定法：如下实施通过ELISA进行的抗STEAP-1抗体筛选，所有温育在室温进行。将测试板(Nunc Immunoplate)用50nM碳酸钠缓冲液(pH9.6)中纯化后的STEAP-1包被2小时，然后用磷酸盐缓冲盐水(PBS)中0.5%牛血清清蛋白封闭30分钟，然后用含0.05%Tween20的PBS(PBST)清洗4次。添加测试抗体上清液，并以摇动方式温育2小时，然后用PBST清洗4次。通过添加100μl/孔溶液（在25ml磷酸盐柠檬酸盐缓冲液(pH5.0)中含有10mg二盐酸邻苯二胺(Sigma,#P8287)和10μl30%过氧化氢溶液）并温育15分钟来对板显色。通过添加100μl/孔2.5M硫酸停止该反应。通过用自动化ELISA读板仪在490nm吸光度读板来获得数据。
通过Scatchard分析进行的抗STEAP-1结合的表征：
单克隆抗体的结合亲和力可以例如使用相关领域公知的标准技术通过Munson等,Anal.Biochem.,107:220(1980)中记载的Scatchard分析来测定。还可参见Scatchard,G.,Ann.N.Y.Acad.Sci.51:660(1947)。
实施例3：抗STEAP-1抗体-药物偶联物的生成
抗STEAP-1auristatin ADC的生成－如下生成抗STEAP-1ADC，即将抗STEAP-1抗体鼠120.545、120嵌合体、120嫁接体、和人源化120框架变体与下列药物-接头模块偶联：spp-DM1、smcc-DM1、MC-vc-PAB-MMAE、MC-vc-PAB-MMAF、MC-MMAE、MC-MMAF、vc-MMAE、和vc-MMAF，这些药物和接头模块及附着方法披露于本文以及2004年2月5日公布的WO2004/010957；2005年9月9日公布的WO2006/034488；及Doronina,S.O.等,Nature Biotechnol.21:778-784(2003)（将每一篇参考文献都完整收入本文作为参考）。在偶联前，使用依照WO2004/010957中记载的方法学的标准方法，用TCEP部分地还原抗体。使用依照在Doronina等(2003)Nat.Biotechnol.21:778-784和US2005/0238649A1中记载的方法学的标准方法，将部分还原的抗体与上述药物-接头模块偶联。简言之，将部分还原的抗体与药物接头模块组合以容许该模块与半胱氨酸残基偶联。淬灭该偶联反应，并纯化ADC。通过HPLC测定每种ADC的药物载荷（每个抗体的药物模块平均数）。在用于本文时，ADC的接头-药物组分“-MC-vc-PAB-MMAE”或“-MC-vc-PAB-MMAF”有时缩写为“-vcMMAE”或“-vcMMAF”，而组分“-MC-MMAF”有时缩写为“MCMMAF”或“mcMMAF”。
抗STEAP-1美登木素生物碱ADC的生成－通过将抗STEAP-1抗体鼠120、120嵌合体、120嫁接体和人源化120框架变体与接头药物模块-smcc-DM1偶联来生成抗STEAP-1ADC。此类偶联可依照WO2005/037992中披露的用于
Figure BDA00002807843501641
抗HER2抗体偶联的方法进行。
实施例4：体内肿瘤体积缩小测定
为了在体内和在体外缩小肿瘤体积的能力方面测试偶联或未偶联毒素的抗STEAP-1单克隆抗体的效力，采用了如下方案。
哺乳动物细胞系和人肿瘤异种移植物：293是人永生化胚胎肾细胞系(ATCC编号CRL1573)，PC-3是人***腺癌细胞系(human prostateadenocarcinoma cell line)(ATCC编号CRL1435)，而LNCaP是***癌细胞系(human prostate carcinoma cell line)(ATCC CRL1740)。所有细胞均在补充有10%胎牛血清(FBS)、2mM谷氨酰胺、1%青霉素-链霉素的50/50的Dulbecco改良Eagle高葡萄糖培养基:Ham氏F12中37℃5%CO2培养。293和PC-3稳定细胞系是通过用编码全长STEAP1（分别是LB50和PS5.4）或空载体的巨细胞病毒驱动载体转染(Fugene,Roche)产生的，并在400μg/ml G418(Geneticin,Life Technologies)中选择。人***外植体模型LuCAP77和LuCAP35V自西雅图大学获得。
细胞表面上外源和内源STEAP-1的表达如下通过免疫组化(IHC)和FACS分析证实。针对STEAP-1的胞内氨基末端肽(参阅Hubert,R.S.,Vivanco,I.等,PNAS25:14523-14528(1999))生成绵羊和小鼠抗STEAP-1抗体(Agensys,Inc.,Santa Monica,CA)。通过用瞬时转染了STEAP-1的293T细胞免疫小鼠产生针对STEAP-1胞外结构域的单克隆抗体(Agensys,Inc.)。为了IHC分析，用绵羊抗STEAP-1一抗进行检测。为了FACS分析，将细胞培养至90%汇合并用PBS中的2mM EDTA自板中取出细胞。将细胞用FACS缓冲液（含1%BSA的PBS）清洗并重悬，并与抗STEAP-1抗体一起在室温温育60分钟，随后与偶联有藻红蛋白的适当二抗一起温育60分钟。在FACSscan(BD Biosciences)上实施分析。为了免疫荧光，将细胞在腔式载玻片上培养过夜，然后与一抗一起在37°C温育60分钟。将细胞在低聚甲醛中固定，在1%BSA中封闭，并与偶联有荧光素的适当二抗一起温育。
使用体内***癌异种移植物模型来测试抗STEAP-1ADC的效力。这些模型包括人细胞系LNCaP(ATCC CRL-1740或Southern Research Institute,Birmingham,AL)。***外植体模型包括LuCaP77和LuCaP35V(Universityof Washington,Seattle,WA)。每种***外植体模型通过在来自Charles River实验室的去势（不受雄激素控制的模型，LuCAP35V）或未去势（受雄激素控制的模型，LuCAP77）的雄性SCID米色小鼠中的连续移植来维持。未去势小鼠在植入前接受睾酮丸剂，而至少在肿瘤植入的两周前进行去势以使睾酮水平达到最低。当供体小鼠的肿瘤达到800-1000mm3之间时，将肿瘤组织无菌切下并分割成适于研究动物的小的可移植大小碎块（大约20mm3）。将肿瘤放入移植位点的口袋中，然后用伤口钳使皮肤闭合。对于LNCaP细胞系模型，将体外培养的LNCaP细胞在50%Matrigel中以8-10x106个细胞/小鼠皮下注射入已接受睾酮丸剂的雄性SCID米色小鼠。当肿瘤大小均值达到100-200mm3时，将动物随机分成10个组，每组10只小鼠，并给予单次IV施用测试抗体ADC或对照抗体（裸抗体或对照）。在有些实验中，施用多剂测试或对照抗体（见图8A、9和10）。在有些实验中，施用单剂测试和对照抗体，如图8B和11所示。在***外植体模型是LuCap77的情况中，在移植外源肿瘤的大约3-7天前将睾酮丸剂植入小鼠中。持续4周每周测量肿瘤两次，然后在余下的研究阶段每周一次或两次或者在整个研究过程中每周一次。在测试动物中肿瘤体积随时间显著缩小被认为是一项效力指标。在有些案例中，肿瘤体积从最初的体积显著减小，并在整个研究过程中保持低水平。结果作图表示于图8-11中。
抗STEAP-1auristatin药物偶联物在体内缩小***肿瘤体积
在***肿瘤（LNCaP-Ner细胞）异种移植物模型中施用3mg/kg鼠抗STEAP-1120-MC-vc-PAB-MMAE是有效的。使用PBS和抗gp120-MC-vc-PAB-MMAE(3mg/kg)作为对照。在第0、7和14天施药。参阅图8A。
对移植有LNCap-Ner肿瘤的SCID米色小鼠（如本文所述经睾酮丸剂处理）施用人源化抗STEAP-1抗体120v.24-MC-vc-PAB-MMAE(3mg/kg)、120v.24-MC-MMAF(6mg/kg)、120v.24-MC-MMAF(12mg/kg)和抗STEAP-1120嵌合体-MC-vc-PAB-MMAE(3mg/kg)显示出是有效的。使用媒介、抗豚草-MC-vc-PAB-MMAE(3mg/kg)和抗豚草-MC-MMAF(12mg/kg)作为对照。在图8所指出的日子施药。结果作图于图8B。
在移植有LNCaP细胞的SCID米色小鼠的***癌异种移植物模型中施用抗STEAP-1抗体120嵌合体-MC-vc-PAB-MMAE(3mg/kg)和抗STEAP-1120嵌合体-MC-MMAF(6mg/kg)显示出是有效的。大约在第15、25和30天给小鼠施用3剂3mg/kg(抗STEAP-vcMMAE)或6mg/kg(抗STEAP-mcMMAF)。使用对照抗豚草-MC-vc-PAB-MMAE(3mg/kg)和抗豚草-MC-MMAF(6mg/kg)。参见图9。
在移植有LuCap77细胞的SCID米色雄性小鼠（受雄激素控制的）的***癌异种移植物模型中施用人源化抗STEAP-1抗体120嵌合体-MC-vc-PAB-MMAE(3mg/kg)显示出是有效的。对照是媒介和抗豚草-MC-vc-PAB-MMAE。施用3剂3mg/kg测试和对照抗体。参见图10。
对移植有LuCap35V***肿瘤的去势SCID米色小鼠施用3mg/kg人源化抗STEAP-1抗体120v.24-MC-vc-PAB-MMAE、6mg/kg和12mg/kg抗STEAP-1抗体120v.24-MC-MMAF显示出相对于对照而言是有效的。药物载荷是每个抗体3.1。对照抗体是以12mg/kg施用的抗豚草-MC-MMAF和以6mg/kg施用的抗gp120-MC-vc-PAB-MMAE。参见图11。
抗STEAP-1auristatin药物偶联物在体外缩小***肿瘤体积
实施了体外细胞杀伤测定法以评估抗STEAP-1药物偶联物抑制表达STEAP-1的细胞生长和/或杀死它们的效力。简言之，将表达STEAP-1的细胞以大约2,000个细胞/孔的密度涂布于96孔板中，并在24小时后用抗体药物偶联物一式两份处理。将板在37°C温育5-7天，并用
Figure BDA00002807843501661
发光细胞存活力测定试剂盒(Promega,Madison,WI,USA)进行显色。测试细胞包括PS5.4（表达外源STEAP-1的PC3细胞）、LB50（表达外源STEAP-1的293细胞）、只用载体转染的PC3细胞、只用载体转染的293细胞、和表达内源STEAP-1的LNCaP细胞。测试抗体药物偶联物包括对照抗体-MC-MMAF、对照抗体-vc-MMAE、抗STEAP-1抗体120嵌合体-vc-MMAE、抗STEAP-1抗体120嵌合体-MC-MMAF（两个不同批次的材料）和抗STEAP-1抗体嵌合体-vc-MMAF。结果如图14A-14E所示。
实施例5：制备半胱氨酸改造抗STEAP-1抗体，用于通过还原和再氧化进行的偶联
将CHO细胞中所表达的全长的、半胱氨酸改造的抗STEAP-1单克隆抗体(ThioMab)溶解于约pH8.0的500mM硼酸钠和500mM氯化钠，并用约50-100倍过量的1mM TCEP（盐酸三(2-羧乙基)膦；Getz等(1999)Anal.Biochem.273:73-80;Soltec Ventures,Beverly,MA）在37°C还原大约1-2小时。将还原后的ThioMab稀释并加载到10mM乙酸钠pH5中的HiTrap S柱上，并用含0.3M氯化钠的PBS洗脱。将洗脱的还原后ThioMab用2mM脱氢抗坏血酸(dhAA)在pH7处理3小时，或用2mM硫酸铜(CuSO4)水溶液在室温处理过夜。环境空气氧化作用也可能是有效的。通过Sephadex G25树脂上的洗脱来更换缓冲液，并用含1mM DTPA的PBS洗脱。如下检查硫醇/Ab值，即根据溶液在280nm的吸光度测定还原抗体浓度，通过与DTNB(Aldrich,Milwaukee,WI)的反应并测定412nm吸光度来测定硫醇浓度。
实施例6：通过半胱氨酸改造抗STEAP-1抗体和药物-接头中间体的偶联来制备半胱氨酸改造抗STEAP-1抗体-药物偶联物
在实施例5的还原和再氧化规程后，将半胱氨酸改造抗STEAP抗体溶解于PBS（磷酸盐缓冲盐水）缓冲液，并在冰上冷却。将相对于改造的半胱氨酸每个抗体大约1.5摩尔当量的auristatin药物-接头中间体（诸如MC-MMAE（马来酰亚氨基己酰基-单甲基auristatin E）、MC-MMAF、MC-val-cit-PAB-MMAE或MC-val-cit-PAB-MMAF）（其具有硫醇反应性官能团（诸如马来酰亚胺））溶解于DMSO，在乙腈和水中稀释，并添加至PBS中冷却的、还原的、再氧化的抗体。在大约1小时后，添加过量的马来酰亚胺以淬灭反应，并给任何未反应的抗体硫醇基团加帽。通过离心超滤来浓缩反应混合物，并将半胱氨酸改造抗STEAP-1抗体-药物偶联物通过经过PBS中G25树脂的洗脱来纯化和脱盐，在无菌条件下通过0.2μm滤器过滤，并冷冻用于贮存。
通过上文规程，制备了下列半胱氨酸改造抗STEAP-1抗体-药物偶联物（其中变体的编号方式是如本文和图17所提供的那样标准化的（轻链用Kabat编号方式，而重链用EU编号方式）：
通过轻链V205C thio hu120和MC-MMAF的偶联而获得的thio人120-MC-MMAF；
通过重链A118C thio hu120和MC-MMAF的偶联而获得的thio人120-MC-MMAF；
通过轻链V205C thio hu120和MC-val-cit-PAB-MMAE的偶联而获得的thio人120-MC-val-cit-PAB-MMAE；及
通过重链A118C thio hu120和MC-val-cit-PAB-MMAE的偶联而获得的thio人120-MC-val-cit-PAB-MMAE。
实施例7：半胱氨酸改造抗STEAP-1的抗体的表征
对如上所述制备的半胱氨酸改造抗STEAP-1抗体药物偶联物(TDC)实施测定法以证实它们保留亲本抗体的体外活性。使用表达STEAP-1的细胞（293STEAP-1NT LB50）和不表达细胞（293载体S408）通过FACS分析评估抗STEAP-1TDC thio-人120-vc-PAB-MMAE(LCV205C)(缩写为huSteap1TDC(L205C)vcE和thio-人120-vc-PAB-MMAE(HCA118C)(缩写为huSteap1TDC(HCA118C)vcE)对STEAP-1的结合。术语“仅第2”指FACS分析中的二抗。TDC对照(vcE)和ADC标准品对照(vcE)分别是对照抗体thio和非thiovc-PAB-MMAE药物偶联物。huSteap1ADC(标准品)是自亲本人抗STEAP-1抗体衍生的vc-PAB-MMAE药物偶联物。如所示的，TDC产生的FACS改变与亲本huSteap1ADC的相似。
还实施了体外细胞杀伤测定法来评估半胱氨酸改造抗STEAP-1抗体药物偶联物抑制表达STEAP-1的细胞生长和/或杀死它们的效力。简言之，将表达STEAP-1的细胞以大约2,000个细胞/孔涂布于96孔板中，并在24小时后用抗体药物偶联物一式两份处理。将板在37°C温育5-7天，并用
Figure BDA00002807843501681
发光细胞存活力测定试剂盒(Promega,Madison,WI,USA)显色。测试细胞包括PS5.4（表达外源STEAP-1的PC3细胞）、LB50（表达外源STEAP-1的293细胞）和表达内源STEAP-1的LNCaP细胞。测试抗体药物偶联物包括对照抗体-vc-MMAE（ADC标准品对照(vcE)）、对照thio抗体-vc-MMAE（TDC对照(vcE)）、抗STEAP-1TDC thio-人120-vc-PAB-MMAE(LCV205C)(缩写为huSteap1TDC(L205C)vcE和thio-人120-vc-PAB-MMAE(HCA118C)(缩写为huSteap1TDC(HCA118C)vcE)及huSteap1ADC(标准品)，一种自亲本人抗STEAP-1抗体衍生的vc-PAB-MMAE药物偶联物。如图19A-19C所示，抗STEAP-1TCD保留亲本ADC的体外活性。
实施例8：半胱氨酸改造抗STEAP-1抗体药物偶联物的体内肿瘤体积缩小测定
使用体内***癌异种移植物模型来测试半胱氨酸改造抗STEAP-1ADC的效力。所采用的这些模型和测试方案与实施例4中所述的对应。
对移植有LNCap-Ner肿瘤的SCID米色小鼠（如本文所述经睾酮丸剂处理）施用抗STEAP-1TDC thio-人120-vc-PAB-MMAE(HCA118C)(缩写为huSteap1HC TDC vcE)(3mg/kg)显示出是有效的。使用媒介(PBS)、对照抗体-vc-MMAE(ADC标准品对照vcE)和对照thio抗体-vc-MMAE(TDC HC对照vcE)作为对照。还将抗STEAP-1TDC的效果与作为阳性对照的人抗STEAP-1抗体120-MC-vc-PAB-MMAE(hu Steap1标准品ADC vcE)比较。在第0天施用单剂。所有抗体均以3mg/kg施用。结果作图于图20。
图21显示在移植有LNCaP细胞的SCID米色小鼠的***癌异种移植物模型中施用3mg/kg抗STEAP-1TDC thio-人120-vc-PAB-MMAE(HCA118C)(缩写为huSteap1HC TDC vcE)和1、3或6mg/kg抗STEAP-1TDC thio-人120-MC-MMAF(HCA118C)(缩写为huSteap1HC TDC mcF)表现出是有效的。在第0天给小鼠施用单剂0.3、1或3mg/kg(huSteap1HC TDC vcE)或者1、3或6mg/kg(huSteap1HC TDC mcF)。使用媒介(PBS)、对照抗体-vc-MMAE(ADC标准品对照vcE)和对照thio抗体-vc-MMAE(TDC HC对照vcE)作为对照。
图22显示在移植有LuCap35V细胞的SCID米色雄性小鼠（受雄激素控制的）的***癌异种移植物模型中施用3mg/kg抗STEAP-1TDC thio-人120-vc-PAB-MMAE(HCA118C)(缩写为huSteap1HC TDC vcE)和3或6mg/kg抗STEAP-1TDC thio-人120-MC-MMAF(HCA118C)(缩写为huSteap1HCTDC mcF)表现出是有效的。在第0天给小鼠施用单剂0.3、1或3mg/kg(huSteap1HC TDC vcE)或者1、3或6mg/kg(huSteap1HC TDC mcF)。使用媒介(PBS)、对照抗体-vc-MMAE(ADC标准品对照vcE)和对照thio抗体-vc-MMAE(TDC HC对照vcE)作为对照。
实施例9：来自抗体120变体24的抗STEAP-1抗体SGIV的制备和表征
制备了另一种LC抗STEAP-1抗体变体，其中进一步修饰了轻链和框架区以获得改良的抗体表达水平。
材料和方法
残基编号依照Kabat(Kabat等,Sequences of proteins of immunologicalinterest,第5版,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991))。使用了单字母氨基酸缩写。DNA简变性使用IUB代码表示（N=A/C/G/T,D=A/G/T,V=A/C/G,B=C/G/T,H=A/C/T,K=G/T,M=A/C,R=A/G,S=G/C,W=A/T,Y=C/T）。
经修订的轻链变体的制备：生成并表征了命名为“Simmons IV”或简称“SGIV”的120.v24抗体变体。SGIV轻链的氨基酸序列参见SEQ ID NO:90。该序列与mu120抗体(SEQ ID NO:89)和120.v24抗体(SEQ ID NO:91)相应区域的比对如图23所示。
变体SGIV与变体120.v24相比的评估－使用稳定转染的Steap1阳性细胞系293Steap1NT LB48、293Steap1NT LB50和293Steap1NT LB53以及内源表达STEAP-1的LNCaP细胞通过FACS分析评估作为IgG表达的SGIV和120.v24抗体（图28）。如实施例1所述制备细胞。每种IgG以5μg/mL添加并在冰上1小时。用FACS缓冲液离心漂洗样品两次并加入1:200稀释的抗人PE偶联物（R-藻红蛋白山羊抗人IgG Fcy片段，Jackson Immunoresearch）30分钟。再次用FACS缓冲液离心漂洗样品两次，并通过FACS分析样品。
基于Scatchard的SGIV和120.v24对STEAP-1结合的亲和力测定－依照标准方法使用Scatchard分析测定120.v24和Simmons IV（“SGIV”）抗体对STEAP-1的结合亲和力。用蛋白G亲和层析纯化IgG。通过Scatchard分析在PC-3-PS5.4、293-LB50和LNCaP-BR细胞中一式两份实施亲和力测定。LNCaPBR细胞和293.LB50细胞中120.v24和SGIV的Scatchard图分别如图25和26所示。比较mu1789、mu120、Fc嵌合体、人源化120.v24、thio-120.v24和thio-SGIV在PC-3-PS5.4、293-LB50和LNCaP-BR细胞以及瞬时表达STEAP-1的293细胞中的平均结合亲和力的表如图27所示。
SGIV和120.v24的定点诱变：如上所述使用标准诱变方案制备SGIV和120.v24抗体的变体。第一类变体由定点诱变产生，其中Simmons IV(“SGIV”)的特定残基用120.v24的相应残基替代以进一步改进结合亲和力。如图24所示，所生成的具体变体如下：
(1)LS.VLVH1，其中残基42(“Q”)和43(“P”)分别被改变成“K”和“A”(SEQID NO:92)
(2)LS.VLVH2，其中残基3(“V”)被改变成“Q”，残基42(“Q”)和43(“P”)分别被改变成“K”和“A”，而残基85(“V”)被改变成“T”(SEQ ID NO:93)
(3)LS.Q，其中残基3(“V”)被改变成“Q”(SEQ ID NO:94)
(4)LS.CH1，其中残基15(“L”)被改变成“V”而残基83(“V”)被改变成“F”(SEQ ID NO:95)
第二类变体是通过定点诱变产生的，其中120.v24的特定残基被SimmonsIV(SGIV)的相应残基替代以改进抗体表达水平。如图24所示，具体变体如下：(1)ED.FW1，其中残基3(“Q”)被改变成“V”；残基9(“S”)被改变成“D”；残基12（“S”）被改变成“A”；残基13(“A”)被改变成“V”；残基15（“V”）被改变成“L”；残基17(“D”)被改变成“E”；残基19（“V”）被改变成“A”；而残基22（“T”）被改变成“N”(SEQ ID NO:96)
(2)ED.FW2，其中120.v24的残基42(“K”)和43(“A”)被分别改变成“Q”和“P”(SEQ ID NO:97)
(3)ED.FW3，其中60(“S”)被改变成“D”；残基80(“P”)被改变成“A”；残基83(“F”)被改变成“V”；而残基85(“T”)被改变成“V”(SEQ ID NO:98)
(4)ED.全部，其中残基3(“Q”)被改变成“V”；残基9(“S”)被改变成“D”；残基12(“S”)被改变成“A”；残基13(“A”)被改变成“V”；残基15(“V”)被改变成“L”；残基17(“D”)被改变成“E”；残基19(“V”)被改变成“A”；残基22(“T”)被改变成“N”；120.v24的残基42(“K”)和43(“A”)被改变成“Q”和“P”；残基60(“S”)被改变成“D”；残基80(“P”)被改变成“A”；残基83(“F”)被改变成“V”；而残基85(“T”)被改变成“V”(SEQ ID NO:99)
(5)ED.Pro，其中残基43(“A”)被改变成“P”而残基80(“P”)被改变成“A”(SEQ ID NO:100)
(6)ED.pl，其中残基9(“S”)被改变成“D”；残基42(“K”)被改变成“Q”而残基60(“S”)被改变成“D”(SEQ ID NO:101)
结果和讨论
SGIV抗体的制备－抗STEAP-1抗体型式24(120.v24)可变区的序列如图23和24所示(SEQ ID NO:91)。使用定点诱变，使用如上所述的标准诱变方案制备了另一种称为“Simmons IV”或简称“SGIV”的变体。图23和24显示了SGIV轻链序列与mu120抗体和120.v24序列的比对。SGIV抗体的各种收获物的滴度见图29。
使用FACS比较SGIV和120.v24对STEAP-1的结合－使用FACS测量两种抗体120.v24和SGIV对细胞表面上表达的STEAP-1结合的能力。一式两份测量抗体对表达外源STEAP-1的细胞系(293STEAP-1LB48、293STEAP-1LB50和293STEAP-1LB53)或表达内源STEAP-1的细胞系(LNCaP.Br)的结合；结果总结于图28。如图28所示，两种抗体均能够结合全部四种细胞系中的STEAP-1。
SGIV抗体对STEAP-1的结合亲和力以及与120.v24的比较－使用Scatchard分析检验SGIV和120.v24对STEAP-1的结合亲和力。120.v24和SGIV在LNCaP BR细胞和293.LB50细胞中的Scatchard图分别如图25和26所示。比较mu1789、mu120、Fc嵌合体、人源化120.v24、thio-120.v24和thio-SGIV抗体在PC-3-PS5.4、293-LB50和LNCaP-BR细胞以及瞬时表达STEAP-1的293细胞中的平均结合亲和力的表如图27所示。结果表明120.v24抗体在293-LB50和LNCaP.BR细胞中的结合亲和力大致是SGIV变体的1.5倍。
实施例10：89Zr-抗STEAP-1-vc-MMAE免疫PET
实施了锆-89-抗STEAP-1-vc-MMAE免疫PET成像来测量数种小鼠原发性***肿瘤中的STEAP-1-vc-MMAE表达水平以评估小鼠模型中的抗体内在化和肿瘤摄取，与受体表达的其它已建立的体外表征和测量比较。使用体内***癌异种移植物模型来测试抗STEAP-1ADC的功效。这些模型包括人细胞系LNCaP（ATCC CRL-1740或Southern Research Institute,Birmingham,AL）。***外植体模型包括LuCaP77和LuCaP35V（University of Washington,Seattle,WA）。每一种***外植体模型通过在经过***的（雄激素独立性模型，LuCAP35V）或未经***的（雄激素依赖性模型，LuCAP77）动物中连续移植来维持。给动物服用100μCi  89Zr-抗STEAP-1-vc-MMAE并在四（4）天后成像。对Lucap96.1、Lucap70、Lucap77和Lucap35V原发性肿瘤进行了评估，结果显示它们的体外特征相似[见实施例4；图8-11]。如图30所示，89Zr-STEAP-1-vc-MMAE的摄取在Lucap35V中最高且在Lucap96.1中最低[Lucap96.1>Lucap70>Lucap77>Lucap35V]。与3天肿瘤摄取研究平行运行多周功效研究[Lucap35V：显示高STEAP-1-vc-MMAE摄取，符合强功效；Lucap70：显示中等摄取和功效]。如此，89Zr免疫PET提供一种非侵入性方法来监测抗体的组织水平生物分布，而且可以跨物种使用，从小鼠到人（如转移性乳腺癌患者中的Herceptin2阳性病灶显示的，如记载于Dijkers E.C.等,Nature Volume87Number5(May2010)）。89Zr-免疫PET可用于测定肿瘤饱和点，推动为未来药物疗法设计剂量给药方案。
尽管为了清楚理解的目的已经通过举例说明的方式较为详细的描述了上述发明，说明书和实施例不应解释为限制发明范围。明确将本申请中所引用的所有专利和科学文献的公开内容完整收入本文作为参考。

Claims (3)

1.一种测定STEAP-1蛋白在怀疑含有所述STEAP-1蛋白的生物学样品中存在的方法，所述方法包括：使该生物学样品暴露于89锆标记的抗STEAP-1抗体并测定所述89锆标记的抗STEAP-1抗体与所述生物学样品中所述蛋白的结合，其中所述89锆标记的抗STEAP-1抗体对所述蛋白的结合指示所述生物学样品中存在所述STEAP-1蛋白。
2.权利要求1的方法，其为免疫PET成像方法。
3.权利要求1的方法，其是在怀疑患有***、肺、结肠、膀胱、卵巢细胞或尤因氏肉瘤细胞增殖性病症的患者中进行的。
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